JP2020065490A - Ｌｐｓ高含有組成物の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】農産物等から効率よくリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を得る技術を提供する。【解決手段】植物素材の微生物発酵物を活性炭カラムに通し、エタノール及び／又は含水エタノールで溶出することにより、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）を高含有に含む組成物を得る。植物素材の微生物発酵物は、酵母及び／又は麹菌による発酵物であることが好ましい。また、植物素材はブドウ及び／又は米であることが好ましい。【選択図】なし

Description

本発明は、リポポリサッカライドを含有するＬＰＳ高含有組成物の製造方法に関する。

リポポリサッカライド（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、以下「ＬＰＳ」とも称する。）やその構成部分であるリピドＡは、従来、細菌由来のエンドトキシンとして知られていた。すなわち、ヒトや動物において強力な炎症応答を引き起こして、例えば敗血症などの重篤な疾病の発症に関与することが知られていた。

近年、ＬＰＳによる免疫賦活作用など、生体に有益な機能性の側面が注目されている。例えば、非特許文献１には、小麦粉から単離され、特徴づけられたＬＰＳが、マウスにおける１型糖尿病の発生率に対して抑制効果を発揮したことが記載されている。また、非特許文献２には、大腸菌由来のＬＰＳの経口投与により、腸内Ｔｏｌｌ様受容体４が刺激し、マウスの先天性免疫抵抗性を高めて、抗生物質耐性細菌による感染を防御したことが記載されている。また、非特許文献３には、小麦粉共生菌であるパントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）由来のＬＰＳが、ドキソルビシンとの併用により、メラノーマ保有マウスの平均生存期間を延長したことが記載されている。また、非特許文献４には、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）由来のＬＰＳを含有する小麦発酵抽出物の経口投与により、卵巣摘出（ＯＶＸ）骨粗鬆症マウスモデルの骨密度及び皮質骨の厚さの減少を抑制したことが記載されている。

一方、上記小麦に由来するもの以外にも、農作物等に由来するＬＰＳ素材の開発も進められている。例えば、特許文献１には、イネに共生するパントエア・アグロメランスから得られるＬＰＳが記載されている。また、特許文献２には、林檎から単離したグラム陰性細菌（パントエア・バガンス）から得られるＬＰＳが記載されている。また、特許文献３には、米糠を水に浸漬・膨潤する一次工程と９０〜１００℃で加熱・撹拌する二次工程と、ミキサーで微粒子化して濾過する三次工程からなることを特徴とするＬＰＳ含有米糠エキスの製造方法が記載されている。

Makoto Iguchi, et al.「Homeostasis as Regulated by Activated Macrophage. V. Suppression of Diabetes Mellitus in Non-obese Diabetic Mice by LPSw (a Lipopolysaccharide from Wheat Flour)」Chem. Pharm. Bull. (1992) 40(4):1004-6. Brandl K., et al.「Vancomycin-resistant enterococci exploit antibiotic-induced innate immune deficits」Nature. (2008 Oct 9) 455(7214):804-7. Takehisa HEBISHIMA, et al. 「Oral Administration of Immunopotentiator from Pantoea agglomerans 1 (IP-PA1) Improves the Survival of B16 Melanoma-Inoculated Model Mice」Exp. Anim. (2011) 60(2):101-109. Nakata K., et al.「Pantoea agglomerans lipopolysaccharide maintains bone density in premenopausal women: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial」Food Sci. Nutr. (2014 Nov);2(6):638-46.

特許第５４４９８３４号公報 特開２０１８−４４０３８号公報 特許第６３７６５０２号公報

しかしながら、特許文献１，２などのように、イネや林檎等から単離した微生物を培養してＬＰＳを得る方法では、培養中の環境バイアスや製造バッチによる品質の変化等により、経口摂取等する場合の安全面にリスクが皆無とはいえなかった。また、特許文献３などのように一般に食経験豊富な農産物等から直接に抽出すれば、安全面のリスクはより低減されると考えられるが、その一方で抽出効率が悪いという問題があった。

本発明の目的は、農産物等から効率よくＬＰＳを得る技術を提供することにある。

上記目的を達成するため、本発明者らが鋭意研究した結果、一般に食経験豊富な農産物として知られる赤ワインや酒粕等を基原として、これを活性炭カラムに通し、エタノールもしくは含水エタノールで溶出させることにより、ＬＰＳを高含有に含む組成物が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、植物素材の微生物発酵物を活性炭カラムに通し、エタノール及び／又は含水エタノールで溶出することを特徴とするＬＰＳ高含有組成物の製造方法を提供するものである。

上記製造方法においては、前記微生物発酵物が酵母及び／又は麹菌による発酵物であることが好ましい。

また、上記製造方法においては、前記植物素材はブドウ及び／又は米であることが好ましい。

また、上記製造方法においては、前記エタノール及び／又は含水エタノールは、該エタノール含有量が４０〜１００質量％であることが好ましい。

また、上記製造方法においては、前記微生物発酵物は、前記植物素材を微生物発酵させた後、その残渣物を再度微生物発酵させ、その再度の発酵工程を１回行うか、あるいは２回以上繰り返して行って得られたものであることが好ましい。

また、上記製造方法においては、前記微生物発酵物は、ワイン醸造の際のブドウ搾りかすを再度酵母で発酵させ、その再度の発酵工程を１回行うか、あるいは２回以上繰り返して行って得られたものであることが好ましい。

また、上記製造方法においては、前記活性炭カラムに通す前の固形分換算ＬＰＳ濃度に比して、５倍以上の固形分換算濃度でＬＰＳを含む組成物を得ることが好ましい。

また、上記製造方法においては、ＬＰＳを固形分濃度換算で５０００ｎｇ／ｇ以上含む組成物を得ることが好ましい。

本発明によれば、植物素材の微生物発酵物を基原として、これを活性炭カラムに通し、エタノールもしくは含水エタノールで溶出させるだけで、ＬＰＳを高含有に含む組成物が得られるので、免疫賦活作用など、生体に有益な機能性を有するＬＰＳ素材を、簡便に、コスト安く提供することができる。

本発明の目的物であるリポポリサッカライド（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）は、当業者に周知の物質である。すなわち、グラム陰性細菌の膜壁構造のうちの外膜の構成成分であり、脂質二重層に埋め込まれる脂質部を有するリピドＡと、そのリピドＡから外膜の外側方向に連なるコア多糖と、そのコア多糖から更に外膜の外側方向の遠位に連なるＯ側鎖多糖とからなる。リピドＡは、グルコサミンの２量体を骨格（β−１，６−ジグルコサミン骨格）とし、通常はそれぞれのグルコサミンの１位と４’位の水酸基に１つずつリン酸残基を有し、更に２位と２’位のアミノ基と３位と３’位の水酸基に、それぞれに脂肪酸が結合している。その脂肪酸は、β位に水酸基をもつ中鎖飽和脂肪酸であり、更にその脂肪酸のβ位の水酸基にも脂肪酸が結合しており、通常、グルコサミンの２量体骨格に対して脂肪酸が６個程度結合している。

本発明においては、その第１の着想は、植物素材の微生物発酵物を基原としてＬＰＳを得ようとするものである。すなわち、例えば赤ワインは、黒ブドウや赤ブドウを原料にして酵母によりアルコール発酵させて得られるが、後述する実施例に示すとおり、赤ワインやその醸造の際のブドウ搾りかすにはＬＰＳが豊富に含まれている。また、米を原料にして麹菌や酵母で発酵されてなる酒粕についても同様に、ＬＰＳが豊富に含まれている。

これは、ブドウ、米等の植物素材には、それに付着している常在菌のなかにＬＰＳを産生するものが生育しており、微生物発酵の過程でその活性が高められて、ＬＰＳを豊富に産生するようになるからであると考えられる。よって、植物素材としては、一般に食品として適性のある農産物等の植物素材であればよく、ブドウや米に限られない。典型的に、例えば大豆、さつまいも、じゃがいも、サトウキビ、乳（牛乳、馬乳）、リンゴ等が挙げられる。また、発酵用微生物についても同様であり、上記した酵母や麹菌が典型的ではあるが、その属種等の種類に制限はなく、酵母や麹菌以外の微生物（乳酸菌、酢酸菌、酪酸菌、糖化菌等）による発酵物であってもよい。また、２種以上の微生物による共発酵物であってもよい。なお、赤ワインは果実をその果皮や種子ごと原料にしているので、一般に果皮や種子は除いて原料にしている白ワインに比べて、果皮や種子に付着している常在菌に由来するＬＰＳ産生能が高くなるものと考えられる。よって、ＬＰＳの基原として用いる微生物発酵物として、より好ましい。

本発明の好ましい態様においては、ＬＰＳの基原として用いる微生物発酵物は、植物素材を微生物発酵させた後、その残渣物を再度微生物発酵させ、その再度の発酵工程を１回行うか、あるいは２回以上繰り返して行って得られたものを用いる。例えば、より具体的には、ワイン醸造の際のブドウ搾りかすに、必要な水、酵母、糖分等を加えたうえ、蒸気により撹拌しながら３０〜４０℃に加温して発酵させることにより、再度の発酵工程を行うことができる。発酵後には、約９０℃まで加温して加熱殺菌してもよい。その再度の発酵工程を１回行うか、あるいは２回以上繰り返して行って得られたものである。この態様によれば、植物素材に付着している常在菌のなかにＬＰＳを産生するものが生育しており再度繰り返される微生物発酵の過程でその活性がより高められて、ＬＰＳを豊富に産生するようになる。

本発明においては、その第２の着想は、ＬＰＳを夾雑物から分離するため活性炭カラムを用いるというものである。すなわち、植物素材の微生物発酵物を基原としてＬＰＳを得ようとする場合、その発酵物に含まれる夾雑物の除去が問題となるが、後述する実施例に示すとおり、植物素材の微生物発酵物を活性炭カラムに通し、エタノールもしくは含水エタノールで溶出させるだけで、ＬＰＳを高含有に含む組成物が得られる。ここで含水エタノールの場合、そのエタノール濃度は、２０質量％１００質量％未満であることが好ましく、４０〜８０質量％であることがより好ましく、５０〜７０質量％であることが最も好ましい。上記範囲を外れると、活性炭カラムからＬＰＳを溶出させ難くなる傾向となる。なお、エタノールもしくは含水エタノールによる溶出であれば、特別な規制を受けることなく、健康食品等の経口摂取用の素材として利用することが可能である。

植物素材の微生物発酵物の活性炭カラムへの通液量としては、基原として用いる植物素材の種類や発酵用微生物の種類、あるいはカラム設置条件等によっても異なり、一概ではないが、典型的には、例えば活性炭カラムの容量に対して３００〜１５００倍量を通液することが好ましく、８００〜１２００倍量を通液することがより好ましい。植物素材の微生物発酵物は、必要に応じて、膜ろ過や遠心分離等の固液分離手段により、その固部を除いた液部を採取してから活性炭カラムに供してもよい。また、上記した酒粕等、固形のものは、適宜適当な抽出溶媒でその抽出液を調製したうえ、必要に応じてフィルターろ過にかけ、上記微生物発酵物として活性炭カラムに供してもよい。溶出溶媒の通液溶出量としては、上記同様、一概ではないが、典型的には、例えば活性炭カラムの容量に対して２〜１０倍量を通液することが好ましく、３〜５倍量を通液することがより好ましい。上記した活性炭カラムへの通液や溶出の際の温度条件としては、特に制限はなく、典型的には２０〜３０℃程度の温度条件であればよく、室温で行うこともできる。

カラムからの溶出物（液体）は、必要に応じてろ過したり、溶媒を減圧留去したり、濃縮したり、乾燥したり、また、乾燥後に粉砕したり、微粒子化したり、造粒したり、粉末化したりしてもよく、溶出後の処理に特に制限はない。例えばスプレードライにより乾燥・粉末化することができる。より具体的には、スプレードライ後に、篩にかけ、水分含量１０質量％以下、より好ましくは水分含量８％質量以下の粉体を調製することができる。粉体は、例えば、全体の８０質量％以上がＪＩＳ規格による標準篩を用いて６０メッシュ（目開き２５０μｍ）をパスする粉末の形態に調製することが好ましく、全体の９０質量％以上がＪＩＳ規格による標準篩を用いて６０メッシュ（目開き２５０μｍ）をパスする粉末の形態に調製することがより好ましい。このような粉末形態によれば、保存安定性が良く、他の素材と配合する場合にも調合しやすい。また、必要に応じてＬＰＳを更に分画・精製してもよい。分画・精製の手段としては、ポリスチレン樹脂、ＯＤＳ、ゲル濾過・サイズ排除カラム等を用いたカラムクロマトグラフィーを好ましく例示することができる。

以上に説明したようにして、ＬＰＳを高含有に含有する組成物を得ることができる。そのＬＰＳ含量としては、基原として用いる植物素材の種類や発酵用微生物の種類、あるいは溶出条件等によっても異なり、一概ではないが、典型的には、例えばＬＰＳを固形分濃度換算で５０００ｎｇ／ｇ以上含む組成物を得ることができる。より好ましくは、ＬＰＳを固形分濃度換算で９０００ｎｇ／ｇ以上含む組成物を得ることができ、更により好ましくは、ＬＰＳを固形分濃度換算で１１０００ｎｇ／ｇ以上含む組成物を得ることができる。また、ＬＰＳ濃縮の程度としてみたとき、活性炭カラムに通す前の固形分換算ＬＰＳ濃度に比して、５倍以上の固形分換算濃度でＬＰＳを含む組成物を得ることができる。より好ましくは、８倍以上の濃度で含む組成物を得ることができ、更により好ましくは、１０倍以上の濃度で含む組成物を得ることができる。なお、ＬＰＳの濃度は、公知のＨＰＬＣ分析により、別途標準品により求めた検量線にあてはめて定量する方法などにより求めることができる。あるいは、カブトガニ血球抽出溶解液に対するゲル化能を利用した比濁時間分析やエンドポイントアッセイによる蛍光定量等により行うことができる。

本発明によるＬＰＳ高含有組成物は、ＬＰＳを豊富に含有するので、生体への様々な有益な効果が期待できる。よって例えば、健康食品、サプリメント、栄養補助食品、機能性食品、化粧品、医薬品、医薬部外品、動物用健康食品、動物用サプリメント、動物用栄養補助食品、動物用機能性食品、動物用医薬品、動物用医薬部外品など各種の製品形態で、あるいはそれら製品と組み合わせて使用されることが可能である。また、各種の飲食品や動物・魚類用飼料と組み合わせて使用されることが可能である。

以下に実施例を挙げて本発明について更に具体的に説明する。なお、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。

＜試験例１＞
調味料用の赤ワインやブドウ発酵物の蒸留酒（グラッパ）に用いられる、ワイン醸造の際のブドウ搾りかすを入手し、常法の赤ワイン醸造の手法に準じて、必要な水、酵母、糖分等を加えたうえ、３００００リットル容のタンクで発酵させ、得られたブドウ発酵物を搾汁した後の一次的な搾汁液を、活性炭を充填してなるカラムに通液した。通液後、ブドウ発酵物に含まれる成分（ＬＰＳを含む）を吸着したおよそ１２００ｋｇの活性炭に対して、エタノール濃度６０質量％の含水エタノール（水：エタノール＝４０：６０）を４８００リットル通液し、その溶出物およそ５２００リットルを得た。これを減圧濃縮し、スプレードライ後、粉砕、篩にかけて、約５００ｋｇのブドウ発酵物由来組成物を得た。この組成物は、水分含量３．８質量％で、全体の９５質量％以上がＪＩＳ規格による標準篩を用いて６０メッシュ（目開き２５０μｍ）をパスする、粉体状組成物であった。

得られたブドウ発酵物由来組成物につき、ＬＰＳ含量測定キット（「リムルス ES-II シングルテストワコー」、和光純薬工業株式会社）を使用して、ＬＰＳ含量を測定した。具体的には、ＬＰＳによるＬＡＬ試薬（カブトガニ血球抽出溶解液）に対するゲル化能を利用し、ゲル化に伴って生じる濁度を透過光量比として予め設定した閾値に達するまでの時間をゲル化時間Ｔｇとし、そのゲル化時間ＴｇとＬＰＳ濃度の関係からＬＰＳ濃度を求めた。ＬＰＳ標準品としては、キット添付の大腸菌由来エンドトキシン（「コントロールスタンダードエンドトキシン(CSE)(E. coli UKT-B)」、和光純薬工業株式会社）を用いた。なお、ＬＰＳ含量の測定は、上記方法で得られたロット１のブドウ発酵物由来組成物とともに、上記方法で別途調製したロット２のブドウ発酵物由来組成物についても、同様にして行った。

その結果、表１に示すように、ロット１ではＬＰＳ含量は固形分濃度換算で１１，９２２ｎｇ／ｇであり、ロット２では１９，５５８ｎｇ／ｇであった。このＬＰＳ含量は、別途、比較対照として試験を行った山芋からの抽出エキスのＬＰＳ含量がおよそ３０ｎｇ／ｇ程度であり、それに比べて顕著に含有量が高かった。また、白米の約６倍、およそ５３０ｎｇ／ｇ程度のＬＰＳを含むことを特徴として販売されている「金芽米（登録商標）」（東洋ライス株式会社）（亜糊粉層と胚芽の基底部である金芽を残す精米方法で加工された米）などよりも、有意に含有量が高かった。

＜試験例２＞
試験例１の結果から、活性炭カラムによりＬＰＳが夾雑物から分離され濃縮されるものと考えられた。そこで、食品に適用可能な吸着剤素材として用いられる活性炭、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、及びシリカについて、ＬＰＳ濃縮用としての性能を評価するため、それらをオープンカラムに３ｇ容量で充填して、ＬＰＳ濃縮用のモデルカラムとした。

試験例１の結果からは、また、植物素材の微生物発酵物にＬＰＳが豊富に含まれていると考えられた。そこで、ＬＰＳの基原として、下記の試料１〜３を準備した。

試料１：赤ワインを醸造した際の一次搾汁液
試料２：試料１のワイン醸造の際のブドウ搾りかすを使用して赤ワインを再度醸造した際の一次搾汁液
試料３：酒粕１００ｇにエタノール５００ｍＬを加えてミキサーで微粉砕した後、超音波振とう抽出した抽出液に水をおよそ等量加えて１Ｌに調整した酒粕抽出液

上記モデルカラムにそれぞれの試料１Ｌを流下させ、更に表２に示す各エタノール濃度の溶出用の溶媒１００ｍＬを流下して、その溶出液を採取した。得られた溶出液について減圧濃縮して５ｍＬに調整後、試験例１と同様にして、ＬＰＳ含量を測定した。

その結果、表２に示すように、ＰＶＤやシリカではＬＰＳを含有する溶出液が得られなかった。これに対して、活性炭では、溶出用の溶媒としてエタノール濃度が４０質量％の含水エタノール、６０質量％の含水エタノール、又は１００％エタノールを使用して、ＬＰＳを高含有に含有する溶出液が得られた。よって、上記吸着剤素材のうち、ＬＰＳ濃縮用としては活性炭のみが適していることが明らかとなった。

また、同じ溶出用溶媒を使用した場合の試料１と試料２の結果を比較すると、試料２のほうが試料１より溶出液中のＬＰＳ含量が高くなった。これは、試料２が試料１のワイン醸造の際のブドウ搾りかすを使用して赤ワインを再度醸造した際の一次搾汁液であるため、ブドウ搾りかすに生息する常在菌に由来するＬＰＳがより収量良く回収できたためと考えられた。

＜試験例３＞
試験例２においてＬＰＳの基原とした植物素材の微生物発酵物のＬＰＳ含量を調べた。具体的には、酒粕については、活性炭カラムに通す前の酒粕抽出液について、ワイン醸造の際のブドウ搾りかすについては、酒粕と同様にして調製した、そのブドウ搾りかす抽出液について、試験例１と同様にして、ＬＰＳ含量を測定した。

その結果、表３に示すように、ブドウ搾りかす抽出液中の固形分換算のＬＰＳ含量は８３４ｎｇ／ｇ程度、酒粕のＬＰＳ含量は３１４ｎｇ／ｇ程度であった。よって、活性炭カラムによる濃縮の程度は、カラムに供する前の固形分換算ＬＰＳ濃度に比して、少なくとも５倍以上、最大では１０倍以上であることが明らかとなった。

Claims (8)

1. 植物素材の微生物発酵物を活性炭カラムに通し、エタノール及び／又は含水エタノールで溶出することを特徴とするＬＰＳ高含有組成物の製造方法。
2. 前記微生物発酵物が酵母及び／又は麹菌による発酵物である、請求項１記載のＬＰＳ高含有組成物の製造方法。
3. 前記植物素材はブドウ及び／又は米である、請求項１又は２記載のＬＰＳ高含有組成物の製造方法。
4. 前記エタノール及び／又は含水エタノールは、該エタノール含有量が４０〜１００質量％である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＬＰＳ高含有組成物の製造方法。
5. 前記微生物発酵物は、前記植物素材を微生物発酵させた後、その残渣物を再度微生物発酵させ、その再度の発酵工程を１回行うか、あるいは２回以上繰り返して行って得られたものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＬＰＳ高含有組成物の製造方法。
6. 前記微生物発酵物は、ワイン醸造の際のブドウ搾りかすを再度酵母で発酵させ、その再度の発酵工程を１回行うか、あるいは２回以上繰り返して行って得られたものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＬＰＳ高含有組成物の製造方法。
7. 前記活性炭カラムに通す前の固形分換算ＬＰＳ濃度に比して、５倍以上の固形分換算濃度でＬＰＳを含む組成物を得る、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＬＰＳ高含有組成物の製造方法。
8. ＬＰＳを固形分濃度換算で５０００ｎｇ／ｇ以上含む組成物を得る、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＬＰＳ高含有組成物の製造方法。