UA64696C2 - Enzyme degrading rhamnogalacturonane ii and derivatives thereof, methods for preparing this enzyme and rhamnogalacturonane ii - Google Patents

Description

Предметом винаходу є ензим, здатний деградувати рамногалактуронан І (РГ-ІЇ) та його похідні, а також спосіб одержання цього ензиму.

Крім того, його предметом є спосіб одержання РГ-І.

Він також стосується застосування цього ензиму.

Рамногалактуронан ІІ є одним з універсальних і дуже складних елементів клітинної оболонки рослин (О'Меї! єї аї., Мештоавз іп Ріапі Віоспетівігу (1990) 2:415-439), Він належить до пектинних полісахаридів і розташовується головним чином на рівні середньої ламели і первинної оболонки.

Його будова надзвичайно складна (фіг.1), оскільки він складається з 12 різних моносахаридів з ступенем полімерізації (сп) близьким до 30. Ця складність збільшується завдяки присутності в його складі рідкісних цукрів, котрі містять апіозу або 3-С-(гідроксиметил)-О-гліцеро-тетрозу, КСО або 2-цето-3-деокси-О-мано- октулозну кислоту; ОНА або 3-деокси-О-ліксо-2-гептулозну кислоту, 2-О-метил-ксилозу і, нарешті, оцтову кислоту або 3-С-карбокси-5-деокси-Ї -ксилозу. Цей останній моносахарид є для РГ-ІЇ специфічним маркером, моносахариди, що більш часто зустрічаються в оболонкових полісахаридах: рамноза, фукоза, арабіноза, галактоза, а також галактуронова та глукуронова кислоти також присутні в складі РГ-ЇЇ, але найчастіше з аномеріями та численними і специфічними типами зв'язків, котрі ще більш посилюють специфічність і складність будови молекули.

Ультраструктуральна організація РГ-ІЇ (фіг.1) це більше підвищує цю складність (Римапезага|анй еї аї.,

Сагропуаг. Аев.(1991) 218:211-222). Гомологічний ланцюг, що складається з від 7 до 14 залишків галактуронової кислоти, поєднаних в о-(1-354), має в це досі не визначених позиціях 4 різних гілки: два дисахариди і два складніших окта- або нонасахаридних ланцюга. Спостерігаються структуральні відмінності в довжині гомогалактуронового ланцюга і в кінцевій частині гілки В, котрі, як здається, зобов'язані своїм існуванням ензиматичним впливам, використаним для їх одержання, з іншого боку, на залижу АБ була помічена присутність досі не визначених замісників. Крім того, молекула РГ-ІЇ містить від 2 до З метальних груп, котрі перетворюють в складні ефіри карбоксильні групи галактуронових кислот і дві ацетильні групи, розташовані на залишках ВАЗ (ацерична кислота) і ВА (2-метил-фукоза).

Таким чином, будова РГ-ІІ є в загальних рисах визначеною, хоч природа окремих замісників лишається досі не ідентифікованою.

В клітинній оболонці рослин РГ-ІІ асоційований з нативними пектинами, але точний тип зв'язку між протопектином і РГ-ІЇ є на цей час невідомим. Так само і його роль в оболонці рослин є мало відомою. Тим часом його присутність відома в усьому рослинному світі (АІрегеНеїт еї аї!., Віоспет. бос. Тгапзасійюпвь (1994) 22:374-378); від птеридофітів до сперматофітів, від гімноспермів до ангіоспермів. від однодольних до дводольних (фіг.2), причому в вартих уваги кількостях, в середній ламелі оболонок. Відомо також, що його будова збережена в тих різних рослинах, в котрих вона вивчалась (АїІрегзпеїга єї а. Віоспет. зос. Тгапзасіпь (1994) 22:374-378).

Останні роботи показали, що він може діяти як сигнальний полісахарид і викликати у рослини специфічні відповіді (еліцитрична активність) (АІдіпдюп еї Егу, у. Ехр. Воїапу (1994) 45:287-293). Тим часом, його велика кількість, його одночасна присутність в багатьох місцях і складність його будови наводять на думку про те, що він відіграє фундаментальну роль в поєднанні клітинних оболонок рослин і таким чином в клітинній організації рослинних тканин.

РГ-ІЇ виділено з клітинних оболонок під впливом ензимів пектолітичної дії (пектин-естераза, ендо- або ексо-полігалактуроназа), котрі деградують гладкі ланцюги нативних пектинів і вивільнюють РГ-П в недеградованій формі (Оагміп еї аї,, Ріапі Рпузіої. (1978) 62:418-422), як показано на фіг.1. Відмінності в довжинах гомогалактуронового ланцюга засвідчують наявність ензиматичних деградацій, котрі уможливили його вивільнення з нативних пектинів (М/пісотре еї а!., Сагонуаг, Нез (1995) 271:15-29).

Складність і оригінальність будови РІГ-І роблять його особливо резистентним щодо деградування ензимами, присутніми в рослинних екстрактах, так само як і комерційними ензимними препаратами, як грибкового так і бактеріального походження.

Дійсно, в комерційних ензиматичних деградувальних препаратах, що мають найбільшу кількість різних активностей, не можна засвідчити ніякої деградувальної активності щодо рослинних оболонок. Єдині з помічених деградацій мають відношення до залишав арабінофуранози, рамнопіранози або галактопіранози, розташованих на невідновному кінці бокових ланцюгів. Екзо-ензими, що дозволять вивільнення таких залишків, дійсно часто присутні в ензиматичних препаратах; що безсумнівно пояснює відмічені різних авторами відмінності різних препаратів РГ-ІЇ.

Під час видушування або розмелювання фруктів і овочів вивільнюються пектолітичні активності, котрі забезпечують деградацію гомогалактуронових ланцюгів нативних пектинів. Ці активності посилюються при додаванні комерційних пектолітичних ензимів і, у випадку вин і ферментованих продуктів, - ферментаційною флорою. РГ-ІЇ вивільнюється в непорушній формі і часом в значній кількості в фруктових та овочевих соках і нектарах та їх похідних, особливо в винах.

В винах РГ-ІЇ є одним з найосновніших полісахаридів (осо єї Впоцеї, Сагропуаг. Вев. (1993) 243:333- 343), і його концентрація може досягнути 100мг/л. Він приймає участь в численних небажаних явищах, таких як кольматаж фільтрувальних мембран (ВеїІеміПе еї а!., Епої. Міс. сі, (1991) 46:100-107), утворення нестійких комплексів з іншими колоїдальними макромолекулами і індукція явищ осадоутворення. його елімінація обов'язково проходить з застосуванням ензимів, призначених для його деградування.

На сьогоднішній день описані численні способи одержання РГ-І! з вина: ензиматичним гідролізом з допомогою грибкової ендополігалактуронази клітинних оболонок, виділених з культур суспендованих рослинних клітин (Ваг! єї а!., Ріапі Рпузіо!. (1978) 62:418-422), з комерційного ензиматичного препарата пектінол АС, одержаного з Агрегдійне підег (біємепвзоп еї аі.,Сагропуаг. Вевз. (1988) 179:269-288); РГ-ІІ присутній в ньому в слабкій концентрпції і його очищення пов'язане з численними етапами елімінації білків і барвної речовини, з вина (Оосо єї ВпіІошеєї, Сагропуаг. Вез. (1993) 243:333-343), описана очистка потребує 4 послідовних етапи хроматографії стеричний вилученням і іонним обміном.

Слід відмітити, що рамногалактуронан І або РГ-ІЇ, хоч і дуже близький за назвою, є складником оболонок рослинних клітин, що повністю відрізняється від РГ-ІЇ як з точки зору будови (його будова базується на чергуванні рамнози і галактуронової кислоти), так і його деградування ензимами. Рамногалактуроназна (спо! єї аї., Сапгопуаг. Вез. (1990) 206:105-115) або протопектиназна (Закатоїй еї ЗакКаї, Сагропуаг. Вез. (1994) 259:77-91) активності вже були описані раніше.

З наведеного веде аналізу стану техніки витікає, що спеціалістам невідомий жоден ензим або ензиматичний препарат, що мав би достатню активність для деградування РГ-ІЇ. Однак присутність цього полісахариду є джерелом небажаних явищ, таких як кольматаж фільтрувальних мембран, утворення з інший колоїдальними макромолекулами нестабільних комплексів і індукція явищ осадоутворення.

Зважаючи на важливість пов'язаної з цими явищами економічної діяльності, описану проблему потрібно було вирішити.

Заявник показав можливість виділити з мікроорганізмів ензиматичні активності, відповідальні за деградацію РГ-ІЇ ї його похідних.

З іншого боку, він розробив новий спосіб одержання РГ-ІІ, котрий дозволяє одержувати його в великих кількостях з різних рослинних джерел.

Предметом цього винаходу є ензим, відмітний тим, що він деградує РГ-ІЇ і його похідні.

В цьому винаході під РГ-ІІ розуміється будь-який полісахарид, що мас будову, показану на фіг.1, будь-то в формі мономера або димера, і будь-яка молекула, утворена в результаті його часткової деградації, що має принаймні один ланцюговий фрагмент А, в, С або 0, характерний як з точки зору складу, так і послідовності.

В подальшому будь-яке посилання на РГ-ІЇ може також стосуватись будь-якої похідної цієї молекули.

Вигідний чином, такий ензим виявляє активність типу ендо-гідролазної.

Такий ензим може зокрема вишити ендо-р-І-рамнопіраносил-(1-»3)-О-апіофураносил-гідролазну і/або ендо-о-І -фукопіраносил-(1-54)-І -рамнопіраносил-гідролазну активності Ці активності можуть бути зідентифіковані по їх спроможності вивільнювати ланцюг А, як це видно з фіг.1.

Такий ензим може бути продукованим мікроорганізмом, зокрема грибом з роду РепісшШіит.

Такі мікроорганізми, що виявляють активність деградування РГ-ЇЇ і його похідних, являють собою інший предмет цього винаходу. Ними зокрема можуть бути наступні штами Репісійшт, депоновані 19 травня 1995 року в Національній колекції культур мікроорганізмів Інституту Пастера (СМСМ): штам РепісшШіит вітріїсізвітит, депонований в СМОСМ під Ме1-1577 (ІРМ'1), штам РепісшШіит даїІєає, депонований в СМСМ під Ме1-1578 (І АМ2).

Ці два штами грибів мають характерний вигляд нитчатих, поділених перегородками, грибів, що швидко утворюють синьо-зелені спори (починаючи з 6-го дня культури).

Р. даієає є малопоширений гриб, котрий завжди виділяють з лісових грунтів і котрий є відомим завдяки своїй спроможності деградувати крохмаль і пектинові полісахариди. Цей вид описано в "Сотреадійт ої в5оїїЇ

Еипаі, Н.К. Юотесп, М. Сатв єї Т.Н. Апаегзоп (1980) асадетіс Ргевв, І опаоп, с.560".

Р. вітріїсізвітит є більш поширеним і його часто виділяють з овочів в стані розкладання. Цей вид описано в "Сотреадіийт ої зоїЇ Рипді, Н.К. ботесі, МУ. Сатв єї Т.Н. Апдеггоп (1980) Асадетіс Ргевв5, І опдоп, со.597-598".

Винахід також стосується ензиматичних препаратів, що містять ензим-деградант РГ-ІЇ і його похідні, такі як описано вище.

Таким чином, такі ензими можуть бути приготовленими у вигляді препаратів, що містять інші ензими, котрі виявляють інші активності.

Збагачення таких препаратів активностями, що дозволяють деградувати РГ-І, створює цілковито нові можливості для всіх застосувань, що потребують часткової або повної деградації клітинних оболонок і полісахаридів рослин.

Ензими, що дозволяють специфічну деградацію РГ-ІЇ та його похідних, можуть бути застосованими для деградування або модифікації РГ-ІЇ або його похідних і зокрема в таких застосуваннях: видалення РГ-0І з соків фруктів, овочів та їх похідних для покращання фільтрувальної спроможності, спрощення виготовлення соків і ароматичних концентратів, сприяння явищам просвітлення і забезпечення стабільної якості виготовлених продуктів, очищення мембран для мікро- і ультрафільтрації, вживаних для просвітлення фруктових та овочевих соків і їх похідних, одержання препаратів типу мацерази, тобто таких, що дозволяють дисоціацію оїтинних тканин молодих овочів разом з мінімальним деградуванням нативних структур (виготовлення фруктових нектарів, пюре, желе і фруктових та овочевих концентратів), одержання препаратів типу зріджувальних, тобто таких, що мають забезпечити повний гідроліз полісахаридів клітинних оболонок рослин (виготовлення з фруктів та овочів соків і ароматичних основ, а також ферментованих напоїв і пива), виробництво пектинів і кормів для тварин з рослинних залишків (бурякова пульпа, тверді залижи після видушування фруктів...), виробництво целюлози з рослин; ензиматичний гідроліз інших складових полісахаридів дійсно дозволяє поліпшити вихід продукції (текстильна промисловість, виробництво паперу).

Комерційні ензиматичні препарати, що дозволяють деградувати клітинні оболонки рослин, в залежності від типу бажаного застосування повинні мати найточніші і найліпше визначені типи біологічних дій.

Специфічне внесення ензимів з властивістю деградувати РГ-ІЇ, що мають точні і добре визначені типи дії, сприяє кращому використанню технологічного потенціалу грибкових ензимів.

Ензими і ензиматичні препарати, що відповідають нижчеописаному винаходу, можуть бути найбажаним чином одержані в спосіб, що складається з наступних етапів: введення в культуру мікроорганізмів, що мають активність деградування РГ-ІЇ або його дохідних, в культуральному середовищі, пристосованому до продукування цих ензимів,

рекуперацію ензиму або ензиматичного препарату з поверхневої плівки культури або з поверхневої плівки розколу мікроорганізмів.

Бажано, щоб цей спосіб включав наступні етапи: введення в культуру мікроорганізмів, що мають активність деградування РГ-0Ї, в культуральному середовищі, що містить РГ-ІЇ, ії пристосованому до цих мікроорганізмів, рекуперацію мікроорганізмів, розмелювання мікроорганізмів, видалення нерозчинної речовини, зокрема фільтрацією або центрифугуванням розмелених мікроорганізмів, і рекуперацію поверхневої плівки, що містить ензим або ензиматичний препарат.

За сприятливих умов ензими можна також одержати безпосередньо з поверхневої плівки культури, без розмелювання мікроорганізмів, підбираючи умови або игами в такий спосіб, щоб ензими вивільнювались в середовище.

З найбільшою користю цей спосіб запроваджується з використанням штамів Репісіїййшт, депонованих, в

СМСМ під МеМе1-1577 та 1-1578.

Такі ензими можуть бути також одержані генною інженерією після клонажу гену або генів, відповідальних за їх синтез, або будь-якими інший технічними прийомами» доступними для спеціаліста, зокрема синтезом з окремих амінокислот, після Ідентифікації їх послідовності.

Даний винахід стосується, крім того, способу одержання РГ-ІІ і його метаболітів або похідних з екстракту рослинного походження, відмітного тим, що він включає етап хроматографії зазначеного екстракту.

Йдеться само собою, що цей спосіб стосується не лише одержання РГ-ІІ, але й тих продуктів деградації цієї молекули, котрі могли утворитись при застосуванні цього способу і звуться метаболітами, також ж і всіх похідних РГ-ІЇ.

Для даного винаходу під "екстрактом рослинного походження" розуміють будь-який препарат, що містить зокрема розчинені полісахариди рослинного походження. Ці полісахариди можуть пройти в ньому етап концентрації, або ультрафільтрацією, або осаджуванням, наприклад етанолом, метанолом або будь-яким іншим підходящим розчинником.

Цей спосіб може складатися принаймні з одного етапу хроматографії обміном аніонами при низькокислотному або нейтральному рН, бажано вищому за 4. Така адсорбційна хроматографія може проводитись на колоні ОЕАЕ або ОЕАЕ.

Цей спосіб може також складатися принаймні з одного етапу хроматографії адсорбцією РГ-ІІ на носієві, що утримує РГ-ІЇ. Така адсорбційна хроматографія може проводитись на активованому вугіллі, на колоні з полістирен-дівінілбензенової смоли, або на будь-якому іншому пристосованому носієві.

Перед і/або після етапу хроматографії можна додати етап сепарації полісахаридів, або частковим осадженням, або ультрафільтрацією, або хроматографією стеричним вилученням. Для проведення часткового осадження найзручніше застосовувати етанол або метанол. Для проведення хроматографії стеричним вилученням зручно користуватись "сефакріловою" колоною або будь-яким іншим пристосованим носієм.

Винахід стосується, крім того, препаратів, котрі можна одержати одним з цих способів: з одного боку, препаратів, котрі містять в значній кількості (тобто щонайменше 9595) мономерів РГ-І, і з іншого боку, препаратів, котрі містять принаймні 8095, бажано більше ніш 9595 димерів РГ-1І.

Після кожної хроматографії визначається, за їх складом, які з фракцій містять РГ-ІІ. Ця операція може бути виконаною спеціалістом.

Ці способи дозволяють з легкістю в значних кількостях (порядку кілограма) одержати препарати рамногалактуронану ІІ з усіх продуктів рослинного походження, таких як соки з фруктів, овочів та їх похідних, зокрема вин, в тому числі концентрованих, вінас і виноградного сусла, за винятком тих продуктів, що походять з злакових, причому на рівні десятка грамів. РГ-ІІЇ найбільш вигідно одержувати з первинних оболонок рослин, але його можна також виділити з усякого продукту, одержаного з рослин, при розчиненні оболонок, або при застосуванні традиційних способів переробки (видушування, ферментація...), або при обробці за допомогою зріджувальних ензимів.

Іншим предметом цього винаходу є спосіб відбору мікроорганізмів, зокрема грибів, зважаючи на їх здатність до деградування РГ-ЇЇ, відмітний тим, що зазначеним мікроорганізмам дають можливість зростати в пристосованому середовищі, що містить РГ-ІЇ.

Він також стосується культурального середовища для мікроорганізмів, відмітного тим, що воно містить РГ-

ІІ.

Способи, що становлять предмет цього винаходу, зокрема способи приготування та виділення ензимів, а також спосіб приготування РГ-ІЇ можуть бути застосованими спеціалістом лише на базі цього опису і загальних знань. Проте, він може скористатися наступним підручником: Меїйоавз іп Місгоріоіоду, томи з 1 по 6, 9.8. Моїтіз ес О.М. Вірропзо (1969-1972), Асадетіс Ргезв, І опаоп, Мем Хогк.

Винахід проілюстровано, але при цьому не обмежено наступними прикладами. Фігури, на які робляться посилання в цьому описі і його прикладах, є такими.

Фіг1 зображає в схематичний спосіб структуру рамногалактуронану її, разом з його чотирма бічними ланцюгами від А до 0. На цій фігурі В! репрезентує водень або с-І -рамнопіраноз, а В2 і ВЗ - водень або інший замісник;

Фіг.2 ілюструє місце РГ-ІЇ в рослинному світі;

Фіг.3 з ілюструє розподіл на фракції полісахаридів, кислих і нейтральних цукрів одного з вин на колоні

ОЕАЕ (Масгоргер);

ФігАА і 48 зображають одержані з допомогою високочутливої хроматографії стеричним вилученням профілі двох фракцій РГ-ІЇ, виділених з червоного вина;

Фіг. 5 показує одержаний високочутливою хромотаграфією стеричнии вилученням на колоні Зирегаех-75

НЕ профіль двох фракцій РГ-ІЇ, очищених з концентрату вина; а: фракція Ії, димер РГ-ІЇ (молекулярна маса

9500 Па, елюція після 18,5хв.); р: фракція ІЇ, мономер РГ-ІЇ (молекулярна маса 4750ба, елюція після 20,5х8.);

Фіг.6 є схемою очищення РГ-1І| на пілотній установці;

Фіг.7 служить для порівняння профілів, визначених високочутливою хроматографією стеричним вилученням на колоні Зирегаех-75 НЕ, повних полісахаридів червоного вина (а) з фракцією, не затриманою на смолі КепевріА! Мер), і затриманою і потім елюйованою 2095-ним етанолом (с);

Фіг.8 ілюструє деградування РГ-ІЇ розчинним клітинним екстрактом Репісійшт вітріїсізвітит (1-1577);

Спектри а, Б і с стосуються відповідно нативного РГ-ІІ та РГ-ІІ після 24 і 48 годин деградування;

Фіг.9 ілюструє деградування РГ-ІЇ розчинним оітинний екстрактом штаму Р.даієае Гама (1-1578) (а - нативний РГ-1ІІ; Б - після 96 годин; с - після 168 годин; а - після 190 годин);

Фіг10 ілюструє деградування РГ-ІЇ культурою Репісйит вітріїсізвітит (1-1577), слідом за яким проводиться хроматографія СЕ5-НР. Криві від а до ї репрезентують відповідно спектр нативного РГ-Ї і спектри РГ-ІЇ після 96, 132, 168, 192 і 400 годин зростання гриба.

Фіг.11 ілюструє деградування РГ- культурою Р.даієае (1-1578) різної тривалості, контрольоване хроматографією СЕ5-НР, (а - нативний РГ-ІЇ, Б - 72 години, с - 120 годин, й - 240 годин, є - 264 години, Її - 336 годин, 4 - 384 годин).

Фіг.12 показує структуру фіг! в спрощеному вигляді. Місця потенційних розрізів ензиму відповідно до цього винаходу показані стрілками 1 і 2.

Фіг.13 показує структуру залишкової фракції РГ-П після його деградування за допомогою Репісшит вітріїсізвітит і Репісіїшт даївєає.

Фіг.14 ілюструє деградування димерного РГ-ІЇ культурою Р. даІєае (1-1578).

Спектри від а до с репрезентують відповідно спектр нативного димерного РГ-ІЇ і спектри РГ-ІЇ після 168 і 300 годин деградування.

Фіг.15 ілюструє деградрання РГ-ІЇ, очищеного повним розчинним клітинним екстрактом Р. вітріїсізвітит (1-1577), контрольоване хроматографією СЕ5-НР. Спектри від а до й стосуються відповідно нативного РГ-І і

РГ-ІЇ після 72, 120 і 148 годин інкубації. фіг.16 слугує для порівняння полісахаридних профілів, визначених за допомогою СЕ5-НР, червоного вина (спектр а) і того ж вина після 48 годин інкубації в присутності ензиматичного екстракту ІРМ1 (спектр Б).

Ффіг.17 призначена для порівняння за допомогою СЕ5-НР полісахаридних профілів червоного вина до (спектр а) і після 48 годин інкубації в присутності лише РесіїпехФ га (спектр Б), або разом з ензиматичним екстрактом штаму ІРМІ (спектр с).

Ффіг18 призначена для порівняння за допомогою СЕ5-НР полісахаридних профілів яблучного соку, одержаного повним зріджуванням фруктів за допомогою ензиматичного препарату Нарідазебі іс після 48 годин інкубації за умов відсутності (спектр а) або присутності (спектр Б) ензиматичного екстракту штаму ІРМ1.

Фіг.19А і 198 ілюструють деградування тканини буряка (фіг.19А) ензиматичним екстрактом штаму ІРМ1 у порівнянні з свідком (фіг.198).

Фіг.19С, 20А і 20С репрезентують відповідно дегадування ензиматичними екстрактами штаму ІРМ1 тканин моркви, яблука та картоплі в порівнянні з відповідними свідками (фіг.190, 208 та 200).

Приклад 1: Очистка рамногалактуронану ІІ з вина аніонообмінною хроматографією і хроматографією молекулярним відсіюванням

РГ-ІЇ присутній в недеградованій формі особливо в фруктових та овочевих соках і їх похідних, зокрема ферментованих. РГ-ІЇ може бути очищеним до гомогенного стану з усіх продуктів рослинного походження при виконанні таких очисних етапів: 1. Одержання макромолекул в один етап, або осаджуванням 8095 етанолом, або ультрафільтруванням; 2. Підготовча хроматографія аніонним обміном при кислому рн; 3. Хроматографія молекулярним відсіюванням (цим останнім етапом, котрий дозволяє вийти на більш високий рівень очистки, можна знехтувати, якщо хочуть вийти на ступінь очистки препарату РГ-ІЇ порядку 809). 1 - Зразок вина і одержання колоїдів:

Вино, призначене для використання, було одержане з стиглого винограду Каріньян чорний (Саїпдпап поїг), зібраного у вересні 1991 року на експериментальній ділянці Пеш-Руж/Нарбон (Респ-Ноцде/Магроппе). 600 літрів було сконцентровано на ультрафільтрувальній мембрані Сабо бер М5 (Тесі бер, Франція) з пороговим отвором 10000, Всі колоїди концентрованого вина (сумарний об'єм 28дл) були після цього осаджені додаванням 4 об'ємів етанолу, підкисленого б0мММ НСЇ, послідовно промиті 80 і 9095 етанолом, перенесені в воду і діалізовані з допомогою буферного розчину з 40мМ цитрату натрію при рН 4,6. Суха вага всіх колоїдів (визначена після знесолювання і ліофіїїзації аліквотної фракції) становила 296г, або близько 0,5г на літр вина. 2 - Аніонообмінна хроматографія

Розчин колоїдів з рН 4,6 фракціонували хроматографією обміном аніонів десятьма послідовними пропусканнями через колону 5хвосм ОЕАЕ-Масгоргер (Віобад, США), налаштовану на 20мл/хв в 40мММ буферному розчині з цитрату натрію при рН 4,6. Нейтральні і слабозаряджені полісахариди елюювались в ін'єкційному буферному розчині (фракція І). Фракції, що містили РГ-ІЇ, спочатку елюювались пропусканням концентрату в 50мММ цитратному буферному розчині (фракція ІІ), потім додаванням 50 (фракція ІІ) ії 150ММ (фракція ІМ) Масі до елююйочого буферного розчину (фіг.3). Ці три фракції складали відповідно 7,9, 6,6 і 4,195 загальної кількості колоїдів в перерахунку на суху вагу.

З - Очистка РГ-ІЇ до гомогенного стану хроматографією стеричним вилученням

РГ-ІЇ, присутній в фракціях І ії І, проходив очистку до гомогенного стану хроматографією стеричнмм вилученням на колоні 5х75см берпасгу!. 5- 400 НА, налаштованій на 7мл/хв, в буферному розчині з 50МмМ ацетату натрію при рН 5, що містив 5Х0мм масі,

Фракції, що містили РГ-ІЇ, були зрештою діалізовані водою перед ліофілізацією.

Два одержані зразки РГ-ІІ мали в високоефективній хроматографії стеричним вилученням (СЕ5-НР, аналіз на двох послідовних колонах З5ПпПодех ОНРак КВ-803 і КВ-805, елюант ЇІМОЗ 0,1М при мл/хв,

рефрактометричні детектори) виключно гомогенний профіль і становили відповідно 4,4 1 4,695 всіх колоїдів зразка вина. Повна кількість РГ-ІЇ в використаному зразку вина перевищувала 5Омг/л, оскільки сюди слід додати РГ-ІЇ, що містилась в фракції ІМ, котру до гомогенного стану не очищували. 4 - Склад фракцій РГ-ІЇ. очищеного з вина

Дві очищені фракції РГ-ІІЇ репрезентують, обидві, характерний склад РГ-ІІ (таблиця 1). Вони помітно не відрізняються з точки зору аналізу їх складу.

Фракції ІІ ії І, одержані на ОЕАЕ-Масгоргер, аналізувались на колоні Зирегадех-75НА (1хзоОсм, вилучення на 14хв.), носія для молекулярного відсіювання. Цей аналіз (фіг.5) виявляє, що фракція ІІ в основному містить мономери РГ-ЇЇ (елюція за 20,5хв, молекулярна вага 4750 Ба), в той час як фракція Ії містить більш як 9595 дилерів РГ-ІІ (елюція за 18,5хв, молекулярна вага 9500 Бра).

Препарат з РГ-ІЇ фракції І пізніше застосовувався для роботи по відбору і індукції ензиматичних активностей специфічних типів деградування.

Приклад 2: Одержання РГ-0 адсорбційною хроматографією з рідких залишків перегонки алкогольної продукції (ВІНАС)

Користувались вінасами, одержаними в результаті вакуумної дистиляції і концентрації ЗООгл червоного вина (суміші вин з різних сортів винограду). Вінаси, одержані дистиляцією, концентрувались вакуумним випаровуванням на установці з падаючою хвилею. Бітартратні солі вилучались з цього концентрату після декантації, потім вінаси концентрувались знову на тій самій установці, загалом вино концентрувалось 30 разів, і всі колоїди, одержані з 1000 літрів концентрованої вінаси осаджувались додаванням 4 об'ємів 9095 етанолу.

Осад зливали в 300 літрів води, щоб одержати розчин вінаси для застосування як джерела для одержання РГ-

ІІ.

Адсорбційна хроматографія

Процес хроматографічної сепарації забезпечується СІНР на колонах Зподех (див. Приклад 1) або на колоні Зирегаєх-НА. 75 (РПаптасіа; дебіт 0,бмл/хв), приєднаної до системи рефрактометричного виявлення (детекції). а) на активованому вугіллі

Активоване вугілля має сильну адсорбційну спроможність по відношенню до численних видів молекул. В даному винаході активоване вугілля було використане, зважаючи на його спроможність відділяти РГ-ЇЇ від пектинових полісахаридів різних класів, дійсно всі полісахариди адсорбуються на активованому вугіллі, але

РГ-ІЇ десорбується при концентраціях в алкоголі нижчих за 4095. Було випробувано два типи вугілля.

Порошкове активоване вугілля

Один літр розбавленого вп'ятеро розчину вінаси тримали протягом 30 хвилин в контакті з 100г порошкового активованого вугілля (МогпКееА"). Після цього розчин фільтрували на фриті для вилучення часток вугілля. Затримане фільтром вугілля вводили в суспензію в 1 літрі 4095 етанолу, одержану суміш ретельно перемішували протягом 30 хвилин і після цього фільтрували в вакуумі. Елюйований РГ-ЇЇ аналізувався після цього СІ НР. Аналіз складу цієї фракції (табл. 2) вказує та чистоту РГ-ІІЇ, близьку 5095.

Екструдоване активоване вугілля

Цей тип вугілля потребує для адсорбції РГ-ІІ з розчину вінаси набагато більшої тривалості контактування (43 годин), але має перевагу у вигляді спрощення етапів фільтрування. З іншого боку, маса необхідного вугілля є вдвічі більшою за масу порошкового вугілля.

Один літр розбавленого вп'ятеро розчину вінаси тримали протягом 48 хвилин в контакті з 200г екструдованого активованого вугілля (МопкеАО-08 Зирга). Після вилучення неадсорбованої фракції фракцію, що містила РГ-ІЇ, десорбували розчиненням в 4095 етанолі протягом 24 годин, одержаний РГ-ЇЇ мав ту ж саму ступінь чистоти, що і у випадку застосування порошкового вугілля. (Б) на смолі з суміші полістирен-дівінілбензен (Незіпе Неїйе Ф СІАІОМО 5РА11)

Смола НеййеФфФ СІАІЮМФО 5Р411 є синтетичною неполярною смолою, складеною з співполімерів полістирен- дівінілбензену. вона утримує РГ-ІЇ краще ніш інші полісахариди, присутні в рослинних екстрактах. Останні розділяються таким чином на дві фракції адсорбційною хроматографією на смолі Неїїе?ж БІАЛІЮМО 5Р411: фракція, що не затримується і що містить різні полісахариди РГ-ІЇ, і фракція, що затримується і що містить РГ-

ІІ.

Очистка РГ-ІЇ на пілотній установці

Схема очистки РГ-ІІ з вінаси на пілотній установці показана на фіг.6. 250 літрів розбавленого вп'ятеро розчину вінаси (2,5 обємів колони) швидко знебарвлювались на активованому вугіллі Мою ВО-08 Зирга і подавались на 90-літрову колону з НеїШеФ ОІДІОМФ 5Р411 з дебітом 40л/год (тривалість контакту для адсорбції РГ-2 на цьому хроматографічному носієві - 2 години). Колона промивалась 100 літрами води. Не утримана фракція складалась таким чином з об'ємів входу і промивки. Елюція РГ-ІЇ досягалось пропусканням 100 літрів 2095 етанолу з подальшою промивкою колони 200 літрами води.

Одержаний в такий спосіб РГ-ІІ (Ікг на всю заготовку вінаси) мав чистоту близьку до 6095 (табл. 2). РГ-ІЇ було осаджено додаванням етанолу (кінцева концентрація - 4095 етанолу). Одержаний осад містить РГ-Ї, чистий на 9095.

Приклад 3: Одержання РГ-ІЇ адсорбційною хроматографією з вин

Вино (червоне вино з винограду Мегпіої 94, біле вино Спагдоппау 94) знеалкоголізовували і концентрували 2 рази під вакуумом на ротаційному випаровувачі.

Фракції ї5мл вводять на 50О0мл НеїйетФ ОІАІЮМОе 5Р411 з продуктивністю 25мл/год. Потім колона промивалась 50мл води. Потім РГ-ІЇ було елюйовано з допомогою 50мл 2095 етанолу, і колона промивалась 100мл води. Кількісний аналіз СІ НР (фіг.7) показав, що РГ-ІЇ адсорбується на смолі, оскільки він відсутній в фракції, не утриманій смолою, і що його вилучено елюцією 2095 етанолом. Стрінь чистоти розчину РГ-ІІ була близькою до 5095 для червоного вина (табл. 2) і 3695 для білого вина.

Приклад 4: Одержання РГ-1ІЇ з виноградного сусла

АтрепіеФ ХА 2 є співполімерною неполярною смолою полістирен-дівінілбензену. 100мл білого виноградного сусла, одержаного роздрібненням ягід винограду Степаспє вводили в колону з 100мл смоли

ХА 2, зрівноваженої в воді. РГ-ІЇ елюювали 6095 метанолом при ступені очистки близько 4095. Результати аналізу елюату наведені в табл.2.

Приклад 5: Одержання РГ-ІЇ з фруктових та овочевих соків

Розчинні екстракти одержувались з 0,бкг яблук, томатів і моркви, очищених від шкірки і нарізаних кубиками в 200мл аскорбінової кислоти (остаточна концентрація ЗмМ). Застосовані фруктові і овочеві соки були одержані ензиматичним зріджуванням сукупною дією комерційних зріджувальних ензиматичних препаратів (Ресіїпех Ф Ота 5РІ; Момо Еептепі єї НарідазефФ Гід; Сіві-Вгосадез) протягом 24 годин при 45"С. Реакція зріджування була зупинена денатурізацією ензимів під впливом високої температури. Тверді осади вилучались центрифугуванням, а поверхнева плівка застосовувалась як джерело РГ-1ЇЇ.

Очистка РГ-ІЇ з фруктів та овочів після ензиматичного зріджування

Фруктові та овочеві соки, одержані ензиматичним зріджуванням, фільтрувались на паперовому фільтрі, перед пропусканням з дебітом 25мл/год через колону (2,5х30см), зрівноважену водою і заповнену НеййетФ

ПІАІОМО 5Р411. Колона промивалась 50мл вода перед елюцією РГ-ІІ 5ЗОмл 2095 етанолу, услід за чим колона промивалась 100мл води.

Одержані в цей спосіб препарати РГ-ІЇ мали показник чистоти, видай за 8095.

Результати їх аналізу наведені в табл.2.

Приклад 6: відбір мікроорганізмів-деградантів РГ-ІІ в мономерній формі

РГ-П є універсальний компонентом клітинних оболонок рослин, і його деградування в біосфері забезпечується мікроорганізмами природних екосистем: грунтів, компостів, грязей очисних станцій і т.п.

З природних зразків було виділено два штами грибів, що належать до двох видів Репісійшт, котрі вживають РГ-ІЇ як єдине джерело вуглецю і енергії. 1 - Кутьтуральне середовище

Культуральне середовище, котре використовувалось для відбору мікроорганізмів, що використовують РГ-

Ії, як джерело вуглецю і енергії, було створене, як показано в табл.3. Йдеться про мінеральне культуральне середовище, до якого додавався розчин мономерного РГ-ІЇ з остаточной концентрацією від 2 до 1Омг/мл.

Культури, що містили гриби, були звільнені від інфекційних бактерій додаванням до середовищ трьох антибіотиків: пеніциліну С, стрептоміцину і тетрацикліну. 2 - відбір мікроорганізмів, котрі вживають РГ-ІІ як джерело вуглецю та енергії

Зразки було взято з різних природних систем (сільськогосподарських та лісових грунтів, торфів, компостів, грязей очисних станцій, зогниваючих фруктів ...) і введено в культуру на мінеральному культуральному середовищі, налаштованому на 1Омг/мл мономерного РГ-ІЇ. Кожного разу, коли було помічене зростання мікроорганізмів, культури пікірувались повторно кілька разів на тому ж середовищі. Ця процедура дозволила напочатку ізолювати кілька культур, що забезпечували своє зростання на середовищі з РГ-ІІ. Паралельно деградування РГ-ІЇ в середовищі контролювалось високоефективною хроматографією стеричним вилученням, і відбирались лише такі культури, де така деградація спостерігалась паралельно з зростанням мікроорганізмів.

Мікроорганізми, що забезпечували деградування РГ-І, ізолювались після посіву культур в чашечках Петрі на середовище з агар-агару, котре одержувалось додаванням агарози в кількості 295 в культуральне середовище (табл.3) і містило 2,5мг/мл нонойерного РГ-ІІ. Після тижня інкубації при 25"С клони відбирались і інокулювались в рідке культуральне середовище для контролю їх спроможності деградувати РГ-ПЇ.

Відбір штанів, деградуючих РГ-ЇЇ

Зрештою було відібрано два штами нитчатих грибів, оскільки вони мали потрібні властивості, а саме: 1 - Швидке зростання, цілковито узгоджене із зменшенням кількості РГ-ІІ в середовищі; 2 - Кількісне зникнення РГ-ІІ спостерігалось паралельно з зсувом об'єму його елюції в НР-5ЕС, що вказувало на наявність ензиматичних активностей деградування ендо-гідролазного типу;

З - Остаточний рівень деградування РГ-ІЇ досягав 7095 після тижня культури при 2570.

Ці дві культури, замарковані як Е і К, застосовувались згодом для продукування ензимів, здатних деградувати РГ-ЇЇ, ії вивчення типів ензиматичних дій. Вони культивуються без перемішування в контакті з повітрям при 25"С в рідкому культуральному середовищі, що містить 5мг/мл РГ-ІЇ в присутності трьох антибіотиків: пеніциліну С, стрептоміцину і тетрацикліну.

Приклад 7: Продукування ензимів, здатних деградувати РГ-1Ї

Відомо, що різні види Репісійит мають здатність продукувати і виділяти в культуральне середовище ензими, здатні до деградування полісахаридів, здатність двох ізольованих штамів продукувати ензими, спроможні деградувати РГ-ІІ, була перевірена, 1 - Пошук ензимів, відповідальних за деградування РГ-ІЇ, в поверхневій плівці культури

Штами Р.ааїєає ІГама2 (Ме депонування в СМОМ 1-1578) і Р. вітріїсіввітит ІРМІ (Ме депонування в СМСМ 1-1577) були введені в культуру при 257С на середовищі, що містило 2,5мг/мл мононерного РГ-ІЇ. Після 96 годин культивування було відібрано 1мл культурального середовища з міцелієм в стадії зростання, стерильно профільтровано на фільтрі 0,22мкм і до нього додано 2мг/мл нативного РГ-ІЇ. Середовище, що містило деградуючі ензими і РГ-ІЇ, було поставлене на інкубацію при 257С, фракції завбільшки в 25мкм відбирались після 0, 20 і 45 годин і аналізувались на СЕ5-НР. Порівняння профілів елюції РГ-ІЇ при різних тривалостях інкубації ясно засвідчують відсутність деградувальних активностей по відношенню до РГ-ІЇ в культуральному середовищі. Тому, ці активності відшукувались в цитоплазмі і периплазмі грибів. 2 - Продукування ензимів, деградуючих РГ-ІЇ, в повних клітинних екстрактах грибів

Зазначені штами Р.даіїєае Гама і Р.вітріїсізвітит ІРМІ вводились в культуру при 25"С на 4мл середовища, що містило бмг/мл мономерного РГ-І. Після 140 годин культивування міцелій вилучали центрифугуванням перед розмелюванням скляними кульками при 4"С протягом 4 хвилин в буферному розчині

МЕ5 (морфоліно-етан-сульфонієвої кислоти)/КОН 50мМ з рН 6, до якого було додано їмММ РН5Е (феніл- метил-сульфоніл-фториду) і їмМ ОТ (дитіотреїтолу). Поверхнева клітинна плівка вилучалась центрифугуванням при 1000049 х 5хв.

Присутність ензимів, здатних деградувати РГ-ІІ, в розчинному клітинному екстракті перевірялась додаванням нативного РГ-ІЇ в кількості 2,5мг/мл до поверхневої плівки після розмелювання і центрифугування, інкубацією при 25"С і контролюванням за допомогою СЕ5-НР за деградуванням РГ-ІІ. Аналіз профілів після 24 і 48 годин в порівнянні з нативним РГ-ІЇ (фіг.8 та 9) свідчить про сильну деградацію РГ-І! (5095), починаючи від 24 годин, котра продовжувалась до 48 годин і дала 4095 молекулярного залишку.

Ензиматичні активності, котрі забезпечують деградування РГ-ЇЇ, містяться таким чином в розчинному клітинному екстракті і тому можуть бути одержаними після розмелювання грибів. Два виділених штами

РепісшШіит є таким чином продуцентами ензимів, що деградують рамногалактуронан І.

Приклад 8: визначення активностей деградування РГ-1ЇЇ

Два виділених і ідентифікованих види РепісіШит продукують ензими, здатні деградувати РГ-ЇЇ в культуральному середовищі. Спосіб дії цих ензимів було вивчено напочатку, спостерігаючи деградацію полісахариду в середовищі під час зростання грибів. Цей підхід має той недолік, що він дозволяє стежити лише за фракцією РГ-ІІ, не асимільованою грибом, однак він дозволяє скласти уяву про залучені до дії активності і їх спосіб дії. 1 - Кінетика деградування РГ-ІІ грибом Репісіййшт вітріїсіввітит

Штам р.взітріїсіввітит ІРМІ вводили в культуру в колбі Ерленмеєра при 257" на 10мл середовищ з концентрацією мономерного РГ-ІЇ 5мг/мл. Проби об'ємом і мл вилучались через 0, 96, 132, 168 і 192 години. рН середовища доводили до 5 додаванням 20мкл НСІ 1М. Ще одне вилучення було зроблене після 360 годин, культивування було остаточно припинене після 400 годин інкубації. Кожну пробу аналізували на СЕ5-НР (фіг.10), що дозволяло стежити за деградацією під час зростання грибів. Різні вилучені фракції були знесолені на колоні (1х5Осм) з Віо-сеєї! Р-6, зрівноваженим в буферному розчині з ацетату натрію 100мМ при рн 4.

Для кожної з тривалостей інкубації проводився повний структурний аналіз фракції РГ-ІЇ, що проходила деградування. Цей аналіз включав: підрахунок ступеня деградації РГ-ІЇ, визначення складу в нейтральних моносахаридах і уронових кислотах, визначення типів зв'язків між залишковими компонентами молекули, визначення довжини гомо-галактуронового ланцюга.

Сукупність цих аналізів дозволяє визначити стан молекули РГ-ІиІ кожної проби і таким чином весь час слідкувати за деградацією. Ці результати створюють уяву про спосіб ензиматичної деградації молекули з плином часу. 2 - Кінетика деградування РГ-ІІ грибом Репісіїйшт даїєає

Для дослідження деградування РГ-І грибом Р.даієаде 500мг препарату мономерного РГ-0И спочатку омилювали (2 годиш при 4"С в Маон 5омМ), потім відновлювали (6 год при 4"С в присутності 2,5г Мавна) з метою маркування відновлюючої кінцевої частини молекули. Штам Р.даІєає Гама було введено в культуру в колбі Ерленнеєра при 25"С на бмл середовища з 5мг/мл омиленого і відновленого РГ-ІІ. Фракції об'ємами

О,бмл відбирались через 0, 72, 120, 168, 240, 264, 336 і 384 години. Кожна проба аналізувалась СЕ5-НР (фіг.11), аби простежити за деградуванням протягом зростання грибів. Різні проби були знесолені на колоні (1х3Осм) з Зирегаех-76НЕА, налаштованій на 0,бмл/хв в буферному розчині з форміату амонію ЗОмМ з рН 5,2.

Для кожного періоду інкубації проводився повний структурний аналіз фракції РГ-ІІ, що проходила деградування. Цей аналіз включав: обчислення ступеня деградації РГ-ІЇ, визначення складу в нейтральних моносахаридах і уронових кислотах в формі похідних триметилсилілів після метилування. визначення типів зв'язків між залишковими компонентами молекули шляхом метшшвання, що включало розкислення уронових кислот тріетилбородейтерійним літієм, визначення довжини гомо-галактуронового ланцюга.

Сукупність цих аналізів дозволяє визначати стан молекули РГ-ІЇ для кожної проби і стежити таким чином за її деградацією з плином часу, ці результати засвідчують, в який спосіб відбувається ензиматична деградація молекули з плином часу.

З - Механізм деградації РГ-ІЇ

Аналіз складу (табл.4 і 5) і типів зв'язку для кожного з залишав, присутніх в молекулі (табл.б і 7), дозволяє стежити за станом залишкової молекули РГ-ІІ з плином часу і дозволяє зрозуміти, що у випадках обох штамів

РепісшШит РГ-ІЇ деградується за допомогою серії послідовно діючих ензимів. а) Перший етап деградації полягає в розриванні зв'язків між залишком тризаміщеної р-І-рамнози і залишками о-Ї-фукози та р-ЮО-апіози, що призводить до втрати ланцюга А (фіг.12), котрий асимілюється грибом. Цей етап має місце протягом перших днів культури, паралельно з невеликим скороченням гомо- галактщюнового ланцюга, котрий з 8-9 залишків скорочується в середньому до 7 залишків, і частково втрачає кінцеві залишки арабинофуранози (В7 і 02) і рамнопіранози (С2). б) Скидається на те, що повна елімінація залишків Аг і А5 ланцюга А, утримуваного залишком р-Ю-апіози, позбавляє молекулу РГ-ЇІЇ опірності ензиматичним деградуванням, оскільки в цей час спостерігається друга фаза деградації, котра характеризується: сильним скороченням гомо-галактуронового ланцюга в середньому до 4 залишків галактуронової кислоти; втратою залишку АТ; тим, що ланцюг В, постійно зв'язаний з гомо-галактуроновим ланцюгом через р-О-апінозу, проходить модифікації, котрі стосуються його нерозкислюваного терміналу, а саме зменшення кількості термінального залишку арабінофурадози і втрата залишку с--І -рамнози (залишки Вб і В7); тим, що залишки Каб та Опа, як здасться, знаходяться частково під впливом ензиматичного деградування.

Всі деградації, помічені під час цієї другої фази, можуть бути одержані з допомогою відомих ензимів: р-О- апіосідази, р-І -арабіносідази, с-І -рамносідази, ендо- або екзс-полігалактуронази.

Остаточна молекула на кінець зростання грибів кількісно відповідає ланцюгу В (залишки ВІ і В5), залишкам Као (СІ) і Опа (01), утримуваних олігосахарадною кислотою з середнім ступенем полімеризації 4, і репрезенту від 20 до 3095 початкової молекули РГ-ІЇ (фіг.13).

Перший етап, котрий вводить в дію дві ензиматичні активності типу ендо- є таким чином ключовим етапом, що уможливлює деградацію молекули РГ-ЇИ. Кількісне вивільнення ланцюга А дійсно робить молекулу чутливою щодо впливу ензимів з відомими типами дій, котрі часто зустрічаються в комерційних ензиматичних препаратах.

Продукування ензимів з активностями типу ендо-р-І -рамнопіраносил(1-»3)-ЮО-апіофураносил-гідролазної (1) ї ендо-со-І -фукопіраносил-(1-»4)-І -рамнопіраносил-гідролазної грибами Р.даІєае Гама і Р.вітріїсізвітит

ІРМ'І є таким чином вирішальним етапом, котрий дозволяє цим грибам забезпечити своє зростання за рахунок використання РГ-ПЇ. Таким чином застосування цих ензимів з ендо-р-І-рамнопіраносил-(1-53)- 0- апіофураносил-гідролазною або ендо-со-Ї-фукопіраносил-(1-»4)-Ї -рамнопіраносил-гідролазною активністю дозволяє активне ензиматичне деградування РГ-ІІ. специфічність активності (1) є сильною, оскільки ланцюг В не піддається дії його гідролітичної активності, хоч він і є пов'язаний з гомо-галактуроновим ланцюгом через рамносил-апіосідний зв'язок такого ж типу. Цю різницю в поведінці активності (1) по відношенню до ланцюгів А і В ноша пояснити: або різницею між замісниками рамнози: один ланцюг, зв'язаний в СЗ в випадку В, один ланцюг, зв'язаний в

СА і два моносахариди, зв'язані в С2 і СЗ в випадку А; або різною локалізацією цих двох ланцюгів в середині молекули РГ-1Ї.

Присутність в ензиматичному препараті однієї або іншої з цих двох активностей уможливлює вивільнення ланцюга А РГ-ІЇ і знімає таким чином проблему неспроможності деградувати РГ-ІЇ за допомогою звичайних ензимів пектинолітичних препаратів, справді, інші ензими, що уможливлюють більш інтенсивне деградування

РГ-ІЇ, вступають в дію після відходу ланцюга А під дією зазначених ензимів. Цей другий етап деградації дозволяє вступити в дію ензимам, що мають активності:

В-О-апіосідазну, р-І-арабіносідазну, о-І -рамносідазну, ендо-полігалактуроназну, екзо-полігалактуроназну.

Приклад 9: Одержання препарати димерного РГ-ІІ і деградування за допомогою Репісіййшт даІєає

Штам Р.даієаєе вводили в культуру на середовищі, що містило 5мг/мл препарату РГ-ІЇ, одержаного пропусканням концентрату вінаси на смолі НейеврілюмМе (приклад 2). Цей препарат містить близько 6095

РГІ-ЇЇ, котрий знаходиться, як це показує аналіз на колоні Зирегдех-75, в димерній формі. Спостереження за допомогою СІ НР (фіг.14) за культуральним середовищем гриба показує сильну деградацію РГ-ІЇ. Домішки з більш високою молекулярною масою (в основному манани, присутні в концентратах вінаси) не деградуються.

Штами Репісйіит, виділені на мономерному РГ-ІЇ, виявляють таким чином спроможність деградувати РГ-ЇЇ в формі димеру. Ензими, котрі є предметом цієї заявки на винахід, є таким чином активними на молекулах двох форм.

Приклад 10: Одержання ензиматичного препарату, деградуючого РГ-1Ї

З культури р.вітріїсізвітит ІРМІ1 було одержано ензиматичний препарат з активностями деградування РгГ-

ПО ендо-р-І-рамнопіраносил-(1-»3)-ЮО-апіофураносил-гідролазного або ендо-о-І -фукопіраносил-(1-»4)-І - рамнопіраносил-гідролазного типу в спосіб, описаний нижче: 120мл культурального середовища, що містило бмг/мл очищеного РГ-ІІ, було розподілено в 8 чашках

Петрі, Штам Р.вітріїсізвітит ІРМІ вводився в культуру при 25"С протягом 6 діб. Міцелій (1,2г чистої ваги) було вилучено центрифугуванням перед розмелюванням, як описано вище (в прикладі з) в буферному розчині

МЕБ/КОН 50мМ з рн 6, що містив 1мММ РМ5БЕ і ОТТ. Ензиматичний екстракт загальною кількістю бмл зрештою було одержано центрифугуванням і застосовано в наступних прикладах.

Приклад 11: Деградування очищеного РГ-ІІЇ ензиматичним екстрактом Р. зітріїсіввітит ІРМ1

В присутності 0,0295 МамМм3З було поставлено на інкубацію при 25"С таку суміш: 50О0мкл буферного розчину ацетату натрію 5ОмМ, рн 4,8; 12,5мкл розчину очищеного РГ-І|| (табл.1, частина ІІ) з концентрацією 200кг/л; 25мкл повного ензиматичного екстракту Р. вітріїсізвітит ІРМ1, одержаного як в прикладі 5.

Проби об'ємом 25мкл відбирались через 0, 72, 120 і 148 годин і аналізувались на СЕ5-НР. Присутність ензимів з активностями типу ендо-р-І-рамнопіраносил-(1-»3)-ЮО-апіофураносил-гідролазної або ендо-с-Ї - фукопіраносил-(1-»4)-І -рамнопіраносил-гідролазної підтверджувалась деградацією РГ-ІЇ (фіг.15). До речі, профіль деградації є опорівняним з одержаним при спостереженні в поверхневій плівці культури

Р.вітріїсіввітит (фіг.1 5).

Приклад 12: Деградування полісахаридів вина ензиматичним екстрактом Р. вітріїсізвітит ІРМ1

Повний ензиматичний екстракт, що містив ензими, деградуючі РГ-ІЇ, зокрема активності типу ендо-Рр-ї - рамнопіраносил-(1-»53)-ЮО-апіофураносил-гідролазного або ендо-о-І-фукопіраносил-(1-»4)-Ї -рамнопіраносил- гідролазної випробовувався на спроможність деградувати РГ-ІЇ, присутній в винах.

Всі полісахариди червоного вина (сорт винограду Саїгдпап пої) були одержані ультрафільтрацією вина (2мл) на мембрані Сепійсоп 30 (Атісоп, США). Фільтрувальний залишок (100мл) знімався 1,9мл ацетатного буферного розчину 50мММ при рн 4,8. Наступні проби було інкубовано при 25"С в присутності 0,0295 Мам3. а: 200мкл фільтрувального залишку з повним вмістом полісахаридів вина, 5мкл Н2О, 20мкл буферного розчину МЕ5, застосовуваного при розмелюванні; р: 200мкл фільтрувального залижу з повним вмістом полісахаридів вина, 5мкл Н2О, 20мкл повного ензиматичного екстракту Р. взітріїсіввітит ІРМІ1, одержаного як в прикладі 9. с: 200мкл фільтрувального залижу з повним вмістом полісахаридів вина, 5мкл Репіпех?б Ойга 5р-Ї. (Момо

Еептепі, Швейцарія), 2омкл буферного розчину НЕ5, застосовуваного при розмелюванні; а: 200мкл фільтрувального залишку з повним вмістом полісахаридів вина, 5мкл РепіпехФ Опга 5р-Ї, 20мкл повного ензиматичного екстракту Р.вітріїсізвітит ІРМ1, одержаного як в прикладі 9.

Через 48год. було відібрано по 25мкл від кожної проби і аналізувалось на СО5-НР. Аналіз результатів (фіг.16 та 17) засвідчив: деградування РГ-І вина (характерний пік, елюйований через 18,2хв.) ензиматичний екстрактом

Р.зітріїсіввітит ІРМ1 (фіг.16); деградування інших полісахаридів вина (манопротеїнів, арабінанів та арабіногалактанів) комерційним ензиматичним препаратом РепіпехФ Ойга Зр-Ї, в той час, коли пік, характерний для ГР-ЇЇ, лишається інтактним (фіг.17); підтверджено доповнювальний ефект обох ензиматичних препаратів (фіг.17) деградацією всієї сукупності полісахаридів вина в експерименті с.

Повний ензиматичний екстракт Р.вітріїсізвітит ІРМІ1, що містить ензими ендо-р-І -рамнопіраносил-(1-»3)-

О-апіофураносил-гідролазного або ендо-о-І-фукопіраносил-(1-54)-І -рамнопіраносил-гідролазного типу, має таким чином ензиматичні активності, відсутні в комерційному ензиматичному препараті, виготовленому з

АврегойШив асцієайв і богатому на целюлічні, геміцелюлазні і пектинолітичні активності, зокрема на рамногалактуроназну активність (спо! еї а!., 1990, Сагропуаг. Рез, 206, 105-115).

Додавання ензимів, відповідних цьому винаходу, в сукупності з іншими пектинолітичними активностями призводить до більш потужної деградації полісахаридів вина і таким чином дозволяє покращати фільтрувальну здатність, а також запобігти колоїдному помутнінню і формуванню осадів.

Приклад 13: Деградування полісахаридів яблучного соку ензиматичним екстрактом Р.вітріїсіввітит ІРМ1.

Яблучний сік було одержано з ї1кг яблук (сорту біаїкіпд): цілі яблука були порізані на скибки 1см завтовшки, до них додали 1г аскорбінової кислоти і 500мл ензиматичного препарату Нарідазеб Під (сіві

Вгосадев, Франція) і перемішували 2год. при 5070. Фрукти були зріджені під дією комерційного ензиматичного препарату, а сік було одержано центрифугуванням. Препарат Нарідазеєді ід має високий рівень активностей пектиназного (пектин, ліаза, евдо-і екзо-полігалактуроназа, рамногалактуроназа, арабадаза, Ьк...), геміцелюлазного (галактоназа, ксіланаза, ...) і целюлазного типів. 1,5мл освітленого яблучного соку було ультрафільтровано на нембрані Сепійсоп 30 (Атісоп, США). фільтрувальний залишок (100мл) було відібрано 1 4мл ацетатного буферного розчину 50мМ при рн 4,8, і було поставлено на інкубацію при 257С в присутності 0,0295 Мам наступні проби. а: 200мкл фільтрувального залижу з повним вмістом полісахаридів яблучного соку, 5О0мкл Н2О; р: 200мкл фільтрувального залишку з повним вмістом полісахаридів яблучного соку, 5О0мкл повного ензиматичного екстракту Р.вітріїсіввітит ІРМ1;

Через 48 год 25мкл з кожної проби відбиралось і аналізувалось на СЕ5-НР.

Аналіз результатів (фіг.183) свідчить про додавальний ефект ензимів, деградуючих РГ-ІЇ, оскільки додавання ензиматичного екстракту з Р.вітріїсізвітит ІРМІ сприяє подальшій деградації сукупності полісахаридів, що залишились після обробки яблук препаратом Варідазеф І ід. Зокрема, характерний пік РГ-1ІЇ (елюйований через 18,2хв.) зазнає сильної деградації. Крім того, деградація структур з більш високими молекулярними масами, резистентних по відношенню до дії ензимів, присутніх в Нарідазеф Гід, свідчить, що ці фракції також містять фрагменти РГ-ІЇ.

Повний ензиматичний екстракт Р.вітріїсізвітит ІРМІ, в якому були засвідчені активності ендо-р-ї - рамнопіраносил-(1-»53)-ЮО-апіофураносил-гідролазного або ендо-о-І-фукопіраносил-(1-»4)-Ї -рамнопіраносил- гідролазного типів, містить таким чином ензиматичні активності, відсутні в комерційному ензиматичному препараті, виготовленому з Аврегадійи5 підег, і про якого повідомляється, як про такого, що має сукупність відомих целюлолітичних, пектинолітичних (включно з рамногалактуроназною) активностей. Додатковий і додавальний ефект ензимів, відповідальних за деградування РГ-ІиІ, є таким чином підтвердженим цим експериментом.

Приклад 14: Мацерація фруктів та овочів ензиматичним екстрактом Р.зітріїсізвітит ІРМ1

Активність дисоціації рослинних тканин повним ензиматичний екстрактом Р.вітріїсізвітит ІРМ1 була перевірена на таких фруктах і овочах: буряк червоний, морква, картопля сорту Віпіде, яблука сорту Соїдеп.

Фрагменти 158х4х2мм кожного фрукта чи овочу вміщували в 2мл ацетатного буферного розчину 5ХОММ рн 4,8 і додавали: 200мкл буферного розчину МЕ5, застосовуваного при розмелюванні, для контролю, 200мкл повного ензиматичного екстракту Р.зітріїсіввітит ІРМІ для ензиматичних проб.

Різні проби були поставлені на інкубацію при 257С в присутності 0,0295 Мам протягом 72год., активно перемішувались в вортексі (2х10сек.) і фотографувались. Аналіз результатів виявив: майже повну дилацерацію (розривання) тканин буряка і моркви (фіг.19), мацерувальний ефект, супроводжуваний появою суспендованих клітин картоплі і яблук (фіг.20).

Повний ензиматичний екстракт Р.вітріїсіввітит ІРМІ з активностями ендо-р-І-рамнопіраносил-(1-»3)-0- апіофураносил-гідролазного або ендо-со-І-фукопіраносил-(1-54)-Ї -рамнопіраносил-гідролазного типів, має таким чином ефект дисоціації рослинних тканин.

Висновки

Ензиматичні активності деградування РГ-ЇЇ можуть таким чином застосовуватись самі або в поєднанні з іншими ензимами в рідкій фазі або на твердих основах і дозволити: деградування РГ-ІІ з підвищеним ступенем ефективності, наприклад 7095, фруктових та овочевих соків і їх похідних для покращання фільтрувальної спроможності, спрощення виготовлення концентрованих соків, сприянню явищ просвітлення і забезпечення хорошої стабільності готових продуктів; очищення носіїв для мікро- і ультрафільтрації, що застосовуються для фільтрування соків фруктів, овочів та їх похідних.

Ці ензиматичні активності сприяють деградації клітинних оболонок рослин, і можуть завдяки цьому застосовуватись самі або в поєднанні з іншими ензимами в усіх застосуваннях, що потребують мацерації, зріджування і повного або часткового гідролізу рослинних тканин, зокрема: в препаратах типу мацерази для виробництва фруктових нектарів, пюре, желе і концентратів фруктів, овочів та їх похідних, включно з вином, в зріджувальних препаратах для виготовлення соків і ароматичних основ з фруктів, овочів та їх похідних, включно з вином, та для виготовлення пива, для виготовлення пектинів з рослинних залишив, таких як бурякова пульпа і твердих залишків після видушування фруктів і подібної сировини, для виготовлення корму для тварин з рослинної сировини, для виготовлення целюлози з рослин для текстильної промисловості, зокрема з бавовни, та для виробництва паперу. для виготовлення з рослинних залишків олігосахарадів з властивостями викликати захисті реакції рослин, котрі можуть бути застосованими як фітосанітарні засоби.

ТАБЛИЦЯ 1 склад двох фракцій РГ-ІЇ, виділених з вина пн паж а Тл т л дл л жд Ла лшжюЛл па а а по ат

Фракція 1Ї Фракція ІІ

Няня стан молекули . Мономер димер а

Протеїни 0,6 0,6 а

Уронові кислоти 36,9 39 а :

Нейтральні цукри 27,3 24,9 а . метанол 1,4 Т.З а оцтова кислота 1,6 1,8 в .

Рамноза ЗІ, 8 35,4 в . 2-9-сНЗ-Фукоза І - 6,3 : 6,5 в

Фукоза ри 3,7 5,2 й в

Ї 2-0-снз-Ксилоза . 4,8 4,8 ; в о Апіоза | 7,4 7,5 в

Врабіноза 25 23,7 в

Галактоза 19,1 15,8 в .

Ацеронова кислота 1,2 2.2

В .

Галактуронова кислота 38,2 37,2 в | :

Глюкуронова кислота | 3,3 3,4 в С ка 4,4 5 в

Ока 2,6 2,5 а - хх сухої речовини; в о - малярний х

ТАБЛИЦЯ 2

Склад в молярних ХХ і ступінь чистоти препаратів РГ-І1Ї, одержаних з різних рослинних екстрактів на різних хроматографічних основах панна а ана а а на а аа а а а а а а а а а а а а а В В В пови ца рт питво концентроване виноградне концентровані

Зразки вино яблука морква томати вино сусло вінаси Й вживані обмін дніонами реліт реліт реліт реліт амберліт реліт вугілля

ОСКОви ПЕАЕ-Масгоргер Рівіоп БРАТІ Оігіоп БРА1ТІ Оійюп 5РЯТІ Оідіоп БРАТ ХА 0 Оівіва БРАМІ 5Ах ен п и нн и п нн в п нн п п а ТО а п 2-0-Ме-Фукоза 6.3 5,0 6,2 ва Ти 2,0 1,8 2.0 рамноза 31,8. 29,9 зі2 20,8 13,6 22,3 146 22,5

Фукоза 3,7 10,8 7,9 14,7 7 6,0 1,7 1.7 2-0-Ке-Ксілоза 4,8 3.9 4,8 4,7 0,9 3.8 1,5 1.5

Арабіноза 25,0 20,1 23,7 29,9 52,3 22,6 29,3 13,0

Ксілоза - - - - 0,3 14,8 0,8 14 дпіоза 13 7.2 2.5 8,0 1.5 ви 2.4 2.9

Маноза 0,9 8.8 4,8 10,8 ви 2,2 187 32,6 галактоза 18 12,0 17.2 14,2 15,0 зо ги 11,8 глюкоза 1 2,3 1,6 - 4,9 ЗА 0,9 ї чистоти 97 35 96 ва 45 ШК 57 Бе.

ТАБЛИЦЯ З. ;

Культуральне середовище з нитчатих грибів «Мінеральне. середовище:

МНаМОХ «В гул

КоНРО4 І г/л

Ме5О4,7Н20 О,5 г/л ка О,5 г/з сульфат заліза І мг/л ("З «Розчин. Гелера: 7п5О4 І г/л '

Мп504,Н2О О,1 г/л

Си5О4,55820 0,05 г/л

АСУ 0,03 г/л

Ї МІСІ2,6Н»О 0,03 г/л ! КІ О,01 г/л

Борна кислота й 1 гихя -Розчин вітамінів: ,

МИ ВІ 0,08 г/л

МН 0,08 г/л

Реалізація культурального середовища: - мінеральне середовище Ї мл - розчин Гелера 1 мкл - розчин вітамінів І 1 мкл - стрептоміцин (БО мг/мл) 2 нКл - тетрациклін (5 мг/мл): 2 мкл - пеніцилін (10000 П/мл) 10 мкл - полісахарид 5 МГ/МЛ

Культуру реалізовано при температурі довкілля (2522) 1 при освітленні

ТАБЛИЦЯ 4: Склад (в Ж від початкової сухої речовини) РГ-1І під час кінетики деградації за допомогою рР.вітріїсівБМтит - початок 96 год 132 год 168 год 192 год 400 год

Нейтральні моносахариди - 282 28,5 23,1 Годі 18,5 103

Уронові кислоти 404 35,3 25,9 181 164 9,9

Нейтр. моносах.- урон. кислоти. 68,6 63,8 490 312 349 202 -0-Ме-Фукоза ве 21 24 24 20 24 20 рання А2,В2,Вб,р2 94 9 12. ва 54 29

Фукоза АЗ 1 1 06 01 0 бо то 2-0-Не-Ксилоза ААУ 14 1,6 12 0 00 00 врабіноза 85,87, 6,2 ГК) 5,5 50. 4,5 1,5

Атоза дві 22 2 2,5 2А 22 14

Галактоза А5,в4 5,5 5 35 2 24 25 талактуронова кисл. А, А?" роїу-Са1А 23,33 242 19,5 169 152 8,5

Глюкуронова кисл. А4 3,2 зо 18 0 02 00 середній др галактуронового 8439 188 7 637 6 4 ланцюга . . 7 залишкової молекули , . 100 93 т 54 51 29 --------------- 1 тт т от о опо о оп о ою о о юю « 1 1 юю 00000000

Й ТАБЛИЦЯ 5

Чисельний склад залишків РГ-ІЇ протягом кінетики деградації за допомогою

Репісіїтїїіцт даїєве початок 120 год 169 год 0240 год Обігод З3Збтгоя 584 год - . 2 рамноза 4.0 32 3.0 124 21 07 02 2-0-снз-Зукоза 10 10 410 0.8 0.8 0.2 01

Фукоза 10 1.0 10 ол 10 0.5 0.6 2-0-снз-ксілоза 1.0 10 1 0.5 0.3

Апіоза 24 2.0 124 11 1.5 0.4 02

Арабіноза 3.0 25 22 14 14 04 02 галактоза 25 18 13 14 па 02 02

Галактуронова кислота 10.5 10.5 7.9 7.5 1 44 т 4.0

Глюкуронова кислота 10 ШЕ 0.5 03 03

Ацеронова кислота 05 06 - 056 06 06 03. - 02 йно 09 19 0 05 09 07 06 а 07 ря в 03 03 0.6 0.6 0.5 загалом 2 215 215 133 1541 а 6.8

Середній бр гомогалактуронового ; ланцюга 8.5 32 8.0 1.5 5.0 4.5 3.5 хХ залишкової молекцли 109 97 7 66 65 29 25

ТАБЛИЦЯ б: Аналіз метилювання і зв'язків між залишками, що утворюють молекулу Й

РГ-ІІ, під час Її деградування Р. Бітріїсіввітит

ЕЕ в п поп нн нн нн

Метиховий ефір Тип зв'язку залишок початок 96 год 132 год 160 год 192 год чоо год ро В я т тт т нн т п т нн т т т нт пт нт т т и нт нн 23,4-Вва Вар (1-35 р2 Вб - 13 1,45 10 11 027 02 3А-КБа -2)-Кар-(1- ве о 0,5 0,5 0,8 09,8 05 2.А-Вла -33)- Бар в 10 10 То 10 10 19 вва «заз ввае ко А? 10 -- 0,55 07 01 о о 2ДА-Бос 2-0-Ме-Баср-(1- вт ол 07 07 0 0,6 бе 2-Евс -3,4)-Ецпср-(1-2 Аз 0,6 бе 0,4 01 й о о 2.3-Арі -3)-Арі-(1- ВІ А 20 20 2,0 1,95 1.7 0,8 2.3,5-Ата Ага - В с В а 14 1.0 10 0,5 о 23А-Ага о Атар-(1-» ві б, 02 п б 0.15 03 3,А-Ага -32)-Атар-(1- "В; 02 о 0,55 ол 0 0.4 4-Ата -2,3)-Ахар-(1-3 во 067 0,5 ва 01 о о 23АХУ 2-0-Ме-Хуїр-(1-у ХУ 0,6 76 о,4 ва о о 2,3А6-Ог1 Саір-(1- А5 0,5 0,45 01 0,05 о І) 3,6-О21 -23-С81р-(1- ві 1 10 10 10 1,0 0,95 рег ши -3,4)-баір-(1- А5 045 04 пл. 0,03 о о

Результати наведено в молярних співвідношеннях, обчислених на базі 1 залишкун»3)-КЛар-(1-3; залишку Ж В» в молекулі РГ-ІІ, котрий залишається незмінним протягом деградування 2234-Мез-Вват 1,5-ді-О-ацетил-7,3,4-три-О-метил-рамнітол, їі т.д. | - р

Бре піраноза /»х Фураноза :

ТАБЛИЦЯ 7: дналіз метилювання і зв'язків між залишками, що утвороють молекулу рг-Ії, під час Її деградування Р.са1їеае ,

Метиловий ефір Тип ЗВ'ЯЗКУ Початок 72 ГОД тїогод ї5агодо 240 ГО 264 ГОД 2,3,4-Айа Влу- 14 12 І 1 12 12 12 3А-Кла -ВЛар- Га 0 0.5 0.4 0.3 04 й 2,4-Бра -3-ЕПар- 1 1 1 ! 1 1 1 ко -23,4-1лар-» 04 04 0.3 '

Кіа -2,3,4-Янар- 1.2 12 12 14 0.8 04 2.3,4-Е0о 2-0-сНа-Епс-» 0 07 07 0.5 07 0.8 2-гис -3 Би 0.6 0,7 0 0.6 0.3 0.2 2,3,-Ху! 2-0-СИЗ-Ху!-з 0.6 06 0.5 0.5 0.3 ва 2,3-Арі -у3-Арі-) 22 2.2 2.3 2.2 2.2 1.8 2,3.5-Атга Агу- 1.6 14 141 1.3 0,8 0.8 - 3,4-Ага -2-Атар-х . 03 0.3 0.3 0.5 0.5 4-Ага -2,3-Агар-з 0.6 0,7 0.5 0.6 0.4 0.2 2,3,4,6-03і Саіро 0.5 0.5 05 (04 0.3 0.2 2,6-08,, -3,4-Ощр- 0.6 0.6 0,5 0,5 04 0.3 зв -зй бере 12 а Та 1.0 0.9 3-Асг -2АссгАнУ 0.5 0.5 0.3 0.2 0.6 0.0 23,4-смА СаірА-» 2.6 3.0 3.0 2.6 1.9 1.4 2,3-ОМА оз4бирид-» 0020 33 хі 1.8 1700715 2-ОМА -3,4-баірА-» 1.5 1,5 1.5 1.5 1.3 13

За А -2,4-С8рА 11 12 1,3 1.3 1.8 1.6 биА -2,3,4-СбаірА-» 0.8 0.9 0.8 07 0.3 0.2 1,2,3,5-0МА -4-ба1рА гей 1.0 0.9 0.8 0.7 07 0.8 2,3,4-б1сА СісрА- 0.2 зЗАбісА -2-бісрА-» 11 14 1.4 11 0,6 0,4 од т

Результати наведено на базі 1 залишку -53-КПдр-», залишку М о в2 в молекцлі РГ-Ї1, гсвіс

Котрий залишається незмінним протягом деградування 2.3,4-Клах 1,5-ді-о-ацетил-2, З, «4-три-о-метил-рамнітол, й і т.д.

(0) (с рі о

Ва-Ага/ ал.-Ввар і і

І 5 сі

В-0-ОНА Крор 2 2

Я і

А А а-0-САТА р -41-74)-а-р-баід р 211 -4)-а-р-СаА р -01-4)-0-р-бага р -1-4)-0-0-СМА р-(-4)--р-багА р 1-4). в-р-баіА р -(1-4)- а-р-СаА р 1 2 - їй Т ві

Во-Арі/ В-О-Арі/ - З з

Ах Тл Аг Тт а-0-О21А р 4(1--2)-В-4-Ква р 43 «-1)-Д-0-баіА р Вл-Кнар 4 3 ! лу Та 1 вз а-р-Хуї р -41--3)-0-1-Буср . Ві-АсеА/ 3 «- 0 -Ас 2 4 2 1 Тл І ве І ве І о-Ме В-О-бісА р Ас-0-0--Бис р(1-32)о-Ю- Ов р 2 2 А .

Тх 1 . 1Т в» - І

Кі-з3ар-баі р Оо-Ме а-л-Атар 3 В, 1 2 1 1 ве

В с Квар й 2 (А) 7 8»

Й Й В--Ага/ М

І (в)

Кі-нНоа-і-Квар

К2. 3 Невизначені замісники І

Фіг. 1 і пн ит поплін пн яні жн ПОпПОрОТЬ

Птеридофіти . , (Роїуроаійт упірагє)

ГіМНосперми сн нь ЯЛИНа Дугласа (Регийогира тепебії)

Сперматофіти . однодольні рис (Огуга зайуа)

Ангіоспермни : двір (Асег ругийоріаіапих) ! дводольні яблуня (Машу айотехйса) ' | Виноград . (рій уп уста) х !

Фіг. 2

І ві ПІ 1У У или п и СН зи «ат та 6о0о0 ч 5000 5тМ о (50 тм 250 тм «000 ї ї | гола КИСЛІ з цукри 3000 й нейтр.

Е и ц цукри 2000 к ; ; к 1000 ! ги Її тя й і " к їх СУ , х пь. І а К. 0 дру рин БА в Шків ол нд о 000 20003000 4000 50006000 07000 об'єм в мл

Фіг. З з о,8о о,6О . , о І 0, А Е і . дн Ки ри нн ІНД ОВО ООН о,2го 0,00 ї - пу о0,0о а,5О0 1,00 1,50 х,0О0 . , х 107 Хвилин

Фіг. А й

Ї; 8,00 в,ра й

Ї що 4,00 | | ц ! і 1 м нанні наочжая а аа аа а на А А А а й пен песни, 2,00 0,0 Її є 0,00 О.О 1,02 1,50 2,20 м літ АВ

Б гл

А !

ОО.) . ши зо, | | ! тв | І І і2я у І

І о ! | І і Ї а ! Ї : і

Ган і І 8 | !

В, ! І і 5 1,бо І | ! з, ши

З і | і 5 | І п . ! І ! . І / і 0,50 ї У Е ' й А, М 1,80 1,8а 2,00 2,20 2,80 й Час (хв. х 10)

Фіг. 5

Приготування розбавлених вінас 250 хітрів

М

Знобарвлення на екструдораному актированпому вугіллі,

Ддекантація Й

Фільтрація на ротаційному фільтрі під вакуулом ! Адсорбційна хроматографія на колоні з 90 літрів смоли

Кеше? ріатоМО5Ра1

І Промивка водою вилучення ' те - ' 100 літрів незахопленої фракції

Еплоція 20Х етанолом 100 літрів

РГ-ІІ чистотою 607 й Осаджування - втанолом 402

РГ-ІЇ чистотою 905

Фіг. 6

2,50 - г

А . і х

Е х . х 2,00 ! й х - , і 8 Ід е РЕ їх р - ме че ншньнн

ГЛ шини й І і - 1,50- І КЯ щ . ! п дн В

В / теку пре нити

Що І шлю шия с здат ннтетнитннян суши Ядерні 1,00 1,40 1,80 2,729

Час (хв. х 10)

Фіг. 7 - а . Н гД ; г ІЗ а і а ! ж : ! й !

БЖ | ; :

З шк щ ! Й ь Ї

Е і і ;

З 0 дХе ї

ГОЛИ 1 ї У га . і і Н . У у т шк М і

ЕЕ Й : / і ій її і й . Ех ху у . , і хх і ! Щ хх ; Н ; / у Х р, Н

МЕ І В; Е ! 7; У то ! Ол І НО й ри пк ши й сами гтнни. піп Кк ЗДА - патини

Ї ї й ї нин; 1,70 1,505 1,0 2,09 2,10

Час (хв. х 10)

Фіг. 8

, а

І г і Ї п,ва | и В

І й

Ї «І с их

Ман І Ще - Іа

В в,во дО . х : | | І е Я я. ! І п е | . / Ії Їй Ди в, | МК) І -й , / НЯ Ї | й ш а /90 / й і І 8 ЕНН! у щ АК С

Ти М і ха спі ііітшпоои Й їст

Єпелду пен стр няння три льна ші 1,90 1,50 1,70 1,980 1,380

Час (хв. х 10) фіг. 95 й а . их / х ій / / х с і Й

І і я

Г/л і / ї Її г Й і ; і Ї /й Кк. и, ух м ; і Н и Я

В. . 7/7, м г й / Н / М ь х те , Ї г В Ї щ ' и; щ Й / : й й Ся т К. / ї / й а М я и І / ра ж

Вес ай Шу 1,75 1,80 1, 55 1,50 1,35

Час (хв. х 10) ! ч Фіг.10 а г

КА В п ій

Ех 0 і 1 ту . НЕ

ШЕ м г с -- і М

В | ! БЕ

Дчи іі Н ка о Гр їх

В ! ! ! ! / у у

ПАК» / ", і тео) І ЩІ ГИ

З і Гр - ! ПНЯ; ля

Фі 7 ща 7 і Н х - '! ! І, ї; і М у

ПИ пу

І НА ж АЇ / 0-Х зр ут Ж і. ї Іри кед сенси ИН - ", 7о Подих в нн ни пи п п ПИ В 2,00 . ; ва 4 та 1 ва ,

Час (хв. х 10)

Фіг.11 1) (с) рі с:

В-і-Ага/ а-Квар 1 і 5 сі

Д-о-оНА крор 2 2 і ї з З о-о-бмА р -01-34)-0-в-ОА р 4(1-34)-й-0-ОЩА р 41-му а бал р «1-4)-02р-ОаїА р -(1-54)-059-О21А р (1-4). о-0-б3А р. (1-4): о-В-ОаА р 2 7

Та Тв; (1) Ши ДИ І ВАР ак ТА: аг 1 в2 е-р-багА р -(1--2)-В-1-ВНа р (3 -12-8-0-Са1А р Д--клар 4 3 сш й 1» Тв (2) осв-Ху! р -(1--3)-а-1-Ечес р Вл-АсеА З е- О-Ас 72 4 2 й 1. ТЯ ля ви Ї ву

О-ме р-р Оса р Ас-0-з0 Рис р 41-32)-0-0-баї р 2 2 4 т їх 1 1 85 8-3 0-0-Саї р о-ме соі-Агар 3 КІ 4 2 ї 1 вв

КЕ п-1-Ква р

Й 2 (8) 1 67

Й В-А-Ага/ (В)

Кі НО. -Кіа р

Кк: Кін Невизначені замісники

Фіс.12

(п) (с) рі сі

В-Р-РНА КрРОр 2 2 і і

З 3 0 а-0-саїА р (1-4)-0-0-С241А р -(1-34)- а-р-баїА р -1-34)- о0-р-СаА р 2 - Ї ві

ВаАрі/ 5:

Т в:

Вл-Квар

З

Ї вз - ВлнАсеА / 3-0 -Ас 2 ве М Т ва Й

Ас-0О-ал Вис р (1-32)-а-р-ба р Й 2 4

Т 1 в»

О-Ме о-і-Агар

Фіг.13 (в) 1 їх 1,600 / що і р

На І - 0,80 і ї

Е І х шк л о |!

ЕЕ І І

ГЯ і ілі

Д, о,бо і ТВ. єн / І І

В, и Що -ї / Ї НІ с, і ; щоб, /й дня / х Я Ї а | / пає З зе й ри чи й Дня и ! - р а Ша; ранні р . о,г2а пишу ли ши ЧА я -и ! с ра 1,00 1,50 1,80 2,20 г,са

Час (хв. х 10)

Фіг.14 у

М

/ у я 8,90 . ! 1 рих їх ши ши ї- і х і

В ! ; М ї РЕ !

Б 6,00. І і ' че ри

Ге, . ' Н р ії ; ІГ/ А А Й їр/й У ТУ / Ї

Е ! і /, х ли и / - їі ; д т, І; ; /и У уж ; и / Й М шли й / / м й сода я ; п ам й . пов стенннннчнинйн че чений тив нн понинининій

Й 4 ' , к,75 41,50 1,85 1,00 3,85 002,0 02,05

Час (хв. Х 10) і Фіг.15 й а д у - . щі І ри

Й

. | дл ш 5, 00. , | ! і ; /4 о | | Я І е х в ї І |!

М гшІ І у чн 8 і ДИ і 5 ї. ОДИН: 5 й іл 4,03: ї в

ЇЇ щи ї ' У" іч

У І ї Ми ; в / КА - гй не в 2 т й з, й шт ; | 2,00 1,20 1,10 1,50 1,50 ,

Час (хв. х 10) , Фіг.16 а

ГУ

С ї їв і й І гі ЩІ 5,00 - ши

І М щ Ше і | сі - Комі 1 с : РИ и дише а) й р

Ез : І ну в / іі М! А . ; ГО п ї я, во й я І І х у а дно ЕМ, й і І дав) Й р вн -й

Кк ХА і - у, їх й 3, о - Я їй : х ра : ти ж 1,30 1,40 1,50 1,50 1,72 1,80 1,8а

Час (хв. х 10)

Фіг.17 а ' й г 2 Уа - і! і

Ше и, Н и ке; , / х шо - ї х і у

В. | ; і у в ? ; о зн / я сан Н Й

В

8 й й ух р г ! у а - и ' щ ;

В " 2 шт щ я " 2,по І. 7 й ї В З ни : я 1,80 4,70 1,50 1,О 4,79 1,50 1,50

Час (хв. х 10)

Фіг.19 й А

НІЖ

ПА : ее :

Ре СА Я у. СВО пи , я і «ЖК к у 5 чу ; й а ї кН й

Але Ск, ; т «г ау

Бе о . вових :

Фіг.І9А Фіг.198 їх уж, їй у

ЕЕ си

Же жу

РИ їх ж

М «я т ле іх я г - ЕД

Як ж з , й ! . : і : "й Еге .

Я ' З б ' ч що що - я

М й с " КІ -к є ль: и

Фіг.19с Фіг.190

С | іїх її і и з сх, Пи щ Я Бр

Б НБН хі й і ; 5 Я.

Бон це бору й ЩИ ух Кк и 0 15 Ен ДО й ле ке ШЕ

Й и Ул Кот ий «ВЕ й Ше Пак й .

З МН шк: ие КИ й в

ІКЕМК. : в. ре ШЕ: і;

Й Як ? ЕК

Є т о нн лесі я т

Фіг. год Фіг. 205 іс.

. ай,

Не Е Щ Е г. я Н р БЕЖВ. . й ч Ж 1 пе

ЩЕ Н ще ' с ! АТ

ДМ че

КЕ І

Ле А і НА ни

Фіг. 200

Фіг.200

Claims (21)

1. Ензим, який відрізняється тим, що він має активність деградування рамногалактуронану І! (РГ-ІЇ) та його похідних.

2. Ензим за п. 1, який відрізняється тим, що він має активність типу у ндогідролазної.

3. Ензим за п. 1 або 2, який відрізняється тим, що він має ендо-7 -І -рамнопіраносил-(1 -7 3)-О-апіофураносил- гідролазну активність.

4. Ензим за п. 1 або 2, який відрізняється тим, що він має ендо-Є -І-фукопіраносил-(1 77 4)-І- рамнопіраносилгідролазну активність.

5. Мікроорганізм, зокрема гриб, що має активність деградування РГ-ІЇ та його похідних.

6. Гриб за п. 5, який відрізняється тим, що він відноситься до роду Репісшіит.

7. Штам гриба за п. 5 або 6, який депоновано в Національній колекції культур мікроорганізмів Інституту Пастера (СМОМ) під Ме 1-1578 (І АМ2).

8. Ензим за одним з пп. 1-4, який відрізняється тим, що його можна виготовити одним з штамів за одним з пп. 5-7.

9. Ензиматичний препарат, який відрізняється тим, що він містить ензим за одним з пп. 1-4 або 8.

10. Спосіб одержання ензиму або препарату за одним з пп. 1-4 або 8-9, що включає наступні етапи: - введення в культуру мікроорганізмів за одним з пп. 5-7 в культуральному середовищі, пристосованому до продукування ензимів за пп. 1-4; - рекуперацію ензиму або ензиматичного препарату з поверхневої плівки культури або з поверхневої плівки розмолу мікроорганізмів.

11. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що він включає наступні етапи: - введення в культуру мікроорганізмів за одним з пп. 5-7 в культуральному середовищі, пристосованому до мікроорганізмів, такому що містить РГ-ІІ або одну з його похідних, - рекуперацію мікроорганізмів, - розмелювання мікроорганізмів, - видалення нерозчинної речовини і - рекуперацію поверхневої плівки, що містить ензим або ензиматичний препарат.

12. Спосіб одержання РГ-ІІ з екстрактів рослинного походження, що включає наступні етапи: - сепарацію макромолекул, що містяться в зазначених екстрактах, і - хроматографію обміном аніонами при рн, вищому за 4.

13. Спосіб за п. 12, який відрізняється тим, що сепарацію проводять осадженням або ультрафільтрацією.

14. Спосіб за одним з п. 12 або 13, який відрізняється тим, що після хроматографії обміном аніонами проводять хроматографію стеричним вилученням.

15. Спосіб одержання РГ-І з екстрактів рослинного походження, що включає принаймні одну адсорбційну хроматографію на носієві, здатному утримувати РГ-ІЇ.

16. Спосіб за п. 15, який відрізняється тим, що адсорбційну хроматографію проводять на активному вугіллі або на полістирендивінілбензеновій смолі.

17. Препарат РГ-ІЇ, здатний бути одержаним в спосіб за одним з пп. 12-16, який відрізняється тим, що він містить щонайменше 95905 мономерів РГ-1Ї.

18. Препарат РГ-ІЇ, здатний бути одержаним в спосіб за одним з пп. 12-16, який відрізняється тим, що він містить щонайменше 8095 і бажано більше ніж 9595 димерів РГ-І.

19. Спосіб відбору мікроорганізмів, зокрема грибів, зважаючи на їх здатність до деградування РГ-ЇЇ, який відрізняється тим, що зазначеним мікроорганізмам дають можливість зростати в пристосованому середовищі, що містить РГ-ІЇ, причому зазначений РГ-ІІ є здатним бути одержаним в спосіб за одним з пп. 12-16.

20. Культуральне середовище для мікроорганізмів, яке відрізняється тим, що воно містить РГ-ІЇ, одержаний в спосіб за одним з пп. 12-16.

21. Спосіб за одним з п. 10 або 11, який відрізняється тим, що РГ-ІІ одержано в спосіб за одним з пп. 12-16.