JP5112706B2 - 機能性組成物 - Google Patents

Description

本発明は、概日リズム調節活性を有する豆乳の乳酸菌発酵物由来の機能性組成物に関する。

概日リズムは約２４時間を１サイクルとする生物リズムであり、そのリズムは概日リズム制御遺伝子によって調節がなされている。哺乳類における概日リズム制御遺伝子としては、Ｒｅｖ−ｅｒｂ遺伝子、Ｃｌｏｃｋ遺伝子、Ｐｅｒ遺伝子、Ｂｍａｌ遺伝子、Ｃｒｙ遺伝子などが知られている。

Ｒｅｖ−ｅｒｂαは核内受容体の１つとして同定され、腎臓や肝臓など生体内の幅広い臓器や器官に存在している（例えば、非特許文献１参照）。Ｒｅｖ−ｅｒｂαは、Ｃｌｏｃｋ遺伝子やＢｍａｌ遺伝子といった概日リズム制御遺伝子を負に制御することで、概日リズムを調節している。Ｒｅｖ−ｅｒｂα遺伝子をノックアウトしたマウスは、通常のマウスと比較して概日リズムに変調をきたすことからも、Ｒｅｖ−ｅｒｂαが概日リズムを制御していることが裏付けられている。

また、躁うつ病の治療薬であるリチウムがＲｅｖ−ｅｒｂαを介することによって、その効果を発揮することが明らかとなっている（例えば、非特許文献２参照）。これらのことから、Ｒｅｖ−ｅｒｂαは、概日リズムの調節機能を担っているばかりでなく、躁うつ病治療の標的因子としても注目されている。

それ以外にも、高脂血症薬であるＦｉｂｒａｔｅが、肝細胞のＲｅｖ−ｅｒｂα発現を増加させるとの報告がある。Ｒｅｖ−ｅｒｂαの発現は、Ｒｅｖ−ｅｒｂα遺伝子のプロモーターのＲｅｖ−ｅｒｂα結合領域にＲｅｖ−ｅｒｂα自身が結合することで、その転写が抑制される。しかしながら、Ｆｉｂｒａｔｅ存在下では、プロモーターのＲｅｖ−ｅｒｂα結合領域にＲｅｖ−ｅｒｂα自身が結合する代りに、ＰＰＡＲαとＲＸＲαが結合することが知られている。Ｒｅｖ−ｅｒｂα以外の因子がＲｅｖ−ｅｒｂα結合領域に結合することによって、Ｒｅｖ−ｅｒｂα自身のＲｅｖ−ｅｒｂα結合領域への結合が阻害され、Ｒｅｖ−ｅｒｂα自身によるＲｅｖ−ｅｒｂαの転写抑制は解除され、Ｒｅｖ−ｅｒｂαの発現量は増加すると考えられている（例えば、非特許文献３参照）。このことから、ＰＰＡＲαないしはＲＸＲαの発現量を増加させることによっても、Ｒｅｖ−ｅｒｂαの発現量の調節は可能である。
Ｆｉｂｒａｔｅによる血中脂質（トリグリセリド）の改善効果は、Ｒｅｖ−ｅｒｂαの支配下にある血中脂質（トリグリセリド）の代謝に関連する遺伝子群の発現を活発化させることよるものであり、Ｒｅｖ−ｅｒｂαの発現量を増加させることで同様のメカニズムにより、血中脂質（トリグリセリド）の改善効果も期待することができる。

一方で、大豆タンパク食ないしはカゼイン食を投与したラットにおける肝臓の遺伝子発現の比較試験において、両者間でＲｅｖ−ｅｒｂα発現には差が認められないことが明らかとなっている（例えば、非特許文献４参照）。

概日リズムが変調をきたすことによって、睡眠障害、不眠症、自律神経失調症、躁うつ病などが引き起こされる。また、夜間勤務等の不規則な就業体系、長距離飛行なども、生体の概日リズムを撹乱する原因となる。

概日リズムの制御遺伝子を調節することによって、変調した概日リズムの正常化をはかることが可能であり、睡眠障害、不眠症及び躁うつ病といった疾患の治療及び予防に寄与することができる。変調した概日リズムの正常化を図る機能性組成物は、医薬品あるいは機能性飲食品として有用である。

概日リズムは、アラキドン酸及び／又はアラキドン酸を構成脂肪酸とする化合物や、５−ヒドロキシトリプトファンによって正常化されることが知られている（例えば、特許文献１〜２参照）。また、概日リズムの制御遺伝子に関しては、制御遺伝子の１つであるＰｅｒ遺伝子の発現増強剤が知られている（例えば、特許文献３参照）。

特表２００６−５２１３６９号公報 特開２００３−８１８２９号公報 特開２００３−３３５６６９号公報 Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ ｅｔ ａｌ． :Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ， Ｖｏｌ．４， ２００６ Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ． :Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３１１， ｐ１００２，２００６ Ｇｅｒｖｏｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．， １３， ｐ４００， １９９９ Ｔａｃｈｉｂａｎａ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．， ５３， ｐ４２５３， ２００５

本発明は、概日リズムを調節する新規な機能性組成物の提供を課題とする。

本発明は、以下に関する。
（１）豆乳の乳酸菌発酵物を有効成分とする、概日リズムを調節する機能性組成物。
（２）Ｒｅｖ−ｅｒｂα及び／又はＰＰＡＲαのｍＲＮＡ発現量の増大を通じて概日リズムを調節する上記（１）記載の概日リズムを調節する機能性組成物。
（３）乳酸菌が、Leuconostoc属に属する微生物である、上記（１）〜（２）記載の概日リズムを調節する機能性組成物。
（４）乳酸菌が、Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291株である、上記（１）〜（２）記載の概日リズムを調節する機能性組成物。

１．機能性組成物とその製造法
本発明の機能性組成物は、豆乳の乳酸菌発酵物を有効成分とする。該発酵物は、豆乳に乳酸菌を添加して発酵を行わせた後、発酵物を採取することによって得られる。

本発明でいう概日リズム調節活性とは、概日リズムを制御する遺伝子発現の変化を引き起こす活性を意味する。

本発明でいう豆乳とは、水に浸漬して膨潤させた大豆を摩砕した液体、又は該液体からおからを分離して得られる液体をいう。原料となる大豆の品種は特に限定されず、例えば「りゅうほう」「たちゆたか」等が使用できる。また、各種市販豆乳若しくは公知技術を用いて製造した豆乳も使用することができる。

概日リズム調節活性を有する発酵物が得られる限り、本発明で使用する乳酸菌の種類は特に限定されない。例えば、Leuconostoc属に属する乳酸菌が使用できる。より具体的には、Leuconostoc mesenteroides、Leuconostoc paramesenteroides、Leuconostoc pseudomesenteroides、Leuconostoc citreum、Leuconostoc dextranicumなどが挙げられる。さらに具体的には、Leuconostoc pseudomesenteroides (ATCC12291)、Leuconostoc citreum (NRIC1579)、Leuconostoc paramesenteroides (NISL7218)が挙げられる。

なお、上記菌種名に関し、「ＮＲＩＣ」とは東京農業大学応用生物科学部菌株保存室が保存する菌株を意味し、「ＮＩＳＬ」とは、財団法人野田産業科学研究所が保存する菌株を意味する。「ＡＴＣＣ」は、米国ＶＡ２０１１０−２２０９、マナサス、ユイバーシティブルーバード１０８０１のＡＴＣＣにあるアメリカンタイプカルチャーコレクション国際寄託当局を指す。

豆乳に乳酸菌を添加して発酵を行わせる方法は特に限定されず、例えば、培養した乳酸菌の菌液を豆乳に添加した後、用いた乳酸菌に適した温度、時間等の条件、例えば、２５〜３５℃で４時間以上の発酵条件を適宜設定して発酵を行えばよい。乳酸菌が嫌気性菌の場合は嫌気条件にて発酵を行う。なお、発酵は、複数種の乳酸菌を使用した混合発酵又は連続発酵であってもよい。発酵性を向上させるために、必要な栄養源、例えば、シュークロース、マルトース、スタキオース又はラフィノースから選択される１種以上の糖類などを豆乳に添加してもよい。

概日リズム調節活性を発揮する限り、上記で得られた発酵物をそのまま本発明の機能性組成物として使用してもよい。また、該発酵物をさらに分画処理して、より強い概日リズム調節活性を有する画分を使用してもよい。分画は、例えば、溶媒抽出法、ゲル濾過カラム、限外濾過膜等を用いて行うことができる。

本発明の機能性組成物は、医薬品、飲食品又は飲食品用素材として使用することができる。医薬品、飲食品又は飲食品用素材の種類、形態、及びその他の含有成分等には特に制約はなく、当業者に公知の任意の各種方法で容易に加工することができる。機能性組成物を使用する場合の有効成分の摂取量は、摂取者の年令、体重、適応症状などによって異なる。例えば、体重６０ｋｇの成人による経口摂取の場合、１日１回又は数回摂取し、その摂取量は１日当たり１回約１００ｇ〜２００ｇ、好ましくは１．６〜３．５ｇ／ｋｇ体重程度とすればよい。この機能性組成物は、継続的に摂取することにより極めて優れた効果を発揮する。

２．本発明の機能性組成物
本発明の機能性組成物は、豆乳の乳酸菌発酵物を含有し概日リズム調節活性を有する。

概日リズムの変調が引き起こされた場合、本発明により、概日リズムを調整できる可能性がある。概日リズムの変調が起きる要因としては、睡眠障害、不眠症、自律神経失調症、躁うつ病、老人性痴呆、夜間勤務・交代勤務、時差ボケなど生活リズムの不規則化による体調の悪化、自閉症などにおける生活リズムの不規則化による消耗などが挙げられる。これらの疾患に対しても、本発明は適用の可能性がある。

概日リズム調節活性を有する限り、豆乳の乳酸菌発酵物をそのまま本発明の機能性組成物として使用してもよいし、該発酵物を他の食品、例えば、肉製品、水産加工品、加工野菜、加工果実、惣菜類、大豆加工品、食用粉類、食用蛋白質、飲料、酒類、調味料、乳製品、菓子に添加して使用してもよい。飲食品としての形状は、特に限定されず、例えば、固形状、乳状、ペースト状、半固形状、液状とすればよい。

また、必要により、以下に示す原材料、例えば、トマト、にんじん、タマネギ、にんにく、ゴマなどの野菜の加工処理物（ピューレ、ペースト、練状物、細断粒状物、磨砕物、粉末など）；リンゴ、ユズ、オレンジ、モモ、イチゴ、パイナップル、ミカン、ブドウなどの果実、果汁の加工処理物（同上）などを適宜添加混和してもよい。
なお、本発明の機能性組成物は、ヒト用のみならずペットフードや動物用飼料として使用することができる。

以下により、豆乳の乳酸菌発酵物を調製し、その概日リズム調節活性を確認した。また、その調節活性メカニズムについて検討を行った。

〔ＤＮＡマイクロアレイと定量的ＲＴ−ＰＣＲでの測定〕
本発明の機能性組成物（豆乳の乳酸菌発酵物）は、次のようにして作製した。豆腐用豆乳（紀文フードケミファ社製）を５０％、２０％ Ｓｕｃｒｏｓｅ（１２１℃、１５分滅菌済み）を５０％含有する豆乳培地に、乳酸菌を１０^６−１０^７ｃｆｕ／ｍｌになるように接種し、３０℃で２４時間培養した。なお、使用した乳酸菌は、Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291株である。

５週齢のＷｉｓｔａｒ系雄性ラットを金網ケージにて飼育した。対照群として、普通飼料であるＭＦ飼料を自由摂取させた（ｎ＝５）。実験群は、豆乳の乳酸菌発酵物を５％の割合で添加した豆乳の乳酸菌発酵物添加飼料を自由摂取させた（ｎ＝５）。

ラットの摂餌量は、約２０ｇで、豆乳の乳酸菌発酵物のラット一匹あたりの一日の摂取量は１ｇとなる。これを人の摂取量に換算すると、１００ｇ〜２００ｇ／日／１人に相当する。

１３週間の投与期間終了後に解剖し、肝臓を速やかに採取した。肝臓からＲＮＡを抽出し、ＤＮＡマイクロアレイ（Ｒａｔ Ｇｅｎｏｍｅ ２３０ ２．０ Ａｒｒａｙ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を用いて遺伝子発現を網羅的に解析した。また、ＤＮＡマイクロアレイによる解析で、最もｍＲＮＡ発現量の変動が大きかったＲｅｖ−ｅｒｂα遺伝子に関しては、グリセロアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）を内部標準とした定量的ＲＴ−ＰＣＲに供した。

試験結果を図１及び図２に示す。対照群と比較して、本発明の機能性組成物（豆乳の乳酸菌発酵物）の投与によって、肝臓の細胞内概日リズム制御遺伝子の発現に変動が認められた。また、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって肝臓のＲｅｖ−ｅｒｂα ｍＲＮＡの発現量が有意に増加したことが確認され（図２）、ＤＮＡマイクロアレイの結果との相関性が確認された。

〔ＰＰＡＲα ｍＲＮＡ測定〕
実施例１において採取した肝臓のＰＰＡＲα遺伝子発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。試験結果を図３に示す。対照群と比較して、本発明の機能性組成物（豆乳の乳酸菌発酵物）の投与によって、ＰＰＡＲα ｍＲＮＡの発現量が有意に増加した。

〔血中トリグリセライドの測定〕
実施例１において、採取した血液中のトリグリセライドをトリグリセライド測定キット（トリグリセライドＥ-テストワコー、和光純薬工業社製）を用いて測定した。

試験結果を図４に示す。対照群と比較して、本発明の機能性組成物（豆乳の乳酸菌発酵物）の投与によって、血中トリグリセライド量が有意に減少した。

本発明の機能性組成物は、医薬品、飲食品又は飲食品用素材として使用することができる。該機能性組成物は、任意の飲食品に添加して使用できるので、概日リズム調節活性を通じて睡眠障害、不眠症及び躁うつ病を治療、予防する機能性組成物を容易に得ることができる。

細胞内の概日リズム制御機構と豆乳の乳酸菌発酵物を投与したラット肝臓の概日リズム制御遺伝子ｍＲＮＡの発現量変化（比対照群）を示す図である。 豆乳の乳酸菌発酵物を投与したラット肝臓Ｒｅｖ−ｅｒｂα ｍＲＮＡの発現量を示す図である。 豆乳の乳酸菌発酵物を投与したラット肝臓ＰＰＡＲα ｍＲＮＡの発現量を示す図である。 豆乳の乳酸菌発酵物を投与したラット血中トリグリセライド濃度を示す図である。

Claims (2)

1. 乳酸菌ロイコノストック・シュードメセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｐｓｅｕｄｏｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＡＴＣＣ １２２９１株の豆乳発酵物を有効成分とする概日リズム調節剤。
2. Ｒｅｖ−ｅｒｂα及び／又はＰＰＡＲαのｍＲＮＡ発現量の増大を通じて概日リズムを調節する請求項１記載の概日リズム調節剤。

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