ES2575981T3 - Péptido cíclico derivado de Nonomuraea sp., proceso para la producción del mismo, y composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de una enfermedad relacionada con micobacterias que comprende el mismo - Google Patents

Abstract

Un péptido cíclico de Fórmula 1 o Fórmula 2 aislado de una cepa Nonomuraea sp. MJM5123 (N.º de acceso: KCTC 12178BP):**Fórmula**

Description

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DESCRIPCION

Peptido dclico derivado de Nonomuraea sp., proceso para la produccion del mismo, y composicion farmaceutica para la prevencion o el tratamiento de una enfermedad relacionada con micobacterias que comprende el mismo

Campo tecnico

La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional del Estados Unidos con numero US 61/476.473, presentada el 18 de abril de 2011; y US 61/513.403, presentada el 29 de julio de 2011; y US 61/555.257, presentada el 3 de noviembre de 2011; y US 61/607.934 presentada el 7 de marzo de 2012.

La presente invencion se refiere a novedosos peptidos dirigidos contra micobacterias muy activas contra Mycobacterium tuberculosis replicante/replicante y varias cepas de M. tuberculosis resistentes a farmacos incluyendo aquellas con resistencia multifarmaco (RMF) y tuberculosis extremadamente resistente a farmacos (XDR). La presente invencion se refiere tambien a un proceso de fermentacion para cultivar una cepa de Nonomuraea sp. MJM5123 para preparar los peptidos antimicobacterianos, y al proceso para la produccion de los mismos y sus composiciones farmaceuticas que comprenden los peptidos antimicobacterianos para la prevencion y/o el tratamiento de la tuberculosis.

Antecedentes de la tecnica

Mycobacterium tuberculosis es una bacteria grande y compleja que produce la enfermedad de la tuberculosis (TB) en seres humanos y otros mairnferos. La TB es una enfermedad muy contagiosa que se disemina de una persona a otra por la ruta respiratoria.

Se produjeron 9,4 millones de casos nuevos de TB en 2009, incluyendo 1,1 millon de casos entre personas con VIH y 0,3 millones de RMF-TB [WHO Actions For Life - Towards a world free of tuberculosis; Organizacion Mundial de la Salud: Ginebra, Suiza, 2006]. La RMF-TB requiere que la duracion del tratamiento se amplfe de seis meses hasta un mmimo de dos anos. La prevalencia mundial de la TB extremadamente resistente a farmacos (XDR-TB) se estima en un 6,6 % entre las cepas de tuberculosis las cepas de tuberculosis RMF M [WHO Actions For Life - Towards a world free of tuberculosis; Organizacion Mundial de la Salud: Ginebra, Suiza, 2006].

A pesar de la amplia concienciacion que ha despertado la epidemia, la prevalencia de la TB de tipo RMF y tambien la XRD-TB sigue en aumento [WHO Anti-tuberculosis drug resistance in the world - Informe n.° 4. 2008]. La rapida aparicion de cepas de tuberculosis RMF y XDR es diffcil o virtualmente intratable con las quimioterapias actuales. Dichas cepas representan una amenaza importante para la salud global, especialmente en los pafses en desarrollo y en pafses con prevalencia creciente del VIH/SIDA [Koenig, R. Drug-resistant tuberculosis. En Sudafrica, la TB XDR y el VIH representan una combinacion mortal. Science 2008, 319, 894-897].

La mayona de personas infectadas con una infeccion de TB latente (LTBI) pueden contener el bacilo impidiendo que cause smtomas y no suponen riesgo de infeccion para otras personas. Con la excepcion de la evidente supresion inmunitaria mediada por enfermedad o por farmacos, se sabe poco acerca delo que hace que la LTBI evolucione a una enfermedad de TB activa, pero una vez que la TB es capaz de evitar el confinamiento inmunologico, se considera que ha evolucionado a una enfermedad TB activa. Los ninos y adultos malnutridos y/o inmunocomprometidos tienen mayor riesgo de evolucion de la enfermedad. En 2008, la TB reclamo las vidas de 1,82 millones de personas, de los que 500.000 se produjeron entre personas infectadas con VIJ, convirtiendose en la causa principal de muerte para las personas con VIH [World Health Organization. Global tuberculosis control: a short update to the 2009 report. Ginebra, Suiza: Organizacion Mundial de la Salud, 2009].

En consecuencia, existe una necesidad urgente de desarrollar nuevos farmacos contra la TB, preferentemente con un nuevo mecanismo de accion.

Entretanto, el documento WO 2009/119710 divulga tiopeptidos dclicos antibacterianos producidos mediante un actinomiceto que pertenece al genero Nonomuraea. Terui et al. en Bioorg. Med. Chem. Lett., 2008, 18(24), 6321-3 divulga tetrapeptidos dclicos derivados del caldo de fermentacion de Nonomuraea sp. TA-0426 que inhibe el transportador de glicina de tipo 1. El documento US 2010/093615 divulga tiopeptidos dclicos antibacterianos obtenidos a partir de una cepa de Nonomuraea sp Bp3714-39.

Divulgacion de la invencion

[Problema tecnico]

Es un objeto de la presente invencion proporcionar novedosos peptidos dirigidos contra la TB activos contra M. tuberculosis replicante/no replicante, y muchas cepas de M. tuberculosis resistentes a farmacos.

Es otro objeto de la presente invencion proporcionar un proceso para la produccion de los peptidos dirigidos contra

la tuberculosis y a un uso de los peptidos anti-TB en las composiciones farmaceuticas para la prevencion y/o el tratamiento de diferentes infecciones de micobacterias.

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[Solucion al problema]

Para conseguir el objetivo anterior, la presente invencion proporciona peptidos dclicos aislados de una cepa de Nonomuraea sp. MJM5123. En una realizacion preferida de la presente invencion, el peptido dclico de la presente invencion puede tener la siguiente Formula 1 o Formula 2:

imagen1

[Formula 1: H-14]

N-Me-4-Cme-Wrp

R-B-OH-Whe

L-Va Is

H-Me-i-Val

L o A H 6nA

L-Val*

i^Val4 r-Thr 0

nA* ,Y1o°MYnhV

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|Formula 2: H-16|

U-Ho-'l-Cwe-t-Trp

H I Vdi5

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Ademas, la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica eficaz para la prevencion y/o el tratamiento de enfermedades relacionadas con Mycobacterium spp. En una realizacion preferida de la presente invencion, la composicion farmaceutica de la presente invencion comprende novedosos peptidos dclicos anti-TB asilados a partir de una cepa de Nonomuraea sp. MJM5123 y un transportador farmaceuticamente aceptable para tratar infecciones causadas por Mycobacteria. Los presentes inventores han depositado la Nonomuraea sp. MJM5123 en la Korean Collection for Type Cultures (KCTC) del Korea Research Institute of Biotechnology and Bioscience (KRIBB) el 3 de abril de 2012 (n.° de acceso: KCTC 12178BP).

A partir de ahora, la presente invencion se describe detalladamente.

La presente invencion proporciona peptidos dclicos aislados de una Mycobacterium spp., preferentemente una cepa de Nonomuraea sp. MjM5123. En una realizacion preferida de la presente invencion, el peptido ciclico de la

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presente invencion tiene la Formula 1 o Formula 2. Preferentemente, los peptidos dclicos de la presente invencion se pueden aislar de una cepa de Nonomuraea sp. MJM5123 mediante los siguientes procedimientos:

Actinomicetos - Una fuente de nuevos antibioticos anti-TB

Los actinomicetos son organismos del suelo ubicuos conocidos por producir una gran variedad de metabolites secundarios. Algunos antibioticos, utilizados para el tratamiento de una variedad de infecciones bacterianas, proceden de los actinomicetos, incluyendo estreptomicina, cefalosporinas, tetraciclina, eritromicina, rifampina, y daptomicina. Aunque tres farmacos diferentes utilizados en la actualidad para tratar la tuberculosis (rifampina, estreptomicina y cicloserina) se descubrieron a partir de actinomicetos usando ensayos de difusion en agar, estos cribados no se realizaron inicialmente usando M. tuberculosis. Esto fue debido a la naturaleza contagiosa y frecuente resultado fatal (en el momento) de la TB. Puesto que ahora se entiende que M. tuberculosis. solamente es susceptible a algunas clases de agentes antimicrobianos, los inventores deben asumir que el fallo del pasado al cribar caldos de fermentacion directamente contra este patogeno, dio como resultado que muchos tipos de compuestos potencialmente utiles quedaran sin detectar. De esta forma, los inventores iniciaron este programa de descubrimiento de farmacos contra la TB realizando el cribado directamente contra una cepa virulenta de M. tuberculosis.

Cribado de alto rendimiento

Las tecnicas de cribado de alto rendimiento tanto para compuestos puros o para extracto se definieron en el Institute for Tuberculosis Research (ITR). La Coleccion de extractos de microorganismos utiles (ECUM, por sus siglas en ingles) de la Myongji University Corea del Sur mantiene una coleccion de cultivo de mas de 7000 aislados de actinomicetos procedentes de Corea, China, Nepal, Filipinas, Vietnam, Antarctica, y el Cffculo Polar Artico. La inclusion de ubicaciones bastante exoticas fue un intento de aislar especies raras y novedosas.

Cada aislado se fermento inicialmente en cultivos de 20 ml en tres medios de cultivo diferentes - G.S.S. (medio rico), medio de Bennett y GyC (medio mmimo) y se sometieron a ensayo tres extractos por cepa en el ensayo en microplaca con azul alamar (MABA) y adicionalmente se clasificaron.

Identificacion de MJM5123

Tras cribar mas de 65.000 extractos almacenados en la Coleccion de extractos de microorganismos utiles (ECUM, por sus siglas en ingles) de la Myongji University en Corea, el extracto metanolico de micelio de una novedosa especie de actinomicetos, cepa MJM5123, parecio tener una fuerte actividad anti-TB. La cepa MJM5123 se identifico como una Nonomuraea sp. mediante un enfoque taxonomico polifasico.

Aislamiento guiado por bioensayo

La cepa MJM5123 se selecciono para un procedimiento de aislamiento guiado por bioensayo basado en un fraccionamiento inicial con cromatograffa lfquida al vado (VLC) seguido por purificacion dirigida con varias etapas de cromatograffa de alta velocidad en contracorriente (CCC).

La investigacion guiada por bioensayo de los principios bioactivos de productos naturales requieren tecnicas analfficas preparativas que son capaces de resolver mezclas complejas eficazmente [Hostettmann, K.; Marston, A. The search for new drugs from higher plants. Chimia 2007, 61, 322-326; Hostettmann, K.; Marston, A. Plants as a still unexploited source of new drugs. Nat Prod Com 2008, 3, 1307-1315; Hostettmann, K.; Marston, A.; Wolfender, J. L. Strategy in the search for new lead compounds and drugs from plants. Chimia 2005, 59, 291-294]. Los metodos convencionales contemporaneos en este campo son diferentes formas de cromatograffa solido-lfquido que utilizan fases solidas estacionaria, tales como columnas/ultrarrapida, vado, y cromatograffa ffquida de alto rendimiento (CC, VLC, HPLC). Sin embargo, existen varios inconvenientes asociados con el uso de fases estacionarias solidas (adsorbentes), que limitan significativamente su funcion en el contexto del fraccionamiento guiado por bioensayo: La adsorcion irreversible es una de estas limitaciones, y esta ampliamente reconocida [Lindblom, T. Irreversible absorption of diphenylamine onto a straight phase and a reverse phase HPLC-column. Symposium on Chemical Problems Connected with the Stability of Explosives, [Proceedings] 1993, 9a, 205-213; Kubo, I. Recent applications of counter-current chromatography to the isolation of bioactive natural products. J Chrom 1991, 538, 187-191; Sadek, P. C.; Carr, P. W.; Bowers, L. D.; Haddad, L. C. A radiochemical study of irreversible adsorption of proteins on reversed-phase chromatographic packing materials. Anal Biochem 1986, 153, 359-371]. De acuerdo con ello, los metodos de CL estan frecuentemente asociados con la perdida de material (recuperacion limitada) y, de manera mas importante, la atenuacion de la bioactividad junto con la ruta de fraccionamiento. Estas limitaciones no se producen en la cromatograffa contracorriente (CCC), ya que es una tecnica lfquido-lfquido que se basa en su totalidad en el reparto de una muestra entre dos disolventes inmiscibles para conseguir la separacion, permite la recuperacion completa del material de muestra y, por tanto, tiene el potencial de evaluar los efectos sinergicos de mezclas complejas de productos naturales. Ademas, es un metodo ideal para el aislamiento dirigido de clases de compuestos espedficas. Asf, el procedimiento de aislamiento esta principalmente basado en CCC.

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La cepa MJM5123 se cultivo en masa en fermentadores de 20 l en el ECUM, se recogio y se extrajo para producir biomasa suficiente para aislamiento, elucidacion de la estructura y perfilado biologico de los compuestos puros H-14 y H-16, dos peptidos dclicos fuertemente activos contra la TB.

Elucidacion de la estructura de los componentes bioactivos

Se llevo a cabo una elucidacion completa de la estructura de H-14 y H-16 usando las tecnicas de RMN 1D/2D mas modernas y de mayor calidad, asf como informacion estructural basada en la EM de alta resolucion, potenciada mediante la cristalogratia de rayos X del peptido. Se utilizo la RMN cuantitativa (RMNc) para el reconocimiento selectivo realizado simultaneamente con la determinacion cuantitativa en cada etapa de aislamiento. La RMNc es una herramienta optima, no solamente para la determinacion de la pureza y/o la cantidad de aislados activos, sino tambien con el fin de perfilar los compuestos biologicamente activos, pero tambien mezclas/fracciones complejas. La estructura 3D global de H-14 y sus restos de aminoacidos se determinaron mediante cristalogratia de rayos X.

Optimizacion del proceso de fermentacion

Para mejorar la productividad de los peptidos anti-TB, se desarrollo un proceso de fermentacion y un medio economico. La fermentacion principal se llevo a cabo a 34 °C con una velocidad de agitacion de 600 rpm y 0,3 vvm de aireacion durante 6 dfas. El volumen final del micelio empaquetado fue del 80 % a un pH de 8,20 y el azucar total fue inferior al 1,8 %. El proceso de fermentacion proporciono 373 mg/l de H-14.

Ademas, la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica eficaz para la prevencion y/o el tratamiento de enfermedades relacionadas con Mycobacterium spp. que comprenden un compuesto de Formula 1 y/o Formula 2 de la presente invencion como principio activo. En una realizacion preferida, la enfermedad relacionada con Mycobacterium spp. es tuberculosis. En otra realizacion preferida de la presente invencion, la tuberculosis puede ser una tuberculosis RMF o una tuberculosis XDR.

La composicion farmaceutica de la presente invencion comprende los novedosos peptidos anti-TB de la presente invencion aislados de una cepa Nonomuraea sp. MJM5123. Preferentemente, la composicion farmaceutica de la presente invencion puede comprender ademas un transportador farmaceuticamente aceptable, un excipiente y un diluyente.

En una realizacion de la presente invencion, los peptidos dclicos de la presente invencion se pueden tratar solos como un agente terapeutico contra la tuberculosis, o se pueden tratar combinados con una composicion mixta de uno o al menos dos tipos de otros agentes antimicobacterianos. En una realizacion preferida de la presente invencion, el agente antimicobacteriano puede ser un agente de tratamiento oral de primera lmea contra la tuberculosis, tal como isoniazida, rifampicina, etambutol y pirazinamida; un agente anti-TB inyectable tal como estreptomicina, amikacina, capreomicina y kanamicina; una fluoroquinolona tal como ciprofloxacina, ofloxacina y moxifloxacina; agente de tratamiento oral de segunda lmea contra la tuberculosis, tal como rifabutin, protionamida, etionamida, cicloserina, PAS y tioacetazona; otros agentes anti-TB tales como linezolida, clofazimina, amoxicilina/clavulanato, y un derivado de diaminodifenilsulfona; y un compuesto actualmente en ensayos clmicos para la tuberculosis tales como bedaquilina, PA-824, Dalamanid, SQ-109, Sutezolid, rifapentina y compuestos en desarrollo preclmico, en particular AZD5847, BTZ043, TBA-354, CPZE/ N-45, SQ-641, SQ-609, DC-159a, Q201, THPP, analogos de riminofenazina de clofazimina e inhibidores LeuRS que contienen boro, pero no siempre limitados a los citados.

Los peptidos dclicos anti-TB de la presente invencion se pueden formular para su administracion por via oral, por ejemplo, polvos, granulos, comprimidos, pfldoras, capsulas, soluciones, suspensiones, emulsiones y jarabes. Los transportadores, excipientes y diluyentes se ilustran mediante lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, almidon, goma acacia, alginato, gelatina, fosfato de calcio, silicato de calcio, celulosa, metilcelulosa, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, agua, hidroxibenzoato de metilo, hidroxibenzoato de propilo, talco, estearato de magnesio y aceite mineral.

Las formulaciones solidas para administracion oral son comprimidos, pfldoras, polvos, granulos y capsulas. Estas formulaciones solidas se preparan por mezclado con uno o mas excipientes adecuados tales como almidon, calcio dihidratado, sacarosa o lactosa, gelatina, etc. Salvo por los excipientes sencillos, se pueden utilizar lubricantes, por ejemplo, estearato de magnesio, talco, etc.

Las formulaciones lfquidas para administracion oral son suspensiones, soluciones, emulsiones y jarabes, y las formulaciones anteriormente mencionadas pueden incluir varios excipientes tales como agentes mojantes, edulcorantes, aromas y conservantes ademas de los diluyentes simples de uso generalizado tales como agua y parafina lfquida.

Los peptidos anti-TB novedosos de la presente invencion se pueden formular para inyeccion intravenosa. Para uso intravenoso (IV), una forma soluble en agua de un compuesto de la presente invencion se puede disolver en cualquiera de los fluidos intravenosos usados habitualmente, y se administran por infusion. Las formulaciones

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intravenosas pueden incluir transportadores, excipientes o estabilizantes que incluyen, sin limitacion, calcio, albumina serica humana, citrato, acetato, cloruro de calcio, carbonato, y otras sales. Los fluidos intravenosos incluyen, sin limitacion, suero salino fisiologico o solucion de Ringer. Los peptidos anti-TB de la presente invencion tambien se pueden introducir en inyectores, canulas, cateteres y lmeas.

Las formulaciones para administracion parenteral pueden estar en la forma de soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas esteriles isotonicas para inyeccion. Estas soluciones o suspensiones se pueden preparar a partir de polvos o granulos esteriles que tienen uno o mas de los transportadores mencionados para su uso en las formulaciones para administracion oral. Los peptidos anti-TB novedosos de la presente invencion se pueden disolver en polietilenglicol, propilenglicol, etanol, aceite de mafz, alcohol bendlico, cloruro de sodio, y/o diferentes tampones.

Para preparaciones intramusculares, parenterales o intravenosas, una formulacion esteril de los peptidos anti-TB o una forma salina soluble adecuada del compuesto, por ejemplo, la sal de clorhidrato, se puede disolver y administrar en un diluyente farmaceutico tal como agua para inyeccion (WFI), suero salino fisiologico o glucosa al 5 %.

Una forma insoluble adecuada de los peptidos contra la tuberculosos tambien se puede preparar y administrar en forma de suspension en una base acuosa o una base oleosa farmaceuticamente aceptable, por ejemplo, un ester de un acido graso de cadena larga tal como oleato de etilo. Las formas de depositos inyectables se pueden preparar formando matrices microencapsuladas de los peptidos anti-TB en poffmeros biodegradables tales como polilactido- poliglicolido. Dependiendo de la relacion de farmaco a poffmero y de la naturaleza del polfmero concreto empleado, se puede controlar la velocidad de liberacion del farmaco. Los poffmeros biodegradables incluyen poli(ortoesteres) y poli(anhffdridos). Se preparan tambien formulaciones inyectables de deposito atrapando el farmaco en microemulsiones que son compatibles con los tejidos corporales.

Para su aplicacion a los ojos o a los ofdos, los peptidos de la presente invencion se pueden formular en bases hidrofobas o hidrofilas tales como pomadas, cremas, lociones, pinturas o polvos.

Para su aplicacion en administracion rectal, los peptidos de la presente invencion se pueden formular en la forma de supositorios premezclados con transportadores convencionales tales como manteca de cacao, cera, u otro glicerido.

Los peptidos anti-TB de la presente invencion tambien se pueden utilizar en inhaladores, tales como inhaladores de dosis medida, y nebulizadores.

La presente invencion proporciona ademas un proceso para la fabricacion del peptido dclico contra la tuberculosis de la Formula 1 o la Formula 2 de la presente invencion. El proceso de la presente invencion puede comprender las siguientes etapas: cultivar un microorganismo productor de un peptido antimicobacteriano con la cepa Nonomuraea sp. MJM5123 en condiciones aerobias en un medio de cultivo acuoso; y aislar los peptidos dclicos contra la tuberculosis de la presente invencion a partir de los micelios fermentados.

En una realizacion de la presente invencion, la etapa de aislar el peptido dclico contra la tuberculosis puede comprender las siguientes etapas: realizar una cromatograffa ffquida en vado (VLC) del extracto metanolico de micelios de Nonomuraea sp. MJM5123 usando metanol y cloroformo como eluyente; realizar una cromatograffa en columna abierta Sephadex LH-20 usando metanol como eluyente; y realizar una cromatograffa en contracorriente de alta velocidad (HSCCC) usando HEMWat+2 como disolvente.

En otra realizacion de la presente invencion, la etapa de aislar el peptido dclico contra la tuberculosis puede comprender las siguientes etapas: extraer los micelios de Nonomuraea sp. MJM5123 usando metanol como disolvente; anadir agua hasta el 30 % del extracto metanolico para preparar metanol acuoso; desgrasar el extracto de metanol usando hexano; separar la capa acuosa y ajustar hasta el 65 % de metanol acuoso; extraer la capa acuosa usando cloroformo; concentrar y resolver el extracto de cloroformo usando metanol; realizar una cromatograffa en columna Sephadex LH-20 usando metanol como eluyente; y realizar la HPLC provista de una columna rellena con un gel de fase invertida (RP-18).

Efectos ventajosos de la invencion

Los peptidos anti-TB novedosos tienen una citotoxicidad muy baja frente a celulas de mairnferos y una actividad potente contra M. tuberculosis replicante no replicante incluyendo cepas de M. tuberculosis resistentes a un solo farmaco, MDR y XDR-TB, de forma que se puedan usar eficazmente como agentes terapeuticos para la tuberculosis.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 muestra los procesos para establecer las bibliotecas de extractos microbianos.

La Figura 2 muestra una vision general del proceso de extraccion de los presentes peptidos.

La Figura 3 muestra una micrograffa de barrido electronico de Nonomuraea sp. MJM5123 que ha crecido en medio lSP3 durante 2 semanas a 28 °C.

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La Figura 4 muestra el resultado del analisis de hidrolizado de celulas completas Nonomuraea sp. MJM5123.

La Figura 5 muestra un perfil lfpido polar de Nonomuraea sp. MJM5123. Las placas se pulverizaron con acido molibdatofosforico para detectar los lfpidos totales (a), ninhidrina para detectar aminolipidos (b), azul de molibdeno para detectar fosfoKpidos (c), y acido a-naftosulfurico para detectar glucolfpidos (d).

La Figura 6 muestra un analisis filogenetico, basado en las secuencias del ADNr de 16S disponibles de la base de datos NCBl, construida a partir de multiples alineamientos de datos mediante CLUSTAL-X [Thompson, J. D.; Gibson, T. J.; Plewniak, F.; Jeanmougin, F.; Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res 1997, 25, 48764882].

La Figura 7 muestra el grafico de biomasa y actividad de los compuestos anti-TB en la fermentacion principal (DCW; peso de celulas secas, PMV; volumen de micelio empaquetado, actividad; zona de inhibicion del crecimiento frente a Mycobacterium smegmatis ml2155 mediante un ensayo de difusion en disco de papel).

La Figura 8 muestra cristales de H-14 crecidos usando un metodo de evaporacion lenta. La dimension mas grande fue de aproximadamente 0,5 mm.

La Figura 9 muestra una estructura 3D de H-14.

La Figura 10 muestra un mapa de densidad electronica de restos seleccionados, triptofano (W10), fenilalanina (F12), treonina (T5) e isoleucina (l3) a una resolucion de 0,83.

La Figura 11 muestra la disposicion estructural del peptido H-14 dclico de la presente invencion.

La Figura 12 muestra la disposicion estructural del peptido H-16 dclico de la presente invencion. La Figura 13 muestra los restos de aminoacidos especiales en las Figuras 15 y 16.

Mejor modo de llevar a cabo la invencion

Las realizaciones practicas y realmente preferidas de la presente invencion son ilustrativas como se muestran en los siguientes Ejemplos.

Sin embargo, se apreciara que los expertos en la materia, tras la consideracion de la presente memoria descriptiva, pueden realizar modificaciones y mejoras comprendidas en el espmtu y el alcance de la presente invencion.

Ejemplo 1: Preparacion de bibliotecas de extractos microbianos para cribado de alto rendimiento

Se aislaron aproximadamente 7.000 aislados de actinomicetos de muestras de suelo recogidas en zonas con condiciones ecologicas y meteorologicas tales como las regiones alpinas, regiones tropicales, regiones polares, volcanes y otros, y se puede mantener mediante el The Extract Collection of Useful Microorganisms (ECUM) en la Myongji University de Corea. Se prepararon nueve tipos diferentes de extractos a partir de cada aislado para el cribado de candidatos contra la tuberculosis. En primer lugar, cada aislado se cultivo con 30 ml de G.S.S, medio de Bennett, de GYC. Tras separar los micelios del caldeo de cultivo mediante centrifugacion, el micelio se extrajo con metanol y el sobrenadante del cultivo se repartio entre acetato de etilo y agua, respectivamente. Finalmente, nueve extractos organicos y acuosos de cada aislado microbiano cultivado en tres medios se concentraron hasta sequedad mediante evaporacion al vacfo y se conservo en un congelador fuerte a -70°C (Figura 1, Figura 2 y Tabla 1).

Tabla 1

_________________[Tabla 1]__________

Tres medios principales para actinomicetos

<1> Medio G.S.S.____________________

Almidon soluble 10 g__________________

Glucosa 20 g________________________

Harina de soja 25 g___________________

Extracto de ternera 1 g________________

Extracto de levadura 4 g_______________

NaCl2 g____________________________

K2HPO4 0,25 g_______________________

CaCO32 g D.W. 1 l

pH 7,2_____________________________

<2> Medio de Bennett________________

Glucosa 10 g________________________

Extracto de levadura 1 g_______________

Bacto-peptona 2 g____________________

Extracto de ternera 1 g________________

<3> Medio DyC______________________

Dextrina 25 g________________________

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Tres medios principales para actinomicetos

Levadura seca 12 g___________________

CSL20 g___________________________

NaBr 1 g____________________________

CoC2 1 g____________________________

pH 7,0_____________________________

<3> Medio de coloracion_____________

D.W. 1 l

Ejemplo 2: Cribado a gran escala

Cada aislado de actinomiceto del ECUM se fermento inicialmente en cultivos de 20 ml en tres medios de cultivo diferentes: G.S.S. (medio rico), medio de Bennett y GyC (medio mmimo). El micelio se extrajo con metanol, y el sobrenadante del cultivo con acetato de etilo, que posteriormente se repartio con agua, produciendo nueve extractos por aislado. Se secaron alfcuotas de 100 pl y se enviaron desde la Myongji University a la UIC en placas de 96 pocillos, se solubilizaron en 100 pl de DMSO y se diluyo a 1:100 en cultivos de ensayo. El HTS de ~63,000 extractos produjo 349 extractos (0,55%) con =90% de inhibicion de M. tuberculosis en medio 7H12 (acido palmftico como fuente de C) determinado mediante lecturas fluorometricas en el ensayo en microplaca con azul alamar (MABA). Noventa de los exitos iniciales se volvieron a fermentar en escala de 1 l en ECUM, y los extractos se fraccionaron posteriormente en UIC con extraccion en medio solido con gel de sflice en fase invertida con un gradiente de MeOH- agua de 20-100 % seguido por CHCh al 100 % para dar seis fracciones por extracto. Las fracciones se perfilaron biologicamente en terminos de: 1.) toxicidad para celulas de mairnfero (celulas VERO CI50); 2.) actividad contra M. tuberculosis no replicante (LORA); 3.) actividad contra cepas de M. tuberculosis resistentes a rifampina (RMP), isoniazida (INH), estreptomicina (SM), kanamicina (KM), capreomicina (CAP), cicloserina (CS), (para asegurar que los inventores no estan simplemente encontrando de nuevo estos antibioticos derivados de actinomicetos) o moxifloxacina (Mox) y 4.) actividad contra M. smegmatis, S. aureus, E. coli y C. albicans. Basandose en estos resultados, se priorizaron 20 cepas de actinomicetos para investigacion adicional.

Ejemplo 3: Identificacion de MJM5123

Determinacion de las caractensticas morfologicas y de cultivo

Se aislo MJM5123 de una muestra de suelo recogida en Mount Halla, Corea. El genero de la cepa se identifico mediante la morfologfa caractenstica y el analisis qmmico de los componentes de la pared celular. Para determinar las caractensticas morfologicas y de cultivo, la cepa se hizo crecer durante 2 semanas a 28 °C en el medio del International Streptomyces Project (ISP) (Shirling, E. B. y D. Gottlieb, Methods for characterization of Streptomyces species. Int J Syst Evol Microbiol. 1966 16(Pt 3): 313-330) tal como agar de extracto de malta con extracto de levadura (ISP2), agar de harina de avena (ISP3), agar de almidon con sales inorganicas (ISP4), agar de asparagina glicerol (ISP5). Se determinaron los colores de las colonias utilizando el Color Harmony Manual (Jacobson, E., W. C. GrauviIle, et al., Color Harmony Manual. 1958. Chicago, Container Corporation of America). Se observaron las esporas y los micelios mediante microscopio de barrido electronico (Hitachi, S-3500 N, Japon) (Figura 3).

Tabla 2

[Tabla 21

Caractensticas del cultivo de MJM5123

Medio de agar

Nonomuraea sp. MJM5123

Crecimiento / color inverso / micelio aereo / esporulacion

Extracto de malta-levadura (ISP2)

++/beige/-/-

Harina de avena (ISP3)

+/beige/++/++

Sales-almidon (ISP4)

+/beige/-/-

ISP5

+/beige/-/-

ISP6

+/beige/-/-

Tirosina (ISP7)

+/beige/-/-

El crecimiento y la esporulacion del micelio aereo se puntuaron como: ++, bueno; +, moderado; ±, malo; -, sin crecimiento ni formacion de esporas

La cepa crecio bien sobre medio ISP2 y mostro crecimiento moderado sobre los otros medios. El color del micelio vegetativo y del micelio aereo fue beige sin pigmento difusible. Se formaron esporas de color blanco solamente en el medio de harina de avena (ISP3) y la micrograffa de barrido electronico mostro cadenas en forma de espiral de esporas rugosas en el micelio aereo.

Para ensayar los pigmentos melanoides, se utilizo agar de hierro y extracto de lavadura con peptona (ISP6) y agar de tirosina (ISP7, con o sin tirosina). Se determinaron el intervalo de temperatura, la tolerancia al NaCl y el intervalo de pH para el crecimiento sobre medio ISP3 y se llevo a cabo el ensayo de resistencia a antibioticos sobre medio ISP2 durante 2 semanas a 28 °C.

5

Tabla 3

[Tabla 3]

Caracteristicas fisiologicas de Nonomuraea sp. MJM5123

Crecimiento en NaCl (%)

0

+ +

1

+ +

2

+

3

+ +

4

-

Crecimiento a la temperatura (°C)

15

-

20

+

25

+

28

+ +

37

+ +

45

-

Crecimiento a pH

5

+ +

6

+ +

6,8

+ +

7,2

+ +

9

+ +

Pigmento melanina

Con tirosina

-

Sin tirosina

-

Las caracteristicas se puntuaron como (++), positivo; (+), moderado; (-), negativo

10 MJM5123 asimilo la tirosina como fuente nutriente sin producir melanina, y la cepa fue capaz de crecer a pH 5,0-9,0

y 0-3,0 % de NaCl y mostro un buen crecimiento a 20°C-37°C. MJM5123 fue susceptible a apramicina, kanamicina, vancomicina y tioestrepton, pero resistente a ampicilina.

Tabla 4 15

__________________________[Tabla 4]__________________

Crecimiento en presencia de antibioticos (50 pg/ml)__________

Resistencia a antibioticos (pg/ml)_________________________

Apramicina (50) -______________________________________

Kanamicina (50) -_____________________________________

Ampicilina (50) +______________________________________

Vancomicina (50) -____________________________________

Tioestrepton (50) -_____________________________________

Las caracteristicas se puntuaron como (+), positivo; (-), negativo

Se uso el medio de agar ISP9 como medio basal para examinar la utilizacion de hidratos de carbono como unicas fuentes de carbono. Se esterilizaron las soluciones madre (10 % p/v) de hidratos de carbono (Sigma Aldrich, CAR10) 20 mediante filtracion y se anadieron a medio ISP9 autoclavado a una concentracion final del 1,0 %. MJM5123 utilizo hexosas, pentosa, alcoholes azucarados y disacaridos (Tabla 5).

Tabla 5

25 ________________________________[Tabla 5]

Utilizacion de hidratos de carbono

Utilizacion de:

MJM5123

Glucosa

+ +

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Utilizacion de hidratos de carbono

Arabinosa

+ +

Sacarosa

+ +

Xilosa

+ +

Inositol

+

Manitol

+ +

Fructosa

+ +

Ramnosa

+ +

Rafinosa

+

Las caractensticas se puntuaron como (++), positivo; (+), moderado; (-), negativo

Determinacion de los caracteres quimiotaxonomicos

Para la caracterizacion quimiotaxonomica de los componentes de la pared celular, se preparo micelio criodesecado por crecimiento en caldo de soja tripticasa (TSB) en un agitador rotatorio durante 7 dfas a 28 °C. Se determinaron los esteroisomeros del acido diaminopicomelico (DAP) y glicina [Becker, B.; Lechevalier, M. P.; Gordon, R. E.; Lechevalier, H.A. Rapid differentiation between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole-cell hydrolysates. Appl Microbiol 1964, 12, 421-423]. Se precintaron 5 mg de celulas secas en una ampolla pequena junto con 1 ml de acido clorlmdrico 6 N. La ampolla se almaceno durante la noche a 100 °C en un horno. El hidrolizado enfriado por aire se filtro a traves de un papel de filtro Whatman n.° 1. El filtrado se concentro hasta sequedad y se disolvio en 0,3 ml de agua destilada. 2 pl de la solucion se inmunotransfirieron a una placa de TLC (Merck, placa de vidrio TLC de Celulosa F n.° 105718) y se revelaron con el sistema disolvente metanol:agua destilada:HCl 6 N:piridina (80:26:4:10, vol/vol) durante 4 horas. Tras el secado al aire, se pulverizo solucion de ninhidrina al 0,2 % (en acetona) y se calento a 100 °C durante 3 min para revelar las transferencias. 1 pl de D,L-DAP 0,1 M (Sigma Aldrich, N.° D-1377) y 1 pl de glicina 0,1 M (Sigma Aldrich, N.° 50046) se utilizaron como patrones autenticos. Las transferencias de glicina y de D,L-DAP se visualizaron de color gris-verde.

Se llevo a cabo el analisis de sacaridos con el metodo de Lechevalier levemente modificado. 50 mg de celulas secas se sometieron a ebullicion durante 2 horas en una ampolla precintada con 2,0 ml de acido sulfurico 1 N. El hidrolizado enfriado se transfirio a un tubo de centnfuga conico de 50 ml y se ajusto el pH a 5,4 mediante hidroxido de bario saturado. Tras la centrifugacion, el sobrenadante se concentro a 0,3 ml y se eliminaron las partfculas no resueltas mediante centrifugacion. Se cargo 1 pl de la solucion sobre una placa TLC (Merck, placa de vidrio TLC Cellulose F n.° 105718). El primer patron de sacaridos (Sigma Aldrich, car10) que contema xilosa, arabinosa, galactosa; y el segundo (Sigma Aldrich, CAR10) que contema ramnosa, ribosa, manosa, glucosa, se aplicaron cada uno a una concentracion de 1 % con el sistema disolvente n-butanol:agua destilada:piridina:tolueno (10:6:6:1, vol/vol) durante 4 horas. Tras pulverizar solucion de ftalato de anilina, (3,25 g de hidrogenoftalato de anilina (TCI-GR, N.° P0284) disueltos en 100 ml de butanol saturado en agua) la placa de TLC se calento a 100 °C durante 4 min. La glicina y D,L-DAP eran constituyentes del peptidoglicano de MJM5123 y los azucares principales en los hidrolizados de celulas completa fueron xilosa, galactosa, manosa, glucosas (Figura 4).

Se extrajeron los lfpidos polares y las menaquinonas mediante el metodo de Minnikin et al. [Minnikin, D. E.; O'Donnella, A. G.; Goodfellowb, M.; Aldersonb, G.; Athalyeb, M.; Schaala, A.; Parlett, J. H. An integrated procedure for the extraction of bacterial isoprenoid quinones and polar lipids. J Microbiol Methods 1984, 2, 233-241]. 2 ml de metanol:agua destilada (100:10, vol/vol) y 2 ml de eter de petroleo se anadieron a 50 mg de celulas secas y se mezclaron durante 15 min. La capa superior se transfirio a un nuevo vial. Se anadio 1 ml de eter de petroleo a la capa inferior y se mezclo. Las capas superiores combinadas se evaporaron con nitrogeno gaseoso a temperatura ambiente y el residuo se uso para el analisis de menaquinonas. Los lfpidos polares se extrajeron de la capa inferior. La capa inferior se calento en un bano de agua en ebullicion durante 5 min. Despues se enfrio a 37 °C, se anadieron 2,3 ml de cloroformo:metanol:agua (90:100:30 vol/vol) y se mezclo durante 60 min. Tras la centrifugacion, el sobrenadante se transfirio a un nuevo tubo. La capa inferior se extrajo mezclandola con 0,75 ml de una solucion de cloroformo:metanol:agua (50:100:40, vol/vol) durante 5 min y el sobrenadante separado se combino con el tubo anterior. Esta etapa se repitio una vez mas. El sobrenadante recogido se mezclo intensamente con 1,3 ml de cloroformo y 1,3 ml de una solucion de cloruro de sodio al 0,3 %. Tras repartir mediante centrifugacion, se descarto la capa superior y se seco la capa inferior bajo atmosfera de nitrogeno a temperatura ambiente. El extracto de lfpidos polares se disolvio en 60 pl de cloroformo:metanol (2,1, vol/vol), y 10 pl de solucion se transfirieron a una placa TLC (Merck, placa de vidrio TLC con gel de sflice 60 F254 n.° 105729) y se identifico segun un metodo TLC bidimensional utilizando cloroformo:metanol:agua destilada (65:25:4, vol/vol) y cloroformo:acido acetico:metanol:agua destilada (40:7.5:6:2, vol/vol) como disolventes de revelado. Se visualizaron los lfpidos polares mediante pulverizacion con cuatro reactivos, solucion de acido fosfomolfbdico al 5 % (Sigma Aldrich, P4869), solucion de ninhidrina al 0,2 % en butanol saturado con agua (Sigma Aldrich, N4876), acido a-naftol sulfurico y azul de molibdeno (Sigma Aldrich, M1942).

El analisis de los lfpidos polares revelo que el lfpido polar de MJM5123 comprendfa fosfatidiletanolamina (PE), difosfatidilglicerol (DPG), fosfatidil-monometiletanolamina (PME), fosfatidilinositol manosido (PIM), un fosfolfpido

5

10

15

20

25

30

35

40

desconocido (PL) y un Ifpido polar desconocido (L) (Figura 5).

Se analizaron los acidos grasos celulares utilizando el sistema de identificacion microbiano (MIDI, version 4.5) combinado con cromatograffa de gases y se identifico con la base de datos ACTIN6. El principal acido graso celular fue iso-C16:0 (25,5 %); se detectaron tambien otros acidos grasos diversos (Tabla 6).

Tabla 6

[Tabla 6]

La composicion de acidos grasos de MJM5123

Acido graso

MJM 5123 (%)

16:0 ISO

25,5

17:1 CIS 9

10,5

15:00

10,1

16:00

9,6

15:0 ISO

9,3

16:1 CIS 9

4,3

17:0 10 METILO

3,9

17:00

3,0

16:0 ISO 2OH

2,9

16:1 ISO G

2,6

14:00

2,4

14:0 ISO

2,2

16:0 10 METILO

1,6

17:0 ANTEISO

1,6

17:0 ISO

1,4

15:0 ANTEISO

1,2

Los valores son porcentajes de los acidos grasos celulares totales. No se muestran las cantidades traza menores de 1,0%

Analisis filogenetico

Se amplifico el ADNr de 16S procedente del ADN genomico de MJM5123 con una pareja de cebadores de 27f (5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3', SEQ. ID. NO: 1) y 1492r (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3', SEQ. ID. NO: 2). Se secuencio el ADN amplificado utilizando los mismos cebadores que anteriormente en un secuenciador de ADN capilar ABI 3730XL (Applied Biosystems, EE.UU.). La comparacion asistida por ordenador del ADNr de 16S se llevo a cabo utilizando el NCBI BLAST disponible en http: /
www.nc-bi-nlm-nih.gov/.

Se construyo un arbol filogenetico mediante un metodo de reunion de vecinos utilizando el programa informatico MEGA4.0. Se genero el soporte de las ramas del arbol filogenetico mediante un arranque de 1.000 replicaciones.

De acuerdo con la busqueda BLAST, la secuencia del ADNr de 16S mostro un 98 % de similitud con Nonomuraea rubra DSM 43768T, Nonomuraea roseola DSM 43767T y un 97 % de similitud con Nonomuraea dietziae DSM 44320T. El analisis filogenetico revelo que MJM5123 perteneda a la familia Nonomuraea, pero se localizo en un subclado diferente de las cepas relacionadas estrechamente.

Se obtuvieron las distancias (usando las opciones de distancia de acuerdo con el modelo Kimura-2) y se llevo a cabo el agrupamiento, utilizando el metodo de reunion de vecinos, usando el paquete informatico MEGA version 4.0. Los valores de arranque, basados en 1.000 replicaciones, se relacionan como porcentajes en el punto de ramificacion. La barra indica 0,002 sustituciones por nucleotido (Figura 6).

Relacion del ADN con cepas estrechamente relacionadas

Se evaluo la relacion ADN-ADN con cepas estrechamente relacionadas mediante el analisis fluorometrico utilizando el metodo de hibridacion en microplacas. Los valores de la relacion ADN-ADN fueron 34-65 % indicando que MJM5123 representaba una especie genomica separada (Tabla 7).

Tabla 7

[Tabla 7] Hibridacion DNA-DNA

Taxon

MJM5123 (%)

MJM5123

100

5

10

15

20

25

Taxon

MJM5123 (%)

N. dietziae DSM 44320T

65

N. roseola DSM 43767T

65

N. rubra DSM 43768T

34

Los presentes inventores han depositado la Nonomuraea sp. MJM5123 en la Korean Collection for Type Cultures (KCTC) del Korea Research Institute of Biotechnology and Bioscience (KRIBB) el 3 de abril de 2012 (n.° de acceso: KCTC 12178BP).

Ejemplo 4: Optimizacion del proceso de fermentacion

Para mejorar la productividad de los peptidos anti-TB, se desarrollo un proceso de fermentacion y un medio economico. La cepa MJM5123 puede utilizar una variedad de fuentes de carbono y nitrogeno tales como glucosa, fructosa, maltosa, galactosa, xilosa, sacarosa, glicerol, aceite de soja, almidon, dextrina, aminoacidos, extracto de levaduras, casema pancreatica digerida, extracto de carne, peptona, extracto de malta, harina de avena, harina de soja, harina de soja digerida enzimaticamente, harina de semillas de algodon, lfquido de maceracion de mafz, sales inorganicas y similares. MJM5123 crecio en un amplio intervalo de temperaturas y pH (entre 20°C y 40°C, pH 5,09,0). Es por tanto ventajoso ajustar el pH del medio inicial a 7,2 antes de la inoculacion. El crecimiento y tftulo mas eficaces se consiguieron cuando la temperatura de la fermentacion se mantuvo a 34 °C. Se desarrollaron un procedimiento de fermentacion en tres etapas y los medios para cada etapa para conseguir una produccion economica y facil de procesar posteriormente, de la siguiente forma;

Tabla 8

[Tabla 81 Medio de activacion (AM)

Ingrediente

Cantidad (%)

Almidon soluble

2,000

Extracto de levadura

0,500

Extracto de carne

0,300

Triptona

0,500

CaCO3

0,200

CoCl2

0,0001

MgSO4-7H2O

0,050

NE-302

0,05

Tabla 9

[Tabla 91

Medio de cultivo iniciador (SC)

Ingrediente

Cantidad (%)

Glucosa

1,000 %

Dextrina

3,000 %

Soytone

1,000 %

Harina de semillas de mafz

O cn 0 0 sp 0s

Extracto de levadura

0,500 %

K2HPO4

0,100 %

CaCO3

0,400 %

MgSO4-7H2O

0,086 %

CaCl2

0,010 %

(NH4)2SO4

0,100 %

Aceite de soja

0,080 %

NE-302

0,050 %

Tabla 10

[Tabla 101

Medio de fermentacion principal (MF)

Ingrediente

Cantidad (%)

Glucosa

2,000 %

Almidon soluble

6,000 %

Licor de mafz fermentado

1,600 %

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Medio de fermentacion principal (MF)

Harina de semillas de mafz

0,600 %

Extracto de levadura

0,800 %

Soytone

1,250 %

CaCO3

0,300 %

K2HPO4

0,100 %

MgSO4-7H2O

0,086 %

CaCl2

0,010 %

FeSO47H2O

0,001 %

L-Valina

0,050 %

NE-302

0,050 %

Para un procesamiento rutinario y reproducible, los micelios vegetativos congelados (FVM) se prepararon de la siguiente forma; Se inoculo un unico micelio en crecimiento sobre medio ISP 3 durante 7 dfas a 28 °C en un matraz con pantallas deflectoras de 500 ml que contema 70 ml de medio SC y se incubo a 34 °C con una velocidad de agitacion de 200 rpm durante 3 dfas. El caldo de cultivo completo se mezclo intensamente con glicerol al 50 % y la mezcla de micelios vegetativos-glicerol se almaceno a -80 °C hasta el uso.

El FVM a un 10 % en v/v se uso para iniciar el cultivo de activacion. La etapa de activacion se llevo a cabo a 34 °C con una velocidad de agitacion de 200 rpm durante 54 horas. A lo largo de esta etapa de activacion, el volumen del micelio empaquetado (PMV) fue del 15 % y el pH estaba a 7,58. El caldo de cultivo vegetativo activo inicial se uso para sembrar el cultivo a un 10% v/v. El segundo cultivo iniciador se mantuvo a 34 °C con una velocidad de agitacion de 200 rpm durante 60 horas. El PMV y el pH fueron 43 %, 7,48, respectivamente. El caldo de cultivo iniciador se transfirio al medio de fermentacion principal a un 10 % en v/v. La fermentacion principal se llevo a cabo a 34 °C con una velocidad de agitacion de 600 rpm y 0,3 vvm durante 144 horas. El PMV final fue del 80 % a pH de 8,20 y el azucar total fue inferior al 1,8 %. El proceso de fermentacion dio como resultado 373 mg/l de H-14 (Figura 7).

Ejemplo 5: Aislamiento de novedosos peptidos anti-TB, H-14 y H-16, derivados de Nonomuraea sp. MJM5123 Ejemplo de aislamiento 1:

La cepa MJM5123, una de las 20 cepas de actinomicetos priorizadas, se fermento a gran escala y sus fracciones activas se aislaron en el ejemplo 1 con el metodo descrito a continuacion.

El extracto metanolico micelial a gran escala de la cepa E5123 se sometio a procesos de fraccionamiento qmmico, en paralelo con la caracterizacion biologica usando la toxicidad celular de celulas MABA, LORA y Vero para realizar un seguimiento la actividad y el mdice de selectividad. El fraccionamiento y el aislamiento de los componentes activos implicaron tres etapas de separacion cromatografica. La cromatograffa ffquida al vacfo (VLC) del extracto (128,7 g) sobre gel de sflice en fase invertida usando un gradiente de agua/metanol en etapas del 20% dio como resultado siete fracciones qmmicamente distintas VC-1 a 7. Se observaron MIC de < 0,76, 0,74 pg/ml para fracciones de VC-6 y 7 eluyendo con metanol al 100% y cloroformo al 100%, respectivamente. vC-6 y 7 se recombinaron (8,47 g) y se separaron adicionalmente en 81 fracciones en una columna Sephadex LH-20 abierta con metanol al 100% como eluyente, dando como resultado un panel de 11 fracciones recombinadas, S-1 a 11 (mediante TLC). Los MIC fueron < 0,21 pg/ml para las subfracciones S-2 y S-3. S-3 (374 mg) se separo en 110 fracciones mediante cromatograffa a alta velocidad en contracorriente (HSCCC) seleccionandose HEMWat+2 como el sistema disolvente mas adecuado mediante el metodo GUESS [Kubo, I. Recent applications of counter-current chromatography to the isolation of bioactive natural products. J Chrom 1991, 538, 187-191]. Estas fracciones se recombinaron en un panel de 11 fracciones de H'-1 a H'-11. Los MIC fueron <0,391 pg/ml para las subfracciones H- 4, H-6, H-8, y H-9. S-2 (177 mg) se separo adicionalmente en 140 fracciones mediante HSCCC con HEMWat+2, y se recombino en un panel de 26 fracciones, H-1 a H-24. Los MIC fueron < 0,51 pg/ml para H-3, H-5, H-7, H-9 a H- 23. Entre las fracciones de peptidos activos, H-14 y H-16 (8 mg, rendimiento = 0,4 mg/l) fueron las mas puras segun el analisis de RMN 1H y, por tanto, se seleccionaron para elucidacion estructural. Tras recombinar H-11 a H-15 y H'- 6 a H'-8 de acuerdo con la similitud de sus espectros de RMN 1H, se obtuvieron 189 mg de H-14 (aprox. 80 % puro) (rendimiento = 9,45 mg/l). La cantidad total de peptidos activos es aproximadamente de 369 mg, rendimiento = 18 mg/l.

Ejemplo de aislamiento 2:

Los compuestos anti-TB producidos por fermentacion de MJM5123 se retienen principalmente en el interior de la celula. Los compuestos anti-B se extrajeron de la torta micelial; esta ultima se recogio del procedimiento de fermentacion, como se ha descrito anteriormente, mediante filtracion del caldo de fermentacion completo. La extraccion de la torta micelial fue mas eficaz con metanol, pero se pueden emplear otros disolventes organicos tales como etanol, n-propanol, isopropanol, acetonitrilo, acetona, diclorometano, acetato de etilo, cloroformo, y similares.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Los compuestos activos contra la tuberculosis brutos se recuperaron de la solucion de extraccion mediante un proceso rutinario que incluye la evaporacion del extracto en un volumen adecuado y el reparto disolvente-disolvente.

El extracto de metanol se concentro al vado a 37 °C y se anadio agua desionizada a la solucion concentrada para conseguir metanol al 70 %. La mezcla de agua se desgraso por reparto con n-hexano y la solucion desgrasada se diluyo con un volumen de agua desionizada. Esta se extrajo con un volumen de cloroformo y la capa de cloroformo que contema los compuestos activos contra la tuberculosis se limpio mediante agitacion con agua desionizada. El secado de la capa de cloroformo proporciono un solido de color amarillento que se disolvio a continuacion en metanol al 100 % y se aplico a Sephadex™ LH-20 equilibrada con metanol al 100 %. Los compuestos activos contra la tuberculosis se combinaron mediante cromatograffa de exclusion por tamano con una elucion de metanol al 100%. H-14 y H-16, que demostraron una potente actividad anti-TB, se purificaron completamente mediante cromatograffa lfquida de alto rendimiento utilizando una columna C-18 en fase invertida y una solucion acuosa de acetonitrilo al 35 % tamponada con fosfato de sodio 20 mM (pH 8,0) como fase movil. Las fracciones purificadas se evaporaron para eliminar el acetonitrilo y extraerse con cloroformo. Finalmente, las capas de cloroformo se concentraron hasta sequedad, y las H-14 y H-16 muy purificadas se sometieron a estudio adicional que inclrna la determinacion de la estructura y la actividad contra la tuberculosis in vitro.

Ejemplo 6: Elucidacion de la estructura de los peptidos H-14 ciclicos anti-TB

H-14 es un metabolito de Nonomuraea sp. MJM5123 que se obtiene mediante extraccion de MeOH de los micelios.

' 1 113

La formula molecular de H-14 es Cs3 H134O17N14 tal como se determina mediante RMN H, C y datos de espectrometna de masas de alta resolucion.

Se aislo H-14 como un polvo de color amarillo claro opticamente activo. El espectro de masas de alta resolucion mostro un pico del ion positivo [M+H]+ a 1600,0189 m/z, y un pico del ion positivo [M+Na]+ a 1621,9982 m/z, indicando una masa exacta de 1599,0111. El espectro IR sugiere la presencia de multiples restos amida (1632,16 cm-1). El espectro UV sugiere que H-14 es un peptido con restos aromaticos, con bandas de absorcion a 211 nm (= 54209 M'W1, 48, 25°C, en metanol), 219 nm (= 55266 M'W'1, 48, 25°C, en metanol), 263 nm (= 7925 M'W'1, 48, 25°C, en metanol), 281 nm (= 6465 M'1cm'1, 48, 25°C, en metanol), y 291 nm (= 5839 M'1cm'1, 48, 25°C, en metanol). El espectro CD sugiere que H-14 es un peptido de estructura en lamina p antiparalela, con elipticidad molar de 1918530 deg cm2mol-1 a 220 nm (25°C, en acetonitrilo) y 616094 deg cm2mol-1 a 196 nm (25°C, en acetonitrilo).

A pesar del tamano relativamente grande de esta molecula, el espectro de RMN mostro una dispersion de la senal aceptable y ha sido por tanto una fuente valiosa de informacion estructural. El espectro de RMN 1H en metanolC presento 8 senales de proton intercambiables entre 9,20 y 7,72 ppm que se desvanecieron tras el intercambio en metanol completamente deuterado. Ademas, aparecieron senales en la region aromatica que codificaban un grupo fenilo y otro sistema aromatico, y se encontraron dobletes a 0,73 a 1,33 ppm que correspondfan a 20 grupos metilo alifaticos. De forma sorprendente para el caso de un peptido, aparecieron siete singletes a 2,16, 2,31, 3,14, 3,23, 3,26, 3,33, y 3,82 ppm indicando 8 grupos N-metilo y/o metoxi, debido a que un singlete a 2,31 ppm esta integrado por 2 grupos metilo. La distribucion de senales con dobletes en la region protonica de la amida y senales que cubren el intervalo completo entre 5,4 y 0,7 ppm es una indicacion clara de que el compuesto investigado es indudablemente un peptido.

La evidencia espectroscopica adicional que respalda la clasificacion del compuesto como un peptido se derivo del espectro de RMN 13C, que revelo un total de 12 senales carbonilo (amida-) en el intervalo entre 170,92 y 175,14 ppm, que corresponde a 13 carbonos carbonilo. Utilizando los experimentos de DEPT135 y HSQC, se identificaron 34 senales metino, 3 metileno, y 28 metilo. Estas senales, junto con 5 senales de carbono cuaternario a 155,23, 142,68, 140,04, 118,36, y 112,47 ppm indicaron un total de 83 carbonos presentes en H-14.

El analisis extenso de los espectro 2D de RMN de H-14, especialmente los basados en los experimentos COSY, TOCSY, HSQC, HMBC y en los experimentos de HMBC semiselectivos dio como resultado la elucidacion de 15 sistemas de espines discretos1H, 1H:: N,N-Me2-Val, Val1, N-Me-L-allo-Ile, L-Thr, N-Me-L-Thr, L-Val2, N-Me-L-Leu, L- Val3, N-Me-L-Val, N-Me-4-OMe-L-Trp a, N-Me-4-OMe-L-Trp b, L-Val4, R-p-OH-L-Phe a, R-p-OH-L-Phe b and L-Val5. En la Tabla 11 se proporciona la asignacion H y C detallada. Las senales de C y H de los grupos metilo de los extremos se encuentran en regiones densamente pobladas. Los espectros de RMN 13C presentaron 14 senales de carbono que representaban 14 carbonos en un intervalo de 0,94 ppm entre 19,10 ppm y 20,04 ppm, y los espectros de RMN 1H presentaron 17 senales de protones que representaban 47 protones en un intervalo de 0,14 ppm entre 0,85 ppm y 1,09 ppm. La resolucion de los experimentos de HSQC y HMBC no es suficientemente alta para establecer una conectividad entre estas senales, de tal manera que los inventores introdujeron el experimento de HMBC semiselectivo, con rendimientos de alta resolucion en la dimension 13C indirecta suprimiendo las modulaciones de acoplamiento de protones homonucleares. La conectividad H-C directa se desarrollo usando correlacione de enlace simple 13C-1H extrafdas de un experimento de HMBC semiselectivo. Se observaron dichas correlaciones con una constante de acoplamiento de alrededor de 126 Hz a lo largo de la direccion F2. Los grupos metilo estaban conectados a sus sistemas de espines utilizando respectivamente correlaciones a larga distancia de 1H, 13C entre las senales de protones del metilo y normalmente senales de p-carbono, y las senales de carbono del

5

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50

55

metilo y normalmente senales de p-protones, ex^dos de un experimento de HMBC semiselectivo.

Se establecio la conectividad dentro de las unidades de N-Me-4-OMe-L-Trp y R-p-OH-L-Phe utilizando correlaciones

113 1 J '

a larga distancia de H, C extrafdas del experimento de HMBC. Dichas correlaciones de HMBC se observaron para N-Me-4-OMe-L-Trp H4 N-Me-4-OMe-L-Trp Cp, R-p-OH-L-Phe H2'/R-p-OH-L-Phe Cp, y R-p-OH-L-Phe H5'/R-p-OH-L-

Phe Cp.

Se determino tambien la posicion del grupo metoxi de N-Me-4-OMe-L-Trp analizando las correlaciones de HMBC. Se observaron correlaciones de HMBC para N-Me-4-OMe-L-Trp H12 / N-Me-4-OMe-L-Trp C10, N-Me-4-OMe-L-Trp H8 / N-Me4-OMe-L-Trp C6, N-Me-4-OMe-L-Trp H7 / N-Me-4-OMe-L-Trp C11, N-Me-4-OMe-L-Trp H9/ N-Me-4-OMe-L-Trp C11.

Se determinaron las posiciones de los grupos N-metilo analizando las correlaciones de HMBC. Se observaron las correlaciones de (i, i) HNMe, Ca y/o (i, i-1) HNMe, CC=O, se observaron correlaciones HMBC para N,N-Me2-Val H6(7)/ N,N-Me2-Val Ca, N-Me-L-allo-Ile H7/Val1 CC=O N-Me-L-allo-Ile H7 / N-Me-L-allo-Ile Ca, N-Me-L-Thr H5/ L-Thr CC=O, N- Me-L-Thr H5 / N-Me-L-Thr Ca, N-Me-L-Leu H7/ L-Val2 CC=O, N-Me-L-Leu H7 / N-Me-L-Leu Ca, N-Me-L-Val H6/ L-Val3

CC=O, N-Me-L-Val H6 / N-Me-L-Val Ca, N-Me4-OMe-L-Trp H13 / N-Me-L-Val CC=O, N-Me-4-OMe-L-Trp H13 / N-Me-4- OMe-L-Trp Ca.

La mayona de los restos aminoacidos individuales se enlazaron con posterioridad secuencialmente mediante correlaciones a larga distancia de 1H, 13C, excepto las unidades N,N-Me2-Val and / N-Me-L-Leu. Para cada resto aminoacido se observaron dos correlaciones entre Ha, CC=O, (i, i) Ha, C C=O e (i, i-1) Ha, CC=O, que determinan junto la conectividad de union al peptido; mientras que solo se observo una correlacion entre Hp, CC=O, que determina el grupo carbonilo del resto. De nuevo se empleo un experimento de HMBC semiselectivo, debido a que los experimentos de HMBC no pueden resolver la region carbonilo densamente poblada con senales 13 13C presentadas en un intervalo de 4,23 ppm entre 170,91 ppm a 175,14 ppm. Se observaron correlaciones para N,N- Me2-Val Ha / N,N-Me2-Val CC=O N,N-Me2-Val Hp / N,N-Me2Val CC=O, Val1 Hal Val1 CC=O, Val1 Hpl Val1 CC=O, N-Me-L- allo-Ile Ha / N-Me-L-allo-Ile CC=O, N-Me-L-allo-Ile Hal Val1 CC=O, N-Me-L-allo-Ile Hp / N-Me-L-allo-Ile CC=O, L-Thr Ha/ L- Thr CC=O, L-Thr Ha / N-Me-L-allo-Ile CC=O, L-Thr Hp/ L-Thr CC=O, N-Me-L-Thr Ha / N-Me-L-Thr CC=O, N-Me-L-Thr Ha / L- Thr CC=O, N-Me-L-Thr Hp / N-Me-L-Thr CC=O, L-Val2 Ha/ L-Val2 CC=O, L-Val2 Ha / N-Me-L-Thr CC=O, L-Val2 Hp/ L-Val2 CC=O, N,N-Me-L-Leu Ha / N-Me-L-Leu CC=O, N-Me-L-Leu Ha/ L-Val2 CC=O, N-Me-L-Leu Hp / N-Me-L-Leu CC=O, L-Val3 Ha/ L-Val3 CC=O, L-Val3 Hp / L-Val3 CC=O, N-Me-L-Val Ha / N-Me-L-Val CC=O, N-Me-L-Val Ha/ L-Val3 CC=O, N-Me-L-Val Hp / N-Me-L-Val CC=O, N-Me-4-OMe-L-Trp Ha / N-Me-4-OMe-L-Trp CC=O, N-Me-4-OMe-L-Trp Ha / N-Me-L-Val CC=O, N- Me-4-OMe-L-Trp Hp / N-Me-4-OMe-L-Trp CC=O, L-Val4 Ha/ L-Val4 CC=O, L-Val4 Ha / N-Me-4-OMe-L-Trp CC=O, L-Val4 Hp/ L-Val4 CC=O, R-p-OH-L-Phe Ha / R-p-OH-L-Phe CC=O, R-p-OH-L-Phe Ha/ L-Val4 CC=O, R-p-OH-L-Phe Hp R-p-OH L-Phe C C=O, L-Val5 Ha/ L-Val5 CC=O, L-Val5 Hal R-p-OH-L-Phe CC=O, L-Val5 Hp/ L-Val5 CC=O. Las senales de 13C de los grupos carbonilo procedentes de NMe2-Val y NMe-L-Leu se solaparon a 173,29 ppm, dejando la conectividad de Val1 Ha and L-Val3 Ha con los grupos carbonilo sin determinar, quedando de esta manera dos posibles estructuras para H-14.

Ademas, se observo una correlacion de HMBC entre L-Thr Hp y L-Val5 CC=O, sugiriendo que H-14 era un depsipeptido dclico ciclado entre el carboxilo del extremo C y la cadena secundaria de un resto de L-Thr.

Estos datos, junto con un peso molecular de 1599,0111 determinado mediante espectrometna de masas de alta resolucion son consistentes con la formula molecular C83H134N14O17.

Sin embargo, la conexion entre N,N-Me2-Val y L-Val1 se confirmo con el analisis del espectro de masas en tandem de H-14 que muestra el fragmento ionico [N,N-Me2-Val + L-Val1 + / N-Me-L-allo-Ile]+ at m/z 354.32.

Los siguientes fragmentos que ayudaron a establecer la secuencia de la molecula se detectaron en el espectro de masas en tandem: m/z (int. rel.) 1600,23 [M+H]+ (8), 1246.95 [M - N,N-Me2-Val-L-Val1 - / N-Me-L-allo-Ile + 2H]+ (48), 990,86 [M-N,N-Me2-Val-L-Val1 - / N-Me-L-allo-Ile - L-Thr - L-Val5 + 2H]+(7), 800,60 [M+2H]2+ (50), 610,41 [N,N-Me2 - Val + L-Val1 + / N-Me-L-allo-Ile + L-Thr+L-Val5]+(36), 354,32 [N,N-Me2-Val + L-Val1 + / N-Me-L-allo-Ile]+ (87).

Tabla 11

[Tabla 11]

Datos de RMN de 1H

/ 13C de H-14 en CD3OD

Aminoacido

1H J (Hz) 13C Aminoacido 1H J (Hz) 13C

N,N-Me 2-Val

1 173,29 L-Val3 1 173,39

2 2,67 (d, 9,2) 75,62 2 4,59 (d, 8,9) 55,34

3 2,04 (ddd, 9,2, 6,6, 6,6) 28,83 3 2,03 (ddd, 8,9, 6,6, 6,8) 32,88

4 2,31 (s) 42,24 4 0,92 (d, 6,6)

Datos de RMN de 1H

/ 13C de H-14 en CD3OD

Aminoacido

1H J (Hz) 13C Aminoacido 1H J (Hz) 13C

5 2,31 (s) 42,24 5 0,86 (d, 6,8)

6 0,85 (d, 6,6) 19,36 NH 9,07 (d, 9,5)b

7 0,98 (d, 6,6) 20,04

L-VaI1

1 174,93 N-Me-L-Va 1 1 170,91

2 4,67 (d, 8,8) 55,78 2 3,07 (d, 7,6) 71,37

3 2,10 (ddd, 8.8, 6,8,6,7) 31,65 3 2,58 (ddd, 7,6, 6,5, 6,8) 30,3

4 0,99 (d, 6,8) 19,61 4 0,98 (d, 6,8)

5 1,06 (d, 6,7) 19,36 5 1,09 (d, 6,5) 22,04

NH 8,17 (d, 8,2)b 6 3,14 (s) 40,5

N-Me-L -allo- IIe

1 172,62 N-Me-4-0 MeL-Trp 1 171,62

2 4,92 (d, 11,2) 59,24 2 4,10 (dd, 11,2, 4,7) 71,09

3 1,95 (dddd, 11,2, 0,5, 2,9, 6,6) 34,32 3 3,54 (dd, 11,2, - 13,7) 26,79

4 0,99 (ddd, 0.5, -12,2,7,3) 26,61 3,69 (dd, 4,7, -13,7)

1,26 (ddd, 2.9, -12,2,7,6) 4 112,5

5 0,75 (dd, 7,3, 7,6) 11,48 5 6,69 (d, 2,0, 0,5) 124,1

6 0,74 (d, 6,6) 15,09 NH 10,22 (d, 2,0)

7 3,23 (s) 31,40 6 140

7 6,92 (d, 0,5, 0,7,8,2) 106,12

8 6,98 (dd, 8,2, 7,8) 123,39

9 6,44 (d, 0,7, 7,8) 99,89

10 155,2

11 118,4

12 3,83 (s) 55,62

13 2,16 (s) 40,98

L-Thr

1 171,95 L-VaI4 1 174,14

2 5,17 (d, 2,3) 53,57 2 4,53 (d, 7,9) 59,29

3 5,78 (dd, 2,3, 6,5) 69,84 3 2,20 (ddd, 7,9, 6,7, 6,8) 33,73

4 1,31 (d, 6,5) 16,76 4 1,03 (d, 6,7)

NH 8,50 (d, 9,1)b 5 0,99 (d, 6,8)

NH 7,85 (d, 9,6)b

N-Me-L -Thr

1 171,21 R-6-OH-L-Phe 1 173,76

2 5,02 (d, 3,7) 62,90 2 4,85 (d, 1,9) 59,78

3 4,46 (dd, 3,7, 6,5) 66,90 3 5,34 (d, 1,9) 72,96

4 0,91 (d, 6,5) 19,91 4 142,8

5 3,33 (s) 34,32 5, 9 7,26a 127,17

6, 8, 7,24a 129,39

7 NH 7.20a 8,30 (d, 7,8)b 128,28

L-Val2

1 174,75 L-Val5 1 175,14

2 4,84 (d, 8,9) 56,78 2 4,40 (d, 8,9) 59,22

3 2,35 (ddd, 8,9, 6,7, 7,0) 31,78 3 1,97 (m, 8,9, 6,8,6,4) 33,19

4 1,09 (d, 6,7) 19,64 4 0,92 (d, 6,4) 19,10

5 0,98 (d, 7,0) 19,70 5 0,93 (d, 6,8) 19,44

NH 7,73 (d, 8,6)b NH 9,02 (d, 9,9)b

N-Me-L -Leu

1 173,28

2 5,11 (dd, 6,2, 8,4) 55,59

3 1,24 (ddd, 8.4, -13,3,5,8) 39,33

1,45 (ddd, 6,2, -13,3, 8,2)

Datos de RMN de 1H

/ 13C de H-14 en CD3OD

Aminoacido

1H J (Hz) 13C Aminoacido 1H J (Hz) 13C

4 0,96 (dddd, 8,2, 5,8, 6,5, 6,6) 25,64

5 0,17 (d, 6,6) 21,69

6 0,33 (d, 6,5) 23,48

7 3,26 (s) 31,63

a La multiplicidad de las senales es incierta debido al solapamiento. b Datos obtenidos del experimento de RMN 1H en metanol-d.

La estructura del H-14 aislado y purificado de MJM5123 (Nonomuraea sp.) se muestra en la formula 1. La figura 11 muestra la disposicion estructural del peptido H-14 dclico.

5 [Formula 1]

imagen2

Cristalizacion y determinacion de la estructura

10

Se obtuvo un cristal en forma de aguja de H-14 en MeOH: MeCN: Agua = (1:1:0,5) usando un metodo de evaporacion lenta durante 57 dfas. Las dimensiones del cristal fueron aproximadamente 0,1 x 0,15 x 0,5 mm. Los datos de rayos X se recogieron a temperatura ambiente en un sistema de rayos X Bruker 08, y el cristal difracto los rayos X a 0,83. El cristal perteneda al grupo espacial ortorrombico P2(1)2(1)2 con parametros de la celdilla unidad, 15 a=71,64, b=11,43, c=12,70. Existe una molecula en la unidad asimetrica (Figura 8 y Tabla 12).

Tabla 12

[Tabla 12] Estadistica de recogida de datos

Longitud de onda de los rayos X (A)

Mo Ka (A = 0,71073 A) (Bruker)

Temperatura (K)

296,15

Grupo espacial

P2-|2-|2

Parametros de la celdilla unitaria (A)

a = 71,64 A

b = 11,43 A

c = 12,70 A

Lfmite de resolucion (A)

0,83

20

El problema de fase se resolvio mediante metodos iterativos directos de espacio doble partiendo de una distribucion aleatoria de atomos con el programa informatico ShelxD. El modelo inicial generado a partir de ShelxD se corrigio de acuerdo con la estructura 2D de H-14 y se anadieron las moleculas de agua segun un mapa de densidad electronica inicial generado con un programa grafico, WinCoot. Finalmente, se obtuvo un modelo refinado reduciendo el factor R 25 a 0,1723 con los programas de refinamiento ShelxL o Refmac. Como se muestra en la Figura 9, la estructura global de H-14 es similar a una estructura antiparalela de tipo horquilla doble. Cinco enlaces H entre los grupos C=O y N-H de la cadena principal estabilizan la estructura global. Ademas, las moleculas de agua circundantes tambien participan en la formacion de enlaces H. A partir de esta estructura de rayos X y el resultado del metodo de Marfey

5

10

15

20

25

30

(no se muestran los datos), los investigadores concluyeron que H-14 consiste en su totalidad de L-aminoacidos o sus analogos. Todos los aminoacidos no convencionales sugeridos por el analisis de RMN tambien se confirmaron mediante examen de la posicion de cada atomo usando el mapa de densidad electronica (Figura 9 y Figura 10).

Ejemplo 7: Elucidacion de la estructura de los peptidos H-16 ciclicos anti-TB

H-16 es otro metabolito de Nonomuraea sp. M5123 que se obtiene del extracto MeOH de los micelios. La formula

' 1 113

molecular de H-16 es C83H134O16N14 tal como se determina mediante RMN H, C y datos de masa de alta resolucion.

H-16 se obtuvo en forma de un polvo amorfo de color amarillo. [El espectro de masas de alta resolucion mostro un pico del ion positivo [M+H]+ a 1584,0227 m/z, y un pico del ion positivo [M+Na]+ a 1606,0035 m/z, indicando una masa exacta de 1583,0149. El espectro de masas de alta resolucion y los datos de RMN 13C fueron consistentes con la formula molecular C83H134N14O16. Los datos de RMN 1H indicaron que H-16 tambien era un peptido. Las asignaciones detalladas de 1H y 13C se proporcionan en la Tabla 13. La identificacion mediante espectroscopia de RMN de H-16 se realizo de forma analoga a la de H-14. En el proceso, los sistemas de espm de los restos de aminoacidos identificaron, de nuevo, mediante interpretacion de los espectros de RMN 2D, incluyendo los espectros COSY, TOCSY, HSQC y HMBC. Los restos de aminoacidos individuales se vincularon secuencialmente sin ambiguedad a traves de correlaciones de HMBC y HMBC semiselectivas. Se observaron ese tipo de correlaciones para N,N-Me2-Val Ha/N,N-Me,-Val CC=O, N,N-Me2-Val Hp/N,N-Me2-Val CC=O, Val1H°/Val1CC=O, Val1H a/N,N-Me2-Val CC=O, Val1Hp/Val1CC=O, N-Me-IleHa/N-Me-Ile CC=O, N-Me-Ile Ha/ Val1 CC=° N-Me-IleH13 / N-Me-Ile CC=O, Thr Ha/Thr

CC=O, Thr Ha / N-Me-Ile CC=O, Thr Hp/Thr CC=O, N-Me-Thr Ha / N-Me-Thr CC=O, N-Me-Thr Ha/Thr CC=O, N-Me-Thr Hp / N-Me-Thr CC=O, Val2 Ha/Val2 CC=O, Val2 Ha / N-Me-Thr CC=O, Val2 Hp/Val2 CC=O, N-Me-Leu Ha / N-Me-Leu CC=O, N-Me- Leu Ha/Val2 CC=O, N-Me-Leu Hp / N-Me-Leu CC=O, Val3 Ha/Val3 CC=O, Val3 Ha / N-Me-Leu CC=O, Val3 Hp/Val3 CC=O, N- Me-Val Ha / N-Me-Val CC=O, N-Me-Val Ha/Val3 CC=O, N-Me-Val Hp / N-Me-Val CC=O, N-Me-4-OMe-Trp Ha / N-Me-4- OMe-Trp CC=O, N-Me-4-OMe-Trp Ha/NMe-Val CC=O, N-Me-4-OMe-Trp Hp / N-Me-4-OMe-Trp CC=O, Val4 Ha/Val4 CC=O, Val4 Ha / N-Me-4-OMe-Trp CC=O, Val4 Hp/Val4 CC=O, Phe Ha/Phe Ct=O, Phe Ha/Val4 CC=O, Phe Hp/ Phe CC=O, Val5

Ha/Val5 CC=O, Val5 Ha/Phe CC=O, Val5 Hp/Val5 CC=O.

Tabla 13

[Tabla 13]

Datos de RMN de 1H y 13C de H-16 en CD3OD

Aminoacido

1H J (Hz) 13C Aminoacido 1H J (Hz) 13C

N,N-Me 2-Val

1 173,35 Val3 1 173,63

2 2,67 (d, 8,8) 75,78 2 4,59 (d, 9,2) 55,59

3 2,07 (m) 28,49 3 2,04 (m) 32,74

4 2,32 (s) 42,40 4 0,97 (d, 6,2) 19,66

5 2,32 (s) 42,40 5 0,87 (d, 6,5) 19,40

6 0,85 (d, 6,6) 19,36

7 0,98 (d, 6,6) 20,12

Val1

1 174,96 N-Me-Val 1 171,09

2 4,66 (d, 8,5) 55,76 2 3,06 (d, 7,4) 71,60

3 2,08 (m) 31,57 3 2,61 (m) 31,57

4 0,99 (d, 6,8) 19,61 4 0,97 (d, 6,2) 19,75

5 1,06 (d, 6,7) 19,36 5 1,10 (d, 6,6) 22,04

6 3,13 (s) 40,51

N-Me-ll e

1 172,86 N-Me-4-O Me-Trp 1 171,57

2 4,94 (d, 11,7) 61,60 2 4,09 (dd, 10,8, 4,1) 71,09

3 1,96 (m) 34,42 3 3,56 (dd, 10,8, 13,5) 22,87

4 1,00 (m) 26,36 3,70 (dd, 4,1, 13,5)

1,25 (m) 4 113,30

5 0,72, (t, 7,7) 19,36 5 6,70 (d, 2,0) 124,90

6 0,75 (d, 5,2) 15,19 NH 10,22 (d, 2,0)

7 3,24 (s) 31,52 6 140,90

7 6,92 (d, 8) 107,00

8 6,98 (dd, 8, 7,8) 124,30

9 6,44 (d, 7,8) 100,80

10 156,00

11 118,90

12 3,82 (s) 55,74

Datos de RMN de 1H y 13C de H-16 en CD3OD

Aminoacido

1H J (Hz) 13C Aminoacido 1H J (Hz) 13C

13 2,16 (s) 41,92

Thr

1 171,92 Val4 1 174,11

2 5,13 (d, 2,5) 53,37 2 4,40 (d, 8,5) 59,17

3 5,76 (dd, 2,5, 6,3) 70,80 3 2,19 (m) 33,62

4 1,32 (d, 6,7) 17,80 4 0,98 (d, 6,5) 19,44

5 1,04 (d, 6,9) 19,96

N-Me-Thr

1 171,42 Phe 1 174,29

2 5,04 (d, 3,6) 63,92 2 4,78 (dd, 2,1, 10,4) 58,25

3 4,44 (m) 67,83 3 3,37 (dd, 2,1, 15,0) 38,20

4 1,10 (d, 6,6) 20,76 2,84 (dd, 10,4, 15,0)

5 3,33 (s) 35,28 4 140,90

5, 9 7,09 (d, 7,0) 131,22

6,8, 7,21 (dd, 7,0, 7,55) 130,47

7 7,15 (d, 7,5) 128,30

Val2

1 174,93 Val5 1 175,45

2 4,82 (d, 9,5) 56,87 2 4,36 (d, 9,2) 59,36

3 2,40 (m) 31,84 3 1,97 (m) 33,62

4 1,09 (d, 6,7) 19,64 4 1,04 (d, 6,9) 19,30

5 0,98 (d, 7,0) 19,70 5 0,98 (d, 6,5) 19,44

N-Me-Leu

1 173,54

2 5,15 (dd, 6,3, 8,4) 56,80

3 1,27 (m) 40,50

1,43 (m)

4 0,97 (m) 26,52

5 0,21 (d, 6,6) 21,96

6 0,32 (d, 6,2) 23,54

7 3,25 (s) 31,63

La estructura de H-16 aislado y purificado a partir de MJM5123 se muestra en la formula 2. La Figura 12 muestra la disposicion estructural del peptido H-14 dclico.

5 [Formula 1]

imagen3

Ejemplo experimental 1: MIC y MBC de H-14 y H-16 contra M. tuberculosis en condiciones aerobias

10 La actividad inhibidora de H-14 y H-16 contra M. tuberculosis se determino usando el ensayo en microplaca con azul alamar [Collins, L. and S.G. Franzblau, Microplate alamar blue assay versus BACTEc 460 system for high- throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium. Antimicrob Agents Chemother, 1997. 41(5): p. 1004-9; Hurdle, J.G., et al., A microbiological assessment of novel Nitrofuranylamides as anti-tuberculosis agents. J Antimicrob Chemother, 2008. 62(5): p. 1037-45]. Los valores de 15 MIC (concentracion inhibitoria minima necesaria para inhibir el crecimiento en un 90 %) y de MBC99 (concentracion

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

minima que destruye el 99 % de los organismos) para H-14 y H-16 se midieron en condiciones aerobias con la cepa de referencia de M. tuberculosis H37Rv se muestran en la Tabla 14.

El MBC99 de cada compuesto es solo aproximadamente dos veces mayor que su MIC, por tanto, H-14 y H-16 debenan clasificarse como bactericidas.

Tabla 14

[Tabla 14]

Valores de MIC y MBC aerobicos contra M. tuberculosis H37Rv

H-14 H-16

MIC (pM)

0,16 0,16

MBC99 (pM)

0,34 0,19

M. tuberculosis es un organismo clonico, que no intercambia informacion genetica de una celula a otra. Durante su evolucion simultanea con los seres humanos, se generaron varios linajes diferentes, o clados, y son prominentes en diferentes partes del planeta [Filliol, I., et al., Global phylogeny of Mycobacterium tuberculosis based on single nucleotide polymorphism (SNP) analysis: insights into tuberculosis evolution, phylogenetic accuracy of other DNA fingerprinting systems, and recommendations for a minimal standard SNP set. J Bacteriol, 2006. 188(2): p. 759-72; Gagneux, S. and P.M. Small, Global phylogeography of Mycobacterium tuberculosis and implications for tuberculosis product development. Lancet Infect Dis, 2007. 7(5): p. 328-37].

La Tabla 15 presenta los valores de MIC de H-14 y H-16 contra seis cepas de M. tuberculosis que representan diversidad geografica/genetica, con la cepa de laboratorio H37Rv como referencia. Los valores de MIC de H-14 y H- 16 contra estas seis cepas son comparables con sus valores de MIC contra la H37Rv natural, lo que sugiere que son muy eficaces.

Tabla 15

[Tabla 15]

Valores de MIC contra aislados clmicos de M. tuberculosis diferentes genetica y g

eograficamente Clados

M. tuberculosis Clado Situacion geografica Codigo de la cepa MIC (pM)

H-14

H-16

MIC (pM) vs.

H37Rv H37Rv 0,38 0,37

Oceano fndico

Africa Oriental, Sudeste Asiatico, Sur de India X003899 0,23 0,19

Asia Oriental

Asia Oriental, Rusia, Sudafrica X004439 0,29 0,19

X004244

0,13 0,09

Euro-americana

Americas, Europa, Norte de Africa, Oriente Medio X005282 0,14 0,14

X005319

0,36 0,34

Africa oriental India

Africa Oriental, Norte de India, Pakistan X001354 0,38 0,37

Ejemplo experimental 2: MBC de H-14 y H-16 contra M. tuberculosis en condiciones de bajo contenido de oxigeno

La actividad bactericida de H-14 y H-16 contra M. tuberculosis no replicante en condiciones de bajo contenido de oxfgeno se determino usando el ensayo de recuperacion en condiciones de bajo contenido de oxfgeno (LORA) [Cho, S.H., et al., Low-oxygen-recovery assay for high-throughput screening of compounds against non-replicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 2007. 51(4): p. 1380-5] con lecturas de ufc. La concentracion que consigue un 99 % de reduccion en la viabilidad de M. tuberculosis tras 10 dfas de incubacion en condiciones sin replica fue de aproximadamente 1,5 pM para ambos H-14 y H-16. Este valor bajo de MBC sugiere que H-14 y H-16 tienen el potencial de reducir la duracion del tratamiento de la tuberculosis inhibiendo una subpoblacion de bacterias persistentes no replicantes.

Ejemplo experimental 3: Selectividades antibacterianas de H-14 y H-16

Las selectividades de H-14 y H-16 se determinaron por cribado de las mismas contra Escherichia coli, una bacteria Gram negativa, Staphylococcus aureus, una bacteria Gram positiva, Candida albicans, una levadura, y seis especies de micobacterias (Tabla 16). Ninguno de los compuestos mostro actividad antimicrobiana con E. coli, S. aureus, y C. albicans. Ambos compuestos son activos contra M. kansasii con valores de MIC inferiores a 0,4 pM, contra M. avium con valores de MIC inferiores a 1,0 pM, contra M. chelonae y M. marinum con valores de MIC inferiores a 2,0 pM, contra M. smegmatis con valores de MIC inferiores a 4,0 pM, pero son significativamente menos activos contra M. abscessus. El resultado sugiere que H-14 y H-16 son compuestos antimicobacterianos selectivos.

Tabla 16

__________________________________________[Tabla 161__________________________________________

Valores de MIC contra otras especies de micobacterias, y prototipos de especies Gram positivas, Gram negativas; y de levadura (datos de la UIC)___________________________________________________________________

MIC (mM) vs.

E. coli S. aureus C. albicans Mycobacterium

S smegmatis

chelonae abscessus kansasii avium marinum

H-14

> 32 > 32 > 32 1,74 0,97 > 63 < 0,24 0,35 0,95

H-16

> 32 > 32 > 32 3,64 1,82 > 32 < 0,12 0,55 0,97

Ejemplo experimental 4: Union a protema y toxicidad contra celulas de mamiferos

5 La union a protemas puede afectar la farmacocinetica de un compuesto, y finalmente afecta a su eficacia reduciendo la cantidad de principio activo no unido. Los valores de MIC de H-14 y H-16 contra M. tuberculosis se determinaron en presencia de albumina de suero de ternera (BSA) al 4 % y sin suplemento adicional de proteina (BSA al 0,4 %) como referencia (Tabla 17). En presencia de FBS al 10% o de BSA al 4%, los valores de MIC solamente aumentaron dos veces, lo que sugiere que la union a protemas no debena afectar negativamente a su eficacia.

10

Tabla 17

[Tabla 171

Efecto de la union a protemas sobre los valores de MIC, medidos con M. tuberculosis H37Rv (Datos de la UIC)

MIC vs. M. tuberculosis (mM)

BSA al 0,5 %

BSA al 4 % FBS al 10%

H-14

0,16 0,58 0,36

15 Las citotoxicidades de H-14 y H-16 frente a celulas de mairnferos se evaluaron por ensayo frente a celulas Vero, una lmea celular de rinon de mono verde africano (Tabla 18). No se descubrio citotoxicidad para ninguno de los compuestos, incluso a las mayores concentraciones de ensayo (32 mM).

Tabla 18

20

[Tabla 181

Toxicidad frente a celulas de mai^eras

Celula Vero CI50 (mM) fndice de selectividad (SI)

H-14

> 32 > 620

H-16

> 32 > 620

Ejemplo experimental 5: Valor de MIC de H-14 y H-16 frente a un panel de cepas de M. tuberculosis resistente a monofarmaco generadas en el laboratorio 25

H-14 and H-16 se sometieron a ensayo frente a un panel de cepas de M. tuberculosis. isogenica para H37Rv. resistentes a rifampina (RMP), isoniazida (INH), moxifloxacina (Mox), estreptomicina (SM), kanamicina (KM), cicloserina (CS), o capreomicina (CAP) respectivamente (Tabla 19). Ambos compuestos mantuvieron su nivel de actividad frente a todas estas cepas de M. tuberculosis resistentes a monofarmaco. lo que sugiere que no existe 30 resistencia cruzada con los farmacos contra la tuberculosis actual y, por tanto, se trata de un novedoso mecanismo de accion que sera igualmente adecuado contra las infecciones por M. tuberculosis sensibles a farmacos y resistentes a farmacos.

35

Tabla 19

__________________________________________[Tabla 191__________________________________________

Valores de MIC contra M. tuberculosis resistente a monofarmaco generada en el laboratorio. Cepas (Datos de la UIC)_________________________________________________________________________________________

MIC (mM) vs.

H37Rv M. tuberculosis cepas resistentes a:

RMP

INH MOX SM KM CS CAP

H-14

0,16 0,19 < 0,12 0,31 < 0,12 < 0,12 < 0,12 0,29

H-16

0,16 0,18 < 0,12 0,3 < 0,12 < 0,12 < 0,12 0,3

En conclusion, tanto H-14 y H-16 tienen perfiles de actividad in vitro anti-TB comparables, si es que no son mejores, que los farmacos de primera lmea contra la tuberculosis sin toxicidad celular in vitro para celulas de mamffero a 100

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

veces su valor MBC. Los valores de MIC contra M. tuberculosis replicante son 0,16 jM, 0,16 jM, 0,09 jM y 0,47 jM para H14, H16, rifampina e isoniazida, respectivamente. Los mdices de selectividad (celulas VERO, CI50/M. tuberculosis. MIC) de H-14 y H-16 son, en ambos casos, >620. Este nivel de actividad se mantiene contra cepas isogenicas de M. tuberculosis resistente a rifampina, isoniazida, estreptomicina, kanamicina, cicloserina y contra el peptido dclico, capreomicina, as^ como para los aislados clmicos representativos de los clados globales. Los valores de MIC contra M. tuberculosis replicante son 0,34 jM y 0,19 jM para H-14 y H-16, respectivamente, indicando que ambos son fuertes agentes bactericidas. Ambos compuestos reducen la viabilidad de la M. tuberculosis no replicante en una log-10 a aproximadamente 1,5 jM en LORA, lo que sugiere el potencial para reducir la duracion del tratamiento contra la TB inhibiendo una subpoblacion de M. tuberculosis persistentes. Por el contrario, no se observo actividad contra S. aureus, E. coli, C. albicans a 31 jM, y la actividad fue inferior contra M. smegmatis, lo que implica que la actividad contra la tuberculosis de ambos peptidos es muy selectiva. Esto sugiere tambien que estos peptidos no se habnan detectado originalmente mediante el cribado con bacterias sustitutas. La union a protemas no debena afectar negativamente a su eficacia, ya que los valores de MIC solamente aumentaron dos veces en presencia de BSA al 4 % o FBS al 10%.

<110> B&C BIOPHARM CO., LTD.

<120> PEPTIDO CfcLICO DERIVADO DE NONOMURAEA SP., PROCESO PARA LA PRODUCCION DEL MISMO, Y COMPOSICION FARMACEUTICA PARA LA PREVENCION O EL TRATAMIENTO DE UNA ENFERMEDAD RELACIONADA CON MICOBACTERIAS QUE COMPRENDE EL MISMO

<150> US 61/476473 <151>

<150> US 61/513403 <151>

<150> US 61/555257 <151>

<150> US 61/607934 <151>

<160>2

<170> KopatentIn 1.71

<210> 1 <211> 20 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador directo, 27f, para la amplificacion de ADNr de 16S a partir de ADN genomico de MJM5123 <400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210>2 <211> 19 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador inverso, 1492r, para la amplificacion de ADNr de 16S a partir de ADN genomico de MJM5123 <400>2

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un peptido dclico de Formula 1 o Formula 2 aislado de una cepa Nonomuraea sp. MJM5123 (N.° de acceso: KCTC 12178BP):

   imagen1

   [Formula 1: H-14]

   N-Me-4-Cine-L-Trp

   R-B-OH-i>Phe

   L-Vals

   N-Me-Ir-Val I N 7 N

   >0° -V °c

   * oi______

   L-Val1

   L-Val* L-Thr 0

   L-Val2

   Yo^-W-V

   L-Val3

   A0 ^

   ji H I I N,N-Me2-

   Val

   OH N-Me- L-allo-Ile

   N-Me-L-Thr

   N-Me- L-Leu

   Formula 2: 11—16]

   N-Me-4-Cone-L-Trp

   Phe

   H I Val

   N-Me-Val i

   Val

   Val4 Thr. 9

   Val* 1 2 I I 2

   V* NH | XT/ 0 0:5inh^YN>T nh>StN

   Val3 I

   N, N-Mo»-Val

   N-Ke-lle

   N-Me-The

   N-Me-Leu
2. 2. La composicion farmaceutica para la prevencion o el tratamiento de enfermedades relacionadas con

   Mycobacterium spp. que comprenden un compuesto de Formula 1 y/o Formula 2 como principio activo.

   imagen2

   [Formula 1: H-14]

   N-Me-4-Cine-L-Trp

   R-li-OH-L-Phe

   L-Vals

   N-Me-L-Val | N 7 N

   >0° -V °c

   * oi______

   L-Val1

   L-Val* L-Thr 0

   L-Val2

   Vo^hVAhV

   L-Val3

   A0

   ji H I I N,N-Me2-

   Vai

   OH N-Me- L-allo-Ile

   N-Me-L-Thr

   N-Me- L-Leu

   Formula 2: 11—16]

   N-Me-4- Cone - L-T rp

   Phe

   H I Val

   N-Me-Val T

   Val

   Val4 Thr. 9

   Val* 1 S I T M

   "Y nh | o °yN'1nh^YN>Y mh^YN

   Val3 I

   N, N-Mo»-Val

   N-Ke-lle

   N-Me-The

   N-Me-Leu
3. 3. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 2, donde la enfermedad relacionada con el Mycobacterium spp. es tuberculosis.

   5
4. 4. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 3, donde la tuberculosis es tuberculosis RMF o tuberculosis XRD.
5. 5. La composicion farmaceutica de acuerdo con una cualquiera de la reivindicacion 2 - reivindicacion 4, donde la 10 composicion comprende ademas uno o mas agentes antimicobacterianos. 6
6. 6. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 4, donde el agente antimicobacteriano se selecciona del grupo que consiste en un agente de tratamiento oral de primera lmea contra la tuberculosis, un

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   agente contra la tuberculosis inyectable, una fluoroquinolona, un agente de tratamiento oral de segunda lmea contra la tuberculosis, otro agente anti-TB, y un compuesto actualmente en ensayos clmicos para la tuberculosis; donde el agente de tratamiento oral de primera lmea contra la tuberculosis se selecciona del grupo que consiste e isoniazida, rifampicina, etambutol y pirazinamida; el agente contra la tuberculosis inyectable se selecciona del grupo que consiste en estreptomicina, amikacina, capreomicina y kanamicina; la fluoroquinolona se selecciona del grupo que consiste en ciprofloxacina, ofloxacina, gatifloxacina y moxifloxacina; el agente de tratamiento oral de segunda lmea contra la tuberculosis se selecciona del grupo que consiste en rifabutm, protionamida, etionamida, cicloserina, PAS y tioacetazona; y el otro agente anti-TB se selecciona del grupo que consiste en linezolida, clofazimina, amoxicilina/clavulanato, claritromicina, y un derivado de diaminodifenilsulfona; el compuesto actualmente en ensayos clmicos para la tuberculosis se selecciona del grupo que consiste en bedaquilina, PA-824, Dalamanid, SQ-109, Sutezolid, rifapentina y compuestos en desarrollo preclmico, en particular AZD5847, BTZ043, TBA-354, CPZE/ N-45, SQ-641, SQ-609, DC-159a, Q201, THPP, analogos de riminofenazina de clofazimina e inhibidores LeuRS que contienen boro.
7. 7. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 5 o la reivindicacion 6, donde el compuesto de la formula general 1 o 2 y al menos un compuesto adicional se adaptan para la administracion simultanea, secuencial o separada.
8. 8. Un proceso para la fabricacion del peptido dclico contra la tuberculosis de la Formula 1 o la Formula 2 de acuerdo con la reivindicacion 1 que comprende; cultivar un microorganismo productor de un peptido antimicobacteriano con la cepa Nonomuraea sp. MJM5123 en condiciones aerobias en un medio de cultivo acuoso; y aislar el peptido dclico contra la tuberculosis de acuerdo con la reivindicacion 1 a partir de los micelios.
9. 9. El proceso de acuerdo con la reivindicacion 8, donde la etapa de aislar el peptido dclico contra la tuberculosis comprende las siguientes etapas: realizar una cromatograffa lfquida en vacrn (VLC) del extracto metanolico de micelios de Nonomuraea sp. MJM5123 usando metanol y cloroformo como eluyente; realizar una cromatograffa en columna abierta Sephadex LH-20 usando metanol como eluyente; y realizar una cromatograffa en contracorriente de alta velocidad (HSCCC) usando HEMWat+2 como disolvente.
10. 10. El proceso de acuerdo con la reivindicacion 8, donde la etapa de aislar el peptido dclico contra la tuberculosis comprende extraer los micelios de Nonomuraea sp. MJM5123 usando metanol y cloroformo como eluyente; anadir agua hasta el 30 % del metanol para preparar metanol acuoso; desgrasar el extracto de metanol usando hexano; separar la capa acuosa y ajustar hasta el 65 % de metanol acuoso; extraer la capa acuosa usando cloroformo; concentrar y resolver el extracto de cloroformo usando metanol; realizar una cromatograffa en columna Sephadex LH-20 usando metanol como eluyente; y realizar la HPLC provista de una columna rellena con un gel de fase invertida (RP-18).