JPH11508127A

JPH11508127A - ラムノガラクツロナン▲ｉｉ▼を劣化させる酵素および微生物

Info

Publication number: JPH11508127A
Application number: JP8535433A
Authority: JP
Inventors: ペレラン，パトリス; ブリルー，ジャン−マルク; ドコ，ティエリ; ウィリアム，パスカル; ヴィダル，ステファン; ムトゥネ，ミシェル
Original assignee: アンスティチュナショナルドゥラルシェルシュアグロノミク
Priority date: 1995-05-23
Filing date: 1996-05-21
Publication date: 1999-07-21
Also published as: FR2734578B1; UA64696C2; EP0827533B1; AR002067A1; CZ370197A3; ATE330006T1; TR199701421T1; WO1996037604A3; US6103506A; RU2220203C2; IL118404A; SK156697A3; HUP9900744A2; WO1996037604A2; BR9608812A; IL118404A0; FR2734578A1; AU6006796A; DE69636247D1; PL323529A1

Abstract

(57)【要約】エンド−β−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→３’）−Ｄ−アピオフラノシル・ヒドロラーゼ活性および／またはエンド−α−Ｌ−フコピラノシル−（１→４）−Ｌ−ラムノピラノシル・ヒロドラーゼ活性を有するラムノガラクツロナンII（ＲＧ−II）劣化酵素。この酵素は微生物、特にＣＮＣＭに寄託された１−１５７７株および１−１５７８株等のペニシリウム種の微生物で作ることができる。ＲＧ−IIはクロマトグラフィーを含む方法で植物抽出物から得ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】ラムノガラクツロナンIIを劣化させる酵素および微生物本発明はラムノガラクツロナン(rhamnoglacturonane)II（ＲＧ−II）およびその誘導体を劣化させる酵素と、この酵素を得る方法とに関するものである。本発明はさらに、ＲＧ−IIを得る方法に関するものである。本発明はさらに、この酵素の使用にも関するものである。ラムノガラクツロナンIIは植物細胞壁に普通に見られる極めて複雑な成分である（Ｏ’Ｎｅｉｌ達、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＰｌａｎｔＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（1990）２：４１５〜４３９）。これはペクチン様多糖類に属し、通常の葉や一次膜に主として存在している。その構造は非常に複雑であり、約30の重合度（dp）に対して12の異なった単糖類で構成されている（図１参照）。この複雑さはその組成中にアピロースまたは３−Ｃ−（ヒドロキシメチル）−Ｄ−グリセロ−テトロース、ＫＤＯすなわち２ −セト−３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソン酸、ＤＨＡすなわち３−デオキシ−Ｄ−リクソ−２−ヘプツロサリック酸、２−Ｏメチル−フコース、２−Ｏメチル−キシロース、酢酸あるいは３−Ｃ−カルボキシ−５−デオキシ−Ｌ−キシロースが存在していることによって一層増している。この後者の単糖類はＧＲ −IIの特殊なマーカーを構成している。体壁多糖類内に一般的に存在している単糖類であるラムノース、フコース、アラビノース、ガラクトース、そしてガラクツロンおよびグルクロン酸もＲＧ−IIの組成内に存在しているが、多くの場合、アノマー化体およびその分子構造の特殊性と複雑性を一層強化する特殊な多重結合タイプを伴っている。ＲＧ−IIの超構造組織（図１）はこの物質の組成をさらに複雑にしている（Pu vanesariah達、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．(1991)２１８：２１１〜２２２）。α−（１→４）で結合されている７〜１４のガラクツロン酸残基で構成されるホモローグ鎖の位置が未だに決定されていない４つの異なった枝すなわち２つの二糖類と２つのより複雑な鎖すなわち非糖類鎖を有している。ホモガラクツロン鎖の長さとブランチＢの末端に関しては構造的な多様性が見られ、これは用いた酵素活性に起因するものと思われる。さらに、Ａ５残基上には特定されていない置換基の存在が確認されている。加えて、ＲＧ−II分子はガラクツロン酸の石炭酸基をエステル化する２〜３のメチル基とＲ３（アセリック酸）およびＢ４（２ −０−メチル−フコース）残基上に存在する２つのアセチル残基を含んでいる。従って、ある種の置換基の種類が未だ確認されてはいないがＲＧ−IIの構造はほぼ決定されている。植物の細胞壁ではＲＧ−IIは天然ペクチン類と結合しているが、プロトペクチンとＲＧ−IIとの間の結合の正確なタイプについては未だ分かっていない。同様に、野菜類の細胞壁内でのその役割もほとんど分かっていない。しかし、それが野菜類全体に存在していることは知られており(Ａｌｂｅｒｓｈｅｉｍ達、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Transactions，1994，22：374〜378)、スペルモトファイト類を伴うプテリドファイト類、アンギオスペルム類を伴うギムノスペルム類、ジコチレドン類を伴うモノコチレドン類（図２）などで壁の平均的な葉にかなりの量で存在している。これまでに調査された種々の植物では、その構造が保持されることも知られている（Albersheim 達、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ、1994、２２：３７４−３７８）。最近の研究からはそれが信号多糖類の役割を有し、植物からの特殊な反応（エリクト活性）を引き出すことができることも示されている（Aldington と Fry，Ｅｘｐ，Ｂｏｔａｎｙ 1994，４５：２８７〜２９３）。しかし、その豊富さおよび普遍的存在とその構造の複雑さから、ＲＧ−IIは植物の細胞壁の結合、従って植物組織の細胞組織において基本的な役割を果たしていると考えられる。図１に示すように、ＲＧ−IIは、天然のペクチン類の滑らかな鎖を劣化させてＲＧ−IIを放出するペクトン化活性を有する酵素の作用で、劣化されていない形で細胞壁から放出される。（Ｄａｒｖｉｌｌ達、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ. （1978）６２：４１８−４２２）。ホモガラクツロン鎖の長さの多様性はそれを天然ペクチン類から放出させる酵素による劣化に原因がある（ＨＩｔｅｃｏｍｂｅ達、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ（1995）２７１：１５−２９）。ＲＧ−IIはそのの構造の複雑さと特殊性によつて、市販の菌類やバクテリア製剤などの場合と同様に、植物抽出物内に存在している酵素による劣化に対して極めて高い抵抗性を有している。この非劣化活性は実際に最も強い植物の細胞壁を劣化させるための種々の活性を有する市販製剤で観察されている。観察されている唯一の劣化は側鎖の非還元性末端に存在しているアラビノフラノース、ラムノピラノースあるいはガラクトピラノース残基に関するものである。これらの残基を放出させるようにする外部酵素は実際に酵素製剤に存在している。このことは多くの著者が指摘したＲＧ−IIのこれまでに報告されている種々の製剤の多様性の原因を疑いなく示している。果実や野菜類を押したり潰したりするとペクトン化活性によつて天然ペクチン類のホモガラクツロン鎖は確実に劣化される。この活性は市販のペクトン化酵素を加え、ワインや発酵製品で用いられる発酵フローラを用いることによってより強くなる。ＲＧ−IIは果汁、野菜類、そしてこれらの誘導体、特にワインにおいて完全な形、そして多くの場合、多量に放出される。ワインではＲＧ−IIは主要多糖類のひとつであり（ＤｏｃｏとＢｒｉｌｌｏｕｅｔ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．1993、４３：３３３−３４３）、その濃度は１００ｍｇ／ｌに達する場合もある。ＲＧ−IIは望ましくない多くの現象、例えば濾過膜の目づまり（Ｂｅｌｌｅｖｉｌｌｅ達、Ｅｎｏｌ．Ｖｉｔｉｃ．Ｓｃｉ 1991、４６：１００−１０７）、他のコロイド状巨大分子との不安定な錯体の形成、沈殿現象の誘発などの原因となる。従って、それを劣化させる特殊な酵素を用いて除去することが必要である。ワインからＲＧ−IIを得るためのいくつかの方法がこれまでに開示されている。 (1) 懸濁させた野菜細胞の培養体から分離した細胞壁の菌性エンドポリガラクツロナーゼ類を用いて酵素加水分解する方法（Ｄａｒｖｉｌｌ達、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．1978、６２：４１８−４２２） (2) アスペルギラス・ニゲル、ＡＣペクチノールの市販酵素から作成する方法（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ達、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．1988、１７９：２９６− ２８８）。しかしＲＧ−IIは低濃度で存在しているため、それを生成するためには蛋白質および発色物質を除去するために多数の工程を必要とする (3) ワインから作成する方法（Ｄｏｃｏ、Ｂｉｌｌｉｏｕ達、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｒｅｓ．1993、２４３：３３３−３４３）。ここに記載の精製プロセスでは立体排除クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィー段階を４つ連続して使用する必要がある。なお、ラムノガラクトロナン１あるいはＲＧ−１は非常に似た名称をしているが、その構造（ラムノースとガラクツロン酸の交互連鎖構造）および酵素による劣化の点でＲＧ−IIとは全く違った野菜の細胞膜成分である。ラムノガラクツロナーゼ活性（Ｓｃｈｏｌｓ達、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．1990、２０６：１０５−１１５）あるいはプロトペクチナーゼ（ＳａｋａｍｏｔｏおよびＳａｋａｌ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．1994、２５９：７７−９１）活性は既に報告されている。従来法に関する上記の説明から分かるように、ＲＧ−１１劣化に関する満足すべき活性を有する酵素あるいは酵素製剤は当業者には知られていない。しかし、この多糖類の存在は濾過用メンブレンの目づまりや他のコロイド状巨大分子との不安定な錯体の形成、沈殿現象の誘発などの好ましくない現象の発生源となっている。この問題は経済的に大きな意味があるため、解決が求められている。本出願人はＲＧ−IIの劣化に関与する酵素活性とその誘導体を微生物からの単離できるということを見出した。本出願人さらに、種々の野菜供給源からＲＧ−IIを大量に得る方法を確立した。本発明の対象はＲＧ−IIを劣化させることを特徴とする酵素とその誘導体にある。本発明では、ＲＧ−IIとは、単量体あるいは二量体の形のいずれでも、図１に示す構造を有する多糖類と、部分的劣化で生じる組成および連鎖の点で特徴的なＡ、Ｂ、ＣあるいはＤ鎖のフラグメントを少なくとも一つ有する分子を意味している。以下の説明で、ＲＧ−IIとはこの分子からの任意の誘導体を含めたものを意味する。この酵素はエンド−ヒドロラーゼ・タイプの活性を示すのが有利である。この酵素は特にエンド−β−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→３’）−Ｄ−アピオフラノシル・ヒドロラーゼおよび／またはエンド−α−Ｌ−フコピラノシル− （１→４）−Ｌ−ラムノフラノシル・リドロラーゼ活性を示すことができる。この活性は図１に示すように、鎖Ａを放出する能力によって特定することができる。この酵素は微生物、そして特にペニシリウム(Penicillium)種の菌から微生物的に作ることができる。本発明の他の対象はＲＧ−IIを劣化させる活性を有するこれらの微生物はある。この微生物はパスツール研究所のＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＣｕｌｔｕｒｅｓｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＣＮＣＭ）に１９９５年５月１９日に寄託された下記のペニシリウム株にすることができる： (1) １−１５７７（ＩＰＶ１）の名称でＣＮＣＭに寄託されたペニシリウム・シンプリシシウム(simplicissium)株。 (2) １−１５７８（ＬａＶ２）の名称でＣＮＣＭに寄託されたペニシリウム・ダレアエ(daleae)株。これら二つの菌株は急速に分裂する青緑色胞子を有する繊維状菌類であるという点に特徴がある。Ｐ．ダレアエは森林の土壌から単離される稀な菌で、アミドンおよびペクチン性多糖類を分解する能力を有することで知られている。この種については「ＣｏｍｐｅｎｄｉｕｍｏｆＳｏｉｌＦｕｎｇｉ，Ｈ．Ｋ．Ｄｏｍｓｃｈ，Ｗ．ＧａｍｓａｎｄＴ．Ｈ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ、1980、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，５００頁」に記載されている。Ｐ．シンプリシシウム(simplicissium)株は一般的なものであり、腐敗した野菜から単離することができる。この種については「ＣｏｍｐｅｎｄｉｕｍｏｆＳｏｉｌＦｕｎｇｉ，Ｈ．Ｋ．Ｄｏｍｓｃｈ，Ｗ．ＧａｍｓａｎｄＴ．Ｈ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ（1080）ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ、５９７〜５９８頁」に記載されている。本発明の他の対象は、ＲＧ−IIを劣化させる酵素およびその誘導体を含んだ酵素製剤にある。この製剤は他の活性を有する別の酵素を含む製剤とすることもできる。ＲＧ−IIを劣化させる活性を強化させたこの製剤は、植物の細胞膜および多糖類類を部分的または全体的に劣化させることを必要とする多くの利用分野に全く新しい可能性を提供する。ＲＧ−IIとその誘導体を劣化させる酵素は特に以下のような目的に用いることができる。 (1) 果汁、野菜類およびその誘導体からＲＧ−IIを除去して、濾過性を改善し、果汁および濃縮アロマの生産をより容易にし、透明化を促進し、最終製品の優れた安定性を保証するための用途 (2) 果汁、野菜およびその誘導体のために用いられるマイクロ濾過膜およびウルトラフィルターの清浄 (3) 液体浸潤分解タイプの調整物の製造すなわち体壁構造をできるだけ劣化させないで野菜類の若い細胞繊維を分離させる用途（果汁ネクター、ピューレ、ジェリーおよび野菜と果汁濃縮物の生産） (4) 植物の細胞壁の多糖類を十分に加水分解する前の液化タイプ調整物の製造での利用（果汁および果実官能基、野菜および発酵飲料、ビールの生産） (5) 野菜残滓（ビートループ・パルプ、果汁処理後の固体残滓など）からのペクチンおよび動物用食品の生産 (6) 野菜からセルロースの生産；他の多糖類成分の酵素加水分解は収率を改善向上させる（繊維産業、製紙産業）植物の細胞壁の劣化を可能にする商業用酵素製剤は、所望の使用タイプに応じた正確かつ厳密に定義された生化学作用を有している必要がある。正確かつ厳密に定義された生化学作用を有するＲＧ−IIを劣化させる酵素の活用が提供されれば、菌の酵素技術の開発が促進される。本発明による酵素および酵素製剤は以下の工程を含む方法によって得るのが好ましい： (1) ＲＧ−IIまたはその誘導体の劣化活性を示す微生物をその酵素の生産に適した適切な培養環境で培養し、 (2) 培養上澄液またはつぶした微生物の上澄液からの酵素あるいは酵素製剤を収集する。この方法は以下の工程を含んでいるのが好ましい： (1) ＲＧ−IIを含む微生物に適した適切な培養液内でＲＧ−IIの劣化活性を示す微生物を培養し、 (2) 微生物を回収し、 (3) 微生物をつぶすし、 (4) 潰した微生物を濾過または遠心分離しえ不溶性物質を除去し、 (5) 酵素または酵素製剤を含んでいる上澄液を回収する。これら酵素はそうした条件が存在する場合は、酵素が培養液内に放出されるように条件あるいはブランチを選択することにより、微生物をつぶさずに培養の上澄液から直接得ることも可能である。この方法は１−１５７７および１−１５７８の名称でＣＮＣＭに登録されたペニシリウム株を用いることによって好適に実施される。これらの酵素はその合成に関与する遺伝子のクローニングによって遺伝子工学的方法を用いて得ることができ、あるいは当業者に公知の他の適切な技術、特にその配列を含むアミノ酸を単離し、同定し、合成によって得ることができる。本発明はさらに、野菜抽出物をクロマトグラフィーにかけてＲＧ−IIおよびその代謝物質または誘導体を得る方法に関するものである。この方法はＲＧ−IIの製造だけでなく、この方法を実施した場合にこの分子から得られる代謝物質としての劣化生成物および全てのＲＧ−II誘導体に関するものである。本発明で「野菜抽出物」という用語は特に可溶化された野菜の多糖類を含んだ調整物を意味する。この多糖類は限外濾過や例えばエタノール、メタノール、その他の適切な溶媒による析出などの濃縮工程を受けたものでもよい。この方法はＲＧ−IIを保持する基質（支持体）上での少なくとも１回のＲＧ− II吸着クロマトグラフィー段階を含むことができる。この吸着クロマトグラフィーは活性炭素、ポリスチレン／ジビニルベンゾン樹脂、その他の適当な基材上で行うことができる。また、クロマトグラフィー段階の前および／または後に限外濾過か立体排除クロマトグラフィーのいずれかで多糖類を分離する段階をつけ加えることもできる。分画沈降はエタノールまたはメタノールを用いて行うのが好ましい。立体排除クロマトグラフィーは「セファクリル」カラム、その他の適切な基材を用いて行うことができる。本発明は上記方法によって得られる以下のような製剤にも関するものである： (1) 主としてＲＧ−IIのモノマーを含んでいる（少なくとも９５％）製剤 (2) 少なくとも８０％、好ましくは９５％以上のＲＧ−IIのダイマーを含んでいる製剤各クロマトグラフィー後に、ＲＧ−IIを含む画分をその組成に基づいて確定する。この操作は当業者に周知である。本発明方法によって禾本性植物からのものを除いた果汁、野菜、それらの誘導体、特に１０グラム程度の濃縮かすまたはブドウ液のワインからＲＧ−IIを簡単かつ大量（１キログラム程度）に得ることができる。ＲＧ−IIは植物の一次壁から得るのが好ましいが、通常の加工プロセス（プレス、発酵）や液化酵素処理で体壁の可溶化をした任意の植物誘導体製品から得ることもできる。本発明のさらに別の対象は微生物、特に菌類のＲＧ−IIを劣化させる能力をスクリーニングする方法において、ＲＧ−IIを含む微生物に適した培地で成長させることを特徴とする方法を提供することにある。本発明はさらに、ＲＧ−IIを含んだ微生物用培地に関するものである。本発明方法、特に本発明の酵素の調製、単離方法と、ＲＧ− IIの調製方法は本明細書と一般的な情報だけで当業者が実行可能であるが、下記マニュアルを参照することは有益であろう：ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ６、Ｊ．Ｒ．Ｍｏｒｒｉｓ、Ｄ．Ｗ．Ｒｏｂｂｏｎｓ 19690〜1972、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＮｅｗＹｏｒｋ。以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明がこれら実施例に限定されるものではない。以下の説明および実施例で参照されている図は以下の通りである。図１は側鎖Ａ−Ｄを含むＲＧ−IIの構造概念図で、この図でＲ１は水素または α−Ｌ−ラムノピラノースを示し、Ｒ２およびＲ３は水素または他の置換基を表す。図２は野菜におけるＲＧ−IIの分布を示す図。図３はワインでの多糖類、酸性糖類および中性糖類のＤＥＡＥカラム（Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ）での分画を示す図。図４Ａおよび４Ｂは赤ワインから単離されたＲＧ−II画分の立体排除クロマトグラフィー特性を示す図。図５はワイン濃縮物から精製された下記の２つのＲＧ−II画分を示す図：ａ：画分III、ＲＧ−II二量体（分子量９５００Ｄａ、18.5分で溶出）ｂ：画分II、ＲＧ−II単量体（分子量４７５０Ｄａ、20.5分で溶出）図６はパイロット規模でのＲＧ−II精製法を示す図。図７はＳｕｐｅｒｄｅｘ−７５ＨＲカラムでＣＥＳ−ＨＰで求めた(a)赤ワインの総多糖類と、(b)ＲｅｌｉｔｅＲＤＡＩＡＯＮＲ樹脂で保持されなかった画分および(c)それで保持され、その後２０％エタノールで溶出されたものとの比較図。図８はペニシリウム・シンプリシシウム（１−１５７７）の可溶性細胞抽出物のＲＧ−IIの劣化を示し、スペクトルａ、ｂおよびｃはそれぞれＲＧ−IIと、劣化２４時間および４８時間後のＲＧ−IIに対応している。図９はＬａＶ２株（１−１５７８）の可溶性細胞抽出物によるＲＧ−IIの劣化を示す図（ａ：天然ＲＧ−II、ｂ：９６時間後、ｃ：１６８時間後、ｄ：１９０時間後）。図１０は劣化後にペニシリウム・シンプリシシウム（１−１５７７）培養によってＲＧ−IIをＣＥＳ−ＨＰクロマトグラフィーにかけた場合を示す図。曲線ａ〜ｆはそれぞれ天然のＲＧ−IIと、その菌を96時間、132 時間、168 時間、192 時間および 400時間成長させた後のＲＧ−IIのスペクトルを示す図。図１１はＰ・デレアエ（１−１５７８）で培養した後、それぞれ異なった時間（ａ：天然のＲＧ−II、ｂ：72時間後、ｃ：120 時間後、ｄ：240 時間後、ｅ： 264 時間後、ｆ：336 時間後、ｇ：384 時間後）のＣＥＳ−ＨＯクロマトグラフィーを行った場合のＲＧ−IIを示す図。図１２は図１の構造を簡略化した図。本発明によって潜在的に酵素切断が可能な箇所を示してある（矢印１および２）。図１３はペニシリウム・シンプリシシウムおよびペニシリウム・ダレアエで劣化させた後のＲＧ−IIの残留画分の構造を示す図。図１４はペニシリウム・ダレアエ培養（１−１５７８）による二量体ＲＧ−II の劣化を示し、スペクトルａ〜ｃは天然二量体ＲＧ−IIと劣化１６８時間および３００時間後のＲＧ−IIのスペクトルを示している。図１５はペニシリウム・シンプリシシウム（１−１５７７）の総可溶性細胞抽出物を精製し、ＲＧ−IIを劣化させた後、ＣＥＳ−ＨＰクロマトグラフィーにかけた状態を示し、スペクトルａ〜ｄはそれぞれ最初のＲＧ−II と、培養72時間後、120 時間後および 148時間後のＲＧ−IIに対応している。図１６は赤ワイン（スペクトルａ）と、ＩＰＶＩ酵素抽出物の存在下で４８時間培養したもの（スペクトルｂ）とのＣＥＳ−ＨＰ多糖類特性の比較図。図１７は赤ワイン（スペクトルａ）と、ＰｅｃｔｉｎｅｘＲＵｌｔｒａＳｐＬのみが存在している状態で４８時間培養した場合（スペクトルｂ）あるいはＩＰＶＩ株の酵素抽出物と組み合わせた場合（スペクトルｃ）とのＣＥＳ−ＨＰの比較図。図１８はＩＰＶＩ株の酵素抽出物が存在しない状態（スペクトルａ）および存在する状態（スペクトルｂ）の両方で４８時間培養した後にＲａｐｉｄａｓｅＲＬｉｑ酵素製剤で果実を完全に液化して得られたアップル・ジュースの多糖類特性のＣＥＳ−ＨＰ特性を示す図。図１９Ａ、１９ＢはＩＰＶＩ株の酵素抽出物による砂糖大根繊維の劣化（図１９Ａ）を対照（図１９Ｂ）と比較した図）。図１９Ｃ、２０Ａおよび２０Ｃはニンジン、リンゴおよびポテト繊維のＩＰＶＩ株の酵素抽出物による劣化を対照と比較して示した図（図１９Ｄ、２０Ｂおよび２０Ｄ）。実施例１アニオン交換クロマトグラフィーおよび分子スクリーニングによるワインからのラムノガラクトナンの精製ＲＧ−IIは果汁、野菜汁およびそれらの誘導体、特に発酵誘導体中に劣化していない形で存在している。このＲＧ−IIは以下の精製工程で植物から得られる任意の製品から均一に精製することができる。１．８０％エタノールによる沈降または限外ろ過による工程で巨大分子を得る。２．酸ｐＨで予備的なアニオン交換クロマトグラフィーを行う。３．分子スクリーニング・クロマトグラフィー（この工程は高い純度を得るためのもので、８０％台の純度のＲＧ−IIを求める場合には無視しても構わない）１．ワインサンプルとコロイドの入手用いたワインはＰｅｃｈ−Ｒｏｕｇｅ／ＮａｒｂｏｎｎｅＤｏｍａｉｎＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌで1991年９月に成熟段階で収穫された黒Ｃａｒｉｇａｎから得られたものである。６００リットルをカットオフ閾値が１０，００のＣａｒｂｏＳｅｐＭ５（ＴｅｃｈＳｅｐ．フランス）限外ろ過薄膜で濃縮した。濃縮されたワイン（最終体積２５Ｌ）のコロイド全てを６０ｍＭＨＣｌに４体積分の酸性化エタノールを加えて沈降させ、続いて８０−９０％のエタノールで洗浄し、水に戻してから４０ｍＭ、ｐＨ４．６のくえん酸ナトリウム緩衝液で透析した。総コロイドの乾燥重量（アリコット画分を脱塩、乾燥冷凍後に求めた）は 2 96ｇすなわちワイン１リットルあたり0.5 ｇ程度である。２．アニオン交換クロマトグラフィーｐＨ４．６のコロイド溶液を４０ｍＭ、ｐＨ４．６のくえん酸ナトリウム緩衝液内で２０．５ｍｌ／ｍｉｎに均衡化されたＤＥＡＥ−Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ（Ｂｉｏｒａｄ，ＵＳＡ）カラム（５ｘ８０ｃｍ）に連続して十回通過させることによってアニオン交換クロマトグラフィーで分画させた。中性あるいはわずかに中性からずれた多糖類が出口の緩衝液中で溶出された（画分１）。ＲＧ−IIを含んでいる画分は最初に５０ｍＭくえん酸緩衝液濃度（画分II）を通過させ、その後５０ｍＭ（画分IIＩ）および１５０ｍＭ（画分ＩＶ）のＮａＣｌを溶出緩衝液に加えることによって溶出された（図３）。これら３つの画分は乾燥重量基準で表した総コロイドのそれぞれ7.9 ％、6.6 ％および 4.1％を示していた。３．立体排除クロマトグラフィーによるＲＧ−IIの均一な精製画分IIおよびIIＩに存在するＲＧ−IIを５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ、ｐＨ５のくえん酸ナトリウム緩衝液内で７ｍｌ／分で均衡化されたＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−４００ＨＲカラム（５ｘ７５ｃｍ）での立体排除クロマトグラフィーによって均質に精製した。ＲＧ−IIを含んだこれら画分を、冷凍乾燥させる前に水で最終的に透析した。得られた２つのＲＧ−IIサンプルは完全に均質な高性能立体排除クロマトグラフィー特性を有しており（ＣＥＳ−ＨＰ、２つのＳｈｏｄｅｘＯＨＰａｋＫＢ −８０３およびＫＢ−８０５カラムで連続的に分析、１ｍｌ／分で０．１ＭＬｉＮＯ３で溶出、屈折計で検出）（図４）、ワイン・サンプルの総コロイドの 4 .4および 4.6％をそれぞれ示した。用いたワイン・サンプルのＲＧ−IIの全含有量は均質に精製されなかった画分ＩＶ内に含まれたＲＧ−IIに加える必要があったので50ｍｇ／ｌ以上であった。４．ワインから精製したＲＧ−II画分の組成２つの精製ＲＧ−II画分はそれぞれＲＧ−IIの特徴的な組成を有していた（表１）。その組成の分析結果に有意差は認められなかった。ＤＥＡＥ−Ｍａｃｒｏｐｒｅｐで得られた画分IIおよびIIIをＳｉｐｅｒｄｅｘ−7511カラム（１ｘ30ｃｍ、14分で排出、分子篩支持体）で分析した。この分析結果（図５）は、画分IIがＲＧ−II単量体（ 20.5分で溶出、分子量4750Ｄａ）を含んでいるのに対し、画分IIＩは95％以上のＲＧ−II二量体（18.5分で溶出、分子量9500Ｄａ）を含んでいることを示している。画分IIのＲＧ−II製剤は酵素活性のスクリーニングおよび誘発実験での較正および劣化基準として用いた。実施例２醸造かすから吸着クロマトグラフィーで得られたＲＧ−II 用いた醸造かすは300ｈｌの赤ワイン（いくつかの種類のブドウからのワインを混合したもの）を真空蒸留、濃縮して得られたものである。蒸留で得られた醸造かすは降流フロート・システム上で蒸発させて濃縮させた。ビタルトレート塩類はこの濃縮物にデカントした後に除去し、その後同じシステム上で醸造かすを再度濃縮させた。このワインは全体で３０回濃縮し、得られた1000リットルの濃縮醸造かすの総コロイドを４体積分の90％エタノールを加えて沈降させた。この沈降物を 300リットルの水に戻して、ＲＧ−II供給源として用いる醸造かすを構成した。吸着クロマトグラフィークロマトグラフィーによる分離結果は屈折計による検出システムに結合されたＳｈｏｄｅｘカラム（実施例１参照）あるいはＳｕｐｅｒｄｅｘ−ＨＲ７５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ；流量0.6 ｍｌ／分）でＣＬＨＰによって確認された。 (a) 活性炭素で活性炭は多くの分子に対して高い吸着能力を有している。本発明においては活性炭は各種のペクチン性多糖類からＲＧ−IIを分離する能力を活用するために使われる。実際、全ての多糖類は活性炭に吸着されるが、ＲＧ−IIは４０％以下の濃度で脱着する。下記の２つのタイプの炭素をテストした。粒状活性炭素５分の１に希釈された醸造かす液１リットルを100 グラムの粉末化活性炭素（ＮｏｒｉｔＲＳＡ*）と30分間接触させた。この溶液をフリット濾過して炭素粒子を取り除いた。フィルター上に残った炭素を１リットルの40％エタノールに懸濁させ、その混合物を３０分間撹拌してから、真空濾過した。溶出したＲＧ−II をＣＬＨＰで分析した。この画分の組成分析の結果は純度がＲＧ−IIの場合50％に達していることを示している（表２）。押出成形活性炭素このタイプの炭素はＲＧ−IIを吸着するためには醸造かす液により長い時間（ 48時間）接触させねばならないが、濾過工程が簡単になるという利点がある。また、必要な炭素重量は粒状炭素の二倍である。５分の１に希釈した醸造かす液を、押出し成形した活性炭素（ＮｏｒｉｔＲＲＯ−０８Ｓｕｐｒａ）と４８時間接触させた。吸着されない画分を除去した後、ＲＧ−IIを含んだ画分を４０％エタノールに２４時間解かして脱着させた。得られたＲＧ−IIは粒状炭素を用いた場合を同じ純度を示した。 (b) ポリスチレン−ジビニルベンゼン混合樹脂（ＲｅｓｉｎＲｅｌｉｔｅＲＤＩＡＩＯＮＲＳＰ４１１）でＲｅｌｉｔｅ（登録商標）ＤＩＡＯＮＲＳＯ４１１樹脂はポリスチレン−ジビニルベンゼン共重合体からなる非極性合成樹脂である。これは植物抽出物内に存在する他の多糖類を無視してＲＧ−IIを保持する。この抽出物はＲｅｌｉｔｅＲＤＩＡＯＮＲＳＯ４１１樹脂の吸着クロマトグラフィーでＲＧ−IIの異なった多糖類を含んだ樹脂に保持されない画分とＲＧ−IIを含んだ保持される画分との２つの画分に分離される。パイロット規模でのＲＧ−IIの精製図６はパイロット規模で醸造かすからＲＧ−IIを精製した結果を示している。５分の１に希釈した醸造かす液250 リットル（2.5 カラム分）をＮｏｒｉｔＲＲＯ−０８Ｓｕｐｒａ活性炭上で急速に脱色してから、90リットルＲｅｌｉｔｅＤＩＡＯＮＲＳＯ４１１カラムに４０１／時の流速で通した（ＲＧ−IIをこのクロマトグラフィー基材に吸着させるための接触時間は２時間）。カラムを 100 リットルの水で洗浄した。保持されなかった画分は流出、洗浄された分である。ＲＧ−IIの溶出物は 100リットルの20％エタノールを通し、その後 200リットルの水でカラムを洗浄することによって得られた。こして得られたＲＧ−II（醸造かす全体を処理して１ｋｇ）は約60％の純度を示した（表２）。ＲＧ−IIはエタノール（最終エタノール濃度は40％程度）を加えて沈降させた。得られた沈降物は純度が９０％のＲＧ−IIを含んでいた。実施例３吸着クロマトグラフィーによるワインからＲＧ−IIの取得ワイン（Ｍｅｒｌｏｔ94赤ワインと、Ｃｈａｒｄｏｎｎａｙ94白ワイン）からアルコール成分を除去し、回転蒸発器で真空蒸発し、２倍に濃縮した。 15ｍｌの画分を50ｍｌのＲｅｌｉｔｅ（登録商標）ＤＩＡＩＯＮＲＳＰ４１１上に20ｍｌ／時の速度で供給した。次にカラムを50ｍｌの水で洗浄した。その後、ＲＧ−IIを50ｍｌの20％エタノールで溶出させ、100 ｍｌの水で洗浄した。ＣＬＨＰ分析の結果は樹脂に保持されない画分内にＲＧ−IIが存在しており、20％エタノールでの溶出でかなり回収されるので、ＲＧ−IIがこの樹脂でかなり吸着されることを示している（図７）。ＲＧ−II溶液の純度は赤ワインの場合、50％程度、白ワインの場合、35％程度であった。実施例４ぶどう発酵液からのＲＧ−IIの取得Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ２は非極性ポリスチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂である。Ｇｒｅｎａｃｈｅ種の実をつぶして得られたぶどう発酵液１００ｍｌを水中で均衡化させ、１００ｍｌのＸＡＤ２樹脂に吹きつけた。６０％容量のメタノールでＲＧ−IIが溶出され、その純度は４０％程度であった。この溶出物の分析結果を表２に示す。実施例５果汁および野菜液からのＲＧ−IIの取得皮をむいてさいの目に切ったリンゴ、トマトおよびニンジン0.6 ｋｇをアスコルビン酸 200ｍｌ（最終濃度３ｍＭ）に浸したものから可溶性抽出物を得た。用いた果汁および野菜液は市販の液化酵素製剤〔Ｒｅｃｔｉｎｅｘ（登録商標）ＵｌｔｒａＳＰＬ；ＮｏｖｏＦｅｒｅｍｅｎｔＲａｐｉｄａｓｅ（登録商標）Ｌｉｑ；Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ〕を使って45℃の温度下で24時間酵素により液化して得られたものである。液化反応は熱を加えて酵素を変性させることで中止させた。固体残滓は脱水によって除去され、表面に浮いている物質をＲＧ− II源として用いた。酵素による液化後の果実および野菜のＲＧ−IIの精製酵素による液化で得られた果汁および野菜液を濾紙で濾過してから５０ｍｌのＲｅｌｉｔｅ（登録商標）ＤＩＡＩＯＮＲＳＰ４１１を含む水で均衡化させたカラム（2.5 ｘ30ｃｍ）に移し、ＲＧ−IIを溶出させる前にそのカラムを50ｍｌの水で洗浄し、その後、100 ｍｌの水でカラムを洗浄した。得られたＲＧ−II製剤は８０％以上の純度を示した。分析結果は表２に示す。実施例６単量体形のＲＧ−IIを劣化させる微生物のスクリーニングＲＧ−IIは植物の細胞壁に普遍的な構成成分であり、その生物界での劣化は自然のエコシステム（土壌、コンポスト、汚水処理施設からのスラッジの微生物）によって分解される。天然試料からＲＧ−IIを唯一の炭素源およびエネルギー源として用いるペニシリウムの二つの菌類株が単離された。１．培地ＲＧ−IIを唯一の炭素源およびエネルギー源として用いる微生物をスクリーニングするための培地を表３に示す手順で作成した。この培地にＲＧ−II単量体を加え、最終濃度を２〜10ｍｇ／ｍｌに調整した。菌類を含む培地を汚染しているバクテリアは培地に３種類の抗生物質：ペニシリンＧ、ストレプトマイシンおよびテトラサイクリンを加えることで除去した。２．炭素源およびエネルギー源としてＲＧ−IIを用いる微生物のスクリーニング種々の自然エコシステム（農地または森林土壌、ピート、コンポスト、汚水処理施設からのスラッジ、分解果汁）からサンプルを取り、ＲＧ−II単量体を１０ｍｇ／ｍｌに調整した無機培地上で２５−２７０Ｃの温度で培養した。微生物の成長が確認される度に、その培養体を同じ培地に数回移植した。この手順で複数の培養体に分離し、ＲＧ−II培地上で成長させることができる。この培地でのＲＧ−IIの劣化は高性能立体排除クロマトグラフィーを同時に行うことによって管理され、微生物の成長と同時に劣化が認められた培養体だけを確保した。ＲＧ−IIを確実に劣化させる微生物を２％アガロースを加えた2.5 ｍｇ／ｍｌのＲＧ−II単量体を含むゲル化培地でペトリ箱内で単離した（表３）。250 ℃で１週間培養した後、クローンを取り出し、ＲＧ−IIを劣化させる能力を調整するために液体培地内で培養した。３．ＲＧ−IIを劣化させる株の選択最終的に以下の所望の性質を有する２つの繊維状菌を選択した。 (1) 成長が速く、培地内でのＲＧ−IIの減少と十分な相関性を有すること (2) ＲＧ−IIが定量的に消失するとともに、エンド−ヒドロラーゼ・タイプの酵素劣化活性の存在を示すＨＰ−ＳＥＣ溶出体積の変化が確認されること。 (3) 250 ℃で１週間培養した後のＲＧ−IIの劣化の最終レベルが70％に達すること。ＥおよびＫの符号を付けたこれら２つの培養体がＲＧ−IIの劣化させる酵素の生産とその酵素的作用モードの調査のために用いた。これらは３つの抗生物質：ペニシリンＧ、ストレプトマイシンおよびテトラマイシンの存在下で５ｍｇ／ｍｌのＲＧ−IIを含んだ液体培地内で 250℃の温度で空気と接触させつつ撹拌しないで培養させた。実施例７ＲＧ−II劣化酵素の生産各種のペニシリウムが多糖類を劣化させる酵素を培地内で作り、増殖する能力を持っていることは知られている。単離された２つの株がＲＧ −IIを劣化させる酵素をつくりだす能力を持っていることが確認された。１．培養上澄み中のＲＧ−II劣化酵素の探索Ｐ・ダレアエＬａＶ２（ＣＮＣＭ寄託番号１−１５７８）およびＰ・シンプリシシウムＩＰＶ１（ＣＮＣＭ寄託番号１−１５７７）の株が 2.5ｍｇ／ｍｌのＲＧ−IIを含んだ培地で250 ℃の温度で培養した。９６時間の培養後、成長中の菌糸体を含んだ培地１ｍｌを取り出し、０．２２μｍフィルターで無菌濾過し、その後２ｍｇ／ｍｌの天然ＲＧ−IIを加えた。劣化酵素およびＲＧ−IIを含む培地を２５０℃で培養し，２５μｌの画分を0.20〜45時間かけて取り出し、ＣＥＳ− ＨＰ分析した。異なった時間でのＲＧ−IIの溶出特性の比較から、培地内にはＲＧ−II劣化活性が存在していないことが明らかに示される。従って、この活性は菌類の細胞液および菌膜液内にあることが示された。２．菌類の全細胞抽出物中でのＲＧ−IIを劣化酵素の生産上記の株、Ｐ・ダレアエＬａＶ２およびＰ．シンプリシシウムＩＰＶ１を６ｍｇ／ｍｌのＲＧ−II単量体を含む培地４ｍｌで250 ℃の温度で培養した。140 時間の培養後、菌糸体を脱水回収し、（ガラス球で）つぶし、５０ｍＭＭＥＳ／ＫＯＨ緩衝液（モルフォリノ−エタン−スルフォン酸）で４分間かけて40℃に温度調節し、ｐＨを６に調節し、１ｍＭの（フェニル・メチル・スルフォニル・フルオライド）および１ｍＭのＤＴＴ（ジチオトレオール）を加えた。この細胞上澄液を10.000ｇ×５分間で遠心分離した。可溶性細胞抽出物内にＲＧ−IIを劣化させる酵素が存在するか否かを、つぶして遠心分離し、表面に2.5 ｍｇ／ｍｌの天然ＲＧ−IIを加え、250 ℃で培養し、その後ＲＧ−IIの劣化をＣＥＳ−ＨＰで分析することによってテストした。天然ＲＧ−IIで２４時間および４８時間後の特性を比較した結果（図８および９）２４時間の培養で高い劣化（５０％）が認められ、それは４８時間後まで続いた。残留分子は40％であった。このように、ＲＧ−IIの劣化を引き起こさせる酵素活性は可溶性細胞抽出物内に存在しており、従って、菌類をつぶした後に得られる。本発明で単離されたペニシリウムの二つの株はラムノガラクトナンIIを劣化させることかできる酵素の優れた生産菌である。実施例８ＲＧ−II劣化活性の特徴付け単離されたこれら２つのペニシリウム株は培地でＲＧ−IIを劣化させる酵素をつくりだす。これらの酵素の作用モードを菌類が成長している間に他糖類の劣化で調べた。この方法は菌類でまだ吸収されていないＲＧ−II画分を追跡することしかできないという欠陥はあるが、用いられた活性とその作用モードを調べることができるという利点がある。１．ペニシリウム・シンプリシシウのＲＧ−IIの劣化能力Ｐ・シンプリシシウムＩＰＶＩ供給源をエルレンメイヤー培養器内で５ｍｇ／ｍｌのＲＧ−II単量体と共に１０ｍｌの培地上に250 ℃の温度下に置いた。0.96 、132，168、192 時間後にそれぞれ１ｍｌ画分を取り出し、２０μｌの１ＭＨＣｌを加えて培養液のｐＨを５に再調整した。３６０時間後に次のサンプル取り出し、培養は４００時間後に最終的に中止した。菌類の成長中の劣化を追跡調査するために各サンプルをＣＥＳ−ＨＰ分析をした（図１０）。サンプリングされた各画分は１００ｍＭのｐＨ４酢酸ナトリウム緩衝液で均衡化したＢｉｏ−ＧｅｌＰ−６カラム（１ ×50ｃｍ）で離脱させた。各培養毎に、劣化中のＲＧ−II画分の下記の構造分析を行った： 1) ＲＧ−IIの劣化速度の定量 2) 中性オウス組成およびウロン酸組成の決定 3) 分子を構成する結合タイプの決定 4) ホモ−ガラクトニック鎖の長さの決定これらの分析全体で各サンプリング時のＲＧ−II分子の状態を示すことでき、従って、その時間と劣化の関係を調べることができる。その結果は一定期間での分子の劣化の酵素作用モードの詳細を与える。２．ペニシリウム・ダレアエのＲＧ−IIの劣化能力Ｐ・ダレアエＬａＶ２によるＲＧ−IIの劣化を追跡調査するために、500 ｍｇの体ＲＧ−II単量製剤を予め鹸化し（50ｍＭのＮａＯＨで40℃の温度で２時間）後に還元（2.5 ｇのＮａＢＨ₄の存在下で40℃の温度で６時間）して分子の複雑さの減少度合いを調べた。その後、Ｐ・ダレアエＬａＶ２をエリエンメイヤー培養器に入れ、250 ℃の温度下で５ｍｇ／ｍｌの鹸化ＲＧ−IIと共に６ｍｌ培養液に入れて還元した。0.6 ｍｌ画分を0.72，120，168，240，264，336 および 384 時間後にそれぞれ取り出した。各サンプルをＣＥＳ−ＨＰ分析して（図１１）、菌が成長している間劣化を追跡調査した。サンプルした各画分を３０ｍＭのｐＨ 5.2nのアンモニウム・ホルミエート緩衝液内で0.6 ｍｌ／分に均衡化させたＳｕｐｅｒｄｅｘ−７５ＨＲカラム（１×30ｃｍ）で離脱させた。各培養時間に対して劣化中のＲＧ−II画分の十分な構造分析を行った。この分析内容は以下の通り： 1) ＲＧ−IIの劣化速度の定量 2) メタノールリ化後のトリエチルシリレート化誘導体の形での中性オウス組成およびウロニック酸組成の決定 3) ウロン酸のトリエチルボロデウテトライド・リチウムへの還元を含むメチル化による分子構成残基間の結合の決定（Ｐｅｌｌｅｒｉｎ達、1995、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Res．２７７：１３５−１４３） 4) ホモ−ガラクトニック鎖長の決定これらすべての分析によって各サンプルのＲＧ−II分子の状態を示し、時間と劣化の相関関係を調べることができる。その結果は一定時間での分子の劣化における酵素の作用モードの詳細を示す。３．ＲＧ−II劣化のメカニズム組成物の分析結果（表４および５）とその分子内に存在する各残基の結合のタイプ（表６および７）から、一定時間でのＲＧ−IIの残留分子の状態を追跡調査することができる。上記２つのペニシリウム株の場合、ＲＧ−IIは連続的に作用する下記の一連の酵素によって劣化されることが分かる：ａ）第一の劣化状態は三置換されたβ−Ｌ−ラムノースとα−Ｌ−フコースおよびβ−Ｄ−アピロース間の結合の破壊からなる。これは菌によって吸収される鎖Ａ（図１２）を喪失させる。この状態は培養の最初の日に起こり、同時にホモ− ガラクトロニック鎖がわずかな短縮し、平均して８〜９から７残基に変化する、アラビノフラノース（Ｂ７およびＤ２）とラムノピラノース（Ｃ２）末端残基が部分的に喪失する。ｂ）β−Ｄ−アピロースによって担持されている鎖ＡのＡ２〜Ａ５までの残基が完全に消失する。第二の劣化フェーズには以下のような特徴が認められるので、これによってＲＧ−II分子の酵素による劣化作用に対する抵抗を強めるように思われる： 1) ホモ−ガラクトロニック鎖がかなり短縮し、平均してガラクトロニック酸の４つの残基のサイズになる。 2) 残基Ａ１の喪失 3) 常にβ−Ｄ−アピロースを介してホモ−ガラクトロニック鎖に結合されている鎖Ｂの非還元性末端構造が変化を受け、端末アラビノフラノースが量的に減少し、α−Ｌ−ラムノース（残基Ｂ６−Ｂ７）残基が喪失する。 4) ＫｄｏおよびＤｈａ残基は酵素による劣化で部分的に影響を受けるようである。この第二段階で観察される全ての劣化は公知の酵素：β−Ｄ−アピオシダーゼ、β−Ｌ−アラビノシダーゼ、α−ラムノシダーゼ、エンド−またはエキソ−ポリガラクツロナーゼを用いて起すことができる。菌の成長が終わった段階での残留分子は量的に鎖Ｂ（残基Ｂ１−Ｂ５）と、最初のＲＧ−II分子の２０−３０％程度の平均重合度が４のオリゴ糖類に担持されたＫｄｏ（Ｃ１）とＤｈａ（Ｄ）の残基とに相当する（図１３）。従って、２つのエンド−タイプの酵素活性が関与する最初の段階がＲＧ−II分子の劣化を可能にするキーとなる段階で、鎖Ａを定量的に放出することで分子は市販の酵素製剤でも往々見られる公知の作用モードで酵素の影響を受けやすくなる。従って、Ｐ・ダレアエＬａＶ２およびＰ・シンプリシシウムＩＰＶＩによってエンド−β−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→３’）−Ｄ−アピオフラノシル・ヒドロラーゼ（１）およびエンド−α−Ｌ−フコピラノシル−（１→４）−Ｌ−ラムノピラノシル・ヒドロラーゼ・タイプの活性を有する酵素を作ることがＲＧ−IIを使ってこれらの菌類が成長できるようにす決定的な段階である。従って、酵素作用によるＲＧ−IIの劣化を可能にするものは、エンド−ベータ−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→３’）−Ｄ−アピオフラノシル・ヒドロラーゼ（１）およびエンド− α−Ｌ−フコピラノシル−（１→４）−Ｌ−ラムノピラノシル・ヒドロラーゼ（２）タイプの活性を有するこれらの酵素の使用である。鎖Ｂは加水分解作用の影響を受けず、同じタイプのラムノフラノシル−アピオシドによってホモ−ガラクツロニック鎖に結合されているので、活性（１）の特殊性は高い。鎖Ａと鎖Ｂに対する活性（１）の挙動の違いは以下の理由で説明できる： (1) ラムノースの置換基の違い：鎖Ｂの場合はＣ３で結合されている鎖、鎖Ａの場合はＣ４で結合されている鎖と、Ｃ２およびＣ３で結合されている２つの単糖類との違い (2) ＲＧ−II分子内でのこれら２つの鎖の場所の違い酵素製剤においてこれら２つの活性のいずれかが存在しているとＲＧ−IIから鎖Ａが放出され、従ってペクチン化製剤の通常の酵素によるＲＧ−IIの非劣化性という問題が起きてくる。実際、ＲＧ−IIのより強い劣化は上記酵素の作用下での鎖Ａの発性の後に起きる。この第二の劣化段階は以下の酵素活性に関与する： β−Ｄ−アピオシダーゼ β−Ｌ−アラビノシダーゼ α−Ｌ−ラムノシダーゼエンド−ポルガラクツロナーゼエキソ−ポリガラクツロナーゼ実施例９二量体ＲＧ−II製剤の製造とペニシリウム・ダレアエによる劣化醸造かす濃縮物をＲｅｌｉｔｅ（登録商標）ＤＩＡＩＯＮＲ（例２参照）を通過させて得られた５ｍｇ／ｍｌのＲＧ−II製剤を含む培養液の入った培養器にＰ・ダレアエ・株を入れる。この製剤は二量体の形のＲＧ−IIを６０％程度含んでおり、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５Ｈｒカラムの分析でわかる。菌培養液のＣＨＬＰ（図１４）の分析結果から、ＲＧ−IIの高い劣化度が示される。分子量がより高い汚染物質（主として醸造かす濃縮物内に存在するもの）は劣化されない。従って、ＲＧ−II単量体で単離されたペニシリウムは二量体形のＲＧ−IIを劣化させる能力を有している。本発明による酵素はこの分子の２つの形に作用する。実施例１０ＲＧ−IIを劣化させる酵素製剤の獲得ＲＧ−IIを劣化させる活性、特にエンド−β−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→ ３’）−Ｄ−アピオフラノシル・ヒドロラーゼまたはエンド−α−Ｌ−フコピラノシル−（１→４）−Ｌ−ラムノピラノシル・ヒドロラーゼ・タイプの活性を有する酵素製剤は以下のようにして作ったＰ．シンプリシシウＩＰＶＩ培養から得た。６ｍｇ／ｍｌの精製ＲＧ−IIを含んでいる培養体１２０ｍｌを８つのペトリ箱に分けた。Ｐ．シンプリシシウＩＰＶＩ株を培養器に入れ、250 ℃の温度に６日間放置した。その後、菌糸を遠心分離で回収し、上記のようにｐＨ６に調整された１ｍＭのＰＭＳＦとＤＴＴを含んだ５０ｍＭのＭＥＳ／ＫＯＨ緩衝液中で上記方法でつぶした（実例３）。最後に遠心分離で全酵素抽出物を回収して以下の実施例で用いた。実施例１１Ｐ・シンプリシシウムの酵素抽出物で精製したＲＧ−IIの劣化以下の混合物を 0.02 ％ＮａＣｌ₃の存在下で250 ℃の温度で培養した： 500 μｌの50ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液 12.5μｌの精製したＲＧ−II溶液(200mg/ml) 実施例５で得られた25μｌのＰ．シンプリシシウムＩＰＶＩの全酵素抽出物 25μｌのサンプルを０、72、120，148時に取り、CES-HPで分析した。ＲＧ−II の劣化によってエンド−β−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→３’）−Ｄ−アピオフラノシル・ヒドロラーゼまたはエンド−α−Ｌ−フコピラノシル−（１→４） −Ｌ−ラムノピラノシル・ヒドロラーゼ・タイプの酵素活性の存在が確認された（図15）。その劣化パターンはＰ．シンプリシシウムの培養物の上澄みから作った物と対比できる。ＲＧ−II分子の劣化生成物は、低分子量の断片中に見られる。実施例１２Ｐ・シンプリシシウムＩＰＶＩの酵素抽出物によるワイン多糖類の劣化ワイン中に存在するＲＧ−IIを劣化させる能力を、ＲＧ−IIを劣化させる酵素、特にエンド−β−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→３’）−Ｄ−アピオフラノシル・ヒドロラーゼまたはエンド−α−Ｌ−フコピラノシル−（１→４）−Ｌ−ラムノピラノシル・ヒドロラーゼ・タイプの活性物を含む全酵素抽出物でテストした。このワイン（２ｍｌ）をＣｅｎｔｒｉｏｎ30（Ａｍｉｃｏｎ、ＵＳＡ）メンブレンで限外濾過して、赤ワイン（黒Ｃａｒｉｇｎａｎ種）の全多糖類を得た。５０ｍＭのｐＨ４．８の酢酸緩衝液で透析残基（１００μｌ）を取った。0.02％のＮａＮ₃の存在下で250 ℃の温度で培養し、以下をテストした：ａ：ワインの全多糖類を含んでいる透析残留物２００μｌＨ₂Ｏ５μｌＭＥＳ緩衝液２０μｌｂ：ワインの全多糖類を含む透析残留物２００μｌＨ₂Ｏ５μｌ実施例９で得られたＰ・シンプリシシウムＩＰＶＩの全酵素抽出物２０μｌｃ：ワインの全多糖類を含む透析残留物２００μｌＲｅｃｔｉｎｅｘ（登録商標）ＵｌｔｒａＳｐ−Ｌ５μｌ実施例９で得られたＰ・シンプリシシウムＩＰＶＩの全酵素抽出物２０μｌ４８時間後に各テストから２５μｌの試料を取って、ＣＥＳ−ＨＰ分析を行った。分析結果は以下のことを示している（図１６および１７）： (1) Ｐ・シンプリシシウムＩＰＶＩの酵素抽出物によるワインのＲＧ−IIの劣化（特徴的ピークは18.2分で検出された）（図１６） (2) 市販のＲｅｃｔｉｎｅｘ（登録商標）Ｓｐ−Ｌ酵素製剤によるワインの他の多糖類（マンノプロテイン、アラビナンおよびアラビノガラクトナン）の劣化（ＲＧ−IIの特徴ークには変化は見られない）（図１７） (3) テストｃのワイン全体の多糖類の劣化によって二つの酵素製剤の相補的な効果が確認される（図１７）。従って、エンド−β−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→３’）−Ｄ−アピオフラノシル・ヒドロラーゼまたはエンド−α−Ｌ−フコピラノシル−（１→４）−Ｌ −ラムノピラノシル・ヒドロラーゼ酵素を含むＰ・シンプリシシウムＩＰＶＩの全酵素抽出物は市販の酵素製剤（アスペルギウス・アクレアタスから作られ、セルロース、セミセルロースおよびペクチン合成活性に富み、ラノムガラクルロナーゼ活性（Ｓｃｈｏｌｓ達、1990、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ，２０６、１０５−１１５）に富んでいる）には存在しない酵素活性を明らかに含んでいる。本発明に合ったペクチン様活性に関係する他の酵素の添加はワインの多糖類の劣化をより徹底的なものにし、濾過性能の改善、コロイド化および沈降物による障害の防止に役立つ。実施例１３Ｐ・シンプリシシウムＩＰＶＩの酵素抽出物によるリンゴジュースの多糖類の劣化１ｋｇのリンゴ（Ｓｐａｒｋｉｎｇ種）からリンゴジュースを作った。リンゴ全体を１ｃｍ厚のスライスに切り、１ｇのアスコルビン酸と50μｌのＲａｐｉｄａｓｅ（登録商標）Ｌｉｑ（ＧｉｓｔＢｒｏｃａｄｅｓ，フランス）酵素製剤を加え、撹拌しながら50℃の温度で２時間放置した。この果実を市販の酵素製剤の作用で液化し、その果汁を遠心分離で回収した。Ｒａｐｉｄａｓｅ（登録商標）Ｌｉｑは高レベルのペクチナーゼ（ペクチン、リアーゼ、エンド−およびエキソ−ポリガラクッロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、アラバナーゼ）、ヘミセルロース（ガラクタナーゼ、キシラナーゼ）およびセルラーゼ活性を有している。１５ｍｌの清浄なアップル・ジュースをＣｅｎｔｒｉｃｏｎ30のメンブレン（Ａｍｉｃｏｎ、ＵＳＡ）で限外濾過した。透析残留物（１００μｌ）を１．４ｍｌの５０ｍＭ、ｐＨ４．８酢酸緩衝液で吸収し、0.02％ＮａＮ₃の存在下で250 ℃の温度で培養し、以下をテストした：ａ：リンゴジュースの全多糖類を含んだ透析残留物200μｌ 50μｌのＨ₂Ｏｂ：リンゴジュースの総多糖類を含んだ透析残留物200μｌＰ・シンプリシシウムＩＰＶ１の酵素抽出物５０μｌを含む透析残留物２００μｌ４８時間後に各テストから２５μｌを取り、ＣＥＳ−ＨＰ分析した。分析結果（図１８）は、シンプリシシウムＩＰＶ１の酵素抽出物の添加でＲａｐｉｄａｓｅ（登録商標）Ｌｉｑ製剤による措置後に全ての残留多糖類が完全に劣化したことから、ＲＧ−IIを劣化させる酵素の相補的な効果を示している。特にＲＧ−II の特性ピーク（18.2分で溶出）は大きく劣化した。さらに、Ｒａｐｉｄａｓｅ（登録商標）Ｌｉｑ中に存在している酵素の作用に対して抵抗性を持つより大きな分子量を有する構造の劣化は、これらの画分がＲＧ−IIフラグメントを有していることを示唆している。エンド−β−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→３’）−Ｄ−アピオフラノシル・ヒドロラーゼまたはエンド−α−Ｌ−フコピラノシル−（１→４）−Ｌ−ラムノピラノシル・ヒドロラーゼ・タイプの活性を有するシンプリシシウムＩＰＶＩの全酵素抽出物は市販の酵素製剤（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒから作られ、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン様（ラムノガラクツロナーゼ・タイプを含む）活性を持っているとされている公知の全ての酵素製剤）には存在しない酵素活性を明らかに持っていることを示す。ＲＧ−IIを劣化させる相補的かつ付加的な効果がこのテストで確認された。実施例１４Ｐ・シンプリシシウムの酵素抽出物による果実と野菜の軟化Ｐ・シンプリシシウムＩＰＶ１の全酵素抽出物の野菜組織の分解活性が以下の果実および野菜でついて確認された。赤砂糖大根ニンジン ”Ｂｉｎｔｇｅ”ポテトゴールデン・アップル各果実または野菜の１５８×４×２ｍｍ断片を２ｍｌの50ｍＭ、ｐＨ４．８、酢酸緩衝液に入れ、さらに酵素テストを行うために以下のものを添加した。対照としてのＭＥＤ緩衝液２０μｌＰ・シンプリシシウムＩＰＶ１の全酵素抽出物200μｌ0.02％ＮａＮ₃の存在下、250 ℃の温度で７２時間培養し、ボルテックス内で激しく撹拌し（２×１０秒）、各テストを行い、写真撮影した。分析結果は以下の通りである。 (1) 砂糖大根およびニンジン組織はほとんど完全に分解された（図１９） (2) 軟化効果でポテトとリンゴの細胞懸濁液ができた（図２０）従って、エンド−β−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→３’）−Ｄ−アピオフラノシル・ヒドロラーゼまたはエンド−α−Ｌ−フコピラノシル−（１→４）−Ｌ −ラムノピラノシル・ヒドロラーゼ・タイプの活性を持つＰ・シンプリシシウムＩＰＶの全酵素活性は野菜組織を分解する作用を有している。結論ＲＧ−IIを劣化させる酵素活性は液相または固体支持体上で単独または他の酵素との組合わされて用いることができ、以下を可能にする： (1) 果実および野菜ジュース、これらの誘導体中のＲＧ−IIの約70％を劣化して、濾過能力を改善し、濃縮ジュースを作り易くし、透明化を促進し、最終製品の安定性を確保する。 (2) 果実や野菜ジュースおよびこれらの誘導体を濾過するために用いられるミクロフィルターおよび限外濾過基板を清浄化する。この酵素活性は植物のセルロース壁の劣化を促進し、植物線繊の軟化、液化あるいは全体的または部分的加水分解を必要とする以下のような応用で単独または他の酵素と組み合わせで用いることができる： (1) 果実ネクター、ピューレ、ジェリー、果実および野菜濃縮物およびワインを含むこれらの誘導体の生産のための軟化製剤 (2) 果実、野菜のジュース、アロマベースおよびワインを含むこれらの誘導体の生産や、ビール生産のための液化製剤 (3) 砂糖大根パルプ、果実加工後の固体残留物などの野菜残留物からのペクチンの生産 (4) 植物原料からの動物用飼料の生産 (5) 繊維産業（特に木綿）、製紙プラントからのセルロースの生産 (6) 植物残留物から植物防衛反応に活性を有するオリゴ糖類の生産。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０８Ｂ 37/06 Ｃ０８Ｂ 37/06 Ｃ１２Ｃ 11/00 Ｃ１２Ｃ 11/00 Ｃ１２Ｇ 1/02 Ｃ１２Ｇ 1/02 Ｃ１２Ｎ 1/14 Ｃ１２Ｎ 1/14 ＡＣ１２Ｐ 19/14 Ｃ１２Ｐ 19/14 Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｄ２１Ｃ 9/10 Ｄ２１Ｃ 9/10 Ｚ //(Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:80） (Ｃ１２Ｎ 1/14 Ｃ１２Ｒ 1:80） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ドコ，ティエリフランス国 34680 サン−ジョルジュ− ドルクリュピガル９ (72)発明者ウィリアム，パスカルフランス国 34090 モンペリエリュドゥラムネダ 20 レジダンスレジャルダンド’オー (72)発明者ヴィダル，ステファンフランス国 34000 モンペリエリュクロワ−ドゥ−ラ−カゼ 421 レジダンスルゴルフバティマン９ (72)発明者ムトゥネ，ミシェルフランス国 34080 モンペリエリュガブリエル−フォーレ 10

Claims

【特許請求の範囲】１．ラムノガラクトナンII（ＲＧ−II）およびその誘導体を劣化させる活性を有することを特徴とする酵素。２．エンド−ヒドロラーゼ・タイプの活性を有する請求項１の酵素。３．エンド−β−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→３’）−Ｄ−アピオフラノシル・ヒドロラーゼの活性を有する請求項１または２に記載の酵素。４．エンド−α−１−フコピラノシル−（１→４）−Ｌ−ラムノフラノシル・ヒドロラーゼ活性の活性を有する請求項１または２に記載の酵素。５．ＲＧ−IIおよびその誘導体を劣化させる活性を有することを特徴とする微生物、特に菌類。６．ペニシリウム種である請求項５の菌。７．ＣＮＣＭに寄託番号１−１５７８（ＬＡＶ２）で登録されている請求項５または６に記載の菌株。８．ＣＮＣＭに寄託番号１−１５７７（ＩＰＶ１）で登録されている請求項５および６に記載の菌株。９．請求項５〜８のいずれか一項に記載の株によって生産されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵素。１０．請求項１〜４および９のいずれか一項に記載の酵素を含むことを特徴とする酵素製剤。１１．以下の段階を含む請求項１〜４、９および１０のいずれか一項に記載の酵素または製剤を得る方法： (1) 請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵素の生産に適した培地で請求項５〜８のいずれか一項に記載の微生物を培養する段階 (2) 培養上澄液中またはつぶした微生物からの上澄液中で酵素または酵素製剤を回収する段階。１２．以下の段階を含む請求項１１に記載の方法： (1) ＲＧ−IIまたはその誘導体を含みかつ微生物に適合した培地で請求項５〜８のいずれか一項に記載の微生物を培養する段階 (2) 微生物を回収する段階 (3) 微生物をつぶす段階 (4) 非溶解性物質を除去する段階 (5) 酵素または酵素製剤を含んだ上澄液を回収する段階。１３．以下の段階を含む植物抽出物からＲＧ−IIを得る方法： (1) 植物抽出物に含まれている巨大分子を分離する段階 (2) ｐＨ４以上でのアニオン交換クロマトグラフィー。１４．沈降分離または限外濾過によって分離を行う請求項１１の方法。１５．アニオン交換クロマトグラフィーに続いて立体排除クロマトグラフィーを行う請求項１３または１４に記載の方法。１６．植物抽出物からＲＧ−IIを得るための少なくともＲＧ−II保持基材上での吸着クロマトグラフィー段階を含む方法。１７．吸着クロマトグラフィーが活性炭素またはポリスチレン／ジビニルベンゼン樹脂上で行われる請求項１６の方法。１８．少なくとも９５％ＲＧ−II単量体を含むことを特徴とする請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法で得られるＲＧ−II製剤。１９．少なくとも８０％、好ましくは９５％以上のＲＧ−II二量体を含んでいることを特徴とする請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法で得られるＲＧ −II製剤。２０．請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法で得られる微生物に適したＲＧ−II含有培地で微生物を成長させることを特徴とするＲＧ−IIを劣化させる能力を判定するための微生物、特に菌類のスクリーニング方法。２１．請求項１３〜１７のいずれかいずれか一項に記載の方法で得られることを特徴とするＲＧ−IIを含有した微生物のための培地。２２．ＲＧ−IIが請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法で得られる請求項１１〜１２のいずれか一項に記載の方法。２３．請求項１〜４、９および１０あるいは請求項１１および１２のいずれか一項に記載の方法で得られる酵素または酵素製剤のＲＧ−IIまたはその誘導体を劣化あるいは変性するための使用。２４．請求項１〜４、９および１０あるいは請求項１１または１２のいずれか一項に記載の方法で得られた酵素または酵素製剤の濾過性を改善し、濃縮果汁を作り易くし、透明化を促進するための使用。２５．請求項１〜４、９および１０のいずれか一項に記載の酵素または酵素製剤の果実、野菜の液およびこれらの誘導体を濾過するために用いられる濾過材を清浄化するための使用。２６．請求項１〜４、９および１０あるいは請求項１１または１２のいずれか一項に記載の方法で得られた酵素または酵素製剤の植物繊維をふやかし、液化または全面的あるいは部分的に加水分解のための使用。２７．アムセラーゼ・タイプの果汁、野菜濃縮物、およびワインを含むその誘導体調製における果汁ネクター、ピューレ、ジェリーを作るための請求項２６に記載の使用。２８．果汁および果実、野菜からのアロマ、ワインを含むこれらの誘導体の生産およびビール生産のための液化調合物での請求項２６の使用。２９．砂糖大根パルプなどの植物残滓および果実加工から生じる残滓からのペクチンの生産のための請求項２６の使用。３０．野菜原料からの動物飼料生産での請求項２９の使用。３１．繊維産業用植物、特に木綿からのセルロースの生産および紙の生産での請求項２６の使用。３２．植物防衛反応活性を強化した植物防疫製品として利用可能なオリゴ糖類を植物残滓から生産するための請求項２６に記載の使用。