CZ370197A3 - Enzym degradující rhamnogalakturonan II a jeho deriváty, způsob výroby tohoto enzymu a rhamnogalakturonanu II a použití enzymu - Google Patents
Enzym degradující rhamnogalakturonan II a jeho deriváty, způsob výroby tohoto enzymu a rhamnogalakturonanu II a použití enzymu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ370197A3 CZ370197A3 CZ973701A CZ370197A CZ370197A3 CZ 370197 A3 CZ370197 A3 CZ 370197A3 CZ 973701 A CZ973701 A CZ 973701A CZ 370197 A CZ370197 A CZ 370197A CZ 370197 A3 CZ370197 A3 CZ 370197A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- enzyme
- degradation
- derivatives
- preparation
- plant
- Prior art date
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 102
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 102
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 39
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 36
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 34
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 17
- LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N n-(2-chloroethyl)-n-nitrosomorpholine-4-carboxamide Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)N1CCOCC1 LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 claims abstract description 8
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 86
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 85
- 235000014101 wine Nutrition 0.000 claims description 46
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 42
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 37
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 36
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 24
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 19
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 claims description 15
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 claims description 13
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 12
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 12
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 12
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 claims description 11
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 claims description 11
- 235000012055 fruits and vegetables Nutrition 0.000 claims description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 9
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 claims description 9
- 239000001814 pectin Substances 0.000 claims description 8
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 claims description 8
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 8
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 7
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims description 7
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 7
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 7
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 6
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 5
- 238000002803 maceration Methods 0.000 claims description 5
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 claims description 5
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 5
- 235000021537 Beetroot Nutrition 0.000 claims description 4
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 235000015203 fruit juice Nutrition 0.000 claims description 4
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 claims description 4
- 238000003825 pressing Methods 0.000 claims description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 3
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000020400 fruit nectar Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 claims description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 3
- 239000004753 textile Substances 0.000 claims description 3
- 235000015192 vegetable juice Nutrition 0.000 claims description 3
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims 2
- XRCFXMGQEVUZFC-UHFFFAOYSA-N anisindione Chemical group C1=CC(OC)=CC=C1C1C(=O)C2=CC=CC=C2C1=O XRCFXMGQEVUZFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229960002138 anisindione Drugs 0.000 claims 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 claims 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 claims 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 abstract description 19
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 abstract description 19
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 abstract description 10
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 abstract description 2
- 239000008914 rhamnogalacturonan II Substances 0.000 description 204
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 79
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 40
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 40
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 40
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 38
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 31
- 241000228129 Penicillium janthinellum Species 0.000 description 27
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 19
- 241000909530 Penicillium daleae Species 0.000 description 14
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 11
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 10
- 230000009471 action Effects 0.000 description 9
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 8
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 8
- 235000020095 red wine Nutrition 0.000 description 8
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 7
- 230000002351 pectolytic effect Effects 0.000 description 7
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 6
- 241000220225 Malus Species 0.000 description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 6
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- AEMOLEFTQBMNLQ-YMDCURPLSA-N D-galactopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-YMDCURPLSA-N 0.000 description 5
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 5
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 5
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 5
- 235000021016 apples Nutrition 0.000 description 5
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 5
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 5
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 5
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 4
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 4
- 101001096557 Dickeya dadantii (strain 3937) Rhamnogalacturonate lyase Proteins 0.000 description 4
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 4
- AEMOLEFTQBMNLQ-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactopyranuronic acid Natural products OC1OC(C(O)=O)C(O)C(O)C1O AEMOLEFTQBMNLQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 108010093305 exopolygalacturonase Proteins 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 4
- PAIOZXJXGSOKFN-UHFFFAOYSA-N Aceric acid Natural products CC1OC(O)C(O)C1(O)C(O)=O PAIOZXJXGSOKFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 3
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 3
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 3
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 3
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 3
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- VCUILRLOJMHSMR-WNJXEPBRSA-N (2s,3r,4r,5s)-3,4,5-trihydroxy-2-methoxyhexanal Chemical compound CO[C@H](C=O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O VCUILRLOJMHSMR-WNJXEPBRSA-N 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 2
- -1 D-apiofuranosyl Chemical group 0.000 description 2
- AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N D-glucopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N 0.000 description 2
- HMFHBZSHGGEWLO-HWQSCIPKSA-N L-arabinofuranose Chemical compound OC[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 2
- 241000446313 Lamella Species 0.000 description 2
- 235000011430 Malus pumila Nutrition 0.000 description 2
- 235000015103 Malus silvestris Nutrition 0.000 description 2
- VCUILRLOJMHSMR-UHFFFAOYSA-N O2-Methyl-D-fucose Natural products COC(C=O)C(O)C(O)C(C)O VCUILRLOJMHSMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 2
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 2
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 2
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 2
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 2
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 2
- 235000009430 Thespesia populnea Nutrition 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 2
- 108010044879 alpha-L-rhamnosidase Proteins 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 235000015197 apple juice Nutrition 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 239000003245 coal Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 239000002361 compost Substances 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 2
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 2
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 description 2
- 229960003082 galactose Drugs 0.000 description 2
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 2
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 229920003053 polystyrene-divinylbenzene Polymers 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 235000020097 white wine Nutrition 0.000 description 2
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ALNDFFUAQIVVPG-SRQIZXRXSA-N 2-O-Methyl-D-xylose Chemical compound CO[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)CO ALNDFFUAQIVVPG-SRQIZXRXSA-N 0.000 description 1
- USSIQXCVUWKGNF-UHFFFAOYSA-N 6-(dimethylamino)-4,4-diphenylheptan-3-one Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(CC(C)N(C)C)(C(=O)CC)C1=CC=CC=C1 USSIQXCVUWKGNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000208140 Acer Species 0.000 description 1
- 235000003930 Aegle marmelos Nutrition 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 101100388291 Arabidopsis thaliana DTX49 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710152845 Arabinogalactan endo-beta-1,4-galactanase Proteins 0.000 description 1
- 241000228215 Aspergillus aculeatus Species 0.000 description 1
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- 241000218631 Coniferophyta Species 0.000 description 1
- ASNHGEVAWNWCRQ-LJJLCWGRSA-N D-apiofuranose Chemical compound OC[C@@]1(O)COC(O)[C@@H]1O ASNHGEVAWNWCRQ-LJJLCWGRSA-N 0.000 description 1
- 101100268840 Danio rerio chrna1 gene Proteins 0.000 description 1
- LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N Dimethyl ether Chemical compound COC LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 description 1
- 101710147028 Endo-beta-1,4-galactanase Proteins 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000011993 High Performance Size Exclusion Chromatography Methods 0.000 description 1
- 102100024023 Histone PARylation factor 1 Human genes 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 241000218922 Magnoliophyta Species 0.000 description 1
- 244000081841 Malus domestica Species 0.000 description 1
- 229920000057 Mannan Polymers 0.000 description 1
- 101150065731 NIC1 gene Proteins 0.000 description 1
- PWHVEHULNLETOV-UHFFFAOYSA-N Nic-1 Natural products C12OC2C2(O)CC=CC(=O)C2(C)C(CCC2=C3)C1C2=CC=C3C(C)C1OC(O)C2(C)OC2(C)C1 PWHVEHULNLETOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ALNDFFUAQIVVPG-UHFFFAOYSA-N O2-methyl-D-xylose Natural products COC(C=O)C(O)C(O)CO ALNDFFUAQIVVPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000003273 Passiflora laurifolia Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- 241000371966 Penicillus <bivalve> Species 0.000 description 1
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 1
- 241001406782 Rhamnosa Species 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 235000005138 Spondias dulcis Nutrition 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- GEEIPHPXFCSZGY-WTFGDDLMSA-N [(2S,3S,4S,5S)-5-acetyloxy-2,3,4-trimethoxyhexyl] acetate Chemical compound CC(=O)OC[C@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](C)OC(C)=O GEEIPHPXFCSZGY-WTFGDDLMSA-N 0.000 description 1
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-SXUWKVJYSA-N alpha-L-fucose Chemical compound C[C@@H]1O[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-SXUWKVJYSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-HGVZOGFYSA-N alpha-L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-HGVZOGFYSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 125000000328 arabinofuranosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 235000021028 berry Nutrition 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-YJRYQGEOSA-N beta-L-rhamnopyranose Chemical class C[C@@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-YJRYQGEOSA-N 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 235000019987 cider Nutrition 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000021448 clear apple juice Nutrition 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004665 defense response Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 150000002085 enols Chemical class 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 235000019985 fermented beverage Nutrition 0.000 description 1
- 238000004362 fungal culture Methods 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- FJEKYHHLGZLYAT-FKUIBCNASA-N galp Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](C)N)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CNC=N1 FJEKYHHLGZLYAT-FKUIBCNASA-N 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 108010002430 hemicellulase Proteins 0.000 description 1
- 229940059442 hemicellulase Drugs 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021579 juice concentrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 108010005335 mannoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000006140 methanolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 235000008486 nectar Nutrition 0.000 description 1
- TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N octane Chemical compound CCCCCCCC TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 230000001936 parietal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000003415 peat Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000008104 plant cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108010070456 protopectinase Proteins 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000009754 rhamnogalacturonan I Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000010801 sewage sludge Substances 0.000 description 1
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003892 tartrate salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D65/00—Accessories or auxiliary operations, in general, for separation processes or apparatus using semi-permeable membranes
- B01D65/02—Membrane cleaning or sterilisation ; Membrane regeneration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
- A23L2/70—Clarifying or fining of non-alcoholic beverages; Removing unwanted matter
- A23L2/84—Clarifying or fining of non-alcoholic beverages; Removing unwanted matter using microorganisms or biological material, e.g. enzymes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D41/00—Regeneration of the filtering material or filter elements outside the filter for liquid or gaseous fluids
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B08—CLEANING
- B08B—CLEANING IN GENERAL; PREVENTION OF FOULING IN GENERAL
- B08B7/00—Cleaning by methods not provided for in a single other subclass or a single group in this subclass
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12G—WINE; PREPARATION THEREOF; ALCOHOLIC BEVERAGES; PREPARATION OF ALCOHOLIC BEVERAGES NOT PROVIDED FOR IN SUBCLASSES C12C OR C12H
- C12G1/00—Preparation of wine or sparkling wine
- C12G1/02—Preparation of must from grapes; Must treatment and fermentation
- C12G1/0203—Preparation of must from grapes; Must treatment and fermentation by microbiological or enzymatic treatment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12H—PASTEURISATION, STERILISATION, PRESERVATION, PURIFICATION, CLARIFICATION OR AGEING OF ALCOHOLIC BEVERAGES; METHODS FOR ALTERING THE ALCOHOL CONTENT OF FERMENTED SOLUTIONS OR ALCOHOLIC BEVERAGES
- C12H1/00—Pasteurisation, sterilisation, preservation, purification, clarification, or ageing of alcoholic beverages
- C12H1/003—Pasteurisation, sterilisation, preservation, purification, clarification, or ageing of alcoholic beverages by a biochemical process
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01171—Rhamnogalacturonan hydrolase (3.2.1.171), i.e. rhamnogalacturonase
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D2321/00—Details relating to membrane cleaning, regeneration, sterilization or to the prevention of fouling
- B01D2321/16—Use of chemical agents
- B01D2321/166—Use of enzymatic agents
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Oblast techniky
Vynález se týká enzymu, degradujícího rhamnogalakturonan II (RG-II) a jeho deriváty, jakož i způsobu výroby tohoto enzymu.
Předmětem vynálezu je též způsob výroby RG-II.
Vynález se taktéž týká použití enzymu.
Dosavadní stav techniky
Rhamnogalakturonan II je univerzální a velmi složitou částí buněčných stěn rostlin (0'Neill a kol., Methods in Plant Biochemistry (1990) 2: 415-439). Přísluší k pektickým polysacharidům a je esenciálně přítomen na úrovni střední lamely a primární buněčné stěny.
Jeho struktura je extremně složitá (obrázek 1), protože se skládá z 12 různých monosacharidů pro jeden polymeračni stupeň (dp) blízký 30. Tato složitost je podporována přítomností málo se vyskytujících cukrů v jeho kompozici, která obsahuje: apiosu nebo 3-C-(hydroxymethyl)-D-glycerotetrosu; KDO nebo 2-keto-3-deoxy-D-mano-oktulosonikovou kyselinu; DHA nebo 3-deoxy-D-lyxo-heptulosarikovou kyselinu, 2-0-methyl-fukosu, 2-0-methyl-xylosu a konečně octovou kyselinu nebo 3-C-karboxy-5-deoxy-L-xylosu. Poslední monosacharid vytváří specifický markér pro RG-II. Nejobvyklejší monosacharidy v polysacharidech buněčných stěn, rhamnosa, fukosa, arabinosa, galaktosa a galakturonová kyselina a glukuronová kyselina, jsou rovněž přítomny v kompozici RG-II, nej častěji s anomery a s násobnými typy vazeb, které posiluji specificitu a složitost struktury molekuly.
Ultrastrukturálni organizace RG-II (obrázek 1) vede ke zvýšení této složitosti (Puvanesarajah a kol. Carbohydr. Res. (1991) 218: 211-222). Homologický řetěz a složenina 7 až 14 zbytků kyseliny galakturonové, vázaných přímo v a(1—>4) nese v ještě nedeterminovaných pozicích, 4 různé větve: dva disacharidy a dva řetězce více složitých oktanebo nonasacharidů. Jsou pozorovány různé struktury co se týče délky homogalakturonového řetězce a konce větve B a obdobně enzymatické účinky potřebené pro jeho získání. Na druhé straně, byla detekována přítomnost ještě neidentifikovaných substituentů na zbytku A5. Kromě toho obsahuje molekula RG-II 2 až 3 methylová seskupení, která esterifikují karbocyklická seskupení galakturonových kyselin a dvě acetylová seskupení situovaná na zbytcích R3 (acerová kyselina) a B4' (2-0-methyl-fukosa).
Struktura RG-II byla takto obecně určena, dokonce i když povaha jistých substituentů nebyla ještě identifikována.
V buněčné stěně rostlin je RG-II asociován s přírodními pektiny, ovšem přesný typ vazby mezi protopektinem a RG-II je ještě neznámý. Ostatně, taktéž jeho úloha v rostlinné stěně je neznámá. Lze tudíž říci, že je přítomen v celém rostlinstvu (Albersheim a kol., Biochem. Soc. Transactions (1994) 22: 374-378); od pteridofytů do spermatofytů, od gymnospermů do angiospermů, od monokotyledonů do dikotyledonů (obrázek 2) a v nezanedbatelném množství v střední lamele stěny. Také je známo, že jeho struktura je zachována u různých rostlin, kde byl studován (Albersheim a kol., Biochem. Soc. Transactions (1994) 22: 374-378) .
Poslední práce ukázaly, že může reagovat jako signální polysacharid a indukovat specifickou odpověď rostliny (elicitický účinek) (Aldington a Fry, J. Exp. Botany (1994) 45: 287-293). Avšak z jeho hojnosti, jeho všudypřítomnosti a ze složitosti jeho struktury lze předpokládat, jakou základní úlohu hraje v kohezi buněčných rostlinných stěn a tudíž v buněčné organizaci rostlinných látek.
RG-II se uvolňuje z buněčných stěn akcí enzymů s pektolytickým účinkem (pektinesterása, endo- nebo exopolygalakturonása), které degradují řetězce přírodních pektinů a uvolňují RG-II v nedegradované formě (Darvill a kol. Plant. Physiol. (1978) 62: 418-422), jak dokládá obrázek 1. Rozdílnost délky řetězce bere v úvahu enzymatické degradace, které umožnily jeho uvolňování z přírodních pektinů (Whitcombe a kol., Carbohydr. Res (1995) 271: 1529) .
Složitost a originalita struktury RG-II způsobuje jeho obzvláštní rezistenci vůči degradaci enzymy přítomnými v extraktech rostlin, jakož i v komerčních enzymatických preparátech jak původu fungicidního, tak bakteriálního.
Žádný degradační účinek nemůže ve skutečnosti jasně ukázat v komerčních enzymatických přípravcích degradaci buněčných stěn rostlin bohatší na různé účinky. Samotné pozorované degradace se týkají zbytků arabinofuranosy, rhamnopyranosy nebo galaktopyranosy ležících na neredukujicích koncích bočních reziduí, přípravě; rozdílností řetězců. Exo-enzymy dovolují uvolnění takových existujících ve skutečnosti což se vysvětluje bez mezi různými přípravami běžně v pochyby
RG-II, enzymatické pozorovanou popisovanými různými autory.
Během lisování nebo drcení ovoce a zeleniny se uvolňují • *
pektolytické účinky, které způsobuji degradaci homogalakturonových řetězců přírodních pektinů. Tyto účinky jsou posilovány přídavkem komerčních pektolytických enzymů a fermentační florou v případě vína a fermentovanými produkty. RG-II je uvolňován v intaktní formě a v množství často významném v ovocných a zeleninových šťávách nebo nektarech v jejich derivátech, zvláště ve víně.
Ve víně představuje RG-II jeden z hlavních polysacharidů (Doco a Brillouet, Carbohydr. Res. (1993) 243: 333-343), jeho koncentrace může dosahovat 100 mg/1. Podílí se na množství nežádoucích jevů, jako je zanesení filtračních membrán (Belleville a kol. , Enol. Vitic. Sci. (1991) 46: 100-107), utváření nestabilních komplexů s jinými koloidními makromolekulami a indukci precipitačních jevů. Jeho eliminace nutně probíhá za použití specifických enzymů působících jeho degradaci.
Do současnosti byly popsány různé metody získání RG-II z vína:
-enzymatickou hydrolýzou za pomoci fungicidních endopolygalakturnas izolovaných z kultur rostlinných buněk v suspensi (Darvill a kol. Plant Physiol. (1978) 62: 418422) ,
- použitím komerčního enzymatického přípravku z Aspergillu niger, Pectinolu AC (Stevenson a kol. Carbohydr. Res. (1988) 179: 269-288); RG-II je zde přítomen ve formě slabé koncentrace a jeho čištění implikuje množství eliminačních etap proteinů a barvící látky,
- z vína (Doco a Brillouet, Carbohydr. Res. (1993) 243:333343) , popsané čištění bylo úspěšně provedeno ve 4 etapách sférickou vylučovací chromatografií (CES) nebo iontovou
Zjistilo se, že rhamnogalakturonan I nebo RG-I, i když má velmi blízké jméno, je zcela odlišnou částí rostlinné buněčné stěny ve srovnání s RG-II jak z hlediska strukturního pohledu (jeho struktura je založena na výměnou .
střídání rhamnosy a galakturonové kyseliny), tak svojí degradací enzymy.
Účinky rhamnogalakturonasy (Schols a kol., Carbohydr. Res.
(1990) 206: 105-115) nebo protopektinasy (Sakamoto a
Sakai,
Carbohydr. Res. (1994)
259: 77-91) byly již popsány.
Z dále uvedené analýzy stavu techniky plyne, že není znám žádný enzym nebo enzymatický přípravek představující dostatečný degradační účinek na RG-II. Proto je přítomnost tohoto polysacharidu zdrojem nežádoucích jevů, jako je zanášení filtračních membrán, utváření nežádoucích komplexů s dalšími koloidními makromolekulami a indukce precipitačních jevů.
Ekonomickým důsledkem uvedených nežádoucích skutečností v tomto případě byla nutnost nalézti řešení daného problému.
Podstata vynálezu
Předložené řešení podle vynálezu ukazuje, že je možné izolovat enzymy způsobující degradaci RG-II a jeho derivátů, z mikroorganismů.
Dalším nově vynalezeným předmětem je způsob přípravy látky RG-II, dovolující získat její velké množství z různých rostlinných zdrojů.
Dalším předmětem vynálezu je enzym, který degraduje RG-II a jeho deriváty.
• ·
Podstatou předloženého vynálezu je látka RG-II, celý polysacharid, mající strukturu vyznačenou na obrázku 1, který je buď ve formě monomeru nebo dimeru a celá výsledná molekula je produktem částečné degradace a obsahuje nejméně jeden fragment řetězu A, B, C nebo D charakterisující jak kompozici, tak i její sekvenci.
V dalším textu, všechny skutečnosti vztahující se k látce RG-II, platí též pro deriváty její molekuly.
Enzym, který obzvláště výhodně představuje popsaný účinek je endohydrolasového typu.
Takovýto enzym může býti obzvláště představován účinkem endo~3-L-rhamnopyranosyl-(1—>3' )-D-apiofuranosyl hydrolasy a/nebo hydrolasy.
řetězec A, endo-a-L-fukopyranosyl- (1—>4) -L-rhamnopyranosyl
Jejich účinek lze určit možností uvolňovat jak je znázorněno na obrázku 1.
Tento enzym může býti produkován mikroorganismem, obzvláště houbou druhu Penicíllium.
Mikroorganismy tohoto druhu mající degradační účinek na látku RG-II a její deriváty, představují další předmět vynálezu. Jsou to zvláště kmeny Penicíllium, které byly následně deponovány dne 19. května 1995 v Collection Nationale de Cultures des Microorganismes de 1'Institut Pasteur (CNCM) - Národní sbírce kultur mikroorganismů při Pasteurově institutu:
- kmen Penicíllium simplicissimum, deponovaný u CNCM pod . označením n° 1-1577 (IPV1),
- kmen Penicíllium dalese, deponovaný u CNCM pod označením houba, izolovaná z lesní (LaV2).
Oba tyto podstatou pěstování) kmeny hub představují jsou houby s rychlou modrozelených spor.
předmět produkcí
Penicillium daleae je méně běžná půdy a která je známá pro svoji kapacitu degradovat amidon a pektické polysacharidy.
„Compendium
T.Η.Anderson
Tento druh je popsán v of Soil Fungi, H.K.Domsch, (1980) Academie
Press, London, strana
560 .
Penicillium simpli cissimum dekomponovaných „Compendium of Soil Fungi, izolovaný z publikaci
T.H.Anderson (1980) Academie Press, je více známý kmen rostlin. Tento druh je Η.K.Domsch,
London, strana častěj i popsán v
W.Gams a
597-598 .
Předložený vynález se také obsahujících enzym degradující jak je uvedeno výše.
týká enzymatických látku RG-II a její přípravků deriváty,
Tyto enzymy však mohou býti ve jiné enzymy představující jiné formě přípravků, obsahujících účinky.
Obohacení těchto přípravků o účinky představující degradaci látky RG-II nabízí zcela nový potenciál pro všechny aplikace vyžadující částečnou nebo úplnou degradaci buněčné stěny a rostlinných polysacharidů.
Enzymy dovolující specifickou degradaci látky RG-II a jejejích derivátů mohou býti použity pro degradaci nebo modifikaci látky RG-II nebo jejích derivátů, a to zvláště v následujících aplikacích:
- eliminace RG-II z šťáv ovoce, zeleniny a jejich derivátů, aby se zlepšila filtrovatelnost, ulehčila výroba šťáv a koncentrovaných aromatických bázi, usnadnilo se čištěni a zajistila se dobrá stabilita finálních produktů,
- čištění membrán mikro- a ultrafiltrace, použitých pro čištění šťáv ovoce, zeleniny a jejích derivátů, získání přípravků typu macerasy, to jest přípravků dovolujících disociaci buněčných látek mladých rostlin s minimální degradací parietálních struktur (výroba ovocných nektarů, pyré, želé a koncentrátů ovoce a zeleniny), získání ztekucených přípravků, to jest před provedením celkové hydrolýzy polysacharidů buněčných stěn rostlin (výroba šťáv na bázi aromatického ovoce, zeleniny a fermentované nápoje, pivo), výroba pektinů a krmiv pro zvířata ze zbytků rostlin (dužina řepy, pevné zbytky po vylisování ovoce...),
- výroba celulosy z rostlin; enzymatická hydrolýza dalších složek polysacharidů dovoluje ve skutečnosti zlepšit výtěžek výroby (textilní průmysl, výroba papíru).
Komerční enzymatické přípravky umožňující degradaci buněčných stěn rostlin musí míti způsob biochemického účinku nejpřesněji a nejlépe definovaný, podle typu zkoumaného použití. Specifický přínos enzymů degradujících RG-II a majících přesný a dobře determinovaný způsob účinku je ve smyslu jednoho z nej lepších využití potenciálních technologií, požívajících enzymy z hub.
Enzymy a enzymatické přípravky podle předloženého vynálezu, výše popsané, mohou býti výhodně získány způsobem, který zahrnuje následující etapy:
- dodáni mikroorganismů majících degradační účinek na RG-II nebo jeho deriváty do prostředí adaptované kultury na produkci těchto enzymů.
opětné sebrání enzymu nebo enzymatického přípravku v supernatantu kultury nebo v supernatantech drtě mikroorganismů.
Způsob výhodně sestává z následujících etap:
- dodání mikroorganismů majících degradační účinek na RG-II do prostředí adaptované kultury na produkci těchto enzymů a obsahující RG-II,
- opětné sebrání mikroorganismů,
- rozdrcení mikroorganismů, eliminace nerozpuštěné látky, zvláště filtrací nebo centrifugováním rozdrcených mikroorganismů a
- opětné sebrání supernatantu, obsahujícího enzymy nebo enzymatický přípravek.
Enzymy mohou býti přímo obsaženy v supernatantu kultury, bez drtě mikroorganismů, když to podmínky dovolují, volíce takové podmínky nebo kmeny takového druhu, že enzymy jsou uvolněny v daném prostředí.
Výhodně tento způsob přípravy probíhá za pomoci kmenů Pemcillium deponovaných ve sbírce kultur CNCM pod čísly N°l-1577 a N°l-1578.
Tyto enzymy lze taktéž získat inženýrství, po klonování genu nebo pomocí genetického genů odpovědných za jejich syntézu nebo zcela jinou technikou dostupnou odborníkovi v oboru, obzvláště syntézou vycházející z jednotlivých aminokyselin, po identifikaci jejich sekvencí.
Předložený vynález se také týká způsobu získání RG-II a jeho
- 10 metabolitů nebo derivátů z extraktů rostlinného původu, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje chromatografování zmíněného extraktu.
Je zřejmé, že se způsob týká nejen získání látky RG-II, ale také produktů degradace její molekuly, které se mohou tvořit, když probíhá způsob přípravy a které se nazývají metabolity, jakož i všech derivátů látky RG-II.
V předloženém vynálezu se rozumí pod pojmem „extrakt rostlinného původu každá příprava obsahující obzvláště rozpustné polysacharidy rostlinného původu. Polysacharidy mohou býti podrobeny etapě koncentrace, buď ultrafiltrací nebo precipitací, například z ethanolu, methanolu nebo ostatních adekvátních rozpouštědel.
Způsob může též zahrnovat alespoň jednu etapu chromatografické aniontové výměny, při pH slabě kyselém nebo neutrálním, výhodně větším než 4. Adsorpční chromatografie probíhá na kolonách DEAE nebo QEAE.
Způsob může též zahrnovat alespoň jednu etapu adsorpční chromatografie RG-II na nosiči zadržujícím RG-II. Adsorpční chromatografii lze provádět na aktivním uhlí, v koloně s náplní polystyren-divinylbenzen nebo na jiné vhodné náplni.
Je možné přidati, před a/nebo po chromatografické etapě, etapu separace polysacharidů, buď frakcionačni precipitací nebo ultrafiltrací, nebo sférickou vylučovací chromatografií. Pro uskutečnění frakcionačni precipitace se výhodně používá ethanol nebo methanol. Pro provedení sférické vylučovací chromatografie se výhodně používá kolona s „sephakrylem nebo jiným vhodným nosičem.
Předložený vynález se mezi jiným týká přípravků, které se získají některým z těchto způsobů:
- část přípravků obsahuje majoritně to jest nejméně 95%) monomerů látky RG-II, a
- druhá část přípravků obsahuje nejméně 80%, výhodně více než 95% dimerů látky RG-II.
Po každé chromatografii se určí, díky složení, jaké frakce látka RG-II obsahuje. Tato operace je dostupná odborníkovi v oboru.
Uvedené způsoby dovolují snadno získat přípravky ve významném množství (řádově kilogramů) rhamnogalakturonanu II ze všech produktů rostlinného původu, s výjimkou těch, které pocházejí z trav, jako jsou šťávy ovoce, zeleniny a jejich derivátů, zvláště vína, obzvláště koncentrovaného vína, vína špatné kvality a vinného moštu a těch, které jsou v rozmezí desítky gramů. Látka RG-II se výhodně získá z primárních stěn rostlin, ale je možné ji také izolovat z každého produktu odvozeného od rostlin umožňujícího rozpustnost buněčných stěn, buď během způsobu tradiční transformace (lisováni, fermentace..) nebo působením za pomoci enzymů v tekutině.
Dalším předmětem předloženého vynálezu je způsob selekce mikroorganismů, speciálně hub, vzhledem k jejich schopnosti degradovat .látku RG-II, jehož podstata spočívá v tom, že mikroorganismy se nechají množit v uzpůsobeném kultivačním prostředí obsahujícím danou látku RG-II.
Vynález se také týká kultivačního prostředí pro mikroorganismy, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje látku RG-II.
Způsoby podle předkládaného vynálezu, obzvláště způsoby výroby a isolace enzymů podle předkládaného vynálezu, stejně tak jako způsob výroby látky RG-II mohou být provedeny odborníkem na základě pouhého přečteni předloženého popisu vynálezu a jeho obecných znalostí. Nicméně je možné pro referenci použít následující manuál: Methods i Microbiology, svazky 1 až 6, J. R. Morris a D. W. Ribbons (1969-1972), Academie Press, London, New York.
Přehled obrázků na výkresech
Předložený vynález bude blíže vysvětlen prostřednictvím konkrétních příkladů provedení, které předmět vynálezu nikterak neomezují.
Popis předmětu vynálezu a příklady jeho provedení se odvolávají na připojené obrázky, na kterých obr. 1 představuje schematicky strukturu rhamnogalakturonanu
II, zahrnující jeho čtyři postranní řetězce A až D. Na tomto obrázku R1 představuje atom vodíku nebo a-L-rhamnopyranosu a R2 a R3 představují atom vodíku nebo jiný substituent, obr. 2 znázorňuje rozdělení RG-II v rostlinné říši, obr. 3 znázorňuje frakcionaci polysacharidů, kyselých cukrů a neutrálních cukrů vína na koloně DEAE (Macroprep), obr. 4A a 4B jsou profily vysokovýkonné sterické vylučovací chromatografie (CES-HP) u dvou frakcí RG-II, isolovaných z červeného vína, obr. 5 ukazuje profily vysokovýkonné sterické vylučovací chromatografie na koloně Superdex-75 HR u dvou
frakci RG-II získaných čištěním vinného koncentrátu:
a) frakce III, dimer RG-II (molekulová hmotnost 9500 Da, vymývaná po 18,5 min),
b) frakce II, monomer RG-II (molekulární hmotnost 4750 Da, vymývání po 20,5 min), obr. 6 je schéma čištění RG-I základní úrovni, obr. 7 je porovnání profilů, určených pomocí CES-HP na koloně Superdex-75 HR, u celkových polysacharidů červeného vína (a) s frakcí, která není zadržena na pryskyřici Relite® DIAION® (b) s frakcí, která je zadržena a potom vymyta ethanolem 20 % (c) , obr. 8 znázorňuje degradaci RG-II rozpustným buněčným extraktem Penicillium simplicissimum (1-1577). Spektra a, b a c odpovídají původnímu RG-II a RG-II po 24 hodinách a 48 hodinách degradace, obr. 9 znázorňuje degradaci RG-II rozpustným buněčným extraktem kmenu P. daleae LaV2 (1-1578) (a:
původní RG-II, b: po 96 hodinách, c: po 168 hodinách, d: po 190 hodinách), obr. 10 znázorňuje degradaci, následovanou chromatografií CES-HP, pro RG-II kulturou Penicillium simplicissimum (1-1577). Křivky a až f představují spektrum původního RG-II a spektra RG-II po 96 hodinách, po 132 hodinách, po 168 hodinách, po 190 hodinách a po 400 hodinách růstu houby, obr. 11 znázorňuje degradaci RG-II kulturou P. daleae (I14
1578), následovanou chromatografii CES-HP, po různých dobách (a: původní RG-II, b: po 72 hodinách, c: po 120 hodinách, d: po 240 hodinách, e: po 264 hodinách f: po 336 hodinách, g: po 384 hodinách), obr. 12 představuje zjednodušenou strukturu z obr. 1. Jsou znázorněna místa potenciálního štěpení enzymu podle předkládaného vynálezu, označená šipkami 1 a 2, obr. 13 znázorňuje strukturu residuálni frakce RG-II po jeho degradaci, způsobené Penicillium simplicissimum a P. daleae.
obr. 14 znázorňuje dimerickou degradaci RG-II kulturou P. daleae (1-1578) . Spektra a až c představují spektrum původního dimerického RG-II a spektra RG-II po 168 hodinách a po 300 hodinách degradace.
| obr. 15 znázorňuje | degradaci, |
| CES-HP, | čištěného |
| buněčným | extraktem |
| (1-1577) | Spektra a |
| RG-II a | RG-II po 72 |
následovanou chromatografií RG-II úplným rozpustným Penicillium simplicissimum až d odpovídají původnímu hodinách, po 120 hodinách a po 148 hodinách inkubace, obr. 16 je porovnání profilů polysacharidů, určených pomocí
CES-HP červeného vína (spektrum a) a po 48 hodinách inkubace v přítomnosti enzymatického extraktu IPV 1 (spektrum b), obr. 17 je porovnáni CES-HP profilů polysacharidů červeného vína (spektrum a) a po 48 hodinách inkubace v • · · · • · ·· • · ·· • · · · · • ·· je přítomnosti Pectinex® (spektrum b) a extraktem kmene porovnání CES-HP nebo
Ultra Sp spojeného s samotného enzymatickým
IPV1 (spektrum c), profilů polysacharidu jablečného moštu, získaného úplným ztekucenim ovoce enzymatickým přípravkem Rapidase® Liq) hodinách inkubace za absence (spektrum přítomnosti (spektrum b) enzymatického extraktu kmene IPV1,
19A a
19B znázorňuji degradaci tkáně červené
19A) enzymatickým extraktem kmene
IPV1 ve srovnání se srovnávacím vzorkem (obr.
obr. 19C, 20A a 20C představuji degradaci enzymatickým extraktem kmene IPV1 u tkáně mrkve, jablka a brambory ve srovnáni s odpovídajícími srovnávacími vzorky (obr'. 19D, 20B a 20D) .
Příklady provedeni vynálezu
PŘÍKLAD lj ČIŠTĚNÍ RHAMNOGALACTURONANU II
CHROMATOGRAFIÍ ANIONTOVOU VÝMĚNOU A CHROMATOGRAFIí
MOLEKULÁRNÍM VYTŘÍDĚNÍM, VYCHÁZEJÍCE Z VÍNA
RG-II se nachází v nedegradované podobě zejména v šťávě ovoce, zeleniny a v jejich derivátech, zejména fermentovaných. RG-II může být čištěn na homogenitu vycházejíce ze všech odvozených rostlinných produktů za použití následujících etap čištění:
1. Získání makromolekul v jedné etapě buď precipitací v ethanolu 80 % nebo ultrafiltrací.
2. . Preparativní chromatografie aniontovou výměnou při kyselém pH.
3. Chromatografie molekulárního vytřídění (tato poslední etapa dovolující dosáhnout zvýšené úrovně čistoty může být vypuštěna, jestliže je požadována úroveň čistoty 80 % při přípravě RG-II).
1. Vzorek vina a získáni koloidů
Použité víno bylo získáno z odrůdy Carignan noir, sklizené ve stavu zralosti v září 1991 v Domaine Experimentale de Pech-Rouge (Narbonne). 600 litrů bylo koncentrováno na ultrafiltrační membráně Carbo Sep M5 (Těch Sep, Francie) do prahové hodnoty 10.000. Úplné koloidy koncentrovaného vína (výsledný objem 25 1) byly potom precipitovány přidáním 4 dílů ethanolu, okyseleného přidáním 60 mM HC1, promývány postupně v ethanolu 80 % a 90 %, vyjmuty ve vodě a dialysovány na pufru citranu sodného 40 mM při pH 4,6. Sušina úplných koloidů (určená po odsolení a lyofilisaci alikvotní frakce) představovala 296 g, to jest zhruba 0,5 g na jeden litr vína.
2. Chromatografie výměnou aniontů
Koloidní roztok při pH 4,6 byl frakcionován chromatografií výměnou aniontů 10 postupnými průchody kolonou (5. x 80 cm) DEAE-Macroprep (BioRad, USA) vyváženou na 20,5 ml/min v pufru citranu sodném 40 mM při pH 4,6. Neutrální nebo slabě nabité polysacharidy byly vymyty injekčním pufrem (frakce
I) . Frakce obsahující RG-II byly vymyty nejprve koncentračním průchodem citranovým pufrem při 50 mM (frakce
II) a potom adicí 50 mM (frakce III) a 150 mM (frakce IV). NaCl do vymývacího pufru (obr. 3) . Tyto tři frakce
| představovaly 7,9 %, | 6,6 % a 4,1 | % celkových koloidů, |
| vyjádřeno v hmotnosti | sušiny. | |
| 3. Čištění RG-II | do homogenity | sférickou vylučovací |
| chromatografii |
RG-II obsažený ve frakcích II a III byl čištěn do homogenity sférickou vylučovací chromatografií na koloně (5 x 75 cm) Sephacryl S-400 HR vyvážené na 7 ml/min v pufru octanu sodném 50 mM při pH 5 obsahujícím 50 mM NaCl.
Frakce obsahující RG-II byly nakonec dialysovány proti vodě před lyofilisací.
Dva získané vzorky RG-II vykazovaly naprosto homogenní profil při vysokovýkonné sférické vylučovací chromatografii (CES-HP, analýza na dvou kolonách Shodex OHPak KB-803 a KB805 v sérii, vymývání L1NO3 0,1 M při 1 ml/min, refraktometrická detekce) (obr. 4) a representovaly 4,4 % a 4,6 % úplných koloidů vzorku vína. Obsah úplného RG-II vzorku použitého vína byl vyšší než 50 mg/1, protože bylo třeba přidat i RG-II obsažený ve frakci IV, který nebyl čištěn do homogenity.
4. Složeni frakcí čištěného RG-II z vina
Dvě frakce čištěného RG-II vykazovaly obě charakteristické složení RG-II (tabulka I) . Neodlišovaly se . významným způsobem při analýze jejich složení.
Frakce II a III získané na DEAE-Macroprep byly analyzovány na koloně Superdex-75HR (1 x 30 cm, vymývání po 14 min) umožňující molekulární vytřídění. Tato analýza (obr. 5) ukazuje, že frakce II obsahuje majoritně monomery RG-II (vymývání po 20,5 min, molekulární hmotnost 4750 Da) , zatímco frakce III obsahovala více než 95 % dimeru RG-II (vymývání po 18,5 min, molekulární hmotnost 9500 Da).
RG-II frakce II byly použit v následujících pokusech pro vytřídění a indukci specifických enzymatických degradačních účinků.
PŘÍKLAD 2 ZÍSKÁNÍ RG-II ADSORPČNÍ CHROMATOGRAFIí Z VÍNA
ŠPATNÉ KVALITY
Použitím vína špatné kvality bylo získáno destilací ve vakuu a koncentrací 300 hl červeného vína (směs vín více odrůd):
Víno špatné kvality získané destilací bylo koncentrováno odpařením ve vakuu. Vinanové soli byly po dekantaci z tohoto koncentrátu eliminovány a potom bylo víno špatné kvality znovu koncentrováno stejným způsobem. Celkově bylo víno koncentrováno třicetkrát a celkové koloidy ze 1000 1 získaného koncentrovaného vína špatné kvality byly precipitovány přidáním 4 objemů ethanolu 90 %. Precipitát byl vyjmut v 300 1 vody, čímž byl získán roztok vína špatné kvality, používaný jako zdroj RG-II.
Adsorpční chromatografie
Produkty chromatografické separace byly získány pomocí CLHP na kolonách Shodex (viz příklad 1 nebo na koloně Superdex HR 75 (Pharmacia, výtěžek 0,6 ml/min) spojených se systémem refraktometrické detekce.
(a) Na aktivním uhlí
Aktivní uhlí vykazuje silnou adsorpční kapacitu vzhledem k množství molekul. Podle předkládaného vynálezu je aktivní uhlí použito pro svou schopnost oddělovat RG-II od různých • · ···· · · · · ·· · • · · · · ···· • ····· · · · ··· · • · · · · · · ·· ·· ··· ···· ·· · druhů pektických polysacharidů. Všechny polysacharidy jsou ve skutečnosti adsorbovány aktivním uhlím, ale RG-II je uvolňován při koncentracích alkoholu nižších než 40 %. Byly zkoušeny dva typy aktivního uhlí.
Práškové aktivní uhlí
Jeden litr pětkrát zředěného roztoku vína špatné kvality byl přiveden do kontaktu s 100 gramy práškového aktivního uhlí (Nořit® SA+) po dobu 30 minut. Potom byl roztok filtrován, aby byly eliminovány částečky uhlíku. Uhlík zbylý na filtru byl suspendován v 1 litru ethanolu 40 % a směs byla pravidelně míchána po 30 minut a potom filtrována ve vakuu. Vymytý RG-II byl potom analyzován pomocí CLHP. Analýza složení této frakce (tabulka 2) ukazuje, že stupeň čistoty RG-II je okolo 50 %.
Extrudované aktivní uhlí
Tento typ aktivního uhlí vyžaduje pro adsorbci RG-II daleko vyšší kontaktní dobu (48 hodin) s roztokem vína špatné kvality, ale jeho výhodou je usnadnění etapy filtrace. Na druhé straně potřebná hmotnost uhlíku je dvakrát větší ve srovnání s práškovým uhlím.
Jeden litr pětkrát zředěného roztoku vína špatné kvality, byl přiveden do kontaktu s 200 gramy extrudovaného aktivního uhlí (Nořit® RO-08 Supra) po dobu 48 hodin. Po . eliminaci neadsorbované frakce byla frakce obsahující RG-II desorbována umístěním do roztoku ethanolu 40 % na dobu 24 hodin. Získaný RG-II vykazoval stejný stupeň čistoty jako RG-II získaný za použití práškového uhlí.
(b) Na smíšené pryskyřici polystyren-divinylbenzenu (Résine. Relite® DIAION® SP411) • ·
DIAION® SP411 je polystyrenu
RG-II na syntetická nepolární a divinylbenzenu. úkor dalších extraktech. Tyto
Pryskyřice Relite® pryskyřice tvořená Tato pryskyřice polysacharidů, jsou tedy separovány na na pryskyřici Relite® obsahuje polysacharidy která obsahuje RG-II.
kopolymery zadržuj e přítomných v dvě frakce adsorpční chromatografií frakce,
DIAION® SP411:
různé od RG-II nezadržená a zadržená frakce,
Čištěni RG-II základní úrovni
Schéma čištění RG-II základní úrovni z vína špatné kvality je znázorněno na obr. 6. 250 litrů pětkrát zředěného roztoku vína špatné kvality (2,5 objemů kolony) bylo rychle odbarveno filtrací na aktivním uhlí Nořit® RO-08 Supra a potom procházelo kolonou 90 litrů Relite® DIAION® SP411 při výtěžku 40 1/hod (kontaktní doba 2 hodiny pro adsorpci RG-II na tomto chromatografickém nosiči). Kolona byla promývána 100 litry vody. Nezadržená frakce je tedy představována promývací tekutinou. Vymývání RG-II bylo dosaženo průchodem 100 litrů ethanolu 20 % následovaným promýváním kolony 200 litry vody.
Takto získaný RG-II (1 kg přípravku z celého objemu vína špatné kvality) vykazoval stupeň čistoty blízký 60 % (tabulka 2). RG-II byl precipitován přidáním ethanolu (koncová koncentrace 40 % ethanolu). Takto získaný precipitát obsahuje RG-II se stupněm čistoty 90 %.
PŘÍKLAD 3 ZÍSKÁNÍ RG-II ADSORPČNÍ CHROMATOGRAFIí Z VÍNA
Víno (červené víno réva Merlot 94, bílé víno Chardonnay 94) bylo dealkoholisováno a koncentrováno dvakrát odpařením ve.
vakuu na rotačním odpařovacim zařízení.
• ·
Dvě frakce 15 ml byly nality na 50 ml Relite® DIAION® SP411 při 25 ml/hod. Potom byla kolona promývána 50 ml vody. RG-II pak byl vymyt 50 ml ethanolu 20 % a kolona byla promývána 100 ml vody. Analýza CLHP (obr. 7) ukazuje, že RG-II je kvantitativně adsorbován na pryskyřici, neboť není přítomen ve frakci, nezadržené na pryskyřici a že je kvantitativně získán promytím ethanolem 20 %. Stupeň čistoty roztoku RG-II je blízké 50 % u červeného vína (tabulka 2) a 35 % u bílého vina.
PŘÍKLAD 4 ZÍSKÁNÍ RG-II ADSORPČNÍ CHROMATOGRAFI! Z MOŠTU VINNÝCH HROZNU
Amberlite® XAD 2 je nepolární pryskyřice, která je kopolymerem polystyrenu a divinylbenzenu. 100 ml moštu bílých vinných hroznů získaných rozdrcením bobulí révy Grenache byly injektovány do kolony 100 ml pryskyřice XAD 2 vyvážená ve vodě. RG-II byl vymyt jedním objemem methanolu 60 % a stupeň čistoty byl zhruba 40 %. Výsledky analýzy vymyté složky jsou uvedeny v tabulce 2.
PŘÍKLAD 5 ZÍSKÁNÍ RG-II ADSORPČNÍ CHROMATOGRAFIí Z OVOCNÉ ŠŤÁVY A ZE ZELENINY
Rozpustné extrakty byly získány z 0,6 kg oloupaných a nastrouhaných jablek, rajských jablek a mrkve v 200 ml kyseliny askorbové (výsledná koncentrace 3 mM),. Použitá šťáva ovoce a zeleniny byla získána enzymatickým ztekucením spojeným působením komerčních enzymatických přípravků (Pectinex® Ultra SPL, Novo Ferment a Rapidase® Liq, GistBrocades) po dobu 24 hodin při 45°C. Reakce zkapalňování byla přerušena denaturací enzymů působením tepla. Pevná residua byla eliminována centrifugací a supernatant byl. použit jako zdroj RG-II.
Čištění RG-II ovoce a zeleniny po enzymatickém ztekucení
Šťávy ovoce a zeleniny, získané enzymatickým ztekucením byly filtrovány filtračním papírem před průchodem kolonou (2,5 x 30 cm) vyváženou vodou, obsahující 50 ml Relite® DIAION® SP411 při 25 ml/hod. Kolona byla promývána 50 ml vody, následovalo vymývání RG-II 50 ml ethanolu 20 % a promývání kolony 100 ml vody.
Tímto způsobem získané RG-II vykazovaly stupeň čistoty vyšší než 80 %.
Výsledky jejich analýzy jsou podány v tabulce 2.
PŘÍKLAD 6 SELEKCE MIKROORGANISMU DEGRADUJÍCÍCH RG-II V
MONOMERNÍ FORMĚ
RG-II je universální složkou buněčných stěn rostlin a jeho degradace v biosféře je zaručována mikroorganismy přirozených ekosystémů: půdy, kompostů, kalech čisticích stanic ...
Vycházejíce z přírodních vzorků byly isolovány dva kmeny hub, náležejících dvěma druhům Penicillium, které používají RG-II jako jediný zdroj uhlíku a energie.
1. Kultivační prostředí
Kultivační prostředí použité pro selekci mikroorganismů, používajících RG-II jako zdroj uhlíku a energie bylo vytvořeno způsobem, který vyplývá z tabulky 3. Jedná se o minerální kultivační prostředí, do kterého byl přidán roztok monomerického RG-II ve výsledné koncentraci od 2 mg/1 do 10. mg/ml. Kultury obsahující houby byly zbaveny kontaminujících — 93 — ·· ·· · ·· ·· ···· ···· ······ · ···· · ···· • ····· · · · ···· • · · · · · · ·· ·· ··· ···· ·· · bakterií přidáním tří antibiotik do kultivačního prostředí: penicilín G, streptomycin a tetracyklin.
2. Selekce mikroorganismů užívajících RG-II jako zdroje uhlíku a energie
Vzorky byly odebrány z různých přírodních ekosystémů (zemědělská nebo lesní půda, rašeliny, komposty, kaly z čisticích stanic, ovoce ve stavu dekompozice . ..) a vloženy do kultury při 25°C až 37°C v minerálním kultivačním prostředí upraveném na obsah 10 mg/ml monomerického RG-II. Pokaždé, když byl pozorován růst mikroorganismů, kultury byly přeočkovány vícenásobně na témž prostředí. Tento postup dovolil isolovat nejdříve více kultur, zaručujících jejich růst na prostředí s RG-II. Degradace RG-II v prostředí byla současně kontrolována vysokovýkonnou sterickou vylučovací chromatografií a byly ponechány pouze kultury, v nichž bylo pozorováno, že současně s růstem mikroorganismů dochází k degradaci RG-II.
Mikroorganismy zaručující degradaci RG-II byly isolovány po rozdělení kultur v Petriho miskách v gelovém prostředí, získaném přidáním agarosy 2 % do kultivačního prostředí (tabulka 3) a obsahujícím 2,5 mg/ml monomerického RG-II. Po jednom týdnu inkubace při 25 °C byly klony odebrány a naočkovány do tekutého kultivačního prostředí, aby bylo možno ověřit jejich schopnost degradace RG-II.
3. Volba kmenů degradujících RG-II
Nakonec byly získány dva kmeny vláknitých hub, neboť vykazovaly požadované vlastnosti:
1. Rychlý růst perfektně korelovaný s ubýváním RG-II v prostředí.
2. Úbytek množství RG-II byl pozorován souběžně s posunem jeho vymývacího objemu při HP-SEC, což indikuje přítomnost enzymatického účinku degradace typu endo-hydrolasy.
3. Výsledné úroveň degradace RG-II dosáhla 70 % po jenom týdnu kultivace při 25°C.
Tyto dvě kultury, označené jako E a K byly následně použity pro produkci enzymů degradujících RG-II a zkoumání způsobů enzymatického působení. Byly kultivovány bez míchání za kontaktu se vzduchem při 25 °C v tekutém kultivačním prostředí obsahujícícm 5 mg/ml RG-II a v přítomnosti tří antibiotik: penicilinu G, streptomycinu a tetracyklinu.
PŘÍKLAD 7 PRODUKCE ENZYMU DEGRADUJÍCÍCH RG-II
Různé druhy Penicillium jsou známy pro jejich schopnost produkovat a rozšiřovat v kultivačním prostředí enzymy degradace polysacharidů. Byla ověřena schopnost dvou isolovaných kmenů produkovat enzymy degradace RG-II.
1. Výzkum enzymů degradace RG-II v supernatantu kultury:
Kmeny P. daleae LaV2 (deponovaný u CNCM jako N° 1-1578) a P.' simplicissimum IPV1 (deponovaný u CNCM jako N° 1-1577) byly kultivovány při 25°C v kultivačním prostředí, obsahujícím
2,5 mg/ml monomerického RG-II. Po 96 hodinách kultivace byl odebrán 1 ml kultury, obsahující rostoucí mycelium, sterilně filtrován na filtru 0,22 μιη a pak bylo přidáno 2 mg/ml původního RG-II. Prostředí obsahující enzymy degradace a RGII bylo ponecháno k inkubaci při 25°C a po 0,20 a 45 hodinách byly odebrány frakce 25 μΐ a analyzovány pomocí CES-HP. Porovnání mezi dvěma profily vymývání RG-II v různých dobách inkubace jasně prokázaly absenci účinku degradace RG-II v kultivačním prostředí. Tyto účinky byly • · · · · ·· ···«·· • » · · ···· · · · • · · · · · · · · • ····· · · · ··· · • · · · · · · ·· ·· ··· ···· ·· · proto hledány v cytoplasmě a periplasmě hub.
2. Produkce enzymů degradace RG-II v úplných buněčných extraktech hub:
Výše uvedené kmeny P. daleae LaV2 a P. simplicissimum IPV1 byly kultivovány při 25°C v 4 ml kultivačního prostředí, obsahujícího 6 mg/ml monomerického RG-II. Po 140 hodinách kultivace bylo mycelium odebráno centrifugací, po které následovalo drcení (se skleněnými kuličkami) při 4°C po dobu 4 minut v pufru MES (kyselina morfolino-ethan-sulfonová)/KOH 50 mM nastaveném na pH 6 s přidáním 1 mM PMSF (fenylmethylsulfonyl fluorid) a 1 mM DTT (dithiothreitol) . Buněčný supernatant byl získán centrifugací při 10000 g x 5 minut.
Přítomnost enzymů degradace RG-II v rozpustném buněčném extraktu byla testována přidáním původního RG-II v koncentraci 2,5 mg/ml do supernatantu po rozdrcení a centrifugací, inkubací při 25°C následovanou chromatografii CES-HP degradace RG-II. Analýza profilů v okamžicích 24 hodin a 48 hodin ve srovnáni s původním RG-II (obr. 8 a obr. 9) ukazuje silnou degradaci (50 %) RG-II po 24 hodinách, která pokračuje až do 48 hodin a dává 40 % residuální ch' molekul.
Enzymatické účinky, zaručující degradaci RG-II jsou tedy přítomny v rozpustném buněčném extraktu a mohou tedy být získány po rozdrcení hub. Dva isolované kmeny Penicillium tedy produkují enzymy degradace rhamnogalacturonanu II.
PŘÍKLAD 8 CHARAKTERIZACE DEGRADAČNÍCH ÚČINKU NA RG-II
Dva isolované a identifikované kmeny Penicillium produkují enzymy, které degradují RG-II v kultivačním prostředí..
Způsob působení těchto enzymů byl nejprve zkoumán sledováním ···· • ·· • ·· • · 4·· •· ··Φ· ··· • ·
·· degradace polysacharidů v kultivačním prostředí souběžně s růstem mikroorganismů. Nevýhodou tohoto přístupu je, že dovoluje sledovat pouze frakci RG-II, která není asimilována houbou, nicméně dovoluje si uvědomit k jakým účinkům dochází a jaký je jejich způsob působení.
1. Provedeni kinetiky degradace RG-II pomocí Penicilliuin simplicissimum
Kmen P. simplicissimum IPV1 byl kultivován v Erlenmeyerově baňce při 25 °C v 10 ml kultivačního prostředí s 5 mg/ml monomerického RG-II. V okamžicích 0, 96, 132, 168 a 192 hodin byly odebrány frakce 1 ml. pH kultivačního prostředí bylo potom upraveno na 5 přidáním 20 μΐ HC1 1M. Nové odebírání bylo provedeno po 360 hodinách a kultura byla nakonec zastavena po 400 hodinách inkubace. Každý vzorek byl analyzován pomocí CES-HP (obr. 10), což dovolilo sledovat degradaci v průběhu růstu hub. Různé odebrané frakce byly odsoleny na koloně (1 x 50 cm) Bio-Gel P-6, vyvážené pufrem octanem sodným 100 mM na pH 4.
Po každé inkubační době byla provedena úplná strukturální analýza frakce RG-II v procesu degradace. Tato analýza zahrnovala:
- Kvantifikativní určení poměru degradace RG-II.
- Určení složení vzhledem k neutrálním glycidům a uronovým kyselinám.
- Určení typu vazeb mezi residuy, vytvářejícími molekulu.
- Určení délky homo-galacturonického řetězce.
Soubor těchto analýz dovolil určit stav molekuly RG-II po každý odebraný vzorek a tedy sledovat jeho degradaci v závislosti na čase. Tyto výsledky ukazují, že docházelo k enzymatické degradaci molekuly v průběhu času.
• e
2. Provedeni kinetiky degradace RG-II pomocí Penicillium daleae
Pro sledování degradace RG-II kmenem P. daleae LaV2 bylo nejprve 500 mg monomerického RG-II nejprve zmýdelněno (2 hodiny při 4°C v NaOH 50 mM) , poté redukováno (6 hodin při 4°C v přítomnosti 2,5 g NaBH4) , aby byla označena extrémní redukční schopnost molekuly. Kmen P. daleae LaV2 byl kultivován v Erlenmeyerově baňce při 25 °C v 6 ml kultivačního prostředí s 5 mg/ml zmýdelněného a redukovaného RG-II. V okamžicích 0, 72, 120, 168, 240, 264, 336 a 384 hodin byly odebrány frakce 0,6 ml. Každý vzorek byl analyzován pomocí CES-HP (obr. degradaci v průběhu růstu hub. odsoleny na koloně (1 x 30 cm)
11), což dovolilo sledovat Různé odebrané frakce byly Superdex-75 HR vyvážené při
0,6 ml/min pufrem mravenčanem amonným 30 mM na pH 5,2.
Po každé inkubačni době byla provedena úplná strukturální analýza frakce RG-II v procesu degradace. Tato analýza zahrnovala:
- Kvantifikativní určeni poměru degradace RG-II.
- Určení složení vzhledem k neutrálním glycidům a uronovým kyselinám ve formě trimethylsilylovaných derivátů po methanolýze.
- Určení typu vazeb mezi residuy, vytvářejícími molekulu analýzou methylace zahrnující redukci uronových kyselin lithium triethylborodeuteridem (Pellerin a kol., 1995 Carbohydr. Res. 277, str. 135-143).
- Určení délky homo-galakturonického řetězce.
Soubor těchto analýz dovolil určit stav molekuly RG-II po každý odebraný vzorek a tedy sledovat jeho degradaci v závislosti na čase. Tyto výsledky ukazují, že docházelo k
3. Mechanismus degradace RG-II
Analýza složeni (tabulky 4 a 5) a typů vazeb pro každé residuum, nacházející se v molekule (tabulky 6 a 7( dovoluje sledovat stav residuální molekuly RG-II v průběhu času. Vyplývá z ní, že RG-II je v případě použití dvou kmenů Penicillium sérií enzymů, které působí sekvenčním způsobem:
a) První etapa degradace spočívá v přerušení vazeb mezi residuem trojnásobně substituované β-L-rhamnosy a residuy aL-fukosy a β-D-apiosy, což vede ke ztrátě řetězce A (obr. 12), který je asimilován houbou. Tato etapa se odehrává v průběhu prvního dne kultivace souběžně se slabým zkrácením homo-galakturonického řetězce, který se mění v průměru z 8-9 residuí na 7 residuí a s částečnou ztrátou koncových residuí arabinofuranosy (B7 a D2) a rhamnopyranosy (Č2).
b) Úplná eliminace residuí A2 až A5 v řetězci A neseném residuem β-D-apiosy se zdá zvyšovat odolnost molekuly RG-II vůči enzymatické degradaci, neboť je pozorována druhá fáze degradace, která se vyznačuje:
- Silným zkrácením homo-galaktoronického řetězce, který se zmenší na v průměru 4 residua kyseliny galakturonové.
- Ztrátou residua Al.
Modifikacemi týkajícími se neredukujícího ’ zakončení řetězce B, stále vázaného ke homo-galakturonickému řetězci prostřednictvím β-D-apiosy, jmenovitě kvantitativní ztrátou koncového arabinofuranosového residua a ztrátou residuí a-Lrhamnosy (residua B6 a B7).
Residua Kdo a Dha se zdají být částečně ovlivněny enzymatickou degradací.
Všechny pozorované degradace v průběhu této druhé fáze mohou být získány pomocí známých enzymů: β-D-apiosidasy, β-Larabinosidasy, oc-L-rhamnosidasy, endo- nebo exopolygalakturonasy.
Residuální molekula na konci růstu hub odpovídá kvantitativně řetězci B (residua Bx až B5) , residuím Kdo (Cl) a Dha (Dl) neseným kyselým oligosacharidem středního stupně polymerace 4 a představuje 20 až 30 % původní molekuly RG-II (obr. 13).
První etapa, ve které dochází ke dvěma enzymatickým účinkům typu endo- je tedy klíčová etapa, která dovoluje degradaci molekuly RG-II. Kvantitativní uvolnění řetězce A činí ve skutečnosti molekulu citlivou na působení enzymů se známými způsoby působení, které jsou často nalézány v komerčních enzymatických přípravcích.
Produkce enzymů s účinkem typu endo- β-L-rhamnopyranosyl(1—»3')-D-apiofuranosyl hydrolasy (1) a endo- a-Lfukopyranosyl-(1—>4)-L-rhamnopyranosyl hydrolasy (2) kmenem P. daleae LaV2 a P. simplicissimum IPV1 je tedy rozhodující etapa, která houbám dovoluje zajistit si. svůj růst použitím
RG-II. Je to tedy použití těchto rhamnopyranosyl- (l-»3')-D-apiofuranosyl enzymů endo- β-Lhydrolasy a endo- aL-fukopyranosyl-(1—>4) -L-rhamnopyranosyl dovoluje zesílenou enzymatickou degradaci účinku (1) je silnější, neboť řetězec B hydrolytickým účinkem, zatímco je galakturonickému řetězci prostřednictvím apiosidové vazby stejného typu. Tento rozdíl řetězci hydrolasy, které
RG-II. Specificita není ovlivněn jeho vázán k homorhamnosylv chování účinku (1) vzhledem k řetězcům A a B může být vysvětlen:
• · · ί ······· ·· *
- buď rozdílem mezi substituenty rhamnosy: jeden řetězec vázaný v C3 v případě B, jeden řetězec vázaný v C4 a dva monosacharidy vázané v C2 a C3 v případě A, nebo rozdílnou lokalizací těchto dvou řetězců uvnitř molekuly RG-II.
Přítomnost jednoho nebo druhého z těchto účinků v enzymatickém přípravku dovoluje uvolnění řetězce A RG-II a řeší tedy problém nedegradovatelnosti RG-II obvyklými enzymy z pektinolytických přípravků. Ostatní enzymy, dovolující ještě více zesílenou degradaci RG-II totiž zasahují až po oddělení řetězce A účinkem výše jmenovaných enzymů. V této druhé etapě degradace zasahují enzymy s účinky:
- β-D-apiosidasy,
- cc-L-arabinosidasy,
- oc-L-rhamnosidasy,
- endo-polygalakturonasy,
- exo-polygalakturonasy.
PŘÍKLAD 9 ZÍSKÁNÍ PŘÍPRAVKU DIMERICKÉHO RG-II A DEGRADACE POMOCÍ Penicillium daleae:
Kmen P. daleae byl kultivován v prostředí obsahujícím 5 mg/ml přípravku RG-II, získaného průchodem koncentrátů vina špatné kvality přes pryskyřici Relite® DIAION® (příklad 2) . Tento přípravek obsahoval zhruba 60 % RG-II, který se nachází v dimerické podobě, jak ukazuje analýza na koloně Superdex-75 HR. Sledování kultivačního prostředí houby chromatografií CLHP (obr. 14) ukazuje silnou degradaci RG-
II. Nečistoty o nej vyšší molekulární hmotnosti (hlavně mannany, přítomné v koncentrátu vína špatné kvality) nejsou degradovány.
Kmeny Penicillium isolované na monomerickém RG-II tedy vykazují schopnost degradovat RG-II ve formě dimeru. Enzymy, které představuji předmět vynálezu, jsou tedy účinné na obě formy molekuly.
PŘÍKLAD 10 ZÍSKÁNÍ ENZYMATICKÉHO PŘÍPRAVKU DEGRADUJÍCÍHO RGII
Enzymatický přípravek obsahující účinek degradace RG-II, speciálně účinky endo- β-L-rhamnopyranosyl-(1—»3') -Dapiofuranosyl hydrolasy a endo- α-L- fukopyranosyl-(1—>4)-Lrhamnopyranosyl hydrolasy, byl získán z kultury P. simplicissimum IPV1 získané následujícím způsobem:
120 ml kultivačního prostředí, obsahujícího 6 mg/ml čištěného RG-II bylo rozmístěno do 8 Petriho misek. Kmen P. simplicissimum IPV1 byl kultivován při 25 °C po dobu 6 dní. Mycelium (v čerstvém stavu 1,2 g) bylo potom získáno centrifugací následovanou rozdrcením, jak bylo popsáno výše (příklad 3) v pufru MES/KOH 50 mM nastaveném na pH 6, obsahujícím 1 mM PMSF a DTT. Celkový enzymatický extrakt (6 ml) byl nakonec získán centrifugací a použit v následujících příkladech.
PŘÍKLAD 11 DEGRADACE ČIŠTĚNÉHO RG-II ENZYMATICKÝM EXTRAKTEM P. simplicissimum IPV1:
Následující směs byla ponechána na inkubaci při teplotě 25°C v přítomnosti 0,02 % NaN3:
- 500 μΐ pufru octanu sodného 50 mM, pH 4,8,
- 12,5 μΐ roztoku čištěného RG-II (tabulka 1, frakce II) 200 ml/ml,
- 25 μΐ úplného enzymatického extraktu P. simplicissimum • ·
IPV1 získaného podle příkladu 5.
Odebírání 25 μΐ byla prováděna po 0, 72, 120 a 148 hodinách a vzorky byly analyzovány pomocí CES-HP. Přítomnost enzymů s účinkem endo- β-L-rhamnopyranosyl-(1—»3')-D-apiofuranosyl hydrolasy nebo endo-a-L-fukopyranosyl-(1—>4)-Lrhamnopyranosyl hydrolasy byla potvrzena degradací RG-II (obr. 15). Degradační profil je ostatně srovnatelný s profilem, získaným sledováním supernatantu kultury P. simplicissimum (obr. 10). Produkty degradace molekuly RG-II se objevují ve frakcionační oblasti nízkých molekulových hmotností (obr. 15).
PŘÍKLAD 12 DEGRADACE POLYSACHARIDU VÍNA ENZYMATICKÝM EXTRAKTEM P. simplicissimum IPV1:
Úplný enzymatický extrakt, obsahující enzymy degradace RGII, speciálně účinky typu endo- β-L-rhamnopyranosyl-(1—»3')D-apiofuranosyl hydrolasy nebo endo- α-L- fukopyranosyl(1—>4)-L-rhamnopyranosyl hydrolasy byl zkoumán na svoji schopnost degradovat RG-II, přítomný ve víně.
Úplné polysacharidy červeného vína (réva Carignan noir) byly získány ultrafiltrací vína (2 ml) na membráně Centrikon 30 (Amicon, USA) . Filtrát (100 μΐ) byl vyjmut 1,9 ml pufru octanu 50 mM pH 4,8. Následující vzorky byly ponechány na inkubaci při 25°C v přítomnosti 0,02 % NaN3:
a: 200 μΐ filtrátu obsahujícího úplné polysacharidy vína, μΐ vody, μΐ pufru MES drcení b: 200 μΐ filtrátu obsahujícího úplné polysacharidy vína, μΐ vody, μΐ úplného enzymatického extraktu P. simplicissimum
IPV1, získaného podle přikladu 9,
C: 200 μΐ filtrátu obsahujícího úplné polysacharidy vína, μί Pectinex® Ultra Sp-L (Novo Ferment, Švýcarsko), μΐ pufru MES drcení, d: 200 μΐ filtrátu obsahujícího úplné polysacharidy vína, μΐ Pectinex® Ultra Sp-L, μΐ úplného enzymatického extraktu P. simplicissimum IPV1, získaného podle příkladu 9,
Po 48 hodinách bylo odebráno 25 μΐ každého vzorku a analyzováno pomocí chromatografie CES-HP. Z analýzy výsledků (obr. 16 a 17) vychází:
- Degradace RG-II vína (charakteristický vrchol, vymývání po 18,2 minutách) enzymatickým extraktem P. simplicissimum IPV1 (obr. 16) .
Degradace dalších polysacharidů vína (mannoproteinů, arabinanů a arabinogalaktananů) komerčním enzymatickým přípravkem Pectinex® Ultra Sp-L, zatímco charakteristický vrchol RG-II zůstává neporušen (obr. 17).
Komplementární účinek dvou enzymatických přípravků byl potvrzen (obr. 17) degradací souboru polysacharidů vína ve vzorku c.
Úplný enzymatický extrakt P. simplicissimum IPV1 obsahující enzymy typu endo- β-L-rhamnopyranosyl-(1—>3 ')-D-api‘ofuranosyl hydrolasy nebo endo- α-L- fukopyranosyl-(1—»4)-Lrhamnopyranosyl hydrolasy tedy obsahuje enzymatické účinky, které chybějí v komerčních enzymatických přípravcích vyráběných z Aspergillus aculeatus a je bohatý na účinky celulolytické, hemicelulasické a pektinolytické, speciálně účinek rhamnogalakturonasy (Schols a kol., 1990, Carbohydr.
• ·
Res., 206, str. 105-115).
Přidání enzymů podle předkládaného vynálezu spolu s dalšímu pektinolytickými účinky vede na zesílenou degradaci polysacharidů vína a dovoluje tedy zlepšení filtrovatelnosti a zabraňuje vytváření problémů s koloidy a precipitáty.
PŘÍKLAD 13 DEGRADACE POLYSACHARIDŮ JABLEČNÉHO MOŠTU ENZYMATICKÝM EXTRAKTEM P. simplicissimum IPV1:
Ovocná šťáva z jablka byla připravena z 1 kg jablek (odrůda Starking): celá jablka byla rozsekána na plátky o tloušťce 1 cm, byl přidán 1 g kyseliny askorbové a 500 μΐ enzymatického přípravku Rapidase® Liq (Gist Brocades, Francie) a ponechány 2 hodiny za míchání při 50°C. Ovoce potom bylo ztekuceno působením komerčního enzymatického přípravku a šťáva je nakonec získána centrifugací. Přípravek Rapidase® Liq obsahuje zvýšené množství účinků typu pektinasy (pektin, lyasa, endo- a exo-polygalakturonasa, rhamnogalakturonasa, arabanasa, ...), hemicelulasy (galaktanasy, xylanasy, .. . ) a celulasy.
1,5 ml čiré jablečné šťávy bylo ultrafiltrováno na membráně Centricon 30 (Amicon, USA) .. Filtrát (100 μΐ) byl vyjmut 1,4 ml pufru octanu 50 mM pH 4,8 a následující vzorky byly ponechány k inkubaci při 25°C v přítomnosti 0,02 % NaN3:
a: 200 μΐ filtrátu obsahujícího úplné polysacharidy jablečné šťávy, μΐ vody, b: 200 μΐ filtrátu obsahujícího úplné polysacharidy jablečné šťávy, μΐ úplného enzymatického extraktu P. simplicissimum
IPV1 .
Po 48 hodinách bylo z každého vzorku odebráno 25 μΐ k provedeni analýzy chromatografií CES-HP.
Analýza výsledků (obr. 18) ukazuje komplementární účinek enzymů degradace RG-II, neboť přidání enzymatického extraktu
P. simplicissimum IPV1 dovoluje zesílenou degradaci residuálních polysacharidů po zpracování jablek přípravkem Rapidase® Liq. Speciálně charakteristický vrchol RG-II (vymývání po 18,2 min) je podroben silné degradaci. Navíc degradace struktur o nejvyšších molekulárních hmotnostech, odolných na účinek enzymů, přítomných v Rapidase® Liq naznačuje, že tyto frakce také obsahují fragmenty RG-II.
Úplný enzymatický extrakt P. simplicissimum IPV1, ve kterém byly prokázány účinky typu endo- β-L-rhamnopyranosyl-(1—>3 ' ) D-apiofuranosyl hydrolasy nebo endo- α-L- fukopyranosyl(1—>4)-L-rhamnopyranosyl hydrolasy, obsahuje tedy enzymatické účinky, které nejsou přítomny v komerčních enzymatických přípravcích vyráběných z Aspergillus niger a popsaných jako přípravky, mající soubor známých celulolytických, hemicelulasických a pektinolytických účinků (v to počítaje účinky rhamnogalakturonasy). Komplementární a doplňující účinek enzymů degradace RG-II je tedy tímto pokusem dostatečně prokázán.
PŘÍKLAD 14 MACERACE OVOCE A ZELENINY ENZYMATICKÝM EXTRAKTEM
P. simplicissimum IPV1:
Účinek disociace rostlinných tkání u úplného enzymatického extraktu P. simplicissimum IPV1 byl prokázán na následujícím ovoci a zelenině:
• · • · · t · · · · · • ····· · « · ··· · • 9 · · · · · • · α · ······· · · ·
- červená řepa,
- mrkev,
- brambory „Bintge
- jablka Golden.
Fragmenty o rozměrech 158 x 4 x 2 mm každého ovoce nebo zeleniny byly umístěny v 2 ml pufru octanu 50 mM pH 4,8 a k nim bylo přidáno:
- 200 μΐ pufru MES drcení pro srovnávací pokusy,
- 200 μΐ úplného enzymatického extraktu P. simplicissimum IPV1 pro enzymatické pokusy.
Různé vzorky byly umístěny k inkubaci při 25°C v přítomnosti NaN3 po dobu 72 hodin a potom byly intenzivně míchány vírem (2 x 10 vteřin) a fotografovány. Z analýzy výsledků vyplynulo:
- Téměř úplná rozpad tkáně u červené řepy a mrkve (obr. 19).
Maceračni účinek, doprovázený objevením se buněk v suspensi u brambor a jablek (obr. 20).
Úplný enzymatický extrakt extraktu P. simplicissimum IPV1 obsahující účinky typu endo-p-L-rhamnopyranosyl-(1—>3' )-Dapiofuranosyl hydrolasy nebo endo-a-L- fukopyranosyl(1—»4)-L-rhamnopyranosyl hydrolasy má tedy schopnost disociace rostlinných tkání.
Průmyslová využitelnost
Enzymatický účinek degradace RG-II může tedy být použit buď jako takový a nebo v kombinaci s dalšími enzymy v tekuté fázi a nebo na pevných nosičích a dovoluje:
- degradaci zvýšeného stupně, například na 70 %, RG-II ve šťávách ovoce, zeleniny a jejich derivátech, čímž se dosáhne lepší filtrovatelnosti, usnadní se příprava koncentrátů šťáv a usnadňují se fenomény čištění a zajišťuje se dobrá stabilita výsledných produktů,
- čištění nosičů mikro- a ultrafiltrace, používaných při filtraci šťáv ovoce, zeleniny a jejich derivátů.
Tyto enzymatické účinky usnadňují degradaci buněčných stěn rostlin a jsou tedy použitelné buď samy o sobě a nebo v kombinaci s ostatními enzymy ve všech aplikacích, které vyžadují maceraci, ztekucení nebo úplnou nebo částečnou hydrolýzu rostlinných tkání, obzvláště:
v přípravě produktů typu maceras, jako jsou ovocné nektary, pyré, želé a ovocné a zeleninové koncentráty a jejich deriváty, v to počítaje i víno,
- v přípravě šťáv a aromatických bází ovoce, zeleniny a jejich derivátů ztekucováním, v to počítaje i víno a přípravu piva,
- ve výrobě pektinů vycházejíce z rostlinných residuí jako jsou bulvy červené řepy, z pevných residuí po lisování ovoce a podobně,
- ve výrobě potravy pro zvířata z rostlinných materiálů ve výrobě celulózy z rostlin pro textilní průmysl (obzvláště s bavlnou jako výchozím materiálem) a ve výrobě papíru, ve výrobě oligosacharidů s elicitickým účinkem vyvolávajícím obrannou reakci rostlin, přičemž tyto oligosacharidy mohou být použity jako fytosanitární produkty.
Zastupuj e:
Dr. Miloš Všetečka v.r.
JUDr. Miloš Všetečka advokát 120 00 Praha 2, Hálkova 2
TABULKA I
Složeni dvou frakcí RG-II isolovaných z vina
Frakce II
Frakce III
| Stav molekuly | monomer | dimer |
| Proteiny® | 0,6 | 0,6 |
| Uronové kyseliny® | 36, 9 | 39 |
| Neutrální cukry® | 27,3 | 24, 9 |
| Methanol® | 1,4 | 1,3 |
| Kyselina octová3 | 1,6 | 1,8 |
| Rhamnosab | 31,8 | 35,4 |
| 2-O-CH3~f ukosab | 6,3 | 6,5 |
| Fukosab | 3,7 | 5,2 |
| 2-0-CH3-xylosab | 4,8 | 4,8 |
| Apiosab | 7,4 | 7,5 |
| Arabinosab | 25 | 23,7 |
| Galaktosab | 19,1 | 15, 8 |
| Kyselina acerováb | 1,2 | 2,2 |
| Kyselina galakturonováb | 38,2 | 37,2 |
| Kyselina glukuronováb | 3,3 | 3,4 |
| Kdob | 4,4 | 5 |
| Dhab | 2, 6 | '2,5 |
a %sušiny b%molárních
Kultivační prostředí vláknitých hub
JUDr. Miloš Všetečka advokát
120 00 Praha 2, Hálkova 2
TABULKA 3
Minerální prostředí
NH4NO3 2 g/1 k2hpo4 1 g/1
| MgSO4, 7 H2O KC1 Síran železitý Hellerův roztok | 0,5 g/1 |
| 0,5 g/1 | |
| 10 mg/1 | |
| ZnSO4 | 1 g/1 |
| MnSO4, H2O | 0,1 g/1 |
| CuSO4, 5 H20 | 0,03 g/1 |
| A1C12 | 0,03 g/1 |
| NíC12, 6 H2O | 0.03 g/1 |
| KJ | 0,01 g/1 |
| Kys. boritá Vitaminový roztok | 1 g/1 |
| Vit Bl | 0,08 g/1 |
| Vit H | 0,08 g/1 |
Provedení kultivačního prostředí
| minerální prostředí | 1 | ml |
| Hellerův roztok | 1 | μι |
| Vitaminový roztok | 1 | μι |
| Streptomycin (50 mg/ml) | 2 | μι |
| Tetracyklin (5 mg/ml) | 2 | μΐ |
| Penicilín (10000 J/ml) | 10 μΐ | |
| Polysacharid | 5 | mg/ml |
| Kultura realizována při teplotě | o | kolí (25°C), |
Tabulka 4 Složeni (v % výchozí sušiny) RG-II v průběhu kinetiky degradace pomocí
P. simplicissimum
| x: o O | 10,3 | o Ch | 20,2 | Ο CM | Ch CM | o o | O o | LO !-----1 | i—1 | LO CM | LO 00 | 0 0 | 'T | <0 CM | |
| x: | to | 'ťT | Ch | t—1 | t—1 | o | LO | CM | 'xT | CM | CM | <0 | í—1 | ||
| CM | •s | *. | v | K. | *» | LO | |||||||||
| Ch | co | kO | CM | lO | o | o | CM | CM | LO | O | |||||
| t—1 | r—| | r-l | 00 | i—1 | |||||||||||
| x: | r*H | r-1 | CM | Ο | 'TT | 1—1 | i—1 | o | r- | Ch | CO | ||||
| co | k. | K. | O. | ·< | o. | <K | K. | 1 | lO | ||||||
| kO | Ch | CO | Γ- | CM | kO | o | o | lO | CM | CM | co | 0 | kD | ||
| ?—1 | r—1 | ΟΟ | t—1 | ||||||||||||
| x: | t—1 | σ\ | o | t—i | CM | kO | CM | LO | LO | LO | LO | co | t~~- | r-J | |
| CM | X | K | s. | S» | s. | v | <0. | s. | s. | Γ- | |||||
| co | co | LO | Ch | CM | r- | o | t—1 | LO | co | 00 | o | r-H | |||
| τ—1 | CM | CM | r-H | ||||||||||||
| x: | LO | 00 | CO | 1------1 | r*H | kO | O | Γ- | o | CM | O | 00 | ΟΟ | ||
| kD | K. | ·». | X | v | 1 | Ch | |||||||||
| Ch | CO | lO | 00 | CM | Ch | !------1 | <—1 | kO | OJ | LO | co | ||||
| CM | CO | MO | CM | ||||||||||||
| Ή | CM | CO | í—1 | i—1 | CM | CM | LO | CO | CM | σ> | 0 | ||||
| N | «Κ | K | X. | K. | 1 | 0 | |||||||||
| O | CO | o | co | CM | Ch | t—1 | rH | kO | CM | LO | 00 | 00 | co | r—1 | |
| r | CM | 'xT | kO | CM | |||||||||||
| o | |||||||||||||||
| > | |||||||||||||||
| < | |||||||||||||||
| 1—1 | Φ | ||||||||||||||
| CM | fd | u | |||||||||||||
| ί>Ί | >υ | 0 | 0 | N | |||||||||||
| α | XV | ||||||||||||||
| Η | ε | kO | CM | 4-> | |||||||||||
| ι—Η | 2 | CQ | O | 1—1 | (V | ||||||||||
| Φ | 2 | K | 0 | >Μ | |||||||||||
| ω | 75 | CM | r- | t—1 | |||||||||||
| Ή | CQ | £Q | m | ω | O | ||||||||||
| ω | K. | K | X. | ř | x: | ||||||||||
| Φ | CM | 00 | CO | lO | t—1 | LO | CM | '(V | |||||||
| 'φ | ít | m | < | < | < | m | < | < | > | ||||||
| > | O | ||||||||||||||
| Ό | ο | c | |||||||||||||
| Ή | C | CM | <5 | ^Ί | |||||||||||
| kj | ο | < | Id | 1--------1 | |||||||||||
| Φ | kj | ||||||||||||||
| 3 | 'íú | +J | |||||||||||||
| O | 4- | > | Sí | Φ | |||||||||||
| cd | >1 | 0 | '(Ú | 75 | r—1 | ||||||||||
| ω | C | χ: | α | > | 1—1 | 0 | |||||||||
| 0 | •H | ο | 0 | 0 | 75 | E | |||||||||
| α | i—1 | φ | >. | cd | cd | c | tP | ||||||||
| o | (1) | CC | 75 | cn | cn | 73 | 0 | O | Ή | ||||||
| E | ω | ο | Ή | 0 | o | kj | ε | α | |||||||
| >1 | C | U | r—| | α | o | Γ—1 | |||||||||
| Ή | 0 | 75 | cd | <d | r | >75 | |||||||||
| C | Ε | Uj | Φ | X | ω | ω | r~H | 3 | b | ||||||
| 1—1 | 'Φ | υ | CO | 1 | 0 | 0 | Φ | <—J | Cl | 75 | |||||
| '<υ | > | 75 | Φ | O | 75 | φ | c | cd | JO | CO | Cn | 75 | -Η | ||
| 0 | kJ | (Ώ | c | cn | 2 | •H | cn | X | cn | ||||||
| 4-> | c | -U | 0 | E | 0 | 1 | 0 | rd | • | • | Φ | ||||
| b | 0 | □ | C | O | rd | X | O | Π5 | Ή | <—1 | cn | cn | >Sd | !a | |
| Φ | kj | φ | 0 | -C | b | 1 | kj | d | 03 | Ξ>ί | 4-) | ||||
| Z | □ | ζ | 2 | CM | 0 | Ul | OJ | < | < | 0 | cn | o\° |
• · · ·
x:
oo co
| OJ | i—1 | tO | cx | CX | Oxl | o | OJ | tO | LD | co | LO |
| V. | s. | <s. | H. | ||||||||
| o | o | o | o | o | o | o | o | o | to | CO |
LO
OJ
Složeni v počtu residuí RG/II v průběhu kinetiky degradace pomocí P. daleae o: to co co oj
O O O CO o!
r—icoocoLO^axr-cotooxtOrH C\lOrHOr-lt—IOC--OOOOCO o
tO
LO tO
| £1 | to | 00 | o- | LT) | o- | co | LO | on | to | LO | co | co | lD | to | |
| O | s. | K. | ·. | s. | to | ||||||||||
| OJ | o | o | o | γΉ | 1-----1 | r-4 | o | o | O | o | co | ||||
| OJ | i—I |
x: co to x: o OJ
Ή N o x: o
XX >
OOOOCOOJCOCO
CO «—I t-1 r—4 í—I OJ t—I Oco o
<0 o
σχ o
co o o <-1
OJ
O co
CO o-
| OJ | o | o | o | o | to | co | LO | to | co | t—i | o | o | |
| ·» | K. | <S, | s. | K. | |||||||||
| co | i—1 | «-Η | i—1 | OJ | OJ | i—i | o rH | v—4 | o | ,--------1 | t—1 o | θ'- oj | co |
| o | o | o | o | o | o | o | LO | o | to | σχ | r- | > | LO |
| •w | v. | S. | S. | ||||||||||
| r4 | r-4 | rH | cx | co | cx | O | 1—1 | o | o | o | θ' | co | |
| !-----1 | Cti |
| <ϋ ω o λ: c | 05 ca 0 ι—1 | ω | π5 | |||
| <0 | d | X | ω | (Ό | ||
| cn | 1 | 1 | ο | 0 | ||
| 0 | φ | φ | φ | ο5 | C | 4J |
| c | S | ω | Σ | ω | • r-4 | |
| E | 1 | ο | I | ο | Ό | 05 |
| 05 | Ο | Ο | •Η | ο5 | 1—I | |
| £. | 1 | 3 | 1 | d | Sx | Π3 |
| Λ | cx | Id | ΟΧ | < | < | Ο |
4J Λί rO
| '05 | ι—1 | ||||||
| > | 05 | ||||||
| Ο | '05 | CH | Φ | ||||
| C | > | Ο | Ο | ||||
| 0 | 0 | ε | Ν | ||||
| S-: | C | ο | >Φ | ||||
| 0 | 0 | '05 | d | 4J | |||
| d | >-ι | > | Φ | ||||
| X | 0 | d | »-Ι | ||||
| 05 | i-l | 73 | |||||
| r—1 | 3 | Φ | Ο | ||||
| 05 | <—4 | Ο | >Φ | Ή | χ: | ||
| ÍJ1 | Cn | 05 | > | C | 'φ | ||
| 0 | 73 | > | |||||
| • | d | Φ | 0 | ||||
| ω | ω | Ο | 05 | ,—I | »4 | α | |
| ^>Ί | >, | Ό | η | φ | 4-J | 0 | |
| d | X | Q | ο | (Ώ | >-ι |
σϊ residuální molekuly 100
| φ | ||
| o 3 TS <0 >-l Cn Φ Ό | JZ | |
| 3 | O o | |
| X | xT | |
| >Φ -Q »3 Gl | X | |
| Csl | ||
| > | <n !------i | |
| HH M 1 O | x: | |
| íX. | o | |
| 3 | X) «—1 | |
| <—1 3 Λί Φ r—1 | x: | |
| O | CM | |
| E | m | |
| r o Ή o Ή | 5—1 x: | |
| •Γ-ι | <O | |
| Φ | O | |
| X '05 > 4—> | Ή | |
| N | ||
| > | o | |
| Ή | X U | |
| 3 | ||
| Ό | > | |
| Ή CO Φ 3 -Q | E 3 | |
| Φ | 3 | |
| N | TS | |
| 05 | H | |
| > | co | |
| 05 | Φ | |
| Φ υ <3 1-------------1 | 5>i | |
| >1 | 5 | n |
| x | 3 | N |
| 4-) | E | o5 |
| φ | Ή | > |
| Ξ | CO | |
| co | O. | |
| 05 | 3 | >1 |
| N | CJ | ř-i |
| '3 | ||
| 1—1 | —5 | |
| 05 | Q. | |
| C | E | |
| < | •3 | |
| <0 | í-l | |
| Φ | ||
| XI | • | x |
| X. | X | |
| o | φ | |
| X | Ή | i—1 |
| r—í | U | X |
| 3 | O | x |
| X | E | 4J |
| 3 | o | φ |
| E-i | £b | s |
| o o o | r-4 | ||
| o o —r o vi oo | 1 a o X oí 1 00 T 3 3 | Φ υ o | |
| <3 O O_ | Ό | Ό | |
| O *-* O | • r—I | o | |
| co Φ | u | Ό | |
| X | ω | ||
| 3SS | i—1 X | Ό 3 X ><u | X Π5 I-------------1 |
| E | 0 | ||
| Φ | »3 | XJ | |
| T5 | •H | ||
| Φ | £L | c | |
| tn O | r—| X M | > | E (Ό x |
| o *—· | > | 'Φ | |
| X | c c | 1 1—1 | |
| o | >φ | >1 | |
| E | x |
| ctí | •3 | ||||||||
| d íÉ | ctí -q | d jQ | O X3 Um | ‘H. | ctí <J ·? ň. | >s >< | o > | 73 | 73 |
| 4 | 2 | á | • O ZJ | < | C | ''T | O | O | |
| en | xr | • Ctí X. -A | en Ix | en | en tt “í | cn | en | 'Ó | tó |
| CM | en | CM* ÍX | CM~ CM | CM* | cm en «4 | CM* | CM* | en | cm“ |
··
Tabulka 7. Analýza methylace a vazeb residuí vytvářejících molekulu RG-II v průběhu degradace pomocí Penicillium daleae
Methylether Vazba Výchozí 72 h
120 h 163 h 240 h 264 h
2.3.4- Rha
3.4- Rlia
2.4- RJia
3- Rha
Rha
2.3.4- Fuc
2- Fuc
2.3.4- Xyl
2.3- Api
2.3.5- Ani
3.4- Ara
4- Ara
2.3.4.6- Gal
2.6- Gal. .
3.6- Gal
3- Acer
2.3.4- GalA
2,3-GaJA
2- GalA
3- CralA
GaJA
1.2.3.5- GalA
2.3.4- GlcA
3,4GlcA
Rlmp—> —>2-Rhap-> ->3-Rhap-+ —>2,4-Rhnp—> —>2,3,4-Rh ap—>
2-O-CH3-Fuc->
—>3,4-Fuc—>
2-G-CH3-Xyl->
->3‘-Api—>
Ara/->
—>2-Arap->
—>2,3-Arap—>
Galp—>
->3,4-Galp-> ->2,4-Galp->
—>2-AccrA—>
Galp A—>
—>4-GalpA—> ->3,4-GalpA-> ->2,4'GalpA->
—>2,3,4-GalpA—> —>4-GalpA rčduit
GIcpA—> —>2-GlcpA—>
| 1.4 | 1.2 |
| 1.1 | 0.7 |
| 1 | 1 |
| 0.4 | 0.1 |
| 1.2 | 1.2 |
| 0.8 | 0.7 |
| 0.6 | 0.7 |
| 0.6 | 0.6 |
| 2.2 | 2.2 |
11.2
0.50.4
1I
0.3
1.21.1
0.70.8
0.70.6
0.50.5
2.32.2
| 1.2 | 1.2 |
| 0.3 | 0.4 |
| 1 | 1 |
| 0.8 | 0.3 |
| 0.7 | 0.8 |
| 0.3 | 0.2 |
| 0.3 | 0,1 |
| 2,2 | 1.8 |
| 1.6 | 1.4 | 1.1 | 1.3 | 0.8 | 0.8 |
| 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.5 | |
| 0.6 | 0.7 | 0.6 | 0.6 | 0.4 | 0.2 |
| 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.4 | 0.3 | 0.2 |
| 0.6 | 0.6 | 0.5 | 0.5 | 0.4 | 0.3 |
| 1.0 | 1.2 | 1.1 | 1.1 | 1.0 | 0.9 |
| 0.5 | 0.5 | 0.3 | 0.5 | 0.6 | 0.6 |
| 2.6 | 3.0 | 3.0 | 2.6 | 1.9 | 1.4 |
| 2.0 | 2.3 | 2.1 | 1.8 | 1.7 | 1 1.5 |
| 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.3 | 1.3 |
| 1.1 | 1.2 | 1.3 | 1.3 | 1.8 | 1.6 |
| 0.8 | 0.9 | 0.8 | 0.7 | 0.3 | 0.2 |
| 1.0 | 0.9 | 0.8 | 0.7 | 0.7 | 0.8 |
| 0.2 | |||||
| 1.1 | 1.4 | 1.3 | 1.1 | 0.6 | 0.4 |
Výsledky jsou dány v molárních poměrech vypočtených vzhledem k 1 residuu —»3) -Rhap->, residuu B2 v molekule RG-II, které zůstává neměnné v průběhu degradace
2,3,4-Me3-Rha = 1,5-di-O-acetyl-2,3,4-tri-O-methyl-rhamnitol, atd.
Claims (27)
-
PATENTOVÉ NÁROKY 1. Enzym, vyznačující se tím, že vykazuje degradační účinek na rhamnogalaktoronanu II (RG-II) a jeho deriváty. 2 . Enzym podle nároku 1, vyznačující se tím, že vykazuje účinek typu endo-hydrolasy. - 3. Enzym podle nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že vykazuje účinek endo-p-L-rhamnopyranosyl-(1—»3' )-Dapiofuranosyl hydrolasy.
- 4. Enzym podle nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že vykazuje účinek endo-a-L-fukopyranosyl-(1—>4)-Lrhamnopyranosyl hydrolasy.
- 5. Mikroorganismus, obzvláště houba, vyznačující se tím, že vykazuje degradační účinek na RG-II a jeho deriváty.
- 6. Houba podle nároku 5, vyznačující se tím, že je druhu Penicillium.
7. Kmen hub podle některého z nároků 5 a 6, vyznačující se tím, že je deponován u CNCM pod číslem 1-1578 (LAV2). 8. Kmen hub podle některého z nároků 5 a 6, vyznačující se tím, že je deponován u CNCM pod číslem 1-1577 (IPV1). - 9. Enzym podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že může být produkován kmenem podle některého z • · · ·
nároků 5 až 8 . • · · • · · · • · ······· ·· 10. Enzymatický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuj e enzym podle některého z nároků 1 až 4 a 9. 11. Způsob výroby enzymu nebo enzymatického přípravku podle některého z nároků 1 až 4 a 9 a 10, zahrnuj ící následující etapy:- kultivace mikroorganismů podle některého z nároků 5 až 8 v kultivačním prostředí upraveném k produkci enzymů podle některého z nároků 1 až 4, získání enzymů nebo enzymatického přípravku ze supernatantu kultury nebo ze supernatantu drti mikroorganismů. - 12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že zahrnuje následující etapy:- kultivaci mikroorganismů podle některého z nároků 5 až 8 v kultivačním prostředí upraveném pro mikroorganismy obsahující RG-II nebo některý z jeho derivátů,- získáni mikroorganismů,- rozdrcení mikroorganismů,- eliminace nerozpustného materiálu, a získání supernatantu obsahujícího enzym nebo enzymový přípravek.
- 13. Způsob získání RG-II z extraktu rostlinného původu, zahrnující následující etapy:- separace makromolekul obsahujících uvedený extrakt a- chromatografie iontovou výměnou při pH vyšším než 4.
- 14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že separace je prováděna precipitací nebo ultrafiltrací.
- 15. Způsob podle některého z nároků 13 a 14, ·· ··· · vyznačující se tím, že chromatografie iontovou výměnou je následována sférickou vylučovací chromatografií.
- 16. Způsob získání RG-II z extraktů rostlinného původu zahrnující alespoň jednu adsorpční chromatografii na nosiči, zadržujícím RG-II.
- 17. Způsob podle nároku 16 vyznačující se tím, že adsorpční chromatografie je prováděna na aktivním uhlí nebo na polystyren/divinylbenzenové pryskyřici.
- 18. Přípravek podle některého z obsahuje alespoň 95RG-II, který může nároků 13 až 17 být získán vyznačující způsobem se tím, z
- 19. Přípravek podle některého obsahuje alespoň
% monomerů RG-II. : RG-II, který může být získán způsobem nároků 13 až 17 vyznačující se tím, %, výhodně více než 95% dimerů RG-II. - 20. Způsob selekce mikroorganismů, obzvláště hub, na jejich schopnost degradovat RG-II vyznačující se tím, že uvedené mikroorganismy se nechají růst na přizpůsobeném kultivačním prostředí obsahujícím RG-II, přičemž uvedený RGII je možno získat způsobem podle některého z nároků 13 až 17 .
- 21. Kultivační prostředí pro mikroorganismy, vyznačující se tím, že obsahuje RG-II, získaný způsobem podle některého z nároků 13 až 17.
- 22. Způsob podle některého z nároků 11 nebo 12 vyznačující se tím, že RG-II je získán způsobem podle některého z nároků 13 až 17.
- 23. Použiti enzymu nebo enzymatického přípravku podle některého z nároků 1 až 4, 9 a 10 nebo získaného způsobem podle některého z nároků 11 a 12 pro degradaci nebo modifikaci RG-II nebo jeho derivátů.
- 24. Použití enzymu nebo enzymatického přípravku podle některého z nároků 1 až 4, 9 a 10 nebo získaného způsobem podle některého z nároků 11 a 12 pro zlepšení filtrovatelnosti a usnadnění přípravy koncentrované šťávy nebo pro usnadnění čištění.
- 25. Použití enzymu nebo enzymatického přípravku podle některého z nároků 1 až 4, 9 a .10 nebo získaného způsobem podle některého z nároků 11 a 12 pro čištění filtračních nosičů použitých pro filtraci ovocných nebo zeleninových šťáv a jejich derivátů.
- 26. Použití enzymu nebo enzymatického přípravku podle některého z nároků 1 až 4, 9 a 10 nebo získaného způsobem podle některého z nároků 11 a 12 pro maceraci, ztekucení nebo úplnou nebo částečnou hydrolýzu rostlinné tkáně.
- 27. Použití podle nároku 26 v macerační přípravě pro výrobu ovocných nektarů, pyré, želé a ovocných a zeleninových koncentrátů a jejich derivátů, v to počítaje i víno.
- 28. Použití podle nároku 26 při ztekucování pro přípravu ovocných a zeleninových šťáv a aromatických bází a jejich derivátů, v to počítaje i víno a při výrobě piva.
- 29. Použití podle nároku 26 pro výrobu pektinů z rostlinných residuí jako jsou bulvy červené řepy a pevných resíduí vzniklých lisováním ovoce.
- 30. Použiti podle nároku 26 pro přípravu potravy pro zvířata z rostlinných látek.
- 31. Použití podle nároku 26 pro výrobu celulózy z rostlin, výhodně z bavlny, pro textilní průmysl a ve výrobě papíru,
- 32. Použití podle nároku 26 pro výrobu oligosacharidů s elicitickým účinkem vyvolávajícím obrannou reakci rostlin, přičemž tyto oligosacharidy jsou vyráběny z rostlinných residuí a mohou být použity jako fytosanitární produkty.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9506142A FR2734578B1 (fr) | 1995-05-23 | 1995-05-23 | Enzyme degradant le rhamnogalacturonane ii, procedes d'obtention de cette enzyme et du rhamnogalacturonane ii et utilisation de cette enzyme |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ370197A3 true CZ370197A3 (cs) | 1998-03-18 |
Family
ID=9479302
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ973701A CZ370197A3 (cs) | 1995-05-23 | 1996-05-21 | Enzym degradující rhamnogalakturonan II a jeho deriváty, způsob výroby tohoto enzymu a rhamnogalakturonanu II a použití enzymu |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6103506A (cs) |
| EP (1) | EP0827533B1 (cs) |
| JP (1) | JPH11508127A (cs) |
| AR (1) | AR002067A1 (cs) |
| AT (1) | ATE330006T1 (cs) |
| AU (1) | AU6006796A (cs) |
| BR (1) | BR9608812A (cs) |
| CA (1) | CA2222193A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ370197A3 (cs) |
| DE (1) | DE69636247D1 (cs) |
| FR (1) | FR2734578B1 (cs) |
| HU (1) | HUP9900744A2 (cs) |
| IL (1) | IL118404A (cs) |
| PL (1) | PL323529A1 (cs) |
| RU (1) | RU2220203C2 (cs) |
| SK (1) | SK156697A3 (cs) |
| TR (1) | TR199701421T1 (cs) |
| UA (1) | UA64696C2 (cs) |
| WO (1) | WO1996037604A2 (cs) |
| ZA (1) | ZA964107B (cs) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7132119B1 (en) | 1997-04-08 | 2006-11-07 | Pall Corporation | Method for producing beer |
| WO1999038956A2 (en) * | 1998-01-30 | 1999-08-05 | Institut National De La Recherche Agronomique | Enzyme modifying rhamnogalacturonane ii, dna encoding for said enzymes and method for producing the enzyme |
| FR2980800B1 (fr) * | 2011-09-30 | 2014-01-10 | Agronomique Inst Nat Rech | Procede de preparation d'un produit alimentaire liquide enrichi en oligosaccharides et en polysaccharides |
| JP6539400B1 (ja) * | 2018-10-24 | 2019-07-03 | 株式会社アンチエイジング・プロ | Ｌｐｓ高含有組成物の製造方法 |
| CN117204574B (zh) * | 2023-11-09 | 2024-02-02 | 北京市农林科学院 | 促进肠道菌群发酵平衡的果胶基膳食补充剂及其制备方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3541945A1 (de) * | 1985-11-27 | 1987-06-04 | Lomapharm Rudolf Lohman Gmbh K | Immunstimulierend wirkende polysaccharide aus zellkulturen von echinacea purpurea (l.) moench und echinacea angustifolia, d.c. verfahren zu ihrer herstellung und sie enthaltende pharmazeutische zubereitungen |
| DE3934304A1 (de) * | 1989-10-13 | 1991-04-18 | Lohmann Rudolf Lomapharm | Polysaccharide mit antiphlogistischer wirkung, verfahren zu ihrer gewinnung und sie enthaltende arzneimittel |
| JPH06506831A (ja) * | 1991-05-02 | 1994-08-04 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | ラムノガラクツロナーゼ、対応するｄｎａ配列、ラムノガラクツロナーゼ含有酵素調製物および該酵素調製物の用途 |
| EP0570075A3 (en) * | 1992-05-15 | 1995-02-15 | Quest Int | Cloning and expression of DNA encoding a ripening form of a polypeptide having rhamnogalacturonase activity. |
| DE4221753C2 (de) * | 1992-07-02 | 1994-11-24 | Plantamed Arzneimittel Gmbh | Immunologisch und antiphlogistisch wirksame Polysaccharide aus Sedum telephium, Verfahren zu ihrer Gewinnung und diese enthaltende Arzneimittel |
| DK24493D0 (cs) * | 1993-03-05 | 1993-03-05 | Novo Nordisk As |
-
1995
- 1995-05-23 FR FR9506142A patent/FR2734578B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-05-21 PL PL96323529A patent/PL323529A1/xx unknown
- 1996-05-21 HU HU9900744A patent/HUP9900744A2/hu unknown
- 1996-05-21 JP JP8535433A patent/JPH11508127A/ja active Pending
- 1996-05-21 SK SK1566-97A patent/SK156697A3/sk unknown
- 1996-05-21 EP EP96917526A patent/EP0827533B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-21 AU AU60067/96A patent/AU6006796A/en not_active Abandoned
- 1996-05-21 WO PCT/FR1996/000758 patent/WO1996037604A2/fr active IP Right Grant
- 1996-05-21 CA CA002222193A patent/CA2222193A1/fr not_active Abandoned
- 1996-05-21 DE DE69636247T patent/DE69636247D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-21 BR BR9608812A patent/BR9608812A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-05-21 RU RU97121499/13A patent/RU2220203C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-05-21 CZ CZ973701A patent/CZ370197A3/cs unknown
- 1996-05-21 US US08/973,335 patent/US6103506A/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-05-21 TR TR97/01421T patent/TR199701421T1/xx unknown
- 1996-05-21 UA UA97126189A patent/UA64696C2/uk unknown
- 1996-05-21 AT AT96917526T patent/ATE330006T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-05-22 AR ARP960102653A patent/AR002067A1/es active IP Right Grant
- 1996-05-22 ZA ZA964107A patent/ZA964107B/xx unknown
- 1996-05-23 IL IL118404A patent/IL118404A/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AR002067A1 (es) | 1998-01-07 |
| CA2222193A1 (fr) | 1996-11-28 |
| US6103506A (en) | 2000-08-15 |
| WO1996037604A2 (fr) | 1996-11-28 |
| IL118404A0 (en) | 1996-09-12 |
| PL323529A1 (en) | 1998-03-30 |
| UA64696C2 (en) | 2004-03-15 |
| ATE330006T1 (de) | 2006-07-15 |
| WO1996037604A3 (fr) | 1997-01-23 |
| SK156697A3 (en) | 1998-09-09 |
| TR199701421T1 (xx) | 1998-02-21 |
| AU6006796A (en) | 1996-12-11 |
| EP0827533B1 (fr) | 2006-06-14 |
| DE69636247D1 (de) | 2006-07-27 |
| EP0827533A2 (fr) | 1998-03-11 |
| ZA964107B (en) | 1996-12-03 |
| HUP9900744A2 (hu) | 1999-06-28 |
| FR2734578B1 (fr) | 1997-08-14 |
| FR2734578A1 (fr) | 1996-11-29 |
| RU2220203C2 (ru) | 2003-12-27 |
| BR9608812A (pt) | 1999-02-17 |
| JPH11508127A (ja) | 1999-07-21 |
| IL118404A (en) | 2006-10-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Vidal et al. | Polysaccharides from grape berry cell walls. Part I: tissue distribution and structural characterization of the pectic polysaccharides | |
| Tapre et al. | Pectinases: Enzymes for fruit processing industry | |
| Shet et al. | Pectinolytic enzymes: classification, production, purification and applications | |
| US5591620A (en) | Methods of detecting and isolating a ripening form of a polypeptide having rhamnogalacturonase activity | |
| NZ202876A (en) | Enzymes for degradation of carbohydrates | |
| AU662327B2 (en) | Rhamnogalacturonase, corresponding DNA sequence, rhamnogalacturonase containing enzyme preparation and use of the enzyme preparation | |
| Vidal et al. | Soluble polysaccharide content at initial time of experimental must preparation | |
| US8563276B2 (en) | Method of enzyme cleavage of polysaccharides derived from algae | |
| CZ370197A3 (cs) | Enzym degradující rhamnogalakturonan II a jeho deriváty, způsob výroby tohoto enzymu a rhamnogalakturonanu II a použití enzymu | |
| DE10019076A1 (de) | Verwendung von Polygalakturoniden als Lebensmittelzusatzstoffe | |
| EP2618686A2 (en) | Methods of juice production | |
| FR2736359A1 (fr) | Beta-glucosidase de champignons filamenteaux, et ses utilisations | |
| Bassim Atta et al. | Chapter Fungal Pectinases in Food Technology | |
| EP0570075A2 (en) | Cloning and expression of DNA encoding a ripening form of a polypeptide having rhamnogalacturonase activity | |
| Vidal et al. | Penicillium daleae, a soil fungus able to degrade rhamnogalacturonan II, a complex pectic polysaccharide | |
| Konno et al. | Degradation of pectic polysaccharides extracted from suspension cultures of carrot by purified exo‐polygalacturonase | |
| Ortiz-Basurto et al. | Presence of rhamnogalacturonan II in the juices produced by enzymatic liquefaction of Agave pulquero stem (Agave mapisaga) | |
| Jeong et al. | Production of an anti-complement exo-polymer produced by Auricularia auricula-judae in submerged culture | |
| Angelova | Microbial pectinases: application in horticultural industries | |
| CN1189185A (zh) | 降解鼠李半乳糖醛酸聚糖ⅱ的酶和微生物 | |
| KR100945717B1 (ko) | 고추 추출물을 발효공법에 의해 변형시킨 변형고추펙틴과 그 제조방법 및 용도 | |
| Gewali et al. | Studies on polygalacturonase from Aspergllus flavus | |
| Mgbede et al. | Pectinase production from a local isolate of Aspergillus niger using orange bagasse as a carbon source | |
| JPH0779769A (ja) | 新規培地およびそれを用いた微生物による可食性セルロースゲルの製造方法 | |
| Herweijer et al. | Endo-xylogalacturonan hydrolase: a novel enzyme for fruit processing |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |