SK156697A3 - Enzyme degrading rhamnogalacturonane ii and its derivatives, process for manufacturing this enzyme and rhamnogalacturonane ii, and application of the enzyme - Google Patents
Enzyme degrading rhamnogalacturonane ii and its derivatives, process for manufacturing this enzyme and rhamnogalacturonane ii, and application of the enzyme Download PDFInfo
- Publication number
- SK156697A3 SK156697A3 SK1566-97A SK156697A SK156697A3 SK 156697 A3 SK156697 A3 SK 156697A3 SK 156697 A SK156697 A SK 156697A SK 156697 A3 SK156697 A3 SK 156697A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- enzyme
- degradation
- preparation
- derivatives
- plant
- Prior art date
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 98
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 98
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 40
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 21
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 34
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 34
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 claims abstract description 11
- LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N n-(2-chloroethyl)-n-nitrosomorpholine-4-carboxamide Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)N1CCOCC1 LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 88
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 87
- 235000014101 wine Nutrition 0.000 claims description 51
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 42
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 36
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 36
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 35
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 27
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 27
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 17
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 claims description 13
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 claims description 13
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 12
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 12
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 12
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 claims description 11
- 235000012055 fruits and vegetables Nutrition 0.000 claims description 11
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 claims description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 11
- 239000008914 rhamnogalacturonan II Substances 0.000 claims description 10
- 239000001814 pectin Substances 0.000 claims description 8
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 7
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims description 7
- 230000008030 elimination Effects 0.000 claims description 7
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 claims description 7
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 7
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 7
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 6
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 5
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 claims description 5
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 claims description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 5
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 claims description 5
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000021537 Beetroot Nutrition 0.000 claims description 4
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 235000015203 fruit juice Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000002803 maceration Methods 0.000 claims description 4
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 3
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 claims description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 3
- 235000020400 fruit nectar Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000003825 pressing Methods 0.000 claims description 3
- 239000004753 textile Substances 0.000 claims description 3
- 235000015192 vegetable juice Nutrition 0.000 claims description 3
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 2
- 230000004665 defense response Effects 0.000 claims description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims 2
- XRCFXMGQEVUZFC-UHFFFAOYSA-N anisindione Chemical group C1=CC(OC)=CC=C1C1C(=O)C2=CC=CC=C2C1=O XRCFXMGQEVUZFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229960002138 anisindione Drugs 0.000 claims 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims 1
- 238000005243 fluidization Methods 0.000 claims 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 claims 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 abstract description 20
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 abstract description 20
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 abstract description 10
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 abstract description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 74
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 39
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 39
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 39
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 39
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- 241000228129 Penicillium janthinellum Species 0.000 description 29
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 20
- 241000909530 Penicillium daleae Species 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 13
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 10
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 9
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 9
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 9
- 230000009471 action Effects 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 8
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 8
- 235000020095 red wine Nutrition 0.000 description 8
- 241000220225 Malus Species 0.000 description 7
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 7
- 230000002351 pectolytic effect Effects 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- AEMOLEFTQBMNLQ-YMDCURPLSA-N D-galactopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-YMDCURPLSA-N 0.000 description 6
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- 229960003082 galactose Drugs 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 5
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 5
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 description 5
- 235000021016 apples Nutrition 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 5
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 5
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 5
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 4
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 4
- 101001096557 Dickeya dadantii (strain 3937) Rhamnogalacturonate lyase Proteins 0.000 description 4
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 4
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 4
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 4
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 108010093305 exopolygalacturonase Proteins 0.000 description 4
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 4
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 4
- PAIOZXJXGSOKFN-UHFFFAOYSA-N Aceric acid Natural products CC1OC(O)C(O)C1(O)C(O)=O PAIOZXJXGSOKFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AVGPOAXYRRIZMM-UHFFFAOYSA-N D-Apiose Natural products OCC(O)(CO)C(O)C=O AVGPOAXYRRIZMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ASNHGEVAWNWCRQ-LJJLCWGRSA-N D-apiofuranose Chemical compound OC[C@@]1(O)COC(O)[C@@H]1O ASNHGEVAWNWCRQ-LJJLCWGRSA-N 0.000 description 3
- ASNHGEVAWNWCRQ-UHFFFAOYSA-N D-apiofuranose Natural products OCC1(O)COC(O)C1O ASNHGEVAWNWCRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 3
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 150000001224 Uranium Chemical class 0.000 description 3
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 3
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 3
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 3
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 3
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 3
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 3
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 3
- 229920003053 polystyrene-divinylbenzene Polymers 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- VCUILRLOJMHSMR-WNJXEPBRSA-N (2s,3r,4r,5s)-3,4,5-trihydroxy-2-methoxyhexanal Chemical compound CO[C@H](C=O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O VCUILRLOJMHSMR-WNJXEPBRSA-N 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 2
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 2
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 2
- HMFHBZSHGGEWLO-HWQSCIPKSA-N L-arabinofuranose Chemical compound OC[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 2
- 241000446313 Lamella Species 0.000 description 2
- 235000011430 Malus pumila Nutrition 0.000 description 2
- 235000015103 Malus silvestris Nutrition 0.000 description 2
- VCUILRLOJMHSMR-UHFFFAOYSA-N O2-Methyl-D-fucose Natural products COC(C=O)C(O)C(O)C(C)O VCUILRLOJMHSMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 2
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 235000015197 apple juice Nutrition 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 235000019987 cider Nutrition 0.000 description 2
- 239000003245 coal Substances 0.000 description 2
- 239000002361 compost Substances 0.000 description 2
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 2
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 2
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 description 2
- 108010002430 hemicellulase Proteins 0.000 description 2
- 229940059442 hemicellulase Drugs 0.000 description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- -1 phenylmethylsulfonyl Chemical group 0.000 description 2
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000010801 sewage sludge Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 235000020097 white wine Nutrition 0.000 description 2
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ALNDFFUAQIVVPG-SRQIZXRXSA-N 2-O-Methyl-D-xylose Chemical compound CO[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)CO ALNDFFUAQIVVPG-SRQIZXRXSA-N 0.000 description 1
- USSIQXCVUWKGNF-UHFFFAOYSA-N 6-(dimethylamino)-4,4-diphenylheptan-3-one Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(CC(C)N(C)C)(C(=O)CC)C1=CC=CC=C1 USSIQXCVUWKGNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000003930 Aegle marmelos Nutrition 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 101710152845 Arabinogalactan endo-beta-1,4-galactanase Proteins 0.000 description 1
- 241000228215 Aspergillus aculeatus Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- 241000218631 Coniferophyta Species 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N D-glucopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N 0.000 description 1
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 description 1
- 101710147028 Endo-beta-1,4-galactanase Proteins 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000011993 High Performance Size Exclusion Chromatography Methods 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 241000218922 Magnoliophyta Species 0.000 description 1
- 229920000057 Mannan Polymers 0.000 description 1
- ALNDFFUAQIVVPG-UHFFFAOYSA-N O2-methyl-D-xylose Natural products COC(C=O)C(O)C(O)CO ALNDFFUAQIVVPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000003273 Passiflora laurifolia Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 235000005138 Spondias dulcis Nutrition 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- GEEIPHPXFCSZGY-WTFGDDLMSA-N [(2S,3S,4S,5S)-5-acetyloxy-2,3,4-trimethoxyhexyl] acetate Chemical compound CC(=O)OC[C@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](C)OC(C)=O GEEIPHPXFCSZGY-WTFGDDLMSA-N 0.000 description 1
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-SXUWKVJYSA-N alpha-L-fucose Chemical compound C[C@@H]1O[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-SXUWKVJYSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-HGVZOGFYSA-N alpha-L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-HGVZOGFYSA-N 0.000 description 1
- 108010044879 alpha-L-rhamnosidase Proteins 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 125000000328 arabinofuranosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 235000021028 berry Nutrition 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactopyranuronic acid Natural products OC1OC(C(O)=O)C(O)C(O)C1O AEMOLEFTQBMNLQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010049297 beta-L-arabinosidase Proteins 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-YJRYQGEOSA-N beta-L-rhamnopyranose Chemical class C[C@@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-YJRYQGEOSA-N 0.000 description 1
- 125000002837 carbocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000021448 clear apple juice Nutrition 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 108010092028 endopolygalacturonase II Proteins 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 150000002085 enols Chemical class 0.000 description 1
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 1
- WQMLFJWIKARBFW-BKKMTDGVSA-N evomonoside Chemical group O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1C[C@@H](CC[C@H]2[C@]3(CC[C@@H]([C@@]3(C)CC[C@H]32)C=2COC(=O)C=2)O)[C@]3(C)CC1 WQMLFJWIKARBFW-BKKMTDGVSA-N 0.000 description 1
- 235000019985 fermented beverage Nutrition 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000004362 fungal culture Methods 0.000 description 1
- 150000002243 furanoses Chemical class 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 235000021579 juice concentrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000006140 methanolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 235000008486 nectar Nutrition 0.000 description 1
- 230000001151 other effect Effects 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 230000001936 parietal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000003415 peat Substances 0.000 description 1
- 108020004410 pectinesterase Proteins 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 108010070456 protopectinase Proteins 0.000 description 1
- 150000003214 pyranose derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000009754 rhamnogalacturonan I Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003892 tartrate salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D65/00—Accessories or auxiliary operations, in general, for separation processes or apparatus using semi-permeable membranes
- B01D65/02—Membrane cleaning or sterilisation ; Membrane regeneration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
- A23L2/70—Clarifying or fining of non-alcoholic beverages; Removing unwanted matter
- A23L2/84—Clarifying or fining of non-alcoholic beverages; Removing unwanted matter using microorganisms or biological material, e.g. enzymes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D41/00—Regeneration of the filtering material or filter elements outside the filter for liquid or gaseous fluids
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B08—CLEANING
- B08B—CLEANING IN GENERAL; PREVENTION OF FOULING IN GENERAL
- B08B7/00—Cleaning by methods not provided for in a single other subclass or a single group in this subclass
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12G—WINE; PREPARATION THEREOF; ALCOHOLIC BEVERAGES; PREPARATION OF ALCOHOLIC BEVERAGES NOT PROVIDED FOR IN SUBCLASSES C12C OR C12H
- C12G1/00—Preparation of wine or sparkling wine
- C12G1/02—Preparation of must from grapes; Must treatment and fermentation
- C12G1/0203—Preparation of must from grapes; Must treatment and fermentation by microbiological or enzymatic treatment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12H—PASTEURISATION, STERILISATION, PRESERVATION, PURIFICATION, CLARIFICATION OR AGEING OF ALCOHOLIC BEVERAGES; METHODS FOR ALTERING THE ALCOHOL CONTENT OF FERMENTED SOLUTIONS OR ALCOHOLIC BEVERAGES
- C12H1/00—Pasteurisation, sterilisation, preservation, purification, clarification, or ageing of alcoholic beverages
- C12H1/003—Pasteurisation, sterilisation, preservation, purification, clarification, or ageing of alcoholic beverages by a biochemical process
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01171—Rhamnogalacturonan hydrolase (3.2.1.171), i.e. rhamnogalacturonase
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D2321/00—Details relating to membrane cleaning, regeneration, sterilization or to the prevention of fouling
- B01D2321/16—Use of chemical agents
- B01D2321/166—Use of enzymatic agents
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Rhamnogalakturonan II je univerzálna a veľmi zložitá časť bunečných stien rastlín (O' Neill a koi., Methods in Plánt Biochemistry (1990) 2, 415 - 439). Patrí k pektickým polysacharidom a je esenciálne prítomný na úrovni strednej lamely a primárnej bunečnej steny.
Jeho štruktúra je extrémne zložitá (obrázok 1), pretože sa skladá z 12 rôznych monosacharidov pre jeden polymerizačný stupeň (dp) blízky 30. Táto zložitosť je podporovaná prítomnosťou málo sa vyskytujúcich cukrov v jeho kompozícii, ktorá obsahuje: apiózu alebo 3-C-(hydroxymetyl)-D-glycerotetrózu; KDO alebo 2-keto-3deoxy-D-mano-oktulozonikovú kyselinu; DHA alebo 3-deoxy-D-lyxo-heptulosarikovú kyselinu, 2-O-metyl-fukózu, 2-O-metyl-xylózu a konečne octovú kyselinu alebo 3-Ckarboxy-5-deoxy-L-xylózu. Posledný monosacharid vytvára špecifický markér pre RG-II. Najbežnejšie monosacharidy v polysacharidoch bunečných stien, rhamnóza, fukóza, arabinóza, galaktóza a galakturonová kyselina a glukuronová kyselina sú rovnako prítomné v kompozícii RG-II, najčastejšie s anomérmi a s násobnými typmi väzieb, ktoré posilňujú špecifitu a zložitosť štruktúry molekuly.
Ultraštrukturálna organizácia RG-II (obrázok 1) vedie k zvýšeniu tejto zložitosti (Puvanesarajah a kol., Carbohydr. Res. (1991) 218, 211 - 242). Homologická reťaz a zloženina 7 až 14 zvyškov kyseliny galakturonovej, viazaných priamo v alfa (1 4) nesie veste nedeterminovaných pozíciách 4 rôzne vetvy: dva disacharidy a dva
30833/H reťazce viacerých zložitých okta- alebo nonasacharidov. Pozorujú sa rôzne štruktúry, čo sa týka dĺžky homogalakturonového reťazca a konca vetvy B a podobne enzymatické účinky potrebné na jeho získanie. Na druhej strane bola detegovaná prítomnosť ešte neidentifikovaných substituentov na zvyšku A5. Okrem toho obsahuje molekula RG-II 2 až 3 metylové zoskupenia, ktoré esterifikujú
I karbocyklické zoskupenie galakturonových kyselín a dve acetylové zoskupenia situované na zvyškoch R3 (acerová kyselina) a B4' (2-O-metyl-fukóza).
Štruktúra RG-II bola takto všeobecne určená, dokonca i keď povaha istých substituentov nebola ešte identifikovaná.
V bunečnej stene rastlín je RG-II asociovaný s prírodnými pektínmi, avšak presný typ väzby medzi protopektínom a RG-II je ešte neznámy. Ostatne, tiež jeho úloha v rastlinnej stene je neznáma. Možno teda povedať, že je prítomný v celom rastlinstve (Albersheim a kol., Biochem. Soc. Transactions (1994) 22, 374 - 378) ; od pteridofytov do spermatofytov, od gymnospermov do angiospermov, od monokotyledónov do dikotyledónov (obrázok 2) a v nezanedbateľnom množstve v strednej lamele steny. Tiež je známe, že jeho štruktúra je zachovaná u rôznych rastlín, kde bol študovaný (Albersheim a koľ, Biochem. Soc. Transactions (1994), 22, 374 - 378).
Posledné práce ukázali, že môže reagovať ako signálny polysacharid a indukovať špecifickú odpoveď rastliny (elicitický účinok) (Aldington a Fry, J. Exp. Botany (1994) 45, 287 - 293). Avšak z jeho hojnosti, jeho všadepritomnosti a zo zložitosti jeho štruktúry možno predpokladať, akú základnú úlohu hrá v kohézii bunečných rastlinných stien, a teda v bunečnej organizácii rastlinných látok.
RG-II sa uvoľňuje z bunečných stien akciou enzýmov s pektolytickým účinkom (pektínesteráza, endo- alebo exopolygalakturonáza), ktoré degradujú reťazce prírodných pektínov a uvoľňujú RG-II v nedegradovanej forme (Darvill a kol., Plánt. Physiol. (1978) 62, 418 - 422), ako dokladá obrázok 1. Rozdielnosť dĺžky reťazca berie do úvahy enzymatické degradácie, ktoré umožnili jeho uvoľňovanie z prírodných pektínov (Whitcombe a kol., Carbohydr. Res. (1995) 271, 15 - 29).
Zložitosť a originalita štruktúry RF-II spôsobuje jeho zvláštnu rezistenciu voči degradácii enzýmami prítomnými v extraktoch rastlín, ako i v komerčných enzymatických preparátoch ako pôvodu fungicídneho, tak bakteriálneho.
30833/H
Žiaden degradačný účinok nemôže v skutočnosti jasne ukázať v komerčných enzymatických prípravkoch degradáciu bunečných stien rastlín bohatšiu na rôzne účinky. Samotné pozorované degradácie sa týkajú zvyškov arabinofuranózy, rhamnopyranózy alebo galaktopyranózy ležiacich na neredukujúcich koncoch bočných reťazcov. Exo-enzýmy dovoľujú uvoľnenie takýchto rezíduí, existujúcich v skutočnosti bežne v enzymatickej príprave; čo sa vysvetľuje nepochybne pozorovanou rozdielnosťou medzi rôznymi prípravami RG-ll, popisovanými rôznymi autormi.
Počas lisovania alebo drvenia ovocia a zeleniny sa uvoľňujú pektolytické účinky, ktoré spôsobujú degradáciu homogalakturonových reťazcov prírodných pektínov. Tieto účinky sú posilňované prídavkom komerčných pektolytických enzýmov a fermentačnou flórou v prípade vína a fermentovanými produktmi. RG-II sa uvoľňuje v intaktnej forme a v množstve často významnom v ovocných a zeleninových šťavách alebo nektároch v ich derivátoch, najmä vo víne.
Vo víne predstavuje RG-II jeden z hlavných polysacharidov (Doco a Brillouet, Carbohydr. Res. (1993) 243, 333 - 343), jeho koncentrácia môže dosahovať 100 mg/l. Podieľa sa na množstve nežiaducich javov, ako je zanesenie filtračných membrán (Belleville a kol., Enol. Vitie. Sci. (1991) 46, 100 - 107), utváranie nestabilných komplexov s inými koloidnými makromolekulami a indukciu precipitačných javov. Jeho eliminácia nutne prebieha za použitia špecifických enzýmov spôsobujúcich jeho degradáciu.
Doteraz boli popísané rôzne metódy získania RG-ll z vína:
- enzymatickou hydrolýzou s pomocou fungicídnych endopolygalakturonáz izolovaných z kultúr rastlinných buniek v suspenzii (Darvill a kol., Plánt Physiol. (1978) 62, 418-422), použitím komerčného enzymatického prípravku z Aspergillus niger, Pectinolu AC (Stevenson a kol., Carbohydr. Res. (1988) 179, 269 - 288), RG-ll je tu prítomný vo forme slabej koncentrácie a jeho čistenie implikuje množstvo eliminačných etáp proteínov a farbiacej látky,
30833/H
- z vína (Doco a Brillouet, Carbohydr. Res. (1993) 243, 333 - 343), popísané čistenie bolo úspešne vykonané v 4 etapách sterickou vylučovacou chromatografiou (CES) alebo iónovou výmenou.
Zistilo sa, že rhamnogalakturonan I alebo RG-I, i keď má veľmi blízke meno, je celkom odlišnou časťou rastlinnej bunečnej steny v porovnaní s RG-II ako z hľadiska štruktúrneho pohľadu (jeho štruktúra je založená na striedaní rhamnózy a galakturonovej kyseliny), tak svojou degradáciou enzýmami. Účinky rhamnogalakturonázy (Schols a kol., Carbohydr. Res. (1990) 206, 105 - 115) alebo protopektinázy (Sakamoto a Sakai, Carbohydr. Res. (1994) 259, 77 - 91) boli už popísané.
Z ďalej uvedenej analýzy stavu techniky vyplýva, že nie je známy žiaden enzým alebo enzymatický prípravok predstavujúci dostatočný degradačný účinok na RG-li. Preto je prítomnosť tohto polysacharidu zdrojom nežiaducich javov, ako je zanášanie filtračných membrán, utváranie nežiaducich komplexov s ďalšími koloidnými makromolekulami a indukcia precipitačných javov.
Ekonomickým dôsledkom uvedených nežiaducich skutočností v tomto prípade bola nutnosť nájsť riešenie daného problému.
Podstata vynálezu
Predložené riešenie podľa vynálezu ukazuje, že je možné izolovať enzýmy spôsobujúce degradáciu RG-II a jeho derivátov, z mikroorganizmov.
Ďalším novým vynájdeným predmetom je spôsob prípravy látky RG-II, dovoľujúci získať jej veľké množstvo z rôznych rastlinných zdrojov.
Ďalším predmetom vynálezu je enzým, ktorý degraduje RG-II a jeho deriváty.
Podstatou predloženého vynálezu je látka RG-II, celý polysacharid, majúci štruktúru vyznačenú na obrázku 1, ktorý je buď vo forme monoméru alebo diméru a celá výsledná molekula je produktom čiastočnej degradácie a obsahuje najmenej jeden fragment reťaze A, B, C alebo D charakterizujúci ako kompozíciu, tak i jej sekvenciu.
V ďalšom texte všetky skutočnosti vzťahujúce sa k látke RG-II platia tiež pre deriváty jej molekuly.
30833/H
Enzým, ktorý obzvlášť výhodne predstavuje popísaný účinok, je endohydrolázového typu.
Takýto enzým môže obzvlášť predstavovať účinok endo-beta-Lrhamnopyranozyl-(1->3')-D-apiofuranozyl hydrolázy a/alebo endo-alfa-Lfukopyranozyl-(1-»4)-L-rhamnopyranozyl hydrolázy. Ich účinok možno určiť možnosťou uvoľňovať reťazec A, ako je znázornené na obrázku 1.
Tento enzým môže byť produkovaný mikroorganizmom, najmä hubou druhu Penicillium.
Mikroorganizmy tohto druhu majúce degradačný účinok na látku RG-II a jej deriváty, predstavujú ďalší predmet vynálezu. Sú to najmä kmene Penicillium, ktoré boli následne deponované dňa 19. mája 1995 v Collection Nationale de Cultures des Microorganismes de ľlnstitut Pasteur (CNCM) - Národnej zbierke kultúr mikroorganizmov pri Pasteurovom inštitúte:
- kmeň Penicillium simplicissimum, deponovaný u CNCM pod označením n° 11577 (IPV1),
- kmeň Penicillium daleae, deponovaný u CNCM pod označením n° 1-1578 (LaV2).
Obidva tieto kmene húb predstavujú predmet vynálezu, ktorého podstatou sú huby s rýchlou produkciou (od šiesteho dňa pestovania) modrozelených spór.
Penicillium daleae je menej bežná huba, izolovaná z lesnej pôdy a ktorá je známa pre svoju kapacitu degradovať amidón a pektické polysacharidy. Tento druh je popísaný v publikácii „Compendium of Soil Fungi,,, H. K. Γomsch, W. Gams a T. H. Anderson (1980), Academic Press, London, str. 560.
Penicillium simplicissimum je viac známy kmeň častejšie izolovaný z dekomponovaných rastlín. Tento druh je popísaný v publikácii „Compendium of Soil Fungi,,, H. K. Domsch, W. Gams a T. H. Anderson (1980), Academic Press, London str. 597 - 598.
Predložený vynález sa tiež týka enzymatických prípravkov obsahujúcich enzým degradujúci látku RG-II a jej deriváty, ako je uvedené vyššie.
30833/H
Tieto enzýmy však môžu byť vo forme prípravkov, obsahujúcich iné enzýmy predstavujúce iné účinky.
Obohatenie týchto prípravkov o účinky predstavujúce degradáciu látky RG-ll ponúka celkom nový potenciál pre všetky aplikácie vyžadujúce čiastočnú alebo úplnú degradáciu bunečnej steny a rastlinných polysacharidov.
Enzýmy dovoľujúce špecifickú degradáciu látky RG-II a ich derivátov môžu byť použité na degradáciu alebo modifikáciu látky RG-II alebo jej derivátov, a to najmä v nasledujúcich aplikáciách:
- eliminácia RG-II zo štiav ovocia, zeleniny a ich derivátov, aby sa zlepšila filtrovateľnosť, uľahčila výroba štiav a koncentrovaných aromatických báz, uľahčilo sa čistenie a zaistila sa dobrá stabilita finálnych pi jduktov,
- čistenie membrán mikro- a ultrafiltráciou, použitých na čistenie štiav ovocia, zeleniny a ich derivátov,
- získanie prípravkov typu macerázy, t.j. prípravkov dovoľujúcich disociáciu bunečných látok mladých rastlín s minimálnou degradáciou parietálnych štruktúr (výroba ovocných nektárov, pyré, želé a koncentrátov ovocia a zeleniny),
- získanie stekutených prípravkov, t.j. pred vykonaním celkovej hydrolýzy polysacharidov bunečných stien rastlín (výroba štiav na báze aromatického ovocia, zeleniny a fermentované nápoje, pivo),
- výroba pektínov a krmív pre zvieratá zo zvyškov rastlín (dužina repy, pevné zvyšky po vylisovaní ovocia, ...),
- výroba celulózy z rastlín; enzymatická hydrolýza ďalších zložiek polysacharidov dovoľuje v skutočnosti zlepšiť výťažok výroby (textilný priemysel, výroba papiera).
Komerčné enzymatické prípravky umožňujúce degradáciu bunečných stien rastlín musia mať spôsob biochemického účinku najpresnejšie a najlepšie definovaný, podľa typu skúmaného použitia. Špecifický prínos enzýmov degradujúcich RG-II a majúcich presný a dobre determinovaný spôsob účinku, je v zmysle jedného z najlepších využití potenciálnych technológií, používajúcich enzýmy z húb.
30833/H
Enzýmy a enzymatické prípravky podľa predloženého vynálezu, vyššie popísané, sa môžu výhodne získať spôsobom, ktorý zahrňuje nasledujúce etapy:
- dodanie mikroorganizmov majúcich degradačný účinok na RG-II alebo jeho deriváty do prostredia adaptovanej kultúry na produkciu týchto enzýmov,
- opätovné zobratie enzýmu alebo enzymatického prípravku v supernatänte kultúry alebo v supernatantoch drviny mikroorganizmov.
Spôsob výhodne pozostáva z nasledujúcich etáp:
- dodanie mikroorganizmov majúcich degradačný účinok na RG-II do prostredia adaptovanej kultúry na produkciu týchto enzýmov a obsahujúcej RG-II,
- opätovné zobratie mikroorganizmov,
- rozdrvenie mikroorganizmov,
- eliminácia nerozpustenej látky, najmä filtráciou alebo centrifugovaním rozdrvených mikroorganizmov a
- opätovné zobratie supernatantu, obsahujúceho enzýmy alebo enzymatický prípravok.
Enzýmy môžu byť priamo obsiahnuté v supernatante kultúry, bez drviny mikroorganizmov, keď to podmienky dovoľujú, voliace také podmienky alebo kmene takého druhu, že enzýmy sú uvoľnené v danom prostredí.
Výhodne tento spôsob prípravy prebieha s pomocou kmeňov Penicillium deponovaných v zbierke kultúr CNCM pod číslami N° 1-1577 a N°1-1578.
Tieto enzýmy možno tiež získať pomocou genetického inžinierstva, po klonovaní génu alebo génov zodpovedných za ich syntézu alebo celkom inou technikou dostupnou odborníkovi v odbore, najmä syntézou vychádzajúcou z jednotlivých aminokyselín, po identifikácii ich sekvencií.
Predložený vynález sa tiež týka spôsobu získania RG-II a jeho metabolitov alebo derivátov z extraktov rastlinného pôvodu, ktorého podstata spočíva v tom, že zahrňuje chromatografovanie uvedeného extraktu.
30833/H
Je zrejmé, že sa spôsob týka nielen získania látky RG-II, ale tiež produktov degradácie ich molekuly,, ktoré sa môžu tvoriť, keď prebieha spôsob prípravy a ktoré sa nazývajú metabolity, ako i všetkých derivátov látky RG-II:
V predloženom vynáleze sa chápe pod pojmom „extrakt rastlinného pôvodu,, každá príprava obsahujúca obzvlášť rozpustné polysacharidy rastlinného pôvodu. Polysacharidy môžu byť podrobené etape koncentrácie, buď ultrafiltráciou alebo precipitáciou, napríklad z etanolu, metanolu alebo ostatných adekvátnych rozpúšťadiel.
Spôsob môže tiež zahrňovať aspoň jednu etapu chromatografickej aniónovej výmeny, pri pH slabo kyslom alebo neutrálnom, výhodne väčšom ako 4. Adsorpčná chromatografia prebieha na kolónach DEAE alebo QEAE.
Spôsob môže tiež zahrňovať aspoň jednu etapu adsorpčnej chromatografie RG-II na nosiči zadržiavajúcom RG-II. Adsorpčnú chromatografiu možno vykonávať na aktívnom uhlí, v kolóne s náplňou polystyrén - divinylbenzén alebo na inej vhodnej náplni.
Je možné pridať, pred a/alebo po chromatografickej etape, etapu separácie polysacharidov, buď frakcionačnou precipitáciou alebo ultrafiltráciou alebo sterickou vylučovacou chromatografiou. Na uskutočnenie frakcionačnej precipitácie sa výhodne používa etanol alebo metanol. Na vykonanie sterickej vylučovacej chromatografie sa výhodne používa kolóna so „sephakrylom,, alebo iným vhodným nosičom.
Predložený vynález sa medzi iným týka prípravkov, ktoré sa získajú niektorým z týchto spôsobov:
- časť prípravkov obsahuje majoritne (t. j. najmenej 95 %) monomérov látky RG-II, a druhá časť prípravkov obsahuje najmenej 80 %, výhodne viac ako 95 % dimérov látky RG-II.
Po každej chromatografii sa určí, vďaka zloženiu, aké frakcie látka RG-II obsahuje. Táto operácia je dostupná odborníkovi v odbore.
Uvedené spôsoby dovoľujú ľahko získať prípravky vo významnom množstve (rádovo kilogramov) rhamnogalakturonanu II zo všetkých produktov rastlinného
30833/H pôvodu, s výnimkou tých, ktoré pochádzajú z tráv, ako sú šťavy ovocia, zeleniny a ich derivátov, najmä vína, obzvlášť koncentrovaného vína, vína zlej kvality a vínneho muštu a tých, ktoré sú v rozmedzí desiatky gramov. Látka RG-II sa výhodne získa z primárnych stien rastlín, ale je možné ju tiež izolovať z každého produktu odvodeného od rastlín umožňujúceho rozpustnosť bunečnýc i stien, buď v priebehu spôsobu tradičnej transformácie (lisovanie, fermentácia,...) alebo pôsobením s pomocou enzýmov v tekutine.
Ďalším predmetom predloženého vynálezu je spôsob selekcie mikroorganizmov, špeciálne húb, vzhľadom k ich schopnosti degradovať látku RG-II, ktorého podstata spočíva v tom, že mikroorganizmy sa nechajú množiť v prispôsobenom kultivačnom prostredí obsahujúcom danú látku RG-II.
Vynález sa tiež týka kultivačného prostredia pre mikroorganizmy, ktorého podstata spočíva v tom, že obsahuje látku RG-II.
Spôsob podľa predkladaného vynálezu, obzvlášť spôsoby výroby a izolácie enzýmov podľa predkladaného vynálezu, rovnako tak ako spôsob výroby látky RG-II môžu byť vykonané odborníkom na základe iba prečítania predloženého popisu vynálezu a jeho všeobecných znalostí. Avšak je možné ako referencie použiť nasledujúci manuál: Methods in Microbiology, zv. 1 až 6, J. R. Morris a D. W. Ríbbons (1969 - 1972), Academic Press, London, New York.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Predložený vynález bude bližšie vysvetlený prostredníctvom konkrétnych príkladov vyhotovenia, ktoré predmet vynálezu nijako neobmedzujú.
!
Popis predmetu vynálezu a príklady jeho vyhotovenia sa odvolávajú na pripojené obrázky, na ktorých
Obr. 1 predstavuje schematicky štruktúru rhamnogalakturonanu II, zahrňujúcu jeho štyri bočné reťazce A až D. Na tomto obrázku R1 predstavuje atóm vodíka alebo alfa-L-rhamnopyranózu a R2 a R3 predstavujú atóm vodíka alebo iný substituent.
Obr. 2 znázorňuje rozdelenie RG-II v rastlinnej ríši.
30833/H
Obr. 3 znázorňuje frakcionáciu polysacharidov, kyslých cukrov a neutrálnych cukrov vína na kolóne DEAE (Macroprep).
Obr. 4A a 4B sú profily vysokovýkonnej sterickej vylučovacej chromatografie (CES-HP) u dvoch frakcií RG-II, izolovaných z červeného vína.
Obr. 5 ukazuje profily vysokovýkonnej sterickej vylučovacej chromatografie na kolóne Superdex-75 HR u dvoch frakcií RG-II získan ch čistením vínneho koncentrátu:
a) frakcie III, dimér RG-II (molekulová hmotnosť 9500 Da, vymývaná po 18,5 min).
b) frakcie II, monomér RG-II (molekulárna hmotnosť 4750 Da, vymývanie po 20,5 min.).
Obr. 6 je schéma čistenia RG-I základnej úrovne.
Obr. 7 je porovnanie profilov, určených pomocou CES-HP na kolóne Superdex-75 HR, u celkových polysacharidov červeného vína (a) s frakciou, ktorá nie je zadržaná na živici Relite® DIAION® (b) s frakciou, ktorá je zadržaná a potom vymytá etanolom 20 % (c).
Obr. 8 znázorňuje degradáciu RG-II rozpustným bunečným extraktom Peniciliium simplicissimum (1-1577). Spektrá a, b a c zodpovedajú pôvodnému RG-II a RG-II po 24 hodinách a 48 hodinách degradácie.
Obr. 9 znázorňuje degradáciu RG-II rozpustným bunečným extraktom kmeňa P. daleae LaV2 (1-1578) (a: pôvodná RG-II, b: po 96 hodinách, c: po 168 hodinách, d: po 190 hodinách).
Obr. 10 znázorňuje degradáciu, nasledovanú chromatografiou CES-HP, pre RG-II kultúru Peniciliium simplicissimum (1-1577). Krivky a až f predstavujú spektrum pôvodného RG-ll a spektrá RG-ll po 96 hodinách, po 132 hodinách, po 168 hodinách, po 190 hodinách a po 400 hodinách rastu huby.
Obr. 11 znázorňuje degradáciu RG-ll kultúrou P. daleae (1-1578), nasledovanou chromatografiou CES-HP, po rôznych dobách (a: pôvodná RG-ll, b: po 72 hodinách, c: po 120 hodinách, d: po 240 hodinách, e: po 264 hodinách, f: po 336 hodinách, g: po 384 hodinách).
30833/H
Obr. 12 predstavuje zjednodušenú štruktúru z obr. 1. Sú znázornené miesta potenciálneho štiepenia enzýmu podľa predkladaného vynálezu, označené šipkami 1 a 2.
Obr. 13 znázorňuje štruktúru reziduálnej frakcie RG-II po jeho degradácii, spôsobenej Penicillium simplicissimum a P. daleae.
Obr. 14 znázorňuje dimerickú degradáciu RG-II kultúrou P. daleae (1-1578). Spektrá a až c predstavujú spektrum pôvodného dimerického RG-II a spektra RG-II po 168 hodinách a po 300 hodinách degradácie.
Obr. 15 znázorňuje degradáciu, nasledovanú chromatografiou CES-HP, čisteného RG-II úplným rozpustným bunečným extraktom Penicillium simplicissimum (1-1577). Spektrá a až d zodpovedajú pôvodnému RG-II a RG-II po 72 hodinách, po 120 hodinách a po 148 hodinách inkubácie.
Obr. 16 je porovnanie profilov polysacharidov, určených pomocou CES-HP červeného vína (spektrum a) a po 48 hodinách inkubácie v prítomnosti enzymatického extraktu IPV 1 (spektrum b).
Obr. 17 je porovnanie CES-HP profilov polysacharidov červeného vína (spektrum a) a po 48 hodinách inkubácie v prítomnosti Pectinex® Ultra Sp L samotného (spektrum b) a/alebo spojeného s enzymatickým extraktom kmeňa IPV1 (spektrum c).
Obr. 18 je porovnanie CES-HP profilov polysacharidov jablčného muštu, získaného úplným stekutením ovocia enzymatickým prípravkom Rapidase® Liq) po 48 hodinách inkubácie za absencie (spektrum a) a v prítomnosti (spektrum b) enzymatického extraktu kmeňa IPV1.
Obr. 19A a 19B znázorňujú degradáciu tkaniva červenej repy (obr. 19A) enzymatickým extraktom kmeňa IPV1 v porovnaní s porovnávacou vzorkou (obr. 19B).
Obr. 19C, 20A a 20C predstavujú degradáciu enzymatickým extraktom kmeňa IPV1 u tkaniva mrkvy, jablka a zemiaku v porovnaní so zodpovedajúcimi porovnávacími vzorkami (obr. 19D, 20B a 20D).
30833/H
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Čistenie rhamnogalakturonanu II chromatografiou aniónovou výmenou a chromatografiou molekulárnym vytriedením, vychádzajúce z vína
RG-II sa nachádza v nedegradovanej podobe hlavne v šťave ovocia, zeleniny a v ich derivátoch, hlavne fermentovaných. RG-II môže byť čistený na homogenitu vychádzajúcu zo všetkých odvodených rastlinných produktov za použitia nasledujúcich etáp čistenia:
1. Získanie makromolekúl v jednej etape buď precipitáciou v etanole 80 % alebo ultrafiltráciou.
2. Preparatívna chromatografia aniónovou výmenou pri kyslom pH.
3. Chromatografia molekulárneho vytriedenia (táto posledná etapa dovoľujúca dosiahnuť zvýšenú úroveň čistoty môže byť vypustená, ak sa požaduje úroveň čistoty 80 % pri príprave RG-II).
1, Vzorka vina a získanie koloidov
Použité víno sa získalo z odrody Carignan noir, zbieranej v stave zrelosti v septembri 1991 v Domaine Experimentale de Pech-Rouge (Narbonne). 600 I bolo koncentrované na ultrafiltračnej membráne Carbo Sep M5 (Tech Sep, Francúzsko) do prahovej hodnoty 10 000. Úplné koloidy koncentrovaného vína (výsledný objem 25 I) boli potom precipitované pridaním 4 dielov etanolu, okysleného pridaním 60 mM HCI, premývané postupne v etanole 80 % a 90 %, vybraté vo vode a dialyzované na pufre citranu sodného 40 mM pri pH 4,6. Sušina úplných koloidov (určená po odsolení a lyofilizácii alikvotnej frakcie) predstavovala 296 g, t. j. zhruba 0,5 g na jeden liter vína.
2. Chromatografia výmenou aniónov
Koloidný roztok pri pH 4,6 sa frakcionoval chromatografiou výmenou aniónov 10 postupnými priechodmi kolónou (5 x 80 cm) DEAE-Macroprep (BioRad, USA) vyváženou na 20,5 ml/min. v pufre citranu sodného 40 mM pri pH 4,6. Neutrálne alebo slabo nabité polysacharidy boli vymyté injekčným pufrom (frakcia I). Frakcie obsahujúce RG-II boli vymyté najprv koncentračným priechodom citranovým pufrom
30833/H pri 50 mM (frakcia II) a potom adíciou 50 mM (frakcia III) a 150 mM (frakcia IV) NaCI do vymývacieho pufra (obr. 3). Tieto tri frakcie predstavovali 7,9 %, 6,6 % a 4,1 % celkových koloidov, vyjadrené v hmotnosti sušiny.
3, Čistenie RG-II do homogenity sterickou vylučovacou chromatografiou
RG-II obsiahnutý vo frakciách II a III bol čistený do homogenity sterickou vylučovacou chromatografiou na kolóne (5 x 75 cm) Sephacryl S-400 HR vyváženej na 7 ml/min. v pufre octanu sodného 50 mM pri pH 5 obsahujúcom 50 mM NaCI. Frakcie obsahujúce RG-II boli nakoniec dialyzované proti vode pred lyofilizáciou.
Dve získané vzorky RG-II vykazovali absolútne homogénny profil pri vysokovýkonnej sterickej vylučovacej chromatografii (CES-HP, analýza na d'Och kolónach Shodex OHPak a KB-803 a KB-805 v sérii, vymývanie L1NO3 0,1 M pri 1 ml/min., refraktometrická detekcia) (obr. 4) a reprezentovali 4,4 % a 4,6 % úplných koloidov vzorky vína. Obsah úplného RG-II vzorky použitého vína bol vyšší ako 50 mg/l, pretože bolo potrebné pridať i RG-II obsiahnutý vo frakcii IV, ktorý nebol čistený do homogenity.
4. Zloženie frakcií čisteného RG-II z vína
Dve frakcie čisteného RG-II vykazovali obidve charakteristické zloženie RG-II (tabuľka I). Neodlišovali sa významným spôsobom pri analýze ich zloženia.
Frakcie II a III získané na DEAE-Macroprep boli analyzované na kolóne Superdex75HR (1 x 30 cm, vymývanie po 14 min.) umožňujúcej molekulárne vytriedenie. Táto analýza (obr. 5) ukazuje, že frakcia II obsahuje majoritne monoméry RG-II (vymývanie po 20,5 min., molekulárna hmotnosť 4750 Dr), zatiaľ čo frakcia III obsahovala viac ako 95 % diméru RG-II (vymývanie po 18,5 min., molekulárna
I hmotnosť 9500 Da).
RG-II frakcie II bol použitý v nasledujúcich pokusoch na vytriedenie a indukciu špecifických enzymatických degradačných účinkov.
Príklad 2
Získanie RG-II adsorpčnou chromatografiou z vína zlej kvality
Použitím vína zlej kvality sa získalo destiláciou vo vákuu a koncentrácii 300 hl červeného vína (zmes vín viacerých odrôd).
30833/H
Víno zlej kvality, získané destiláciou, bolo koncentrované odparením vo vákuu. Vínanové soli boli po dekantácii z tohto koncentrátu eliminované a potom bolo víno zlej kvality znova koncentrované rovnakým spôsobom. Celkovo bolo víno koncentrované tridsaťkrát a celkové koloidy z 1000 I získaného koncentrovaného vína zlej kvality boli precipitované pridaním 4 objemov etanolu 90 %. Precipitát bol vybratý v 300 I vody, čím sa získal roztok vína zlej kvality, používaný ako zdroj RG-II. Adsorpčná chromatografia
Produkty chromatografickej separácie sa získali pomoco·' CLHP na kolónach Shodex (pozri príklad 1) alebo na kolóne Superdex HR 75 (Pharmacia, výťažok 0,6 ml/min) spojených so systémom refraktometrickej detekcie.
a) Na aktívnom uhlí
Aktívne uhlie vykazuje silnú adsorpčnú kapacitu vzhľadom k množstvu molekúl. Podľa predkladaného vynálezu je aktívne uhlie použité kvôli svojej schopnosti oddeľovať RG-II od rôznych druhov pektických polysacharidov. Všetky polysacharidy sú v skutočnosti adsorbované aktívnym uhlím, ale RG-II je uvoľňovaný pri koncentráciách alkoholu nižších ako 40 %. Vyskúšali sa dva typy aktívneho uhlia.
Práškové aktívne uhlie
Jeden liter päťkrát zriedeného roztoku vína zlej kvality bol privedený do kontaktu so 100 g práškového aktívneho uhlia (Norit® SA+) po dobu 30 minút. Potom bol roztok filtrovaný, aby sa eliminovali čiastočky uhlíka. Uhlík <_vyšný na filtri bol suspendovaný v 1 I etanolu 40 % a zmes bola pravidelne miešaná po 30 minút a potom filtrovaná vo vákuu. Vymytý RG-II sa potom analyzoval pomocou CLHP. Analýza zloženia tejto frakcie (tabuľka 2) ukazuje, že stupeň čistoty RG-II je okolo 50 %. 1
Extrudované aktívne uhlie
Tento typ aktívneho uhlia vyžaduje pre adsorbciu RG-II oveľa vyššiu kontaktnú dobu (48 hodín) s roztokom vína zlej kvality, ale jeho výhodou je uľahčenie etapy filtrácie. Na druhej strane potrebná hmotnosť uhlíka je dvakrát väčšia v porovnaní s práškovým uhlím.
Jeden liter päťkrát zriedeného roztoku vína zlej kvality bol privedený do kontaktu s 200 g extrudovaného aktívneho uhlia (Norit® RO-08 Supra) po dobu 48 hodín. Po
30833/H eliminácii neadsorbovanej frakcie bola frakcia obsahujúca RG-II desorbovaná umiestnením do roztoku etanolu 40 % na dobu 24 hodín. Získaný RG-II vykazoval rovnaký stupeň čistoty ako RG-II získaný za použitia práškového uhlia.
b) Na zmiešanej živici polystyrén - divinylbenzénu (Résine, Relite® DIAION®SP411)
Živica Relite® DIAION®SP411 je syntetická nepolárna živica tvorená kopolymérmi polystyrénu a divinylbenzénu. Táto živica zadržiava RG-II na úkor ďalších polysacharidov, prítomných v rastlinných extraktoch. Tieto sú teda separované na dve frakcie adsorpčnou chromatografiou na živici Relite® DIAION® SP411; nezadržaná frakcia obsahuje polysacharidy odlišné od RG-II a zadržaná frakcia, ktorá obsahuje RG-II.
Čistenie RG-II základnej úrovne
Schéma čistenia RG-II základnej úrovne z vína zlej kvality je znázornená na obr. 6. 250 I päťkrát zriedeného roztoku vína zlej kvality (2,5 objemov kolóny) bolo rýchlo odfarbené filtráciou na aktívnom uhlí Norit® RO-08 Supra a potom prechádzalo kolónou 90 I Relite® DIAION® SP411 pri výťažku 4 l/hod. (kontaktná doba 2 hodiny pre adsorbciu RG-II na tomto chromatografickom nosiči). Kolóna bola premývaná 100 I vody. Nezadržaná frakcia je teda predstavovaná premývacou tekutinou. Vymývanie RG-II sa dosiahlo priechodom 100 I etanolu 20 % nasledovným premývaním kolóny 200 I vody.
Takto získaný RG-II (1 kg prípravku z celého objemu vína zlej kvality) vykazoval stupeň čistoty blízky 60 % (tabuľka 2). RG-II bol precipitovaný pridaním etanolu (koncová koncentrácia 40 % etanolu). Takto získaný precipitát obsahuje RG-II so stupňom čistoty 90 %.
Príklad 3
Získanie PG-II adsorpčnou chromatografiou z vína
Víno (červené víno vinič Merlot 94, biele víno Chardonnay 94) bolo dealkoholizované a koncentrované dvakrát odparením vo vákuu na rotačnom odparovacom zariadení. Dve frakcie 15 ml boli naliate na 50 ml Relite® DIAION® SP411 pri 25 ml/hod. Potom bola kolóna premývaná 50 I vody. RG-II potom bol vymytý 50 ml etanolu 20 % a kolóna bola premývaná 100 ml vody. Analýza OLHP (obr. 7) ukazuje, že RG-II je kvantitatívné adsorbovaný na živici, lebo nie je prítomný vo frakcii, nezadržanej na
30833/H živici a že je kvantitatívne získaný premytím etanolom 20 %. Stupeň čistoty roztoku RG-II je blízky 50 % u červeného vína (tabuľka 2) a 35 % u bieleho vína.
Príklad 4
Získanie RG-II adsorpčnou chromatografiou z muštu vínneho hrozna
Amberlite® XAD 2 je nepolárna živica, ktorá je kopolymérom polystyrénu a divinylbenzénu. 100 ml muštu bieleho viničového hrozna získaného rozdrvením bobúľ viniča Grenache bolo injektované do kolóny 100 ml živice XAD 2 vyváženej vo vode. RG-II bol vymytý jedným objemom metanolu 60 % a stupeň čistoty bol zhruba 40 %. Výsledky analýzy vymytej zložky sú uvedené v tabuľke 2.
Príklad 5
Získanie RG-II adsorpčnou chromatografiou z ovocnej šťavy a zo zeleniny
Rozpustné extrakty boli získané z 0,6 kg olúpaných a nastrúhaných jabĺk, paradajok a mrkvy v 200 ml kyseliny askorbovej (výsledná koncentrácia 3 mM). Použitá šťava ovocia a zeleniny sa získala enzymatickým stekutením spojeným pôsobením komerčných enzymatických prípravkov (Pectinex® Ultra SPL, Novo Ferment a Rapidase® Liq, Gist - Brocades) po dobu 24 hodín pri 45 °C. Reakcia skvapalňovania bola prerušená denaturáciou enzýmov pôsobením tepla. Pevné rezíduá boli eliminované centrifugáciou a supernatant bol použitý ako zdroj RG-II. Čistenie RG-II ovocia a zeleniny po enzymatickom stekutení
Šťavy ovocia a zeleniny, získané enzymatickým stekutením boli filtrované filtračným papierom pred priechodom kolónou (2,5 x 30 cm) vyváženou vodou, obsahujúcou 50 ml Relite® DIAION® SP411 pri 25 ml/hod. Kolóna bola premývaná 50 ml vody, nasledovalo vymývanie RG-II 50 ml etanolu 20 % a premývanie kolóny 100 ml vody. Týmto spôsobom získané RG-II vykazovali stupeň čistoty vyšší ako 80 %.
Výsledky ich analýzy sú podané v tabuľke 2.
Príklad 6
Selekcia mikroorganizmov degradujúcich RG-II v monomérnej forme
30833/H
RG-ll je univerzálnou zložkou bunečných stien rastlín a jeho degradácia v biosfére je zaručená mikroorganizmami prirodzených ekosystémov: pôdy, kompostov, kalov čistiacich staníc...
Vychádzajúc z prírodných vzoriek boli izolované dva kmene húb, patriacich dvom druhom Penicillium, ktoré používajú RG-ll ako jediný zdroj uhlíka a energie.
1. Kultivačné prostredie
Kultivačné prostredie použité na selekciu mikroorganizmov, používajúcich RG-ll ako zdroj uhlíka a energie bolo vytvorené spôsobom, ktorý vyplýva z tabuľky 3. Jedná sa o minerálne kultivačné prostredie, do ktorého bol pridaný roztok monomerického RGll vo výslednej koncentrácii od 2 mg/l do 10 mg/ml. Kultúry obsahujúce huby boli zbavené kontaminujúcich baktérií pridaním troch antibiotík do kultivačného prostredia: penicilín G, streptomycín a tetracyklín.
2. Selekcia mikroorganizmov používajúcich RG-ll ako zdroj uhlíka a energie
Vzorky boli odobraté z rôznych prírodných ekosystémov (poľnohospodárska alebo lesná pôda, rašelina, komposty, kaly z čistiacich staníc, ovocie v stave dekompozície...) a vložené do kultúry pri 25 °C až 37 °C v minerálnom kultivačnom prostredí upravenom na obsah 10 mg/ml monomerického RG-ll. Zakaždým, keď sa pozoroval rast mikroorganizmov, kultúry boli preočkované viacnásobne na tom istom prostredí. Tento postup dovolil izolovať najprv viacero kultúr, zaručujúcich ich rast na prostredí s RG-ll. Degradácia RG-ll v prostredí bola súčasne kontrolovaná vysokovýkonnou sterickou vylučovacou chromatografiou a nechali sa iba kultúry, v ktorých sa pozorovalo, že súčasne s rastom mikroorganizmov dochádza k degradácii RG-ll.
Mikroorganizmy zaručujúce degradáciu RG-ll boli izolované po rozdelení kultúr v Petriho miskách v gelovom prostredí, získanom pridaním agarózy 2 % do kultivačného prostredia (tabuľka 3) a obsahujúcom 2,5 mg/ml monomerického RG-ll. Po jednom týždni inkubácie pri 25 °C boli klony odobraté a naočkované do tekutého kultivačného prostredia, aby bolo možné overiť ich schopnosť degradácie RG-ll.
3. Voľba kmeňov degradujúcich RG-ll
Nakoniec sa získali dva kmene vláknitých húb, lebo vykazovali požadované vlastnosti:
30833/H
1. Rýchly rast perfektne korelovaný s ubúdaním RG-II v prostredí.
2. Úbytok množstva RG-ll bol pozorovaný súbežne s posunom jeho vymývacieho objemu pri HP-SEC, čo indikuje prítomnosť enzymatického účinku degradácie typu endo-hydrolázy.
3. Výsledná úroveň degradácie RG-ll dosiahla 70 % po jednom týždni kultivácie pri 25 °C.
Tieto dve kultúry, označené ako E a K boli následne použité na produkciu enzýmov degradujúcich RG-ll a skúmanie spôsobu enzymatického pôsobenia. Boli kultivované bez miešania za kontaktu so vzduchom pri 25 °C v tekutom kultivačnom prostredí obsahujúcom 5 mg/ml RG-ll a v prítomnosti troch antibiotík: penicilínu G, streptomycínu a tetracyklínu.
Príklad 7
Produkcia enzýmov degradujúcich RG-ll
Rôzne druhy Penicillium sú známe kvôli ich schopnosti produkovať a rozširovať v kultivačnom prostredí enzýmy degradácie polysacharidov. Bola overená schopnosť dvoch izolovaných kmeňov produkovať enzýmy degradácie RG-ll.
1. Výskum enzýmov degradácie RG-ll v supernatante kultúry
Kmene P. daleae LaV2 (deponovaný u CNCM ako N° 1-1578) a P. simplicissimum IPV1 (deponovaný u CNCM ako N° 1-1577) boli kultivované pri 25 °C v kultivačnom prostredí, obsahujúcom 2,5 mg/ml monomerického RG-ll. Po 96 hodinách kultivácie bol odobratý 1 ml kultúry, obsahujúcej rastúce mycelium, sterilné filtrovaný na filtri 0,22 pm a potom sa pridalo 2 mg/ml pôvodného RG-il. Prostredie obsahujúce enzýmy degradácie a RG-ll bolo nechané na inkubáciu pri 25 °C a po 0,20 a 45 hodinách boli odobraté frakcie 25 μΙ a analyzované pomocou CES-HP. Porovnanie medzi dvoma profilmi vymývania RG-ll v rôznych dobách inkubácie jasne preukázali absenciu účinku degradácie RG-ll v kultivačnom prostredí. Tieto účinky boli preto hľadané v cytoplazme a periplazme húb.
2. Produkcia enzýmov degradácie RG-ll v úplných bunečných extraktoch húb
Vyššie uvedené kmene P. daleae LaV2 a P. simplicissimum IPV1 boli kultivované pri 25 °C v 4 ml kultivačného prostredia obsahujúceho 6 mg/ml monomerického RG-ll.
30833/H
Po 140 hodinách kultivácie bolo mycelium odobraté centrifugáciou, po ktorej nasledovalo drvenie (so sklenenými guľôčkami) pri 4 °C po dobu 4 minúty v pufre MES (kyselina morfolino-etánsulfónová)/KOH 50 mM nastavenom na pH 6 s pridaním 1 mM PMSF (fenylmetylsulfonyl fluorid) a 1 mM DTT (ditiotreitol). Bunečný supernatant bol získaný centrifugáciou pri 10 000 g x 5 minút.
Prítomnosť enzýmov degradácie RG-ll v rozpustnom bunečnom extrakte bola testovaná pridaním pôvodného RG-ll v koncentrácii 2,5 mg/ml do supernatantu po rozdrvení a centrifugácii, inkubácii pri 25 °C nasledovanou chromatografiou CES-HP degradácie RG-ll. Analýza profilov v okamihoch 24 hodín a 48 hodín v porovnaní s pôvodným RG-ll (obr. 8 a obr. 9) ukazuje silnú degradáciu (50 %) RG-ll po 24 hodinách, ktorá pokračuje až do 48 hodín a dáva 40 % reziduálnych molekúl.
Enzymatické účinky, zaručujúce degradáciu RG-ll sú teda prítomné v rozpustnom bunečnom extrakte a môžu teda byť získané po rozdrvení húb. Dva izolované kmene Penicillium teda produkujú enzýmy degradácie rhamnogalakíuronanu II.
Príklad 8
Charakterizácia degradačných účinkov na RG-ll
Dva izolované a identifikované kmene Penicillium produkujú enzýmy, ktoré degradujú RG-ll v kultivačnom prostredí. Spôsob pôsobenia týchto enzýmov bol najprv skúmaný sledovaním degradácie polysacharidov v kultivačnom prostredí súbežne s rastom mikroorganizmov. Nevýhodou tohto prístupu je, že dovoľuje sledovať iba frakciu RG-ll, ktorá nie je asimilovaná hubou, avšak dovoľuje si uvedomiť, k akým účinkom dochádza a aký je ich spôsob pôsobenia.
1. Vykonanie kinetiky degradácie RG-ll pomocou Penicillium simplicissimum
Kmeň P. simplicissimum IPV1 bol kultivovaný v Erlenmeyercvej banke pri 25 °C v 10 ml kultivačného prostredia s 5 mg/ml monomerického RG-ll. V okamihoch 0, 96,132, 168 a 192 hodín boli odobraté frakcie 1 ml. pH kultivačného prostredia bolo potom upravené na 5 pridaním 20 μΙ HCi 1M. Nové odoberanie bolo vykonané po 360 hodinách a kultúra bola nakoniec zastavená po 400 hodinách inkubácie. Každá vzorka bola analyzovaná pomocou CES-HP (obr. 10), čo dovolilo sledovať degradáciu v priebehu rastu húb. Rôzne odobraté frakcie beli odsolené na kolóne (1 x 50 cm) Bio-Gel P-6, vyváženej pufrom octanu sodného 100 mM na pH 4.
30833/H
Po každej inkubačnej dobe bola vykonaná úplná štrukturálna analýza frakcie RG-II v procese degradácie. Táto analýza zahrňovala:
- Kvantifikatívne určenie pomeru degradácie RG-II.
- Určenie zloženia vzhľadom k neutrálnym glycidom a uránovým kyselinám.
- Určenie typu väzieb medzi rezíduami, vytvárajúcimi molekulu.
- Určenie dĺžky homo-galakturonického reťazca.
Súbor týchto analýz dovolil určiť stav molekuly RG-II po každú odobratú vzorku, a teda sledovať jej degradáciu v závislosti od času. Tieto výsledky ukazujú, že dochádzalo k enzymatickej degradácii molekuly v priebehu času.
2. Vykonanie kinetiky degradácie RG-II pomocou Penicillium daleae
Kvôli sledovaniu degradácie RG-II kmeňom P. daleae LaV2 bolo najprv 500 mg monomerického RG-II najprv zmydelnené (2 hodiny pri 4 °C v NaOH 50 mM), potom redukované (6 hodín pri 4 °C v prítomnosti 2,5 g NaBH4), aby bola označená extrémna redukčná schopnosť molekuly. Kmeň P. daleae ĽaV2 bol kultivovaný v Erlenmeyerovej banke pri 25 °C v 6 ml kultivačného prostredia s 5 mg/ml zmydelneného a redukovaného RG-II. V okamihoch 0, 72, ľ?0, 168, 240, 264, 336 a 384 hodín boli odobraté frakcie 0,6 ml. Každá vzorka bola analyzovaná pomocou CES-HP (obr. 11), čo dovolilo sledovať degradáciu v priebehu rastu húb. Rôzne odobraté frakcie boli odsolené na kolóne (1 x 30 cm) Superdex-75 HR vyváženej pri 0,6 ml/min pufrom mravčanom amónnym 30 mM na pH 5,2.
Po každej inkubačnej dobe bola vykonaná úplná štrukturálna analýza frakcie RG-II v procese degradácie. Táto analýza zahrňovala:
- Kvantifikatívne určenie pomeru degradácie RG-II.
- Určenie zloženia vzhľadom k neutrálnym glycidom a uránovým kyselinám vo forme trimetylsilylovaných derivátov po metanolýze.
- Určenie typu väzieb medzi rezíduami, vytvárajúcimi molekulu analýzou metylácie zahrňujúcej redukciu uránových kyselín lítium trietylborodeuteridom (Pellerin a kol., 1995 Carbohydr. Res. 277, str. 135- 143).
- Určenie dĺžky homo-galakturonického reťazca.
30833/H
Súbor týchto analýz dovolil určiť stav molekuly RG-II po každú odobratú vzorku, a teda sledovať jeho degradáciu v závislosti od času. Tieto výsledky ukazujú, že dochádzalo k enzymatickej degradácii molekuly v priebehu času.
3. Mechanizmus degradácie RG-II
Analýza zloženia (tabuľky 4 a 5) a typov väzieb pre každé rezíduum, nachádzajúce sa v molekule (tabuľky 6 a 7) dovoľuje sledovať stav reziduálnej molekuly RG-II v priebehu času. Vyplýva znej že RG-II je v prípade použitia dvoch kmeňov Penicillium sériou enzýmov, ktoré pôsobia sekvenčným spôsobom.
a) Prvá etapa degradácie spočíva v prerušení väzieb medzi rezíduom trojnásobne substituovanej beta-L-rhamnózy a rezídua alfa-L-fukózy a beta-D-apiózy, čo vedie k strate reťazca A (obr. 12), ktorý je asimilovaný hubou. Táto etapa sa odohráva v priebehu prvého dňa kultivácie súbežne so slabým skrátením homogalakturonického reťazca, ktorý sa mení v priemere z 8 - 9 rezíduí na 7 rezíduí a s čiastočnou stratou koncových rezíduí arabinofuranózy (B7 a D2) a rhamnopyranózy (C2).
b) Úplná eliminácia rezíduí A2 až A5 v reťazci A nesenom rezíduom beta-D-apiózy sa zdá zvyšovať odolnosť molekuly RG-II voči enzymatickej degradácii, lebo sa pozoruje druhá fáza degradácie, ktorá sa vyznačuje:
- Silným skrátením homo-galakturonického reťazca, ktorý sa zmenší na v priemere 4 rezíduá kyseliny galakturonovej.
- Stratou rezídua A1.
- Modifikáciami týkajúcimi sa neredukujúceho zakončenia reťazca B, stále viazaného k homo-galakturonickému reťazcu prostredníctvom beta-D-apiózy, menovite kvantitatívnou stratou koncového arabinofuranózového rezídua a stratou rezíduí alfa-L-rhamnózy (rezídua B6 a B7).
- Rezíduá Kdo a Dha sa zdajú byť čiastočne ovplyvnené enzymatickou degradáciou.
Všetky pozorované degradácie v priebehu tejto druhej fázy môžu byť získané pomocou známych enzýmov: beta-D-apiozidázy, beta-L-arabinozidázy, alfa-Lrhamnozidázy, endo- alebo exo-polygalakturonázy.
30833/H
Reziduálna molekula na konci rastu húb zodpovedá kvantitatívne reťazcu B (rezídua Βί až B5), rezíduám Kdo (C1) a Dha (D1) neseným kyslým oligosacharidom stredného stupňa polymerizácie 4 a predstavuje 20 až 30 % pôvodnej molekuly RG-II (obr. 13).
Prvá etapa, v ktorej dochádza k dvom enzymatickým účinkom typu endo- je teda kľúčová etapa, ktorá dovoľuje degradáciu molekuly RG-II. Kvantitatívne uvoľnenie reťazca A robí v skutočnosti molekulu citlivou na pôsobenie enzýmov so známymi spôsobmi pôsobenia, ktoré sa často nachádzajú v komerčných enzymatických prípravkoch.
Produkcia enzýmov s účinkom typu endo-beta-L-rhamnopyranozyl-(1->3')-Dapiofuranozyl hydrolázy (1) a endo-alfa-L-fukopyranozyl-(1-»4)-L-rhamnopyranozyl hydrolázy (2) kmeňom P. daleae LaV2 a P. simplicissimum IPV1 je teda rozhodujúca etapa, ktorá hubám dovoľuje zaistiť si svoj rast použitím RG-II. Je to teda použitie týchto enzýmov endo-beta-L-rhamnopyranozyl-(1-+3')-D-apiofuranozyl hydrolázy a endo-alfa-L-fukopyranozyl-(1-»4)-L-rhamnopyranozyl hydrolázy, ktoré dovoľuje zosilnenú enzymatickú degradáciu RG-ll. Špecifita účinku (1) je silnejšia, lebo reťazec B nie je ovplyvnený jeho hydrolytickým účinkom, zatiaľ čo je viazaný k homogalakturonickému reťazcu prostredníctvom rhamnozyiapiozidovej väzby rovnakého typu. Tento rozdiel v chovaní účinku (1) vzhľad om k reťazcom A a B môže byť vysvetlený:
- buď rozdielom medzi substituentmi rhamnózy: jeden reťazec viazaný v C3 v prípade B, jeden reťazec viazaný v C34 a dva monosacharidy viazané v C2 a C3 v prípade A,
- alebo rozdielnou lokalizáciou týchto dvoch reťazcov vo vnútri molekuly RG-ll.
Prítomnosť jedného alebo druhého z týchto účinkov v enzymatickom prípravku dovoľuje uvoľnenie reťazca A RG-ll a rieši teda problém nedegradovateľnosti RG-ll zvyčajnými enzýmami z pektinolytických prípravkov. Ostatné enzýmy, dovoľujúce ešte viac zosilnenú degradáciu RG-ll totiž zasahujú až po oddelení reťazca A účinkom vyššie menovaných enzýmov. V tejto druhej etape degradácie zasahujú enzýmy s účinkami:
- beta-D-apiozidázy,
30833/H
- alfa-L-arabinozidázy,
- alfa-L-rhamnozidázy,
- endo-polygalakturonázy,
- exo-polygalakturonázy.
Príklad 9
Získanie prípravku dimerického RG-ll a degradácia pomocou Peniciliium daleae
Kmeň P. daleae bol kultivovaný v prostredí obsahujúcom 5 ng/ml prípravku RG-ll, získaného priechodom koncentrátov vína zlej kvality cez živicu Relite® DIAION® (príklad 2). Ten prípravok obsahoval zhruba 60 % RG-ll, ktorý sa nachádza v dimerickej podobe, ako ukazuje analýza na kolóne Superdex -75 HR. Sledovanie kultivačného prostredia huby chromatografiou CLHP (obr. 14) ukazuje silnú degradáciu RG-ll. Nečistoty s najvyššou molekulárnou hmotnosťou (hlavne manany, prítomnej v koncentráte vina zlej kvality) nie sú degradované.
Kmene Peniciliium izolované na monomerickom RG-ll teda vykazujú schopnosť degradovať RG-ll vo forme diméru. Enzýmy, ktoré predstavujú predmet vynálezu, sú teda účinné na obidve formy molekuly.
Príklad 10
Získanie enzymatického prípravku degradujúceho RG-ll
Enzymatický prípravok obsahujúci účinok degradácie RG-ll, špeciálne účinky endobeta-L-rhamnopyranozyl-(1->3')-D-apiofuranozyl hydrolázy a endo-alfa-Lfukopyranozyl-(1-»4)-L-rhamnopyranozyl hydrolázy, bol získaný z kultúry P. simplicissimum IPV1 získanej nasledujúcim spôsobom.
120 ml kultivačného prostredia, obsahujúceho 6 mg/ml čisteného RG-ll bolo rozmiestnené do 8 Petriho misiek. Kmeň P. simplicissimum PIV1 bol kultivovaný pri 25 °C po dobu 6 dní. Mycelium (v čerstvom stave 1,2 g) bolo potom získané centrifugáciou nasledovanou rozdrvením, ako bolo popísané vyššie (príklad 3) v pufre MES/KOH 50 mM nastavenom na pH 6, obsahujúcom 1 mM PMSF a DTT. Celkový enzymatický extrakt (6 ml) bol nakoniec získaný centrifugáciou a použitý v nasledujúcich príkladoch.
30833/H
Príkladu
Degradácia čisteného RG-II enzymatickým extraktom P. simplicissimum IPV1
Nasledujúca zmes bola nechaná na inkubáciu pri teplote 25 °C v prítomnosti 0,02 % NaN3:
- 500 μΙ pufra octanu sodného 50 mM, pH 4,8,
- 12,5 μΙ roztoku čisteného RG-II (tabuľka 1, frakcia II) 200 ml/ml,
- 25 μΙ úplného enzymatického extraktu P. simplicissimum IPV1 získaného podľa príkladu 5.
Odoberanie 25 μΙ bolo vykonávané po 0, 72, 120 a 148 hodinách a vzorky boli analyzované pomocou CES-HP. Prítomnosť enzýmov s účinkom endo-beta-Lrhamnopyranozyl-(1-*3')-D-apiofuranozyl hydrolázy alebo endo-alfa-Lfukopyranozyl-(1->4)-L-rhamnopyranozyl hydrolázy bola potvrdená degradáciou RG-II (obr. 15). Degradačný profil je naostatok porovnateľný s profilom, získaným sledovaním supernatantu kultúry P. simplicissimum (obr. 10). Produkty degradácie molekuly RG-II sa objavujú vo frakcionačnej oblasti nízkych molekulových hmotností (obr. 15).
Príklad 12
Degradácia polysacharidu vína enzymatickým extraktom P. simplicissimum IPV1
Úplný enzymatický extrakt, obsahujúci enzýmy degradácie RH-II, špeciálne účinky typu endo-beta-rhamnopyranozyl-(1->3')-D-apiofuranozyl hyd’olázy alebo endo-alfaL-fukopyranozyl-(1->4)-L-rhamnopyranozyl hydrolázy bol skúmaný na svoju schopnosť degradovať RG-II, prítomný vo víne.
Úplné polysacharidy červeného vína (vinič Carignan noir) boli získané ultrafiltráciou vína (2 ml) na membráne Centrikon 30 (Amicon, USA). Filtrát (100 μΙ) bol vybratý 1,9 ml pufra octanu 50 mM pH 4,8. Nasledujúce vzorky boli nechané na inkubáciu pri 25 °C v prítomnosti 0,02 % NaN3.
a: 200 μΙ filtrátu obsahujúceho úplné polysacharidy vína, μΙ vody, μΙ pufra MES drvenia
30833/H b: 200 μΙ_ filtrátu obsahujúceho úplné polysacharidy vína, μΙ vody, μΙ úplného enzymatického extraktu P. simplicissimum IPV1, získaného podľa príkladu 9.
c: 200 μΙ filtrátu obsahujúceho úplné polysacharidy vína, μΙ Pectinex®Ultra Sp-L (Novo Ferment, Švajčiarsko), μΙ pufra MES drvenia, d: 200 μΙ filtrátu obsahujúceho úplné polysacharidy vína, μΙ Pectinex® Ultra Sp-L, μΙ úplného enzymatického extraktu P. simplicissimum IPV1, získaného podľa príkladu 9.
Po 48 hodinách bolo odobratých 25 μΙ každej vzorky a analyzované pomocou chromatografie CES-HP. Z analýzy výsledkov (obr. 16 a 17) vychádza:
- Degradácia RG-II vína (charakteristický vrchol vymývania po 18,2 minútach) enzymatickým extraktom P. simplicissimum IPV1 (obr. 16),
- Degradácia ďalších polysacharidov vína (manoproteínov, arabinanov a arabinogalaktananov) komerčným enzymatickým prípravkom Pectinex® Ultra SpL, zatiaľ čo charakteristický vrchol RG-II zostáva neporušený (obr. 17).
- Komplementárny účinok dvoch enzymatických prípravkov bol potvrdený (obr. 17) degradáciou súboru polysacharidov vína vo vzorke c.
Úplný enzymatický extrakt P. simplicissimum IPV1 obsahujúci enzýmy typu endobeta-L-rhamnopyranozyl-(1->3')-D-apiofuranozyl hydrolázy alebo endo-alfa-Lfukopyranozyl-(1-»4)-L-rhamnopyranozyl hydrolázy teda obsahuje enzymatické účinky, ktoré chýbajú v komerčných enzymatických prípravkoch vyrábaných z Aspergillus aculeatus a je bohatý na účinky celulolytické, hemicelulázické a pektinolytické, špeciálne účinok rhamnogalakturonázy (Schols a kol., 1990, Carbohydr. Res. 206, str. 105 - 1i 5).
Pridanie enzýmov podľa predkladaného vynálezu spolu s ďalšími pektinolytickými účinkami vedie k zosilnenej degradácii polysacharidov vína a dovoľuje teda zlepšenie filtrovateľnosti a bráni vytváraniu problémov s koloidmi a precipitátmi.
30833/H
Príklad 13
Degradácia polysacharidu jablčného muštu enzymatickým extraktom P. simplicissimum IPV1
Ovocná šťava z jablka bola pripravená z 1 kg jabĺk (odroda Starking). Celé jablká boli rozsekané na plátky o hrúbke 1 cm, bol pridaný 1 g kyseliny askorbovej a 500 μΙ enzymatického prípravku Rapidase® Liq (Gist Brocades, Francúzsko) a nechané 2 hodiny za miešania pri 50 °C. Ovocie potom bolo stekutené pôsobením komerčného enzymatického prípravku a šťava sa nakoniec získala centrifugáciou. Prípravok Rapidase® Liq obsahuje zvýšené množstvo účinkov typu pektinázy (pektín, lyáza, endo- a exo-polygalakturonáza, rhamnogalakturonáza, arabináza, ...), hemicelulózy (galaktanázy, xylanázy,...) a celulázy.
1,5 ml čírej jablčnej šťavy bolo uLrafiltrované na membráne Centricon 30 (Amicon, USA). Filtrát (100 μΙ) bol vybraný 1,4 ml pufra octanu 50 mM pH 4,8 a nasledujúce vzorky boli nechané na inkubáciu pri 25 °C v prítomnosti 0,02 % NaNg:
a: 200 μΙ filtrátu obsahujúceho úplné polysacharidy jablčnej šťavy, μΙ vody, b: 200 μΙ filtrátu obsahujúceho úplné polysacharidy jablčnej šťavy, μΙ úplného enzymatického extraktu P. simplicissimum IPV1.
Po 48 hodinách bolo z každej vzorky odobraté 25 ml na vykonanie analýzy chromatografiou CES-HP.
Analýza výsledkov (obr. 18) ukazuje komplementárny účinok enzýmov degradácie RG-II, lebo pridanie enzymatického extraktu P. simplicissimum IPV1 dovoľuje zosilnenú degradáciu reziduálnych polysacharidov po spracovaní jabĺk prípravkom Rapidase® Liq. Špeciálne charakteristický vrchol RG-II (vymývanie po 18,2 min.) je podrobený silnej degradácii. Navyše degradácia štruktúr s najvyššími molekulárnymi hmotnosťami, odolnými na účinok enzýmov, prítomnými v Rapidase® Liq naznačuje, že tieto frakcie tiež obsahujú fragmenty RG-II.
Úplný enzymatický extrakt P. simplicissimum IPV1, v ktorom boli preukázané účinky typu endo-beta-L-rhamnopyranozy!-(1->3')-D-apÍofuranozyl hydrolázy alebo endoalfa-L-fukopyranozyl-(1—>4)-L-rhamriopyranozyl hydrolázy, obsahuje teda enzymatické účinky, ktoré nie sú prítomné v komerčných enzymatických prípravkoch
30833/H vyrábaných z Aspergillus niger a μ upísaných ako prípravky, majúce súbor známych celulolytických, hemicelulázických a pektinolytických účinkov 'do toho rátajúc účinky rhamnogalakturonázy). Komplementárny a doplňujúci účinok enzýmov degradácie RG-II je teda týmto pokusom dostatočne preukázaný.
Príklad 14
Macerácia ovocia a zeleniny enzymatickým extraktom P. simplicissimum IIPV1
Účinok disociácie rastlinných tkanív u úplného enzymatického extraktu P. simplicissimum IPV1 bol preukázaný na nasledujúcom ovocí a zelenine:
- červená repa,
- mrkva,
- zemiaky „Bintge,,
- jablká Golden.
Fragmenty s rozmermi 158 x 4 x 2 mm každého ovocia alebo zeleniny boli umiestnené v 2 ml pufra octanu 50 mM pH 4,8 a k nim bolo pi .dané:
- 200 μΙ pufra MES drvenia kvôli corovnávacím pokusom,
- 200 μΙ úplného enzymatického extraktu P. simplicissimum IPV1 pre enzymatické pokusy.
Rôzne vzorky boli umiestnené na nkubáciu pri 25 °C v prítomnosti NaN3 po dobu 72 hodín a potom boli intenzívne miešané vírom (2 x 10 sekúnd) a fotografované. Z analýzy výsledkov vyplynulo:
- Takmer úplný rozpad tkaniva u červenej repy a mrkvy (obr. 19).
- Maceračný účinok, sprevádzaný objavením sa buniek v suspenzii u zemiakoy a jabĺk (obr. 20). ' .
Úplný enzymatický extrakt extraklj P. simplicissimum IPV1 obsahujúci účinky typu endo-beta-L-rhamnopyranozyl-(1—>3')-D-apiofuranozyl hydrolázy alebo endo-alfa-Lfukopyranozyl-XI-^-L-rhamnopyra íozyl hydrolázy má teda schopnosť disociácie rastlinných tkanív.
30833/H
Priemyselná využiteľnosť
Enzymatický účinok degradácie RG-II môže byť teda použitý buď ako taký a/alebo v kombinácii s ďalšími enzýmami / tekutej fáze a/alebo na pevných nosičoch a dovoľuje:
- degradáciu zvýšeného stupňa, napríklad na 70 %, RG-II v šťavách ovocia, zeleniny a ich derivátoch, čím sa dosiahne lepšia filtrovateľnosť, uľahčí sa príprava koncentrátov štiav a uľahčujú sa fenomény čistenia a zaisťuje sa dobrá stabilita výsledných produktov,
- čistenie nosičov mikro- s uHmfiltrácie, používaných pri filtrácii štiav ovocia, zeleniny a ich derivátov.
Tieto enzymatické účinky uľahčujú degradáciu bunečných stien rastlín a sú teda použiteľné buď samotné a/alebo v kombinácii s ostatnými enzýmami vo všetkých aplikáciách, ktoré vyžadujú mace áciu, stekutenie alebo úplnú alebo čiastočnú hydrolýzu rastlinných tkanív, najmä:
- v príprave produktov typu maceráz, ako sú ovocné nektáre, pyré, želé a ovocné a zeleninové koncentráty a ich derváty, do toho rátajúc i víno,
- v príprave štiav a aromatických báz ovocia, zeleniny a ich derivátov stekuccvaním, do toho rátajúc i víno a prípravu piva,
- vo výrobe pektínov vychádzajúc z rastlinných rezíduí ako sú bulvy červenej repy, z pevných rezíduí po lisovar í odučia a podobne,
- vo výrobe potravy pre zvieratá z rastlinných materiálov,
- vo výrobe celulózy z rastlín pre textilný priemysel (najmä s bavlnou ako východiskovým materiálcm) a vo výrobe papiera,
- vo výrobe oligosacharidov s elicitickým účinkom vyvolávajúcim obrannú reakciu rastlín, pričom tieto oligosacharicy môžu byť použité ako fytosanitárne produkty.
30833/H
Tabuľka I Zloženie dvoch frakcií RG-II izolovaných z vína
| Stav molekuly | Frakcia II | Frakcia III |
| Monomér | Dimér | |
| Proteíny3 | 0,6 | 0,6 |
| Urónové kyseliny3 | 36,9 | 39 |
| Neutrálne cukry3 | 27,3 | 24,9 |
| Metanol3 | 1,4 | 1,3 |
| Kyselina octová3 | 1,6 | 1,8 |
| Rhamnóza0 | 31,8 | 35,4 |
| 2-O-CH3-fukóza° | 6,3 | 6,5 |
| Fukóza0 | 3,7 | 5,2 |
| 2-O-CH3-xylóza° | 4,8 | 4,8 |
| Apióza0 | 7,4 | 7,5 |
| Arabinóza0 | 25 | 23,7 |
| Galaktóza0 | 19,1 | 15,8 |
| Kyselina acerová0 | 1,2 | 2,2 |
| Kyselina galakturonová0 | 38,2 | 37,2 |
| Kyselina glukuronová0 | 3,3 | 3,4 |
| Kdo° | 4,4 | 5 |
| Dha° | 2,6 | 2,5 |
a % sušiny b % molárnych
30833/H
Tabuľka 3 Kultivačné prostredie vláknitých húb
| Minerálne prostredie | |
| NH4NO3 | 2 g/l |
| K2HPO4 | 1 g/l |
| MgSO4, 7 H2O | 0,5 g/l |
| KCI | 0,5 g/l |
| Síran železitý | 10 mg/l |
| Hellerov roztok | |
| ZnSO4 | 1 g/l |
| MnSO4, H2O | 0,1 g/l |
| CuSO4, 5 H2O | 0,03 g/l |
| AICI2 | 0,03 g/l |
| NiCI2, 6 H2O | 0,03 g/l |
| KJ | 0,01 g/l |
| Kys. boritá | 1 g/l |
| Vitamínový roztok | |
| Vit. B1 | 0,08 g/l |
| Vit. H | 0,08 g/l |
| Vyhotovenie kultivačného prostredia | |
| Minerálne prostredie | 1 ml |
| Hellerov roztok | 1 μΙ |
| Vitamínový roztok | 1μΙ |
| Streptomycín (50 mg/ml) | 2μΙ |
30833/H
Tabuľka 3 Kultivačné prostredie vláknitých húb
| Tetracyklín (5 mg/ml) | 2 μ! |
| Penicilín (10 000 J/ml) | 10 μΙ |
| Polysacharid | 5 mg/ml |
| Kultúra realizovaná pri teplote okolia (25 °C), za svetla J |
30833/H
Tabuľka 4 Zloženie (v % východiskovej sušiny) RG-'! v priebehu kinetiky degradácie pomocou P. simplicissimum
| Východiskové | 96 h | 132 h | ||
| Neutrálne monosacharidy | 28,2 | 28,5 | 23,1 | |
| Urónové kyseliny | 40,4 | 35,3 | 25,9 | |
| Neutr. monosach.+ urónové kys. | 68,6 | 63,8 | 49,0 | |
| Monosacharidy | Rezíduum č. | |||
| 2-O-Me-fukóza | B4' | 2,1 | 2,4 | 2,1 |
| Rhamnóza | A2,B2,B6,D2 | 9,4 | 9,1 | 7,2 |
| Fukoza | A3 | 1,1 | 1,1 | 0,6 |
| 2-O-Me-xylóza | A3' | 1,4 | 1,6 | 1,2 |
| Arabinóza | B5,B7,C2 | 6,2 | 6,0 | 5,5 |
| Apióza | A1.B1 | 2,2 | 2,7 | 3,5 |
| Galaktóza | A5,B4 | 5,5 | 5,0 | 3,5 |
| Kys. galakturonová | A2',A2, poly- GalA | 23,3 | 24,2 | 19.5 |
| Kys. glukuronová | A4 | 3,2 | 3,0 | 1,8 |
| str. dp homogalakturonového reťazca | 8-9 | 7-8 | 7 | |
| % reziduálnej molekuly | 100 | 93 | 71 |
30833/H
Tabuľka 4
| 168 h | 192 h | 400 h | ||
| Neutrálne monosacharidy | 19,1 | 18,5 | 10,3 | |
| Urónové kyseliny | 18,1. | 16,4 | 9,9 | |
| Neutr. monosach.+ urónové kys. | 37,2 | 34,9 | 20,2 | |
| Monosacharidy | Rezíduum č. | |||
| 2-O-Me-fukóza | B4' | 2,0 | 2,1 | 2,0 |
| Rhamnóza | A2,B2,B6,D2 | 6,4 | 5,4 | 2,9 |
| Fukoza | A3 | 0,1 | 0,1 | 0,0 |
| 2-O-Me-xylóza | A3' | 0,1 | 0,0 | 0,0 |
| Arabinóza | B5,B7,C2 | 5,0 | 4,5 | 1,5 |
| Apióza | A1,B1 | 2,4 | 2,2 | 1,4 |
| Galaktóza | A5,B4 | 2,7 | 2,4 | 2,5 |
| Kys. galakturonová | A2',A2, poly- GalA | 18,9 | 15,2 | 8,5 I |
| Kys. glukuronová | A4 | 0,3 | 0,2 | 0,0 |
| str. dp homogalakturonového reťazca | 6-7 | 6 | 4 | |
| % reziduálnej molekuly | 54 | 51 | 29 |
30833/H
Tabuľka 5 Zloženie v počte rezíduí RG-II v priebehu kinetiky degradácie pomocou P. daleae
| Výcho- diskový | 120 h | 168 h | 240 h | 264 h | 336 h | 384 h | |
| Rhamnóza | 4,0 | 3,2 | 3,0 | 2,6 | 2,1 | 0,7 | 0,2 |
| 2-O-Me-fukóza | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 0,8 | 0,8 | 0,2 | 0,1 |
| Fukóza | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 0,7 | 1,0 | 0,5 | 0,6 |
| 2-O-Me-xylóza | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 0,5 | 0,3 | ||
| Apióza | 2,0 | 2,0 | 1,9 | 1,7 | 1,5 | 0,4 | 0,2 |
| Arabinóza | 3,0 | 2,6 | 2,2 | 1,8 | 1,4 | 0,4 | 0,2 |
| Galaktóza | 2,0 | 1,8 | 1,3 | 1,1 | 0,9 | 0,2 | 0,2 |
| Kys. galakturonová | 10,5 | 10,5 | 7,9 | 7,5 | 7,7 | 4,1 | 4,0 |
| Kys. glukuronová | 1,0 | 1,4 | 0,8 | 0,3 | 0,3 | ||
| Kys. acerová | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,3 | 0,2 |
| Kdo | 0,9 | 1,9 | 0,9 | 0,5 | 0,9 | 0,7 | 0,6 |
| Dha | 0,7 | 0,1 | 0,3 | 0,3 | 0,6 | 0,6 | 0,5 |
| Celkovo | 27,7 | 27,0 | 21,9 | 18,3 | 18,1 | 8,1 | 6,8 |
| stredná dp homogalakturo- nového reťazca | 8,5 | 8,0 | 8,0 | 7,5 | 6,0 | 4,5 | 3,5 |
| % reziduálnej molekuly | 100 | 97 | 79 | 66 | 65 | 29 | 25 |
30833/H
Tabuľka 6 Analýza metylácie a väzieb rezíduí vytvárajúcich molekulu RG-II v priebehu degradácie pomocou P. simplicissímum x
CM cn x
o so x
CM n
x
Ό
OS τί
O
X υ
>
CM — O O
OO — O ° v-l
Os vq oo os sr Λ o o o o o o o o co o o r- oo — S O o o — o o o — o o’ o O O 0 — 0 °°. o — r-. ri O X o* o o so u-ι O p~ r- tí· O O CM vs os xf — o /1
- O — O o o cm* — o* o* o o 0—0 vs_ vs xr vs O oo o — o r, x, ?, 0.32-3 %
CM
CO oo O O Γ-ζΌ O CM/Ί Ά ''’.’ľ't.
_?o —~ o O CM* F-/O O o ® 0 — 0
| 3 T3 H | Ό CM | SO CM m m | 5 | Φ co « < | r·· ·< t—* |
| N | Q | « | |||
| d) | |||||
| K |
m
G >s
X
N :<D >
Oj >1
E-i k
Φ
4J s<D
H ►i
P
Φ £
o.
T T11Ť T ΪΤΤ • *—'x-/ · »
-Λ » ’ ♦ A, c co <
| o o o | x* | |
| o —' O | T | |
| Q. | ||
| cd | ||
| x | ||
| (X | ||
| 5SS- | 1 co Ť | φ |
| 3 | Ό | |
| 3 | ‘CD | |
| VS Tí* | p | Ό |
| X o o' | 'n | CD |
| O — | E | U. 05 |
| Φ | ||
| t— | X3 | |
| JiC | 3 | |
| E | X Φ | |
| U1 v-> — ΌO* — O* | o . T3 CD c__ | X ,Φ 'L·. |
| X | Q. | |
| 2 | > | |
| X & | ‘CD X X | |
| c | Φ | |
| ľ? ” ľ? < « < | CD +-» ίο o | E φ x |
| Q. | CD | |
| > •CD | ||
| X | en | |
| O | o | |
| 2 | N | |
| t T T *'*' ·—< | ω E | ‘CD u_ O |
| 'T*' * x-z | o | v |
o ô o «5
O «4 . rt <3 λ 5SS
CM CO cM*CX
O (2 • o
Φ 3 co
CM* CM ?“ CM OS :f cm 1 T
o.
o s
ó
CM φ ’φ cM* co
Ť T
-C = £ o E Qí
| *Sr | <ď <í% tí. | >» ><í | Ί3 O 'Ó | 3 73 |
| < | •AX·? S | 1 •Φ | Φ | o O |
| τ\ | os<n4 < | CO | co | vS vo |
| CM* | cm 01 OS* xf | CM | cm | CO CM* |
Í5 o
E >
-ω x
(O
D
O
V) >.
Ό φ
en
Φ
Φ
O
E >
CM ω
>6 □
•σ
N
Φ
2,3,4-Me3-Rha = 1,5-di-O-acetyl-2,3,4-tri-O-metyl-rhamnitol, atď. p = pyranóza, f = furanóza
| Tabuľka 7 | Analýza metylácie a | väzieb | rezíduí vytvárajúcich | molekulu | RG-II | ||
| v priebehu degradácie pomocou Penicillium daleae | |||||||
| Metyléter | Väzba | Východ 72 h | 120 h | 160 h | 240 h | 264 h | |
| 2,3,4-Rha | Rhfl/)-» | 1.4 | 1.2 | 1 | 1.2 | 1.2 | 1.2 |
| 3,4-Rlia | ->2-Rhap-> | 1.1 | 0.7 | 0.5 | 0.4 | 0.3 | 0.4 |
| 2,4-RJia | -»3-Rhap-> | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 3-Rha | —>2,4-Rhnp-> | 0.4 | 0.1 | 0.3 | |||
| Rha | -»2,3,4-Rhap-+ | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.1 | 0.8 | 0.3 |
| 2,3,4-Fuc | 2-G-CH3-Fuc-> | 0.8 | 0.7 | 0.7 | 0.8 | 0.7 | 0.8 |
| 2-Fuc | —>3,4-F»c—> | 0.6 | 0.7 | 0-7 | 0.6 | 0.3 | 0.2 |
| 2,3,4-Xy) | 2-0-CH3-Xyl-> | 0.6 | 0.6 | 0.5 | 0.5 | 0.3 | 0.1 |
| 2,3-Api | -»3'-Api-> | '2.2 | 2.2 | 2.3 | 2.2 | 2.2 | 1.8 |
| 2,3,5-Ara | Ara/—> | 1.6 | 1.4 | 1.1 | 1.3 | 0.8 | 0.8 |
| 3,4-Ara | ->2-Arap-> | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.5 | |
| 4-Ara | ->2,3-Arňp—> | 0.6 | 0.7 | 0.6 | 0.6 | 0.4 | 0.2 |
| 2,3,4,6-Gal | Galp—> | 0.5 | 0.5 | 0.5 ' | 0.4 | 0.3 | 0.2 |
| 2,6-Gal. . | -»3,4-GaIp-> | 0.6 | 0.6 | 0.5 | 0.5 | 0.4 | 0.3 |
| 3,6-Gal | ->2,4-Gal/>-> | 1.0 | 1.2 | 1.1 | 1.1 | 1.0 | 0.9 |
| '3-Accr | —>2-AccrA-> | 0.5 | 0.5 | 0.3 | 0.5 | 0.6 | 0.6 |
| 2,3,4-GalA | GalpA—> | 2.6 | 3.0 | 3.0 | 2.6 | 1.9 | 1.4 1' . - |
| 2,3-GaJA | —>4-GaIpA—» | 2.0 | 2.3 | 2.1 | 1.8 | 1.7 | 1.5 |
| 2-GiiIA | ->3,4-GídpA-> | 1.5 | 1.5 | 1.5 . | 1.5 | 1.3 | 1.3 |
| 3-GalA | -»2,4-Gal/JA-» | 1.1 | 1.2 | 1.3 | 1.3 | 1.8 | 1.6 |
| GalA · | —>2,3,4-GalpA—> | 0.8 | 0.9 | 0.8 | 0.7 | 0.3 | 0.2 |
| 1,2,3,5-GalA | —>4-Ga!/>A rcduit | 1.0 | . o.y | 0.8 | 0.7 | 0.7 | 0.8 |
| 2,3,4-GlcA | GIc/jA—> | 0.2 | 1 | ||||
| 3,4GlcA | —>2-GlcpA— | 1.1 | 1.4 | 1.3 | 1.1 | 0.6 | 0.4 |
Výsledky sú dané v molárnych pomeroch vypočítaných vzhľadom k 1 rezíduu ->3)Rhap-(1->, rezíduu B2 v molekule RG-II, ktorá zostáva nemenná v priebehu degradácie 2,3,4-Me3-Rha = 1,5-di-0-acetyl-2,3,4-tri-0-metyl-rhamnitol, atď.
30833/H
Claims (32)
1. Enzým, vyznačujúci sa tým, že vykazuje degradačný účinok na rhamnogalakturonan II (RG-II) a jeho deriváty.
2. Enzým podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že vykazuje účinok typu endohydrolázy.
3. Enzým podľa nárokov 1 a 2, vyznačujúci sa tým, že vykazuje účinok endobeta-L-rhamnopyranozyl-(1-»3')-D-apiofuranozyl hydrolázy.
4. Enzým podľa nárokov 1 a 2, vyznačujúci sa tým, že vykazuje účinok endoalfa-L-fukopyranozyl-(1 ->4)-L-rhamnopyranozyl hydrolázy.
5. Mikroorganizmus, najmä huba, vyznačujúci sa tým, že vykazuje degradačný účinok na RG-II a jeho deriváty.
6. Huba podľa nároku 5, vyznačujúca sa tým, že je druh Penicillium.
7. Kmeň húb podľa niektorého z nárokov 5 a 6, vyznačujúci sa tým, že je deponovaný u CNCM pod číslom 1-1578 (LAV2).
8. Kmeň húb podľa niektorého z nárokov 5 a 6, vyznačujúci sa tým, že je deponovaný u CNCM pod číslom 1-1577 (IPV1).
9. Enzým podľa niektorého z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že môže byť produkovaný kmeňom podľa niektorého z nárokov 5 až 8.
10. Enzymatický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje enzým podľa niektorého z nárokov 1 až 4 a 9.
11. Spôsob výroby enzýmu alebo enzymatického prípravku podľa niektorého z nárokov 1 až 4 a 9 a 10, zahrňujúci nasledujúce etapy:
- kultivácia mikroorganizmov podľa niektorého z nárokov 5 až 8 v kultivačnom prostredí upravenom na produkciu enzýmov podľa niektorého z nárokov 1 až 4,
- získanie enzýmov alebo enzymatického prípravku zo supernatantu kultúry alebo zo supernatantu drviny mikroorganizmov.
30833/H
12. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje nasledujúce etapy:
- kultiváciu mikroorganizmov podľa niektorého z nárokov 5 až 8 v kultivačnom prostredí upravenom pre mikroorganizmy obsahujúce RG-II alebo niektorý z jeho derivátov,
- získanie mikroorganizmov,
- rozdrvenie mikroorganizmov,
- eliminácia nerozpustného materiálu a
- získanie supernatantu obsahujúceho enzým alebo enzýmový prípravok.
13. Spôsob získania RG-II z extraktu rastlinného pôvodu, zahrňujúci nasledujúce etapy:
- separácia makromolekúl obsahujúcich uvedený extrakt a
- chromatografia iónovou výmenou pri pH vyššom ako 4.
14. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že separácia je vykonávaná precipitáciou alebo ultrafiltráciou.
15. Spôsob podľa niektorého z nárokov 13 a 14, vyznačujúci sa tým, že chromatografia iónovou výmenou je nasledovaná sterickou vylučovacou chromatografiou.
16. Spôsob získania RG-II z extraktov rastlinného pôvodu zahrňujúci aspoň jednu adsorpčnú chromatografiu na nosiči, zadržiavajúcom RG-ll.
17. Spôsob podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že adsorpčná chromatografia je vykonávaná na aktívnom uhlí alebo na polystyrén/ divinylbenzénovej živici.
18. Prípravok RG-ll, ktorý môže byť získaný spôsobom podľa niektorého z nárokov 13 až 17, vyznačujúci sa tým, že obsahuje aspoň 95 % monomérov RGll.
19. Prípravok RG-ll, ktorý sa môže získať spôsobom podľa niektorého z nárokov 13 až 17, vyznačujúci sa tým, že obsahuje aspoň 80 %, výhodne viac ako 95 % dimérov RG-ll.
3G833/H
20. Spôsob selekcie mikroorganizmov, najmä hu.j, na ich schopnosť degradovať RG-ll, vyznačujúci sa tým, že uvedené mikroorganizmy sa nechajú rásť na prispôsobenom kultivačnom prostredí obsahujúcom RG-ll, pričom uvedený RG-ll je možné získať spôsobom podľa niektorého z nárokov 13 až 17.
21. Kultivačné prostredie pre mikroorganizmy, vyznačujúce sa tým, že obsahuje RG-ll, získaný spôsobom podľa niektorého z nárokov 13 až 17.
22. Spôsob podľa niektorého z nárokov 11 alebo 12, vyznačujúci sa tým, že RG-ll je získaný spôsobom podľa niektorého z nárokov 13 až 17.
23. Použitie enzýmu alebo enzymatického prípravku podľa niektorého z nárokov 1 až 4, 9 a 10 alebo získaného spôsobom podľa niektorého z nárokov 11 a 12 pre degradáciu alebo modifikáciu RG-ll alebo jeho deriv átov.
24. Použitie enzýmu alebo enzymatického prípravku podľa niektorého z nárokov 1 až 4, 9 a 10 alebo získaného spôsobom podľa niektorého z nárokov 11 a 12 na zlepšenie filtrovateľnosti a uľahčenia prípravy koncentrovanej šťavy alebo kvôli uľahčeniu čistenia.
25. Použitie enzýmu alebo enzymatického prípravku podľa niektorého z nárokov 1 až 4, 9 a 10 alebo získaného spôsobom podľa niektorého z nárokov 11 a 12 na čistenie filtračných nosičov použitých na filtráciu ovocných alebo zeleninových štiav a ich derivátov.
26. Použitie enzýmu alebo enzymatického prípravku podľa niektorého z nárokov 1 až 4, 9 a 10 alebo získaného spôsobom podľa niektorého z nárokov 11 a 12 pre maceráciu, stekutenie alebo úplnú alebo čiastočnú hydrolýzu rastlinného tkaniva.
27. Použitie podľa nároku 26 v maceračnej príprave pre výrobu ovocnýcn nektárov, pyré, želé a ovocných a zeleninových koncentrátov a ich derivátov, do toho rátajúc i víno.
28. Použitie podľa nároku 26 pri stekucovaní na prípravu ovocných a zeleninových štiav a aromatických báz a ich derivátov, do toho rátajúc i víno a pri výrobe piva.
29. Použitie podľa nároku 26 na výrobu pektínov z rastlinných rezíduí ako sú bulvy červenej repy a pevných rezíduí vzniknutých lisovaním ovocia.
3C833/H
30. Použitie podľa nároku 26 na prípravu potravy p;e zvieratá z rastlinných látok.
31. Použitie podľa nároku 26 na výrobu celulózy z mstlin, výhodne z bavlny, pre textilný priemysel a vo výrobe papiera.
32. Použitie podľa nároku 26 na výrobu oligosacharidov s elicitickým ičinkom vyvolávajúcim obrannú reakciu rastlín, pričom tieto oiigc sacharidy sú vyrábané z rastlinných rezíduí a môžu sa použiť ako fytosanitárne produkty.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9506142A FR2734578B1 (fr) | 1995-05-23 | 1995-05-23 | Enzyme degradant le rhamnogalacturonane ii, procedes d'obtention de cette enzyme et du rhamnogalacturonane ii et utilisation de cette enzyme |
| PCT/FR1996/000758 WO1996037604A2 (fr) | 1995-05-23 | 1996-05-21 | Enzyme et microorganisme degradant le rhamnogalacturonane ii |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK156697A3 true SK156697A3 (en) | 1998-09-09 |
Family
ID=9479302
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1566-97A SK156697A3 (en) | 1995-05-23 | 1996-05-21 | Enzyme degrading rhamnogalacturonane ii and its derivatives, process for manufacturing this enzyme and rhamnogalacturonane ii, and application of the enzyme |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6103506A (sk) |
| EP (1) | EP0827533B1 (sk) |
| JP (1) | JPH11508127A (sk) |
| AR (1) | AR002067A1 (sk) |
| AT (1) | ATE330006T1 (sk) |
| AU (1) | AU6006796A (sk) |
| BR (1) | BR9608812A (sk) |
| CA (1) | CA2222193A1 (sk) |
| CZ (1) | CZ370197A3 (sk) |
| DE (1) | DE69636247D1 (sk) |
| FR (1) | FR2734578B1 (sk) |
| HU (1) | HUP9900744A2 (sk) |
| IL (1) | IL118404A (sk) |
| PL (1) | PL323529A1 (sk) |
| RU (1) | RU2220203C2 (sk) |
| SK (1) | SK156697A3 (sk) |
| TR (1) | TR199701421T1 (sk) |
| UA (1) | UA64696C2 (sk) |
| WO (1) | WO1996037604A2 (sk) |
| ZA (1) | ZA964107B (sk) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7132119B1 (en) | 1997-04-08 | 2006-11-07 | Pall Corporation | Method for producing beer |
| WO1999038956A2 (en) * | 1998-01-30 | 1999-08-05 | Institut National De La Recherche Agronomique | Enzyme modifying rhamnogalacturonane ii, dna encoding for said enzymes and method for producing the enzyme |
| FR2980800B1 (fr) * | 2011-09-30 | 2014-01-10 | Agronomique Inst Nat Rech | Procede de preparation d'un produit alimentaire liquide enrichi en oligosaccharides et en polysaccharides |
| JP6539400B1 (ja) * | 2018-10-24 | 2019-07-03 | 株式会社アンチエイジング・プロ | Ｌｐｓ高含有組成物の製造方法 |
| CN117204574B (zh) * | 2023-11-09 | 2024-02-02 | 北京市农林科学院 | 促进肠道菌群发酵平衡的果胶基膳食补充剂及其制备方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3541945A1 (de) * | 1985-11-27 | 1987-06-04 | Lomapharm Rudolf Lohman Gmbh K | Immunstimulierend wirkende polysaccharide aus zellkulturen von echinacea purpurea (l.) moench und echinacea angustifolia, d.c. verfahren zu ihrer herstellung und sie enthaltende pharmazeutische zubereitungen |
| DE3934304A1 (de) * | 1989-10-13 | 1991-04-18 | Lohmann Rudolf Lomapharm | Polysaccharide mit antiphlogistischer wirkung, verfahren zu ihrer gewinnung und sie enthaltende arzneimittel |
| CA2109218A1 (en) * | 1991-05-02 | 1992-11-03 | Kurt Dorreich | Rhamnogalacturonase, corresponding dna sequence, rhamnogalacturonase containing enzyme preparation and use of the enzyme preparation |
| EP0570075A3 (en) * | 1992-05-15 | 1995-02-15 | Quest Int | Cloning and expression of DNA encoding a ripening form of a polypeptide having rhamnogalacturonase activity. |
| DE4221753C2 (de) * | 1992-07-02 | 1994-11-24 | Plantamed Arzneimittel Gmbh | Immunologisch und antiphlogistisch wirksame Polysaccharide aus Sedum telephium, Verfahren zu ihrer Gewinnung und diese enthaltende Arzneimittel |
| DK24493D0 (sk) * | 1993-03-05 | 1993-03-05 | Novo Nordisk As |
-
1995
- 1995-05-23 FR FR9506142A patent/FR2734578B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-05-21 EP EP96917526A patent/EP0827533B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-21 CA CA002222193A patent/CA2222193A1/fr not_active Abandoned
- 1996-05-21 DE DE69636247T patent/DE69636247D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-21 PL PL96323529A patent/PL323529A1/xx unknown
- 1996-05-21 HU HU9900744A patent/HUP9900744A2/hu unknown
- 1996-05-21 JP JP8535433A patent/JPH11508127A/ja active Pending
- 1996-05-21 RU RU97121499/13A patent/RU2220203C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-05-21 TR TR97/01421T patent/TR199701421T1/xx unknown
- 1996-05-21 WO PCT/FR1996/000758 patent/WO1996037604A2/fr active IP Right Grant
- 1996-05-21 SK SK1566-97A patent/SK156697A3/sk unknown
- 1996-05-21 UA UA97126189A patent/UA64696C2/uk unknown
- 1996-05-21 US US08/973,335 patent/US6103506A/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-05-21 CZ CZ973701A patent/CZ370197A3/cs unknown
- 1996-05-21 BR BR9608812A patent/BR9608812A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-05-21 AU AU60067/96A patent/AU6006796A/en not_active Abandoned
- 1996-05-21 AT AT96917526T patent/ATE330006T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-05-22 AR ARP960102653A patent/AR002067A1/es active IP Right Grant
- 1996-05-22 ZA ZA964107A patent/ZA964107B/xx unknown
- 1996-05-23 IL IL118404A patent/IL118404A/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AR002067A1 (es) | 1998-01-07 |
| WO1996037604A3 (fr) | 1997-01-23 |
| AU6006796A (en) | 1996-12-11 |
| ATE330006T1 (de) | 2006-07-15 |
| DE69636247D1 (de) | 2006-07-27 |
| CZ370197A3 (cs) | 1998-03-18 |
| EP0827533B1 (fr) | 2006-06-14 |
| US6103506A (en) | 2000-08-15 |
| WO1996037604A2 (fr) | 1996-11-28 |
| JPH11508127A (ja) | 1999-07-21 |
| EP0827533A2 (fr) | 1998-03-11 |
| FR2734578B1 (fr) | 1997-08-14 |
| TR199701421T1 (xx) | 1998-02-21 |
| BR9608812A (pt) | 1999-02-17 |
| CA2222193A1 (fr) | 1996-11-28 |
| IL118404A0 (en) | 1996-09-12 |
| HUP9900744A2 (hu) | 1999-06-28 |
| ZA964107B (en) | 1996-12-03 |
| FR2734578A1 (fr) | 1996-11-29 |
| UA64696C2 (en) | 2004-03-15 |
| PL323529A1 (en) | 1998-03-30 |
| RU2220203C2 (ru) | 2003-12-27 |
| IL118404A (en) | 2006-10-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Vidal et al. | Polysaccharides from grape berry cell walls. Part I: tissue distribution and structural characterization of the pectic polysaccharides | |
| Øbro et al. | Rhamnogalacturonan I in Solanum tuberosum tubers contains complex arabinogalactan structures | |
| Nacos et al. | Kenaf xylan–A source of biologically active acidic oligosaccharides | |
| Prabasari et al. | Pectic polysaccharides from mature orange (Citrus sinensis) fruit albedo cell walls: Sequential extraction and chemical characterization | |
| Shet et al. | Pectinolytic enzymes: classification, production, purification and applications | |
| Basanta et al. | Effect of extraction time and temperature on the characteristics of loosely bound pectins from Japanese plum | |
| JPH072113B2 (ja) | 高温性細菌アシドサームス・セルロリティクスからの熱安定性精製エンドグルカナーゼ | |
| Flores-Gallegos et al. | Comparative study of fungal strains for thermostable inulinase production | |
| JPH07508890A (ja) | エンドグルカナーゼとセロビオヒドロラーゼの共同作用 | |
| Kurakake et al. | Enzymatic Properties of β‐1, 3‐Glucanase from Streptomyces sp Mo. | |
| NZ202876A (en) | Enzymes for degradation of carbohydrates | |
| SK156697A3 (en) | Enzyme degrading rhamnogalacturonane ii and its derivatives, process for manufacturing this enzyme and rhamnogalacturonane ii, and application of the enzyme | |
| Lu et al. | Improved production and antioxidant activity of exopolysaccharides by submerged culture of Lentinula edodes by the addition of lignocellulose | |
| JPH06506831A (ja) | ラムノガラクツロナーゼ、対応するｄｎａ配列、ラムノガラクツロナーゼ含有酵素調製物および該酵素調製物の用途 | |
| DE10019076A1 (de) | Verwendung von Polygalakturoniden als Lebensmittelzusatzstoffe | |
| US20130156890A1 (en) | Methods of Juice Production | |
| Bassim Atta et al. | Chapter Fungal Pectinases in Food Technology | |
| Hart et al. | Orange finisher pulp as substrate for polygalacturonase production by Rhizopus oryzae | |
| US5330903A (en) | Method for producing capsular polysaccharides | |
| Vidal et al. | Penicillium daleae, a soil fungus able to degrade rhamnogalacturonan II, a complex pectic polysaccharide | |
| Ortiz-Basurto et al. | Presence of rhamnogalacturonan II in the juices produced by enzymatic liquefaction of Agave pulquero stem (Agave mapisaga) | |
| Konno et al. | Degradation of pectic polysaccharides extracted from suspension cultures of carrot by purified exo‐polygalacturonase | |
| Jeong et al. | Production of an anti-complement exo-polymer produced by Auricularia auricula-judae in submerged culture | |
| Alvarez et al. | A novel substitution pattern in glucuronoarabinoxylans from woody bamboos | |
| Konno et al. | Expolygalacturonase from Suspension Cultures of Marchantia polymorpha: Its Presence and Involvement in Pectic Polysaccharide Degradation |