JPH11269203A - 新規リポ多糖バイオサ―ファクタント - Google Patents
新規リポ多糖バイオサ―ファクタントInfo
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- JPH11269203A JPH11269203A JP10361201A JP36120198A JPH11269203A JP H11269203 A JPH11269203 A JP H11269203A JP 10361201 A JP10361201 A JP 10361201A JP 36120198 A JP36120198 A JP 36120198A JP H11269203 A JPH11269203 A JP H11269203A
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- dodecanoic acid
- acid
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- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【解決手段】 リポ多糖が大部分２−アミノ−２、６−
ジデオキシアルドヘキソース糖およびグルコサミンおよ
び一種または二種以上の非アミノ化糖からなる多糖鎖か
ら構成される、タンパク分子を随伴したリポ多糖バイオ
サーファクタントであり、アミノ化糖がアミン基の全て
もしくはほとんど全てがアセチル化された形態であり、
多糖鎖がエステル結合により脂質フラクションに結合さ
れ、脂質フラクションが炭素原子１０から１８の親油性
鎖長の飽和および／または不飽和酸基からなり、その９
５−５０％がドデカン酸および３−ヒドロキシ−ドデカ
ン酸であり、ドデカン酸が３−ヒドロキシ−ドデカン酸
に対して優勢であるリポ多糖バイオサーファクタント。 【効果】上記バイオサーファクタントは乳化能が高く、
水中炭化水素の生物分解を促進し、水／油界面への微生
物の付着を有利にする。
ジデオキシアルドヘキソース糖およびグルコサミンおよ
び一種または二種以上の非アミノ化糖からなる多糖鎖か
ら構成される、タンパク分子を随伴したリポ多糖バイオ
サーファクタントであり、アミノ化糖がアミン基の全て
もしくはほとんど全てがアセチル化された形態であり、
多糖鎖がエステル結合により脂質フラクションに結合さ
れ、脂質フラクションが炭素原子１０から１８の親油性
鎖長の飽和および／または不飽和酸基からなり、その９
５−５０％がドデカン酸および３−ヒドロキシ−ドデカ
ン酸であり、ドデカン酸が３−ヒドロキシ−ドデカン酸
に対して優勢であるリポ多糖バイオサーファクタント。 【効果】上記バイオサーファクタントは乳化能が高く、
水中炭化水素の生物分解を促進し、水／油界面への微生
物の付着を有利にする。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は新規なリポ多糖バイ
オサーファクタント，このバイオサーファクタントを産
生するAcinetobacter calcoaceticus 菌株，上記バイオ
サーファクタントの調製方法，ならびにエネルギーおよ
び環境分野へのその使用に関するものである。
オサーファクタント，このバイオサーファクタントを産
生するAcinetobacter calcoaceticus 菌株，上記バイオ
サーファクタントの調製方法，ならびにエネルギーおよ
び環境分野へのその使用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】水環境中に炭化水素汚染物質が漏洩して
起こす現象は周知である。生態系が炭化水素による汚染
と反応する主たる機構は，炭化水素分解性フロラ（flor
a）による生物分解からなっている。
起こす現象は周知である。生態系が炭化水素による汚染
と反応する主たる機構は，炭化水素分解性フロラ（flor
a）による生物分解からなっている。
【０００３】通常条件では実質的に水不混和性の液体で
ある石油は微細な層”ステイン（stain）”の形で水面
上に拡散する傾向がある。
ある石油は微細な層”ステイン（stain）”の形で水面
上に拡散する傾向がある。
【０００４】生物分解に関しては，”ステイン”を砕い
て分散し得る現象はいずれも陽性であると見做されるべ
きである。事実，水中に懸濁もしくは乳化する固形粒子
上への部分溶解もしくは付着は，一層広い付着表面が与
えられる微生物の活動にとり有利である。
て分散し得る現象はいずれも陽性であると見做されるべ
きである。事実，水中に懸濁もしくは乳化する固形粒子
上への部分溶解もしくは付着は，一層広い付着表面が与
えられる微生物の活動にとり有利である。
【０００５】これらの考察に基ずいて，広範囲の合成分
散剤／乳化剤が生産されているが，これら製品の環境へ
の毒性および永続性の見地から，それらの使用は依然と
して意見が対立している。
散剤／乳化剤が生産されているが，これら製品の環境へ
の毒性および永続性の見地から，それらの使用は依然と
して意見が対立している。
【０００６】上記事実は，微生物由来のバイオサーファ
クタント使用の可能性についての研究が過去数年におい
て広く実施されてきた理由を説明する。事実，バイオサ
ーファクタントは生物分解性があり，したがって現在使
用される合成化合物よりも毒性が少ない可能性を秘めて
いる。
クタント使用の可能性についての研究が過去数年におい
て広く実施されてきた理由を説明する。事実，バイオサ
ーファクタントは生物分解性があり，したがって現在使
用される合成化合物よりも毒性が少ない可能性を秘めて
いる。
【０００７】特に興味が持てるバイオサーファクタント
の一群は， Acinetobacter calcoaceticus菌株から産
生されるリポ多糖バイオポリマーにより代表される。
の一群は， Acinetobacter calcoaceticus菌株から産
生されるリポ多糖バイオポリマーにより代表される。
【０００８】現在，市場で入手できる唯一の上記製品は
Emulsan，すなわちAcinetobacter calcoaceticus 株
ＲＡＧＩ ＡＴＣＣ ３１０１２（米国特許第3,941,69
2 号および同第4,395,354 号）を用いた醗酵により得ら
れるポリアニオン性リポ多糖である。
Emulsan，すなわちAcinetobacter calcoaceticus 株
ＲＡＧＩ ＡＴＣＣ ３１０１２（米国特許第3,941,69
2 号および同第4,395,354 号）を用いた醗酵により得ら
れるポリアニオン性リポ多糖である。
【０００９】このバイオサーファクタントは油／水エマ
ルションの形成および安定化能力があり，合成界面活性
剤（ＰＣＴ ＷＯ第8501.889 号）と共に重質原油（hea
vy crude oils）の輸送のため，およびタンク清浄化用
に専ら使用されている。Emulsanは化粧品（ＥＰ242.296
号、ＤＥ3.610.384号、ＪＰ62.286.914号、ＪＰ62.289.
508号）および洗剤（ＪＰ第62.297.397号）等の分野で
も使用できる。
ルションの形成および安定化能力があり，合成界面活性
剤（ＰＣＴ ＷＯ第8501.889 号）と共に重質原油（hea
vy crude oils）の輸送のため，およびタンク清浄化用
に専ら使用されている。Emulsanは化粧品（ＥＰ242.296
号、ＤＥ3.610.384号、ＪＰ62.286.914号、ＪＰ62.289.
508号）および洗剤（ＪＰ第62.297.397号）等の分野で
も使用できる。
【００１０】バイオサーファクタントにより惹起される
水中油の分散ならびに水／油界面の表面増加も，その特
性を修飾することは既知である。これにより油および微
生物の表面の間の親和性に変化を引き起こせる。
水中油の分散ならびに水／油界面の表面増加も，その特
性を修飾することは既知である。これにより油および微
生物の表面の間の親和性に変化を引き起こせる。
【００１１】特にこれが，水／油界面への付着が生物分
解プロセス活性化の基本的前提である炭化水素分解性フ
ロラの親和性を変更させうる。
解プロセス活性化の基本的前提である炭化水素分解性フ
ロラの親和性を変更させうる。
【００１２】上記現象は細胞膜と油表面間の複雑な相互
作用により左右されるために，分散剤が炭化水素への細
胞の付着性を改良するのか，または阻害するかを論理的
に予め予測するのは現在のところで不可能である。
作用により左右されるために，分散剤が炭化水素への細
胞の付着性を改良するのか，または阻害するかを論理的
に予め予測するのは現在のところで不可能である。
【００１３】しかし，それらの直鎖型構造と高分子量と
が原因で，リポ多糖バイオサーファクタントは水／油界
面の特性を著しく修飾し，これにより微生物の付着能に
有意の変化を決定付けるものと推定できる。
が原因で，リポ多糖バイオサーファクタントは水／油界
面の特性を著しく修飾し，これにより微生物の付着能に
有意の変化を決定付けるものと推定できる。
【００１４】実際は，ポリマー性バイオサーファクタン
トのEmulsanは水／油界面への微生物の付着を阻害する
ことが見いだされている［E. Rosenberg ら，Infect.
Immun., 39, 1024-1028 (1983)］。換言すれば，このバ
イオサーファクタントで被覆された油表面はバイオマス
との類似性が低減し，それに対する付着能が低下する。
トのEmulsanは水／油界面への微生物の付着を阻害する
ことが見いだされている［E. Rosenberg ら，Infect.
Immun., 39, 1024-1028 (1983)］。換言すれば，このバ
イオサーファクタントで被覆された油表面はバイオマス
との類似性が低減し，それに対する付着能が低下する。
【００１５】Emulsan は直鎖型アルカンおよび他の飽和
炭化水素ならびに芳香族化合物の生物分解を，混合培養
または純粋培養では５０−９０％低減させることも観察
されている［J.M. Foght ら，Appl. Environ. Microbio
l., 55, 36-42 (1989)］。
炭化水素ならびに芳香族化合物の生物分解を，混合培養
または純粋培養では５０−９０％低減させることも観察
されている［J.M. Foght ら，Appl. Environ. Microbio
l., 55, 36-42 (1989)］。
【００１６】これらの結果，この種の乳化剤は，水中へ
原油が流出する場合に惹起し得る種類の環境問題を解決
するには適当でないことになる。
原油が流出する場合に惹起し得る種類の環境問題を解決
するには適当でないことになる。
【００１７】
【課題を解決するための手段】この度，新規 Acinetoba
cter calcoaceticus 菌株の使用により，上記既知の不
利益が克服できることが判明した。
cter calcoaceticus 菌株の使用により，上記既知の不
利益が克服できることが判明した。
【００１８】この菌株は，特に油／水の乳濁液の形成お
よび安定化能に優れ，同時に水／油界面への微生物の付
着を容易にし，かつ水中炭化水素の生物分解を促進する
ヘキソ細胞のリポ多糖系バイオサーファクタント（以下
用語ＥＰＳと呼称することがある）を産生する。
よび安定化能に優れ，同時に水／油界面への微生物の付
着を容易にし，かつ水中炭化水素の生物分解を促進する
ヘキソ細胞のリポ多糖系バイオサーファクタント（以下
用語ＥＰＳと呼称することがある）を産生する。
【００１９】この菌株の試料は 1997 年７月２２日付き
受託番号ＣＢＳ 962,97 号としてCentraalbureau voor
Schimmelcultures (CBS) に寄託された。
受託番号ＣＢＳ 962,97 号としてCentraalbureau voor
Schimmelcultures (CBS) に寄託された。
【００２０】結論的に本発明目的は，菌株 A. calcoace
ticus CBS 962.97 に関する。本発明の他の目的は，菌
株 A. calcoaceticus CBS 962.97から得られるバイオサ
ーファクタントに関する。本発明のさらなる目的は，菌
株 A. calcoaceticus CBS 962.97の使用を特徴とする上
記バイオサーファクタントの調製方法に関する。本発明
の他の目的は，エネルギーおよび環境分野における，か
くして得られたバイオサーファクタントの使用に関す
る。本発明のさらなる目的は，次の記載および実施例の
判読により一層明瞭になろう。
ticus CBS 962.97 に関する。本発明の他の目的は，菌
株 A. calcoaceticus CBS 962.97から得られるバイオサ
ーファクタントに関する。本発明のさらなる目的は，菌
株 A. calcoaceticus CBS 962.97の使用を特徴とする上
記バイオサーファクタントの調製方法に関する。本発明
の他の目的は，エネルギーおよび環境分野における，か
くして得られたバイオサーファクタントの使用に関す
る。本発明のさらなる目的は，次の記載および実施例の
判読により一層明瞭になろう。
【００２１】［発明の具体的説明］石油生成物を乳化し
得るバイオサーファクタント生産者である微生物菌株を
単離する目的で，炭化水素類（原油，ガス油および揮発
油）で汚染された場所から採取した土壌試料を用いた。
得るバイオサーファクタント生産者である微生物菌株を
単離する目的で，炭化水素類（原油，ガス油および揮発
油）で汚染された場所から採取した土壌試料を用いた。
【００２２】Bushnell-Haas 法［J. Bateriol., 41, 6
53-673 (1940)］に準拠して，単一炭素源としての炭化
水素（例えば，燃料油，原油，ワセリン油，ｎ−ヘキサ
デカンまたはガス油）を含む塩分含有土壌中で逐次的に
濃縮および精製して単離したが，他の従来技法も採用で
きる。
53-673 (1940)］に準拠して，単一炭素源としての炭化
水素（例えば，燃料油，原油，ワセリン油，ｎ−ヘキサ
デカンまたはガス油）を含む塩分含有土壌中で逐次的に
濃縮および精製して単離したが，他の従来技法も採用で
きる。
【００２３】各種表現型の乳化能力を”クラック試験”
［Krigsvoll らの " Microbial emulsification of cru
de oil" in Proceedings of the 5th European Congre
ss in Biotechnology, Vol. I, 221-224 頁，コペンハ
ーゲン, 1990, ７月) ］の手法に準拠して予備的に試験
した。この方法は，炭化水素例えば原油と純培養物とを
接触させ，バイオサーファクタントの存在下に得られる
油のメニスカス破壊を確認することからなる。
［Krigsvoll らの " Microbial emulsification of cru
de oil" in Proceedings of the 5th European Congre
ss in Biotechnology, Vol. I, 221-224 頁，コペンハ
ーゲン, 1990, ７月) ］の手法に準拠して予備的に試験
した。この方法は，炭化水素例えば原油と純培養物とを
接触させ，バイオサーファクタントの存在下に得られる
油のメニスカス破壊を確認することからなる。
【００２４】得られた結果は，高乳化能を有する単一菌
株の存在を示した。この菌株を略号ＥＲ−９６として予
備的に識別した。
株の存在を示した。この菌株を略号ＥＲ−９６として予
備的に識別した。
【００２５】菌株ＥＲ−９６の特性決定のためには，Be
rgey´s Manual of SystematicBacteriology, Vol I, 3
06頁，Krieg & Holt Eds., 1984, Williams & Wilkins,
Baltimore, および”The Biology of Acinetobacter",
Towner, Bergogne-Berezin および Fewson eds., 1991,
Plenum Press, New York 記載の方法を参照した。菌
株ＥＲ−９６の分類学的特性一覧表を次に示す： Ａ）形態および染色特性 ＧＲＡＭ−反応 陰性 細胞形態 定常期で球菌状 細胞寸法（μｍ） ０．８×１．８（多形態細胞） 移動性 陰性 莢膜（capsule）産生 陽性 Ｂ）培養特性 栄養寒天上のコロニー 環状 寒天上の色素形成 陰性 コロニー隆起 凸形 コロニー表面 平滑 コロニー縁 全体 コロニー乳化性 陽性 温度 ３０℃ ｐＨ ７ Ｃ）生理特性 シトクロム−オキシダーゼ 陰性 カタラーゼ 陽性 Ｏｘ／Ｆ，ａｃｃ．Ｌｅｉｆｓｏｎ 酸化性（Oxidating) メチル−レッド試験 陰性 ウレアーゼ 陰性 ゼラチナーゼ，ａｃｃ．Ｋｏｈｎ 陰性 アルカリホスフアターゼ 陽性 エステラーゼ−リパーゼ 陽性 トリプシン 陰性 酸ホスフアターゼ 陽性 ナフトール−ホスフオヒドロラ−ゼ 陽性 α−ガラクトシダーゼ 陰性 β−ガラクトシダーゼ 陰性 トリプトフアンからのインドール 陰性 ピルビン酸塩からのアセトイン 陽性 硝酸塩→亜硝酸塩への還元 陰性 硝酸塩→Ｎ2 への還元 陰性 Ｄ）炭素源の使用 グリセロール − アルブチン − Ｄ−フコース ＋ エリトリトール − エスクリン − Ｌ−フコース − Ｄ−アラビノース ＋ セロビオース − Ｌ−アラビトール − リボース ＋ マルトース − グルコン酸塩 − Ｄ−キシロース − ラクトース − ２−ケト−グルコネート− Ｌ−キシロース − メリビオース ＋ ５−ケト−グルコネート− アドニトール − スクロース − カプリン酸塩 ＋ ガラクトース ＋ トレアロース − アジピン酸塩 ＋ グルコース ＋ イヌリン − リンゴ酸塩 ＋ フルクトース − メレジトース − フエニル酢酸塩 ＋ マンノース ＋ ラフイノース − クエン酸塩 ＋ ソルボース − 可溶性澱粉 − エタノール ＋ ラムノース − グリコーゲン − 酢酸カルシウム ± ズルシトール − キシリトール − ヘキサデカン ＋ イノシトール − ゲンチオビオース± オリーブ油 ＋ マンニトール − ツラノース − Ｔｗｅｅｎ−８０ ＋ ソルビトール − Ｄ−リソース − アミグダリン − Ｄ−タガトース− 表中：＋ ＝陽性同化； − ＝陰性同化； ± ＝弱い同化
rgey´s Manual of SystematicBacteriology, Vol I, 3
06頁，Krieg & Holt Eds., 1984, Williams & Wilkins,
Baltimore, および”The Biology of Acinetobacter",
Towner, Bergogne-Berezin および Fewson eds., 1991,
Plenum Press, New York 記載の方法を参照した。菌
株ＥＲ−９６の分類学的特性一覧表を次に示す： Ａ）形態および染色特性 ＧＲＡＭ−反応 陰性 細胞形態 定常期で球菌状 細胞寸法（μｍ） ０．８×１．８（多形態細胞） 移動性 陰性 莢膜（capsule）産生 陽性 Ｂ）培養特性 栄養寒天上のコロニー 環状 寒天上の色素形成 陰性 コロニー隆起 凸形 コロニー表面 平滑 コロニー縁 全体 コロニー乳化性 陽性 温度 ３０℃ ｐＨ ７ Ｃ）生理特性 シトクロム−オキシダーゼ 陰性 カタラーゼ 陽性 Ｏｘ／Ｆ，ａｃｃ．Ｌｅｉｆｓｏｎ 酸化性（Oxidating) メチル−レッド試験 陰性 ウレアーゼ 陰性 ゼラチナーゼ，ａｃｃ．Ｋｏｈｎ 陰性 アルカリホスフアターゼ 陽性 エステラーゼ−リパーゼ 陽性 トリプシン 陰性 酸ホスフアターゼ 陽性 ナフトール−ホスフオヒドロラ−ゼ 陽性 α−ガラクトシダーゼ 陰性 β−ガラクトシダーゼ 陰性 トリプトフアンからのインドール 陰性 ピルビン酸塩からのアセトイン 陽性 硝酸塩→亜硝酸塩への還元 陰性 硝酸塩→Ｎ2 への還元 陰性 Ｄ）炭素源の使用 グリセロール − アルブチン − Ｄ−フコース ＋ エリトリトール − エスクリン − Ｌ−フコース − Ｄ−アラビノース ＋ セロビオース − Ｌ−アラビトール − リボース ＋ マルトース − グルコン酸塩 − Ｄ−キシロース − ラクトース − ２−ケト−グルコネート− Ｌ−キシロース − メリビオース ＋ ５−ケト−グルコネート− アドニトール − スクロース − カプリン酸塩 ＋ ガラクトース ＋ トレアロース − アジピン酸塩 ＋ グルコース ＋ イヌリン − リンゴ酸塩 ＋ フルクトース − メレジトース − フエニル酢酸塩 ＋ マンノース ＋ ラフイノース − クエン酸塩 ＋ ソルボース − 可溶性澱粉 − エタノール ＋ ラムノース − グリコーゲン − 酢酸カルシウム ± ズルシトール − キシリトール − ヘキサデカン ＋ イノシトール − ゲンチオビオース± オリーブ油 ＋ マンニトール − ツラノース − Ｔｗｅｅｎ−８０ ＋ ソルビトール − Ｄ−リソース − アミグダリン − Ｄ−タガトース− 表中：＋ ＝陽性同化； − ＝陰性同化； ± ＝弱い同化
【００２６】形態、生理および培養学的試験結果に基ず
いて、本発明菌株ＥＲ−９６をAcinetobacter群、一層
具体的には Acinetobacter calcoaceticus 種に任命す
ることが可能であった。
いて、本発明菌株ＥＲ−９６をAcinetobacter群、一層
具体的には Acinetobacter calcoaceticus 種に任命す
ることが可能であった。
【００２７】菌株ＥＲ−９６の試験によればＥＲ−９６
は，特許文献記載のA.calcoaceticusの他の菌株であるE
mulsanの産生菌株 A. calcoaceticus RAG-1(Rosenberg,
E.); 新規バイオサーファクタント（ＥＰ−401700) の
産生菌株 A. calcoaceticus 217 (Tanaka, Y.) とは識
別可能な特徴をも示した。
は，特許文献記載のA.calcoaceticusの他の菌株であるE
mulsanの産生菌株 A. calcoaceticus RAG-1(Rosenberg,
E.); 新規バイオサーファクタント（ＥＰ−401700) の
産生菌株 A. calcoaceticus 217 (Tanaka, Y.) とは識
別可能な特徴をも示した。
【００２８】菌株ＥＲ−９６，ＲＡＧ−１および２１７
の特徴は表１のようである：表１ ＥＲ−９６ ＲＡＧ−１ ２１７ 平均細胞寸法μｍ ０．８×１．８ １．３×３．３ １．８×２．６（多形態細胞） 顕著な生理学的特徴 ゼラチナーゼ − ＋ ＋ 硝酸塩から亜硝酸への還元 − ＋ ＋ 硝酸塩からＮ2 への還元 − ｎ．ｄ． ＋ インドール産生 − ｎ．ｄ． ＋ ＮＨ4 + 利用 ＋ ＋ − ウレアーゼ − − ＋ Ｏｘ／Ｆｅｒｍ．試験 酸化性 ｎ．ｄ． 醗酵性 リシンデカルボキシラーゼ − ｎ．ｄ． ＋ 各種炭素源の同化 Ｌ−アラビノース ＋ ＋ − Ｄ−キシロース − ＋ − Ｄ−マンノース ＋ ＋ − Ｄ−フルクトース − ＋ ＋ ガラクトース ＋ ＋ − Ｄ−マルトース − ＋ ＋ スクロース − ＋ ＋ トレアロース − ＋ ＋ Ｄ−マンニトール − ＋ ＋グリセロール − ＋ − 表中：＋ ＝ 陽性活性； − ＝ 陰性活性； ｎ．ｄ． ＝データ得られず
の特徴は表１のようである：表１ ＥＲ−９６ ＲＡＧ−１ ２１７ 平均細胞寸法μｍ ０．８×１．８ １．３×３．３ １．８×２．６（多形態細胞） 顕著な生理学的特徴 ゼラチナーゼ − ＋ ＋ 硝酸塩から亜硝酸への還元 − ＋ ＋ 硝酸塩からＮ2 への還元 − ｎ．ｄ． ＋ インドール産生 − ｎ．ｄ． ＋ ＮＨ4 + 利用 ＋ ＋ − ウレアーゼ − − ＋ Ｏｘ／Ｆｅｒｍ．試験 酸化性 ｎ．ｄ． 醗酵性 リシンデカルボキシラーゼ − ｎ．ｄ． ＋ 各種炭素源の同化 Ｌ−アラビノース ＋ ＋ − Ｄ−キシロース − ＋ − Ｄ−マンノース ＋ ＋ − Ｄ−フルクトース − ＋ ＋ ガラクトース ＋ ＋ − Ｄ−マルトース − ＋ ＋ スクロース − ＋ ＋ トレアロース − ＋ ＋ Ｄ−マンニトール − ＋ ＋グリセロール − ＋ − 表中：＋ ＝ 陽性活性； − ＝ 陰性活性； ｎ．ｄ． ＝データ得られず
【００２９】バイオサーファクタントの産生および性質 炭素源として例えばｎ−ヘキサデカン，原油，ガス油ま
たは他の生成物等の炭化水素を用いて液体培地中で菌株
ＥＲ−９６を培養すると，細胞の成長につれてこれが乳
化されることが観察された。
たは他の生成物等の炭化水素を用いて液体培地中で菌株
ＥＲ−９６を培養すると，細胞の成長につれてこれが乳
化されることが観察された。
【００３０】例えばエタノール等の水可溶性炭素源を用
いて菌株ＥＲ−９６を培養すると，乳化は直接には観察
され得ないが，この培地に炭化水素を添加するとこれら
は直ちに乳化される。
いて菌株ＥＲ−９６を培養すると，乳化は直接には観察
され得ないが，この培地に炭化水素を添加するとこれら
は直ちに乳化される。
【００３１】炭素源としてエタノールを用いて菌株ＥＲ
−９６を培養し，醗酵中に培養ブロス（broth）のアリ
コットを採取し、かつ例えば遠心分離により細胞を除去
すると、無細胞上清は極めて安定した態様で炭化水素を
乳化し，この能力は醗酵末期まで増加することも観察さ
れた。この結果は，菌株ＥＲ−９６により産生されるバ
イオサーファクタントが醗酵ブロス中に放出されること
を示す。
−９６を培養し，醗酵中に培養ブロス（broth）のアリ
コットを採取し、かつ例えば遠心分離により細胞を除去
すると、無細胞上清は極めて安定した態様で炭化水素を
乳化し，この能力は醗酵末期まで増加することも観察さ
れた。この結果は，菌株ＥＲ−９６により産生されるバ
イオサーファクタントが醗酵ブロス中に放出されること
を示す。
【００３２】菌株ＥＲ−９６により産生されたバイオサ
ーファクタントを用いて得られる、水中の炭化水素の乳
濁物は何ケ月間も安定に維持される。時間の経過および
静止条件下に，分散油滴は低密度のために表面に上昇す
るが合体せず、生成クリームは極めて容易に再分散がで
きる。
ーファクタントを用いて得られる、水中の炭化水素の乳
濁物は何ケ月間も安定に維持される。時間の経過および
静止条件下に，分散油滴は低密度のために表面に上昇す
るが合体せず、生成クリームは極めて容易に再分散がで
きる。
【００３３】バイオサーファクタントの産生は醗酵ブロ
スの乳化能を測定すれば追跡できる。この目的には各種
方法が採用でき，これらの方法は無細胞培養ブロスのア
リコットを水または適当な緩衝液で希釈し，一定量の炭
化水素を添加して混合物を撹拌し，かつ乳濁物の濁度を
測定することからなる。
スの乳化能を測定すれば追跡できる。この目的には各種
方法が採用でき，これらの方法は無細胞培養ブロスのア
リコットを水または適当な緩衝液で希釈し，一定量の炭
化水素を添加して混合物を撹拌し，かつ乳濁物の濁度を
測定することからなる。
【００３４】本発明で採用する再現性の非常に良い系
は，Gutnick らの（ＥＰ第16,546）記載の方法の変形型
である：すなわちヘキサデカンと２−メチルナフタレン
との混合物（１：１）５０μｌを，ＭｇＳＯ4 １０ｍＭ
を含むトリス−ヒドロキシメチルアミノメタン２０ｍＭ
緩衝液ｐＨ７．２中のバイオサーファクタント溶液３．
２５ｍｌに添加し，全混合物を撹拌する；この乳濁物の
光学密度を光距１ｃｍでキユベット中，６２０ｎｍで測
定する。
は，Gutnick らの（ＥＰ第16,546）記載の方法の変形型
である：すなわちヘキサデカンと２−メチルナフタレン
との混合物（１：１）５０μｌを，ＭｇＳＯ4 １０ｍＭ
を含むトリス−ヒドロキシメチルアミノメタン２０ｍＭ
緩衝液ｐＨ７．２中のバイオサーファクタント溶液３．
２５ｍｌに添加し，全混合物を撹拌する；この乳濁物の
光学密度を光距１ｃｍでキユベット中，６２０ｎｍで測
定する。
【００３５】Eniricerche 乳化能単位（１ ＵＥ）と
は，上記条件下に１の光学密度を生ずるバイオサーファ
クタントの量を指す。
は，上記条件下に１の光学密度を生ずるバイオサーファ
クタントの量を指す。
【００３６】したがって，特定された乳化能は産生物１
ｍｇの乳化能として定義される。
ｍｇの乳化能として定義される。
【００３７】研究を継続するにつれて，バイオサーファ
クタントを含む無細胞醗酵ブロスを透析しても透析され
ないので，このバイオサーファクタントはポリマーの性
質を示すことが判った。
クタントを含む無細胞醗酵ブロスを透析しても透析され
ないので，このバイオサーファクタントはポリマーの性
質を示すことが判った。
【００３８】無細胞凍結乾燥醗酵ブロスは粗製（ｒａ
ｗ）ＥＰＳの用語で表示した。
ｗ）ＥＰＳの用語で表示した。
【００３９】このバイオサーファクタントの構造および
性質測定のために，これを単離し精製した。この目的に
は、例えば硫酸アンモニウムを用いた選択的沈殿法，中
空繊維もしくは平膜等のらせん状限外濾過膜を用いた醗
酵ブロスの濃縮および脱塩，または固体担体上の選択吸
着等の各種技法が使用できる。
性質測定のために，これを単離し精製した。この目的に
は、例えば硫酸アンモニウムを用いた選択的沈殿法，中
空繊維もしくは平膜等のらせん状限外濾過膜を用いた醗
酵ブロスの濃縮および脱塩，または固体担体上の選択吸
着等の各種技法が使用できる。
【００４０】本発明の実施態様では，醗酵ブロスに硫酸
アンモニウム添加してこのポリマー性のバイオサーファ
クタントを沈降させた。飽和値の３０から４０％範囲の
硫酸アンモニウム濃度を用いて遠心分離で回収し，水に
対して透析し，かつ凍結乾燥して得られた沈殿をＥＰＳ
と呼称した。
アンモニウム添加してこのポリマー性のバイオサーファ
クタントを沈降させた。飽和値の３０から４０％範囲の
硫酸アンモニウム濃度を用いて遠心分離で回収し，水に
対して透析し，かつ凍結乾燥して得られた沈殿をＥＰＳ
と呼称した。
【００４１】このバイオサーファクタントは，タンパク
質約２０−２５重量％［Bio-Rad Protein Assay Kit
「バイオ・ラド」プロテインアッセイキット］，リポ多
糖約６５−７０重量％，ならびに金属イオン，本質的に
はマグネシウムおよびナトリウムの残部％からなること
が判明している。
質約２０−２５重量％［Bio-Rad Protein Assay Kit
「バイオ・ラド」プロテインアッセイキット］，リポ多
糖約６５−７０重量％，ならびに金属イオン，本質的に
はマグネシウムおよびナトリウムの残部％からなること
が判明している。
【００４２】ＥＰＳの上記特有乳化能は９３ ＵＥ／ｍ
ｇ［４２８ ＵＧ／ｍｇに該当，この場合のＵＧは３３
０ＵＧ／ｍｇに相当するEmulsanの場合に Gutnick ら
（EPA16546 号）が定義した単位を指す］であることが
証明された。
ｇ［４２８ ＵＧ／ｍｇに該当，この場合のＵＧは３３
０ＵＧ／ｍｇに相当するEmulsanの場合に Gutnick ら
（EPA16546 号）が定義した単位を指す］であることが
証明された。
【００４３】リポ多糖の精製および特徴ずけ 上記バイオサーファクタント中に存在するリポ多糖の物
理化学的および構造的特徴ずけを可能にするために，Ｅ
ＰＳをさらに精製して核酸に関して可能性のある一切の
汚染物を除去し，リポ多糖をタンパク質と金属イオンと
から分離した。
理化学的および構造的特徴ずけを可能にするために，Ｅ
ＰＳをさらに精製して核酸に関して可能性のある一切の
汚染物を除去し，リポ多糖をタンパク質と金属イオンと
から分離した。
【００４４】核酸の除去はヌクレアーゼを用いて酵素的
に実施でき，一方，タンパク質フラクションは酵素的消
化もしくは温フエノール処理またはこれらの併用により
除去できる。
に実施でき，一方，タンパク質フラクションは酵素的消
化もしくは温フエノール処理またはこれらの併用により
除去できる。
【００４５】本発明の実施態様では，先ず無核酸の上記
ＥＰＳをプロテアーゼで処理し，次いで O.Westphal &
K. Jann ["Methods in Carbohydrate Chemistry", R.
L. Whistler Ed., Vol. V, 83-91頁，Academic Press,
New York, 1965］記載の方法に従って温フエノールで
処理した。
ＥＰＳをプロテアーゼで処理し，次いで O.Westphal &
K. Jann ["Methods in Carbohydrate Chemistry", R.
L. Whistler Ed., Vol. V, 83-91頁，Academic Press,
New York, 1965］記載の方法に従って温フエノールで
処理した。
【００４６】水性抽出物をエチルエーテルで洗浄し、次
いで水，ナトリウムＥＤＴＡ，水，ＮａＣｌ，水，ＨＣ
ｌ，水に対して透析し，次いで凍結乾燥した。無タンパ
クの上記リポ多糖バイオサーファクタントをＥＰＳ Ｉ
Ｉと呼称した。
いで水，ナトリウムＥＤＴＡ，水，ＮａＣｌ，水，ＨＣ
ｌ，水に対して透析し，次いで凍結乾燥した。無タンパ
クの上記リポ多糖バイオサーファクタントをＥＰＳ Ｉ
Ｉと呼称した。
【００４７】ＥＰＳ ＩＩの特有の乳化能はＥＰＳの場
合の約半分（４８ＵＥ／ｍｇ）であることが証明され
た。
合の約半分（４８ＵＥ／ｍｇ）であることが証明され
た。
【００４８】ＥＰＳ ＩＩの物理化学的特性ずけによ
り，次の結果が得られた：−ＨＰＬＣ−ＳＥＣ［Size E
xclusion Chromatography (サイズ排除クロマトグラフ
イー）］により決定された分子量は約1,556,400 ダルト
ン。 −元素分析（％）：Ｃ＝４４．５；Ｈ＝７．３３；Ｎ＝
４．９９；Ｏ＝４０．６；Ｓ＝０。 −赤外スぺクトル（ＦＴ−ＩＲ）。図１に関して： 341
8 cm-1（OH, NH); 2924-2854 cm-1 (CH); 1735 cm-1 (C
O酸およびエステル） 1656-1550 cm-1 (CO アミド）；
1037 cm-1 (グルコシド COC) 。 −ＮＭＲ分析：Ｄ2 Ｏ（重水素化水）中に溶解したＥＰ
ＳＩＩの分析では脂肪族化合物鎖を含む多糖の構造を示
した；メチレン基の存在以外にもメチルおよびアセチル
基の存在に係わる極めて強いシグナルが観察される。 −アミノ化糖：Z. Dische ［Methods of Biochem. Ana
l., 2, 352-358 (1967)］記載の方法を用いて加水分解
したＥＰＳ ＩＩについてアミノ化糖を測定した。この
方法は亜硝酸で糖を脱アミノ化し，過剰試薬をカルバミ
ン酸アンモニウムで分解し，ＨＣｌ中のインドールを用
いて上記脱アミノ化糖と反応させることからなる。 −他の糖類はグルコース標準を用いて Dubois ら［Ana
l. Chem. 28, 350-356(1956)] の方法により測定した。 −グルコースはＵＶ試験 Boehringer ( ヘキソキナー
ゼ、ＡＴＰ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
およびＮＡＤＰ）を用いて測定したが，不存在が証明さ
れた。 −エステル化脂肪酸［I. Stern & B. Shapiro, J. Cli
n. Path., 6, 158-160(1953); スクロースジパルミテー
ト標準（SERVA)］：ヒドロキシアミンと反応させてエス
テル化した酸基はヒドロキサム酸（hydroxamic acids)
へと転換し，塩化第２鉄で紫色に変色した。
り，次の結果が得られた：−ＨＰＬＣ−ＳＥＣ［Size E
xclusion Chromatography (サイズ排除クロマトグラフ
イー）］により決定された分子量は約1,556,400 ダルト
ン。 −元素分析（％）：Ｃ＝４４．５；Ｈ＝７．３３；Ｎ＝
４．９９；Ｏ＝４０．６；Ｓ＝０。 −赤外スぺクトル（ＦＴ−ＩＲ）。図１に関して： 341
8 cm-1（OH, NH); 2924-2854 cm-1 (CH); 1735 cm-1 (C
O酸およびエステル） 1656-1550 cm-1 (CO アミド）；
1037 cm-1 (グルコシド COC) 。 −ＮＭＲ分析：Ｄ2 Ｏ（重水素化水）中に溶解したＥＰ
ＳＩＩの分析では脂肪族化合物鎖を含む多糖の構造を示
した；メチレン基の存在以外にもメチルおよびアセチル
基の存在に係わる極めて強いシグナルが観察される。 −アミノ化糖：Z. Dische ［Methods of Biochem. Ana
l., 2, 352-358 (1967)］記載の方法を用いて加水分解
したＥＰＳ ＩＩについてアミノ化糖を測定した。この
方法は亜硝酸で糖を脱アミノ化し，過剰試薬をカルバミ
ン酸アンモニウムで分解し，ＨＣｌ中のインドールを用
いて上記脱アミノ化糖と反応させることからなる。 −他の糖類はグルコース標準を用いて Dubois ら［Ana
l. Chem. 28, 350-356(1956)] の方法により測定した。 −グルコースはＵＶ試験 Boehringer ( ヘキソキナー
ゼ、ＡＴＰ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
およびＮＡＤＰ）を用いて測定したが，不存在が証明さ
れた。 −エステル化脂肪酸［I. Stern & B. Shapiro, J. Cli
n. Path., 6, 158-160(1953); スクロースジパルミテー
ト標準（SERVA)］：ヒドロキシアミンと反応させてエス
テル化した酸基はヒドロキサム酸（hydroxamic acids)
へと転換し，塩化第２鉄で紫色に変色した。
【００４９】ＥＰＳ ＩＩは，炭素１０から１８の親油
鎖長を有する飽和および／または不飽和酸基からなる脂
質フラクションにエステル結合を介して結合したヘテロ
多糖骨格からなることが立証され，この場合の上記フラ
クションはリポ多糖約５−２０％からなることが判って
いる。
鎖長を有する飽和および／または不飽和酸基からなる脂
質フラクションにエステル結合を介して結合したヘテロ
多糖骨格からなることが立証され，この場合の上記フラ
クションはリポ多糖約５−２０％からなることが判って
いる。
【００５０】この脂質フラクションの構成成分を固定す
るために，脂肪酸のメチルエステルを直接取得する目的
でＥＰＳ ＩＩのアルカリ性加水分解を実施した［the
Association of Official Analytical Chemists （"Off
icial Methods of Analysisof AOAC International",
P. Cunnif Ed., 16th ed., Vol. II, # 41.1.28, AOAC
Int. (1995))のプロトコール第 969.33 号準拠］。
るために，脂肪酸のメチルエステルを直接取得する目的
でＥＰＳ ＩＩのアルカリ性加水分解を実施した［the
Association of Official Analytical Chemists （"Off
icial Methods of Analysisof AOAC International",
P. Cunnif Ed., 16th ed., Vol. II, # 41.1.28, AOAC
Int. (1995))のプロトコール第 969.33 号準拠］。
【００５１】実施に際しては，脂肪酸のメチルエステル
の形成用触媒としての三フッ化ホウ素の存在下，ＥＰＳ
ＩＩをメタノールソーダを用いて沸点下に処理した。
次いでエステルをｎ−ヘプタンで抽出し，脂肪酸をガス
クロマトグラフイー／質量分析により同定した。
の形成用触媒としての三フッ化ホウ素の存在下，ＥＰＳ
ＩＩをメタノールソーダを用いて沸点下に処理した。
次いでエステルをｎ−ヘプタンで抽出し，脂肪酸をガス
クロマトグラフイー／質量分析により同定した。
【００５２】結果は主産物としてのドデカン酸（ラウリ
ン酸）の存在を，第２産物としての３−ヒドロキシ−ド
デカン酸の存在を，および小量の２−ヒドロキシドデカ
ン酸，ヘキサデカン酸（パルミチン酸），オクタデカン
酸（ステアリン酸）およびオクタデセン酸（オレイン
酸）の存在を示した。
ン酸）の存在を，第２産物としての３−ヒドロキシ−ド
デカン酸の存在を，および小量の２−ヒドロキシドデカ
ン酸，ヘキサデカン酸（パルミチン酸），オクタデカン
酸（ステアリン酸）およびオクタデセン酸（オレイン
酸）の存在を示した。
【００５３】Emulsan と比較すると次のような差異を示
した： 表２ 脂肪酸 ＥＰＳ ＩＩ Ｅｍｕｌｓａｎ 全脂肪酸（％） デカン酸（カプリン酸） − １１．４ ドデカン酸（ラウリン酸） ６９．８ ２３．０ ドデセン酸 − ２．４ ２−ヒドロキシドデカン酸 ２．６ １０．５ ３−ヒドロキシドデカン酸 ２０．３ ３９．５ ヘキサデカン酸 ２．０ ０．７ ヘキサデセン酸 − 痕跡 オクタデカン酸 ０．８ ０．３ オクタデセン酸 ０．９ 痕跡同定されず ３．９ １２．０ 脂肪酸量は試料毎に，および成長条件毎に変わり得る
が，ドデカン酸および３−ヒドロキシ−ドデカン酸は常
に主生成物として９５から５０％の範囲で存在し，ドデ
カン酸は３−ヒドロキシ−ドデカン酸に対して一般的に
優勢である。
した： 表２ 脂肪酸 ＥＰＳ ＩＩ Ｅｍｕｌｓａｎ 全脂肪酸（％） デカン酸（カプリン酸） − １１．４ ドデカン酸（ラウリン酸） ６９．８ ２３．０ ドデセン酸 − ２．４ ２−ヒドロキシドデカン酸 ２．６ １０．５ ３−ヒドロキシドデカン酸 ２０．３ ３９．５ ヘキサデカン酸 ２．０ ０．７ ヘキサデセン酸 − 痕跡 オクタデカン酸 ０．８ ０．３ オクタデセン酸 ０．９ 痕跡同定されず ３．９ １２．０ 脂肪酸量は試料毎に，および成長条件毎に変わり得る
が，ドデカン酸および３−ヒドロキシ−ドデカン酸は常
に主生成物として９５から５０％の範囲で存在し，ドデ
カン酸は３−ヒドロキシ−ドデカン酸に対して一般的に
優勢である。
【００５４】ポリマーの酸加水分解を不活性雰囲気中１
０５℃，４時間で遂行してＥＰＳＩＩの多糖骨格の特徴
ずけを行った。冷却後，真空下に酸を除去し，沈殿をエ
チルエーテルで崩壊させ抽出し，次いでＤ2 Ｏ中に溶解
し，ＮＭＲ分析にかけた。
０５℃，４時間で遂行してＥＰＳＩＩの多糖骨格の特徴
ずけを行った。冷却後，真空下に酸を除去し，沈殿をエ
チルエーテルで崩壊させ抽出し，次いでＤ2 Ｏ中に溶解
し，ＮＭＲ分析にかけた。
【００５５】完全プロトンのＮＭＲスペクトルを図２に
示す。図３は上記スペクトル（図２）の４．５から５．
５ｐ．ｐ．ｍ．領域の拡大を示し，これには一般に単糖
の１位置の炭素に係わるプロトンのシグナルが含まれ
る。
示す。図３は上記スペクトル（図２）の４．５から５．
５ｐ．ｐ．ｍ．領域の拡大を示し，これには一般に単糖
の１位置の炭素に係わるプロトンのシグナルが含まれ
る。
【００５６】これらのシグナルは，単糖のαおよびβア
ノマー形態が溶液中に同時に存在するために，一般には
二重である。図３のスペクトルは単糖の３種に係わるダ
ブレットの３対を示し、その１つは他の二つに対して優
勢である。
ノマー形態が溶液中に同時に存在するために，一般には
二重である。図３のスペクトルは単糖の３種に係わるダ
ブレットの３対を示し、その１つは他の二つに対して優
勢である。
【００５７】ＥＰＳ ＩＩの多糖骨格を形成する単糖類
を同定するために，予備的な酸加水分解を行った。異な
ったＨＣｌ濃度を使用して各種時間でＥＰＳＩＩのアリ
コットを１００℃で保温し，最適加水分解条件を先ず測
定した。加水分解に続いてアミノ化糖および還元糖両方
を測定した［J. T. Park & M. J. Johnson, J. Biol.Ch
em., 181, 149 (1949)］; 最良条件はＨＣｌ ０．５
Ｍを用いた６時間の加水分解において確認した。
を同定するために，予備的な酸加水分解を行った。異な
ったＨＣｌ濃度を使用して各種時間でＥＰＳＩＩのアリ
コットを１００℃で保温し，最適加水分解条件を先ず測
定した。加水分解に続いてアミノ化糖および還元糖両方
を測定した［J. T. Park & M. J. Johnson, J. Biol.Ch
em., 181, 149 (1949)］; 最良条件はＨＣｌ ０．５
Ｍを用いた６時間の加水分解において確認した。
【００５８】これらの結果を基に，ＥＰＳ ＩＩを０．
５Ｍ ＨＣｌ中に溶解し，Ｎ2 のガスシール下に６時間
還流沸騰した。溶液を冷却し，真空下に濃縮し，同量の
エチルエーテルで３回抽出した。次いで溶液を蒸発さ
せ，水で希釈し，減圧下に再度濃縮した；乾燥に先立ち
この処理を３回繰り返した。
５Ｍ ＨＣｌ中に溶解し，Ｎ2 のガスシール下に６時間
還流沸騰した。溶液を冷却し，真空下に濃縮し，同量の
エチルエーテルで３回抽出した。次いで溶液を蒸発さ
せ，水で希釈し，減圧下に再度濃縮した；乾燥に先立ち
この処理を３回繰り返した。
【００５９】上記乾燥生成物を水に加え，次いで R. W.
Weath による［Methods Enzymol., 8, 60-78 (1966)]
記載のスキームに従って処理した。Ｈ+ 型強カチオン
樹脂カラム上に加水分解生成物を装填し，次いで溶出液
のｐＨが中性に戻るまでカラムを水で溶離した。
Weath による［Methods Enzymol., 8, 60-78 (1966)]
記載のスキームに従って処理した。Ｈ+ 型強カチオン
樹脂カラム上に加水分解生成物を装填し，次いで溶出液
のｐＨが中性に戻るまでカラムを水で溶離した。
【００６０】樹脂により保持されなかった中性糖および
／または酸からなるフラクションは部分的にのみ特徴ず
けした：Dubois 試験は陽性の反応，アミノ化糖試験は
陰性，ウロン酸［T. Bitter & H. H. Muir, Anal. Bioc
hem., 4, 330-334 (1962)]は陽性であることがわかっ
た。
／または酸からなるフラクションは部分的にのみ特徴ず
けした：Dubois 試験は陽性の反応，アミノ化糖試験は
陰性，ウロン酸［T. Bitter & H. H. Muir, Anal. Bioc
hem., 4, 330-334 (1962)]は陽性であることがわかっ
た。
【００６１】アミノ糖が固定された上記カラムを０．３
Ｍ ＨＣｌを用いてイソクラティク溶離した。捕集フラ
クションの還元糖を分析し，２種のクロマトグラフピー
クが観察された。これらのピークに係わるフラクション
を併合し，乾燥し，水に数回加えてＨＣｌを除き，次い
で凍結乾燥し，ＮＭＲ分析にかけた。
Ｍ ＨＣｌを用いてイソクラティク溶離した。捕集フラ
クションの還元糖を分析し，２種のクロマトグラフピー
クが観察された。これらのピークに係わるフラクション
を併合し，乾燥し，水に数回加えてＨＣｌを除き，次い
で凍結乾燥し，ＮＭＲ分析にかけた。
【００６２】最初のピークはグルコサミンと同定され
た：このプロトンのＮＭＲスペクトルは市販グルコサミ
ン・ＨＣｌ試料（Fluka) のスペクトルと同一であっ
た。第２ピーク（図４）のスペクトルは６位のメチル
（−ＣＨ2 ＯＨよりも寧ろ）を有するアミノヘキソース
のスペクトルと整合性があった；具体的にはこの化合物
は２−アミノ−２，６−ジデオキシアルドヘキソースで
あることが立証され，多糖骨格の約７０−８０％を表
す。
た：このプロトンのＮＭＲスペクトルは市販グルコサミ
ン・ＨＣｌ試料（Fluka) のスペクトルと同一であっ
た。第２ピーク（図４）のスペクトルは６位のメチル
（−ＣＨ2 ＯＨよりも寧ろ）を有するアミノヘキソース
のスペクトルと整合性があった；具体的にはこの化合物
は２−アミノ−２，６−ジデオキシアルドヘキソースで
あることが立証され，多糖骨格の約７０−８０％を表
す。
【００６３】２位のアミン基の存在は，５３０ｎｍに最
大吸収のある発色団を生ずる Rondle-Morgan 反応［C.
J. M. Rondle & W. T. J. Morgan, Biochem. J., 61,
586(1955); N. Suzuki, Biochem. Biophys. Acta, 177,
371-373(1969)] により確認した。
大吸収のある発色団を生ずる Rondle-Morgan 反応［C.
J. M. Rondle & W. T. J. Morgan, Biochem. J., 61,
586(1955); N. Suzuki, Biochem. Biophys. Acta, 177,
371-373(1969)] により確認した。
【００６４】結論的に上記実験結果は，リポ多糖が７０
−８０％の２−アミノ−２，６−ジデオキシアルドヘキ
ソース，５−１０％のグルコサミンおよび１５−２０％
の一種または２種以上の非アミノ化糖からなるヘテロ多
糖鎖を含むことを示す。このアミン基は全部またはほと
んど全部がアセチル化されていることが立証される。
−８０％の２−アミノ−２，６−ジデオキシアルドヘキ
ソース，５−１０％のグルコサミンおよび１５−２０％
の一種または２種以上の非アミノ化糖からなるヘテロ多
糖鎖を含むことを示す。このアミン基は全部またはほと
んど全部がアセチル化されていることが立証される。
【００６５】既知の生物学的乳化剤との主たる相違点を
表３に示す。 表３ 単糖 ＥＰＳ Emulsan ＢＳＦ２１７ グルコース なし ０−５．２％ ３１％ マンノース ｎ．ｄ． なし １５．５％ ガラクトース ｎ．ｄ． なし ２２．５％ Ｄ−ガラクトサミン なし ２０−３０％ なし グルコサミン ５−１０％ なし なし ２−アミノ−２，６− ７０−８０％ なし なしジデオキシヘキソース ２−アミノ−２−デオキシ− なし ３３％ なし ヘキスロン酸 ウロン酸 ありうる 多分なし １０−１８％
表３に示す。 表３ 単糖 ＥＰＳ Emulsan ＢＳＦ２１７ グルコース なし ０−５．２％ ３１％ マンノース ｎ．ｄ． なし １５．５％ ガラクトース ｎ．ｄ． なし ２２．５％ Ｄ−ガラクトサミン なし ２０−３０％ なし グルコサミン ５−１０％ なし なし ２−アミノ−２，６− ７０−８０％ なし なしジデオキシヘキソース ２−アミノ−２−デオキシ− なし ３３％ なし ヘキスロン酸 ウロン酸 ありうる 多分なし １０−１８％
【００６６】本発明のバイオサーファクタントの機能的
特徴ずけは，主として海水中原油の生物分解刺激剤およ
び炭化水素表面への微生物細胞の付着性刺激に関連す
る。この目的のために二種の実験を行い，ここで炭化水
素上での生育に適応させた炭化水素分解性微生物フロラ
の海水中原油の分解と，海水の土着種微生物フロラの海
水中原油の分解を記録した。
特徴ずけは，主として海水中原油の生物分解刺激剤およ
び炭化水素表面への微生物細胞の付着性刺激に関連す
る。この目的のために二種の実験を行い，ここで炭化水
素上での生育に適応させた炭化水素分解性微生物フロラ
の海水中原油の分解と，海水の土着種微生物フロラの海
水中原油の分解を記録した。
【００６７】A. calcoaceticus ER-96により産生された
バイオサーファクタントの存在下または不在下に，上記
微生物フロラを原油と共に保温してこの実験を行い，さ
らにこのバイオサーファクタントにより誘発される効果
を市販分散剤の効果と比較した。
バイオサーファクタントの存在下または不在下に，上記
微生物フロラを原油と共に保温してこの実験を行い，さ
らにこのバイオサーファクタントにより誘発される効果
を市販分散剤の効果と比較した。
【００６８】醗酵ブロス中に存在の可能性のある栄養物
質に起因する効果をバイオサーファクタントに係わるも
のから分離するために，粗製（ｒａｗ）ＥＰＳとＥＰＳ
との両方を用いたが，結果は同一であった。
質に起因する効果をバイオサーファクタントに係わるも
のから分離するために，粗製（ｒａｗ）ＥＰＳとＥＰＳ
との両方を用いたが，結果は同一であった。
【００６９】原油の生物分解の測定のために，各種の保
温時間後に培養物をFreon-113R（登録商標）と混合し，
遠心分離し，残った炭化水素を有機抽出物中でＥＰＡ 4
18.1法に準拠して赤外分光測光法［"Methods for Chemi
cal Analysis of Water andWastes", J. F. Kopp & G.
D. McKee Eds., Report Nr. EPA-600/4-79-020 (1983)]
により測定した。
温時間後に培養物をFreon-113R（登録商標）と混合し，
遠心分離し，残った炭化水素を有機抽出物中でＥＰＡ 4
18.1法に準拠して赤外分光測光法［"Methods for Chemi
cal Analysis of Water andWastes", J. F. Kopp & G.
D. McKee Eds., Report Nr. EPA-600/4-79-020 (1983)]
により測定した。
【００７０】これらの結果は，ｎ−ヘキサデカンでの生
育に適応させた微生物フロラは粗製ＥＰＳの存在下に保
温１４日後，初期原油の７５％を分解したことを示し
た。この値は，ＥＰＳ不在下の場合の約６倍も大きく，
市販分散剤を用いて得られる値よりも約３倍も大きいこ
とが証明された。
育に適応させた微生物フロラは粗製ＥＰＳの存在下に保
温１４日後，初期原油の７５％を分解したことを示し
た。この値は，ＥＰＳ不在下の場合の約６倍も大きく，
市販分散剤を用いて得られる値よりも約３倍も大きいこ
とが証明された。
【００７１】ＥＰＳ存在下の生物分解は２倍であり，ま
たバイオマスの増加は，無ＥＰＳの対照では１００倍増
加に過ぎないのに対して，次数５（１．１０4 から３．
１０ 9 ）でバイオマスを増加する。
たバイオマスの増加は，無ＥＰＳの対照では１００倍増
加に過ぎないのに対して，次数５（１．１０4 から３．
１０ 9 ）でバイオマスを増加する。
【００７２】さらに，ｎ−ヘプタデカンとプリスタンの
間およびｎ−オクタデセンとフイタンの間の比率の変化
をガスクロマトグラフイーにより分析すると，ＥＰＳ存
在下でのこれらの指数は無ＥＰＳの対照に比べて一層大
きく変わることを示した。
間およびｎ−オクタデセンとフイタンの間の比率の変化
をガスクロマトグラフイーにより分析すると，ＥＰＳ存
在下でのこれらの指数は無ＥＰＳの対照に比べて一層大
きく変わることを示した。
【００７３】結論として本発明バイオサーファクタント
は，炭化水素での生育に適応した炭化水素分解性微生物
フロラおよび土着種微生物フロラの両方による海水中炭
化水素の生物分解を刺激する。この観点ではEmulsanが
阻害効果を示すことを知ることは重要である。
は，炭化水素での生育に適応した炭化水素分解性微生物
フロラおよび土着種微生物フロラの両方による海水中炭
化水素の生物分解を刺激する。この観点ではEmulsanが
阻害効果を示すことを知ることは重要である。
【００７４】炭化水素分解性微生物の炭化水素への付着
性を増進させるＥＰＳの能力を測定する目的でEmulsan
に採用された方法を使用した［E. Rosenbergらの（Infe
ct. Immun.,39, 1024-1028, 1983) ］。この方法は，微
生物懸濁物を一定量の炭化水素と共に温和に震盪し，付
着に起因する微生物懸濁物の濁度の低減を測定すること
からなる。
性を増進させるＥＰＳの能力を測定する目的でEmulsan
に採用された方法を使用した［E. Rosenbergらの（Infe
ct. Immun.,39, 1024-1028, 1983) ］。この方法は，微
生物懸濁物を一定量の炭化水素と共に温和に震盪し，付
着に起因する微生物懸濁物の濁度の低減を測定すること
からなる。
【００７５】Emulsanの場合に生起するものとは対照的
に，ＥＰＳの場合は水／炭化水素界面への細菌細胞の付
着を促進することが判った。事実，Arthrobacter sp.
の純粋培養物および海水中に存在する全有機栄養生物フ
ロラの両方を用いた場合，無ＥＰＳの対照に比べてＥＰ
Ｓの付着性は２から４倍も大きかった。
に，ＥＰＳの場合は水／炭化水素界面への細菌細胞の付
着を促進することが判った。事実，Arthrobacter sp.
の純粋培養物および海水中に存在する全有機栄養生物フ
ロラの両方を用いた場合，無ＥＰＳの対照に比べてＥＰ
Ｓの付着性は２から４倍も大きかった。
【００７６】結論として，この二種のバイオサーファク
タントの構造上の差異に加えて，ＥＰＳの機能的挙動が
Emulsanとは異なることを示す実験的証拠がある：１）
水中炭化水素の生物分解をEmulsanは阻害し，ＥＰＳは
促進すると思われ，かつ２）水／油界面への付着性は，
本発明バイオサーファクタントの場合は減少の代わりに
増加する。
タントの構造上の差異に加えて，ＥＰＳの機能的挙動が
Emulsanとは異なることを示す実験的証拠がある：１）
水中炭化水素の生物分解をEmulsanは阻害し，ＥＰＳは
促進すると思われ，かつ２）水／油界面への付着性は，
本発明バイオサーファクタントの場合は減少の代わりに
増加する。
【００７７】したがって本発明のバイオサーファクタン
トは，海中および水中両方での”油流出”の処理に特に
好適である。
トは，海中および水中両方での”油流出”の処理に特に
好適である。
【００７８】このバイオサーファクタントの産生は，炭
素源，窒素，リンおよび硫黄，ならびにミネラル塩類を
含む培養基中で A. calcoaceticus ER-96 菌株を培養し
て得られる。同化し得る炭素源には，エタノール，ナト
リウム，パルミテート，オレイン酸，大豆油等が包含さ
れる。これらの源の濃度は培養基基準で０．２から５％
好ましくは１から３％の範囲で通常用いられる。窒素源
は例えば硝酸アンモニウム，硫酸アンモニウム，塩化ア
ンモニウム，重炭酸アンモニウム等の無機アンモニウム
塩類から選択でき，またはペプトン，酵素抽出物もしく
は肉抽出物等の有機もしくは無機窒素含有材料から選択
でき，アンモニアも使用可能である。
素源，窒素，リンおよび硫黄，ならびにミネラル塩類を
含む培養基中で A. calcoaceticus ER-96 菌株を培養し
て得られる。同化し得る炭素源には，エタノール，ナト
リウム，パルミテート，オレイン酸，大豆油等が包含さ
れる。これらの源の濃度は培養基基準で０．２から５％
好ましくは１から３％の範囲で通常用いられる。窒素源
は例えば硝酸アンモニウム，硫酸アンモニウム，塩化ア
ンモニウム，重炭酸アンモニウム等の無機アンモニウム
塩類から選択でき，またはペプトン，酵素抽出物もしく
は肉抽出物等の有機もしくは無機窒素含有材料から選択
でき，アンモニアも使用可能である。
【００７９】リン源には，二塩基性もしくは一塩基性リ
ン酸カリウム，リン酸ナトリウム，燐酸アンモニウム等
が包含される。
ン酸カリウム，リン酸ナトリウム，燐酸アンモニウム等
が包含される。
【００８０】次のカチオンおよびアニオンも同様に本発
明の上記目的に好適である：カリウム，ナトリウム，マ
グネシウム，鉄，カルシウム，マンガン，コバルト，
銅，亜鉛，モリブデン，リン酸塩，硫酸塩および塩化
物。１から１００ｍＭ範囲の濃度が一般的に使用され
る。
明の上記目的に好適である：カリウム，ナトリウム，マ
グネシウム，鉄，カルシウム，マンガン，コバルト，
銅，亜鉛，モリブデン，リン酸塩，硫酸塩および塩化
物。１から１００ｍＭ範囲の濃度が一般的に使用され
る。
【００８１】醗酵は２５から３７℃，好ましくは２８か
ら３２℃の温度範囲で著しい曝気条件下に撹拌して実施
する。滅菌圧縮空気を０．２から１容量／容量／分の変
化量で醗酵培地中に循環する。
ら３２℃の温度範囲で著しい曝気条件下に撹拌して実施
する。滅菌圧縮空気を０．２から１容量／容量／分の変
化量で醗酵培地中に循環する。
【００８２】醗酵培地のｐＨは６．５から７．５，好ま
しくは６．８から７．２の範囲内に維持する。ｐＨ調節
は例えばアンモニア，水酸化カリウム，水酸化ナトリウ
ムの水溶液等の塩基性水溶液の添加により実施できる。
ｐＨは１０Ｍ水酸化アンモニウムを用いて所望値に維持
するのが好ましい。
しくは６．８から７．２の範囲内に維持する。ｐＨ調節
は例えばアンモニア，水酸化カリウム，水酸化ナトリウ
ムの水溶液等の塩基性水溶液の添加により実施できる。
ｐＨは１０Ｍ水酸化アンモニウムを用いて所望値に維持
するのが好ましい。
【００８３】醗酵中に形成される泡は，例えばポリプロ
ピレングリコール等の市販品から選択した適当な消泡剤
の添加により，または機械的手段により制御できる。
ピレングリコール等の市販品から選択した適当な消泡剤
の添加により，または機械的手段により制御できる。
【００８４】醗酵プロセスはバッチ，フェッドバッチま
たは連続方式で実施できる。醗酵末期に，バイオサーフ
ァクタントを単離し，既知技法の一つを用いて精製しう
る。別法としては醗酵ブロスそれ自体または細胞を含ま
ないブロスが直接使用しうる。
たは連続方式で実施できる。醗酵末期に，バイオサーフ
ァクタントを単離し，既知技法の一つを用いて精製しう
る。別法としては醗酵ブロスそれ自体または細胞を含ま
ないブロスが直接使用しうる。
【００８５】産生菌株の醗酵中および醗酵末期の培養ブ
ロス中のリポ多糖濃度の測定は二つの方法で実施でき
る：最初の方法は醗酵ブロスの乳化能を測定し，較正曲
線を用いて Enispolの濃度を得ることからなり；第二の
方法はアミノ化糖を測定し，この場合は較正曲線を用い
てＥＰＳ濃度を得ることからなる。次の実施例は本発明
を一層詳細に記載するのが目的であり，本発明範囲を制
限することを意図するものではない。
ロス中のリポ多糖濃度の測定は二つの方法で実施でき
る：最初の方法は醗酵ブロスの乳化能を測定し，較正曲
線を用いて Enispolの濃度を得ることからなり；第二の
方法はアミノ化糖を測定し，この場合は較正曲線を用い
てＥＰＳ濃度を得ることからなる。次の実施例は本発明
を一層詳細に記載するのが目的であり，本発明範囲を制
限することを意図するものではない。
【００８６】
【実施例】実施例１ アシネトバクター・カルコアセチカス(Acinetobacter c
alcoaceticus)ER-96の単離 蒸留水１リットル当たり以下の組成：KH２PO４ 1g; K２
HPO４ 1g; NH４NO３ 1g; MgSO４・7H２O 0.2g; CaCl２
・2H２O0.02g; FeCl３ 0.05g; NaOH 0.1NでpH 7.0; 酵
母抽出物100mg/lを含んだBushnell-Haas培地(BHB)500ml
を含有する2000mlフラスコに、汚染土壌混合物の一部15
0gずつを入れてバイオマスの再活性化を与えた。このフ
ラスコを、200回転/分のオービタル（orbital）スター
ラーで、22℃にて8時間インキュベートした。培養ブロ
ス（broth）のアリコット10mlを、蒸留水１リットル当
たりNaCl 5g;MgS0４・7H２0 1g; KCl 0.7g; KH２PO４ 2
g; Na２HPO４ 3g; NH４NO３ 1g; pH 7.2、並びにAGIP
(登録商標)燃料油、[Forties]原油、およびCarlo Erba
(登録商標)ワセリン油より選択される炭化水素炭素源1%
を含有するMillsら[Can. J. Microbiol., 24, 552-557
(1978)]の改変緩衝ミネラル培地(Buffered Mineral Med
ium, BMM)100mlを各々含有する一連の500mlフラスコの
接種材料として用いた。このフラスコを200回転／分の
オービタルスターラーで、22℃にて10日間インキュベー
トした。次いで、この培養ブロスを用い、用いた炭素源
各々について一連の３回の継代培養を行った。各々20ml
のBMMおよび0.1ml炭素源を含有する50mlフラスコに、種
々の培養ブロスを接種し、続いて、200回転／分のオー
ビタルスターラーで、22℃にて5日間インキュベートし
た。富化培養ブロス中に存在する単一の微生物の表現型
個体群の単離は、2%寒天で固化させた「LAB-LEMCO Brot
h培地(OXOID)」上での培養により行った。このプレート
を22℃にて48時間インキュベートした。全ての中で、形
態的特性および／または色素形成特性において互いとは
明らかに異なるものを発達させたコロニーを選択した。
これらのコロニーを単離し、20mlBHBおよび1%「ライト
・アラビアン(light arabian)」原油を含有する50mlフ
ラスコに接種した。このフラスコを200回転／分のオー
ビタルインキュベーターで、22にて7日間インキュベー
トした。次いで、得られた単一純粋培養物のストリップ
を2%寒天で固化させたBHB培地のプレート上で混合し
た。炭素源は気相中に供給し、プレートのふたに原油／
ワセリン油／軽油の混合物(50:40:10)をしみ込ませた濾
紙のディスクを置いた。このプレートをオーブン中、22
℃にて7日間インキュベートした。各プレートから取り
出したコロニーを種々の希釈でBHB中に懸濁させ、「ク
ラック試験(crack test)」に用いた[Krigsvollら, "Mic
robial emulsification ofcrude oil" in Proceedings
of the 5th European Congress in Biotechnology, 第
Ｉ巻, 221-224頁, Copenhagen, 1990年7月]。この目的
のため、24試験穴を有するポリスチレンプレートを用
い、各試験穴に1mlの微生物懸濁液を入れ、原油0.025ml
で注意深く覆った。この試験穴を直ちに顕微鏡下（10
倍）で調べ、界面活性剤の存在を示す油状メニスカスの
破損を観察した。陽性のシグナルが得られた種々の菌株
のうち、１菌株だけが高い乳化力を有するバイオサーフ
ァクタントを生産することができることがわかった。こ
の菌株を略称ER-96で表し、続いてアシネトバクター・
カルコアセチカスとして同定した。
alcoaceticus)ER-96の単離 蒸留水１リットル当たり以下の組成：KH２PO４ 1g; K２
HPO４ 1g; NH４NO３ 1g; MgSO４・7H２O 0.2g; CaCl２
・2H２O0.02g; FeCl３ 0.05g; NaOH 0.1NでpH 7.0; 酵
母抽出物100mg/lを含んだBushnell-Haas培地(BHB)500ml
を含有する2000mlフラスコに、汚染土壌混合物の一部15
0gずつを入れてバイオマスの再活性化を与えた。このフ
ラスコを、200回転/分のオービタル（orbital）スター
ラーで、22℃にて8時間インキュベートした。培養ブロ
ス（broth）のアリコット10mlを、蒸留水１リットル当
たりNaCl 5g;MgS0４・7H２0 1g; KCl 0.7g; KH２PO４ 2
g; Na２HPO４ 3g; NH４NO３ 1g; pH 7.2、並びにAGIP
(登録商標)燃料油、[Forties]原油、およびCarlo Erba
(登録商標)ワセリン油より選択される炭化水素炭素源1%
を含有するMillsら[Can. J. Microbiol., 24, 552-557
(1978)]の改変緩衝ミネラル培地(Buffered Mineral Med
ium, BMM)100mlを各々含有する一連の500mlフラスコの
接種材料として用いた。このフラスコを200回転／分の
オービタルスターラーで、22℃にて10日間インキュベー
トした。次いで、この培養ブロスを用い、用いた炭素源
各々について一連の３回の継代培養を行った。各々20ml
のBMMおよび0.1ml炭素源を含有する50mlフラスコに、種
々の培養ブロスを接種し、続いて、200回転／分のオー
ビタルスターラーで、22℃にて5日間インキュベートし
た。富化培養ブロス中に存在する単一の微生物の表現型
個体群の単離は、2%寒天で固化させた「LAB-LEMCO Brot
h培地(OXOID)」上での培養により行った。このプレート
を22℃にて48時間インキュベートした。全ての中で、形
態的特性および／または色素形成特性において互いとは
明らかに異なるものを発達させたコロニーを選択した。
これらのコロニーを単離し、20mlBHBおよび1%「ライト
・アラビアン(light arabian)」原油を含有する50mlフ
ラスコに接種した。このフラスコを200回転／分のオー
ビタルインキュベーターで、22にて7日間インキュベー
トした。次いで、得られた単一純粋培養物のストリップ
を2%寒天で固化させたBHB培地のプレート上で混合し
た。炭素源は気相中に供給し、プレートのふたに原油／
ワセリン油／軽油の混合物(50:40:10)をしみ込ませた濾
紙のディスクを置いた。このプレートをオーブン中、22
℃にて7日間インキュベートした。各プレートから取り
出したコロニーを種々の希釈でBHB中に懸濁させ、「ク
ラック試験(crack test)」に用いた[Krigsvollら, "Mic
robial emulsification ofcrude oil" in Proceedings
of the 5th European Congress in Biotechnology, 第
Ｉ巻, 221-224頁, Copenhagen, 1990年7月]。この目的
のため、24試験穴を有するポリスチレンプレートを用
い、各試験穴に1mlの微生物懸濁液を入れ、原油0.025ml
で注意深く覆った。この試験穴を直ちに顕微鏡下（10
倍）で調べ、界面活性剤の存在を示す油状メニスカスの
破損を観察した。陽性のシグナルが得られた種々の菌株
のうち、１菌株だけが高い乳化力を有するバイオサーフ
ァクタントを生産することができることがわかった。こ
の菌株を略称ER-96で表し、続いてアシネトバクター・
カルコアセチカスとして同定した。
【００８７】実施例２ バッチ発酵におけるEPSの生産 A.カルコアセチカス ER-96の凍結乾燥細胞を「Lab-Lemc
o」ブロス培地(OXOID CM 15)中で活性化させ、１リッタ
ー当たりエタノール10g、KH２PO４ 10g、NH４Cl4.0g、M
gSO４・7H２O 0.5g、CaCl２ 2.08mg、CoCl２・6H２O 2.
08mg、MnCl２・4H２O 1.73mg、Na２MoO４ 2.12 mg、MnS
O４・H２O 1.49mg、ZnSO４・7H２O 2.52mg、FeSO４・7H
２O 2.43mg、NaOHでpH 7.4に調整したもの含有する培地
(T1)50mlを含有する250mlフラスコにこの培養物を接種
した(5%)。このフラスコを、180回転／分のオービタル
スターラーで、30℃にて48時間インキュベートし、次い
でこれを用いて、T1培地500mlを含有する、波除け付き2
Lフラスコに接種した。前記条件下で48時間培養を延長
し、続いてこれを用いて、KH２PO４ 7g/l、NH ４Cl 10g/
lおよびMgSO４・7H２O 1g/lを含む以外はT1培地と同様
の組成を有するT2培養ブロス10 1を含有する、波除け付
き14 l Chemap(登録商標)発酵槽に接種した(5%)。２機
のタービンを用いて700回転／分で攪拌しながら、30℃
にて、毎分0.5 l/lの通気を用いて発酵を行った。pHはN
aOHを用いて自動的に７に補正し、発泡はポリプロピレ
ングリコール(PPG2000)を用いて制御した。22時間後、
発酵ブロスを遠心分離して細胞を除去し、次いで（粗
（raw）EPSを形成する）上清を凍結乾燥した。700mg/l
の生成物と3.7g/l（乾燥重量）のバイオマスが得られ
た。
o」ブロス培地(OXOID CM 15)中で活性化させ、１リッタ
ー当たりエタノール10g、KH２PO４ 10g、NH４Cl4.0g、M
gSO４・7H２O 0.5g、CaCl２ 2.08mg、CoCl２・6H２O 2.
08mg、MnCl２・4H２O 1.73mg、Na２MoO４ 2.12 mg、MnS
O４・H２O 1.49mg、ZnSO４・7H２O 2.52mg、FeSO４・7H
２O 2.43mg、NaOHでpH 7.4に調整したもの含有する培地
(T1)50mlを含有する250mlフラスコにこの培養物を接種
した(5%)。このフラスコを、180回転／分のオービタル
スターラーで、30℃にて48時間インキュベートし、次い
でこれを用いて、T1培地500mlを含有する、波除け付き2
Lフラスコに接種した。前記条件下で48時間培養を延長
し、続いてこれを用いて、KH２PO４ 7g/l、NH ４Cl 10g/
lおよびMgSO４・7H２O 1g/lを含む以外はT1培地と同様
の組成を有するT2培養ブロス10 1を含有する、波除け付
き14 l Chemap(登録商標)発酵槽に接種した(5%)。２機
のタービンを用いて700回転／分で攪拌しながら、30℃
にて、毎分0.5 l/lの通気を用いて発酵を行った。pHはN
aOHを用いて自動的に７に補正し、発泡はポリプロピレ
ングリコール(PPG2000)を用いて制御した。22時間後、
発酵ブロスを遠心分離して細胞を除去し、次いで（粗
（raw）EPSを形成する）上清を凍結乾燥した。700mg/l
の生成物と3.7g/l（乾燥重量）のバイオマスが得られ
た。
【００８８】実施例３ NH４OH 10Mを用いてpHを７に補正した以外は、実施例２
に記載したものと同様の操作条件下で発酵を行った。1.
3g/lの生成物と4.2g/l（乾燥重量）のバイオマスが得ら
れた。
に記載したものと同様の操作条件下で発酵を行った。1.
3g/lの生成物と4.2g/l（乾燥重量）のバイオマスが得ら
れた。
【００８９】実施例４ フェッドバッチ発酵を用いるエタノールからのEPSの生
産 実施例３と同様の操作条件下でA.カルコアセチカスER-9
6を培養した。培養ブロスの660nmでの光学濃度が４の値
に達したとき、細胞の複製時間（duplicationtime）が2
4時間となるような流速で、47.5%のエタノール水溶液を
発酵ブロスに加えた。培養83時間後、発酵を中断した。
EPS収率は6.7g/lであり、細胞収率は13g/l（乾燥重量）
であった。
産 実施例３と同様の操作条件下でA.カルコアセチカスER-9
6を培養した。培養ブロスの660nmでの光学濃度が４の値
に達したとき、細胞の複製時間（duplicationtime）が2
4時間となるような流速で、47.5%のエタノール水溶液を
発酵ブロスに加えた。培養83時間後、発酵を中断した。
EPS収率は6.7g/lであり、細胞収率は13g/l（乾燥重量）
であった。
【００９０】実施例５ 発泡をFundafoam(登録商標)(Chemap)破泡剤の使用によ
り機械的に制御し、加えてエタノールの初期濃度を5ml/
lとした以外は、実施例４と同様の手順でA.カ ルコアセ
チカスER-96を培養した。14時間後、培養ブロスの660nm
での光学濃度が4の値に達したとき、複製時間が16時間
となるような量で、エタノールの添加を開始した。発酵
は90時間延長した。20g/lのEPSおよび21g/lのバイオマ
スが得られた。
り機械的に制御し、加えてエタノールの初期濃度を5ml/
lとした以外は、実施例４と同様の手順でA.カ ルコアセ
チカスER-96を培養した。14時間後、培養ブロスの660nm
での光学濃度が4の値に達したとき、複製時間が16時間
となるような量で、エタノールの添加を開始した。発酵
は90時間延長した。20g/lのEPSおよび21g/lのバイオマ
スが得られた。
【００９１】実施例６ オレイン酸からのEPSの生産 単一炭素源としてエタノールの代わりにオレイン酸を用
いた以外は、実施例４と同様の操作条件下でA.カルコア
セチカスER-96を培養した。83時間後のEPS収率は7.5g/
l、細胞収率は24.8g/l（乾燥重量）であった。
いた以外は、実施例４と同様の操作条件下でA.カルコア
セチカスER-96を培養した。83時間後のEPS収率は7.5g/
l、細胞収率は24.8g/l（乾燥重量）であった。
【００９２】実施例７ 大豆油からのEPSの生産 単一炭素源としてオレイン酸の代わりに大豆油を用いた
以外は、実施例６と同様の手段を適用してA.カルコアセ
チカスER-96の細胞を培養した。発酵72時間後のEPS収率
は15g/l、細胞収率は20g/l（乾燥重量）であった。
以外は、実施例６と同様の手段を適用してA.カルコアセ
チカスER-96の細胞を培養した。発酵72時間後のEPS収率
は15g/l、細胞収率は20g/l（乾燥重量）であった。
【００９３】実施例８ EPSの調製 20g/lのエタノールを加えたT2培地10 lを含有する14 l
Chemap(登録商標)発酵槽で、A.カルコアセチカスER-96
の細胞を培養した。必要に応じ種々の時間にエタノール
を追加し、アンモニアでpHを7に維持した。30℃にて70
時間、通気しながら（毎分0.5 l/l）発酵を行った。終
了時、培養物を室温まで冷却し、遠心分離(Alfa-Laval
(登録商標)LAPX 202)により細胞を除去した。その上清
(10.4 l)に硫酸アンモニウム(166g/l)を加えて攪拌下で
一晩放置し、次いで遠心分離した(13,000 x gｍａｘ; S
orvall-DuPont(登録商標)RC-5B)。透明な上清に硫酸ア
ンモニウム(57g/l)を加え、4時間攪拌した後、遠心分離
により沈殿を回収し、最小量の水に溶かし、水に対して
透析し、次いで凍結乾燥した。93UE/mgの固有乳化力を
有する38.5gのEPSが得られた。乳化力はGutnickら[EPA
16546]の方法の変法を用いて求めた。実際には、HClでp
H7.2とし、MgSO4 10mMを含有するトリス-ヒドロキシメ
チルアミノメタン（トリス-HCl）50mMの緩衝液中3.25ml
のEPS溶液を、ネジ式キャップとテフロンシール付きの
硼珪酸塩ガラス試験管25 x 80mmに入れ、次いで、n-ヘ
キサデカンと2-メチルナフタレンの混合物（1:1; 容量
／容量）50μlを加えた。この混合物を、10mmの振幅を
有する垂直振盪攪拌機("Agitest" Bioblock)を用いて80
0ストローク／分で5分間攪拌し、次いで、この試験管の
全内容物をガラスキュベットに注ぎ、620nmにて吸光度
を測定した。前記した標準条件下で１の光学濃度を与え
るバイオサーファクタントの量は、Eniricerche乳化力
単位(1UE)と定義される。従って、固有乳化力は生成物1
mgについての乳化力と定義された。EPSは、約22%のタン
パク質(Bio-Rad Protein Assey Kit)、約67%のリポ多糖
および残分パーセンテージの金属イオン、本質的にマグ
ネシウムおよびナトリウムからなることがわかった。
Chemap(登録商標)発酵槽で、A.カルコアセチカスER-96
の細胞を培養した。必要に応じ種々の時間にエタノール
を追加し、アンモニアでpHを7に維持した。30℃にて70
時間、通気しながら（毎分0.5 l/l）発酵を行った。終
了時、培養物を室温まで冷却し、遠心分離(Alfa-Laval
(登録商標)LAPX 202)により細胞を除去した。その上清
(10.4 l)に硫酸アンモニウム(166g/l)を加えて攪拌下で
一晩放置し、次いで遠心分離した(13,000 x gｍａｘ; S
orvall-DuPont(登録商標)RC-5B)。透明な上清に硫酸ア
ンモニウム(57g/l)を加え、4時間攪拌した後、遠心分離
により沈殿を回収し、最小量の水に溶かし、水に対して
透析し、次いで凍結乾燥した。93UE/mgの固有乳化力を
有する38.5gのEPSが得られた。乳化力はGutnickら[EPA
16546]の方法の変法を用いて求めた。実際には、HClでp
H7.2とし、MgSO4 10mMを含有するトリス-ヒドロキシメ
チルアミノメタン（トリス-HCl）50mMの緩衝液中3.25ml
のEPS溶液を、ネジ式キャップとテフロンシール付きの
硼珪酸塩ガラス試験管25 x 80mmに入れ、次いで、n-ヘ
キサデカンと2-メチルナフタレンの混合物（1:1; 容量
／容量）50μlを加えた。この混合物を、10mmの振幅を
有する垂直振盪攪拌機("Agitest" Bioblock)を用いて80
0ストローク／分で5分間攪拌し、次いで、この試験管の
全内容物をガラスキュベットに注ぎ、620nmにて吸光度
を測定した。前記した標準条件下で１の光学濃度を与え
るバイオサーファクタントの量は、Eniricerche乳化力
単位(1UE)と定義される。従って、固有乳化力は生成物1
mgについての乳化力と定義された。EPSは、約22%のタン
パク質(Bio-Rad Protein Assey Kit)、約67%のリポ多糖
および残分パーセンテージの金属イオン、本質的にマグ
ネシウムおよびナトリウムからなることがわかった。
【００９４】実施例９ EPSIIの調製 実施例４と同様の条件下でA.カルコアセチカスER-96の
発酵を行った。終了時、この培養ブロス10 lに1660gの
硫酸アンモニウムを加えた。4℃にて攪拌下、一晩の
後、この懸濁液を遠心分離し(13,000 x gｍａｘ)、次い
で、得られた上清(7.6リットル)に434gの硫酸アンモニ
ウムを加えた。4℃にて一晩の後、該懸濁液を遠心分離
し、沈殿を2 lの水に溶解し、400mlの容量までカットオ
フ10,000ダルトンの限外濾過スパイラルメンブラン(Ami
con SIY1O)を通すことにより濃縮した。次いでこの溶液
を再び水で2リットルまで希釈し、400mlに再濃縮し、こ
の処理を10回繰り返した。最終的に得られた残留物(1
1)に、MgCl２ 10mM pH 7.2および500単位のＩ級ベンゾ
ナーゼ(Benzon Nuclease(登録商標), Merck)を含有する
1lのトリス-HCl 0.1M緩衝液を加え、これを25℃に3時間
維持して、存在する可能性のあるＤＮＡおよびＲＮＡの
いずれをも破壊した。このようにして得られた溶液を1
リットルに濃縮し、EDTANa2 0.2Mおよび1,4-ジチオトレ
イトール2mM pH8を含有する1 lのトリス-HCl 50mM緩衝
液を加え、25℃にて一晩、32gのパパイン(Calbiochem)
存在下で、全混合物をインキュベートした。O. Westpha
lおよびK. Jann(R. L. Whistlerにより編集された"Meth
ods in Carbohydrate Chemistry", 第Ｖ巻, 83-91頁, A
cademic Press, Inc., New York, 1965)の方法に従い、
1リットルまで減じられた混合物を70℃まで加熱し、次
いで、再蒸留して予め70℃に加熱した等容量のフェノー
ルを加えた。70℃にて激しい攪拌下15分後、混合物を室
温まで冷却し、生じた乳濁液を23,000 x gｍａｘでの遠
心によって分離した。等容量のエーテルで３回抽出した
後、フェノール相を等容量の水で３回抽出し、水性抽出
物を合わせ、膜を用いて500mlまで濃縮した。500mlのED
TANa２ 0.1 MpH 8を添加した後、この溶液を500mlまで
再濃縮し、この処理を６回繰り返した。続いて、同じ手
法を用いて、10リットルのH２O（20回）、10リットルの
NaCl 0.1 M（20回）、10リットルのHCl 50mM（20回）、
および10リットルのH２O（20回）を加えて溶出させた。
得られた溶液を凍結乾燥し、48UE/mgの固有乳化力を有
する6.9gのEPS IIを得た。
発酵を行った。終了時、この培養ブロス10 lに1660gの
硫酸アンモニウムを加えた。4℃にて攪拌下、一晩の
後、この懸濁液を遠心分離し(13,000 x gｍａｘ)、次い
で、得られた上清(7.6リットル)に434gの硫酸アンモニ
ウムを加えた。4℃にて一晩の後、該懸濁液を遠心分離
し、沈殿を2 lの水に溶解し、400mlの容量までカットオ
フ10,000ダルトンの限外濾過スパイラルメンブラン(Ami
con SIY1O)を通すことにより濃縮した。次いでこの溶液
を再び水で2リットルまで希釈し、400mlに再濃縮し、こ
の処理を10回繰り返した。最終的に得られた残留物(1
1)に、MgCl２ 10mM pH 7.2および500単位のＩ級ベンゾ
ナーゼ(Benzon Nuclease(登録商標), Merck)を含有する
1lのトリス-HCl 0.1M緩衝液を加え、これを25℃に3時間
維持して、存在する可能性のあるＤＮＡおよびＲＮＡの
いずれをも破壊した。このようにして得られた溶液を1
リットルに濃縮し、EDTANa2 0.2Mおよび1,4-ジチオトレ
イトール2mM pH8を含有する1 lのトリス-HCl 50mM緩衝
液を加え、25℃にて一晩、32gのパパイン(Calbiochem)
存在下で、全混合物をインキュベートした。O. Westpha
lおよびK. Jann(R. L. Whistlerにより編集された"Meth
ods in Carbohydrate Chemistry", 第Ｖ巻, 83-91頁, A
cademic Press, Inc., New York, 1965)の方法に従い、
1リットルまで減じられた混合物を70℃まで加熱し、次
いで、再蒸留して予め70℃に加熱した等容量のフェノー
ルを加えた。70℃にて激しい攪拌下15分後、混合物を室
温まで冷却し、生じた乳濁液を23,000 x gｍａｘでの遠
心によって分離した。等容量のエーテルで３回抽出した
後、フェノール相を等容量の水で３回抽出し、水性抽出
物を合わせ、膜を用いて500mlまで濃縮した。500mlのED
TANa２ 0.1 MpH 8を添加した後、この溶液を500mlまで
再濃縮し、この処理を６回繰り返した。続いて、同じ手
法を用いて、10リットルのH２O（20回）、10リットルの
NaCl 0.1 M（20回）、10リットルのHCl 50mM（20回）、
および10リットルのH２O（20回）を加えて溶出させた。
得られた溶液を凍結乾燥し、48UE/mgの固有乳化力を有
する6.9gのEPS IIを得た。
【００９５】実施例１０ EPS IIの物理化学的特性 実施例９に記載したように、得られたEPS IIを分析し、
以下の特性を求めた： -乾燥損失（70℃；真空下；16時間）：3.7%（重量／重
量） -元素分析(%)：C= 44.5; H= 7.33; N= 4.99; O=40.6; S
= 0 -灰分(900℃)：3.6%（重量／重量） -タンパク質[Bio-Rad Protein Assay; M. Bradford, An
al. Biochem, 72 248 (1976), ウシγ-グロブリン標準
品]58.6mg/g -金属（原子または発光吸収分光法）：Na= 7800; Ca< 1
0; Mg= 60; Mn= 1; Cu=3; Co< 10; Ni< 2; Fe< 10（p.
p.m） -赤外スペクトル(FT-IR) 図１に関して：3417.5 cm-1(OH, NH); 2924-2853 cm
-1(CH); 1735 cm-1（CO酸およびエステル） 1655-1554
cm-1（COアミド）; 1038 cm-1（グルコシドCOC） -NMRスペクトル D２Oに溶解させたEPS IIのプロトンおよび13Cスペクト
ルを記録した。このスペクトルは、脂肪族鎖を含有する
多糖構造と一致していることがわかったが、同時にメチ
ルおよびアセチル基の存在に関連する非常に強力なシグ
ナルであるメチレン基の存在も観察された。 -アミノ化糖 EPS IIを100℃にて30分間、HCl 5M中で加水分解し中和
した。次いで亜硝酸で糖を脱アミノ化し、カルバミン酸
アンモニウムを用いて過剰な試薬を分解し、次いでこの
脱アミノ化糖をHCl中でインドールと反応させることか
らなるZ. Dische[Methods of Biochem. Anal., 2, 352-
358 (1967)]の方法を用いて、このアミノ化糖を測定し
た。標準品としてN-アセチルグルコサミンを用い、604m
g/gの値が得られた。 -他の糖 [Duboisら, Anal. Chem. 28, 350-356 (1956);
グルコース標準品]：190mg/g -グルコース（UV Test Boehringer: ヘキソキナーゼ、A
TP、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼおよびNAD
P）：存在せず -分子量： これは、Waters Styragel 106、Styragel 1
05およびStyragel 104カラムでのHPLC-SEC（サイズ排除
クロマトグラフィー）分析により求めた。移動相として
ジメチルスルホキシドを、そして標準品としてプルラン
(Hayashibara Biochemical Laboratories Inc., Japan)
を使用。1,556,400ダルトンの値が得られた。 -エステル化脂肪酸 [I. SternおよびB. Shapiro, J. Cl
in. Path., 6, 158-160(1953); 標準品としてジパルミ
チン酸スクロース(SERVA)]：ヒドロキシアミンとの反応
によりエステル化された酸基をヒドロキシアミド酸へと
転換させ、塩化鉄(III)で紫色を与えた。1.15meq/gが得
られた。平均分子量を182.32と（ラウリル基）仮定する
と、脂肪酸含量は209.7mg/gと算出された。
以下の特性を求めた： -乾燥損失（70℃；真空下；16時間）：3.7%（重量／重
量） -元素分析(%)：C= 44.5; H= 7.33; N= 4.99; O=40.6; S
= 0 -灰分(900℃)：3.6%（重量／重量） -タンパク質[Bio-Rad Protein Assay; M. Bradford, An
al. Biochem, 72 248 (1976), ウシγ-グロブリン標準
品]58.6mg/g -金属（原子または発光吸収分光法）：Na= 7800; Ca< 1
0; Mg= 60; Mn= 1; Cu=3; Co< 10; Ni< 2; Fe< 10（p.
p.m） -赤外スペクトル(FT-IR) 図１に関して：3417.5 cm-1(OH, NH); 2924-2853 cm
-1(CH); 1735 cm-1（CO酸およびエステル） 1655-1554
cm-1（COアミド）; 1038 cm-1（グルコシドCOC） -NMRスペクトル D２Oに溶解させたEPS IIのプロトンおよび13Cスペクト
ルを記録した。このスペクトルは、脂肪族鎖を含有する
多糖構造と一致していることがわかったが、同時にメチ
ルおよびアセチル基の存在に関連する非常に強力なシグ
ナルであるメチレン基の存在も観察された。 -アミノ化糖 EPS IIを100℃にて30分間、HCl 5M中で加水分解し中和
した。次いで亜硝酸で糖を脱アミノ化し、カルバミン酸
アンモニウムを用いて過剰な試薬を分解し、次いでこの
脱アミノ化糖をHCl中でインドールと反応させることか
らなるZ. Dische[Methods of Biochem. Anal., 2, 352-
358 (1967)]の方法を用いて、このアミノ化糖を測定し
た。標準品としてN-アセチルグルコサミンを用い、604m
g/gの値が得られた。 -他の糖 [Duboisら, Anal. Chem. 28, 350-356 (1956);
グルコース標準品]：190mg/g -グルコース（UV Test Boehringer: ヘキソキナーゼ、A
TP、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼおよびNAD
P）：存在せず -分子量： これは、Waters Styragel 106、Styragel 1
05およびStyragel 104カラムでのHPLC-SEC（サイズ排除
クロマトグラフィー）分析により求めた。移動相として
ジメチルスルホキシドを、そして標準品としてプルラン
(Hayashibara Biochemical Laboratories Inc., Japan)
を使用。1,556,400ダルトンの値が得られた。 -エステル化脂肪酸 [I. SternおよびB. Shapiro, J. Cl
in. Path., 6, 158-160(1953); 標準品としてジパルミ
チン酸スクロース(SERVA)]：ヒドロキシアミンとの反応
によりエステル化された酸基をヒドロキシアミド酸へと
転換させ、塩化鉄(III)で紫色を与えた。1.15meq/gが得
られた。平均分子量を182.32と（ラウリル基）仮定する
と、脂肪酸含量は209.7mg/gと算出された。
【００９６】実施例１１ リポ多糖の特徴付け バイオサーファクタントの脂質画分を特徴付けするた
め、Association of Official Analytical Chemistsの
プロトコールNr. 969.33を用いた["Official Methods o
f Analysis of AOAC International". P. Cunnif編, 第
16版, 第II巻, #41.1.28, AOAC Int.(1995)]。実際に
は、脂肪酸のメチルエステルの形成に関する触媒として
の三フッ化ホウ素の存在下、沸点にてメタノールソーダ
でEPS IIを処理した。次いでn-ヘプタン中でこのエステ
ルを抽出し、ガスクロマトグラフィー／マススペクトロ
メトリーによって脂肪酸を同定した。前記のように操作
して以下の生成物： -主生成物としてのドデカン酸（ラウリン酸）； -副生成物としての3-ヒドロキシ-ドデカン酸および -より少量の2-ヒドロキシドデカン酸、ヘキサデカン酸
（パルミチン酸）、オクタデカン酸（ステアリン酸）お
よびオクタデセン酸（オレイン酸）を同定した。EPS II
の多糖骨格の特徴付けは、このポリマーの酸加水分解に
より行った。80mgのEPS IIを8mlのHCl 5Mに溶解し、105
℃の不活性雰囲気下で4時間インキュベートした。室温
まで冷却後、真空下でHClを除去した。得られた沈殿を
破砕してエチルエーテルで抽出し、次いでD２O中に溶解
し、NMR分析にかけた。完全なプロトンのNMRスペクトル
は図２に示されている。図３は、一般に単糖類の炭素１
位に関するプロトンのシグナルを含む、4.5ないし5.5p.
p.m.の間という以前のスペクトル領域の拡張を示してい
る。これらのシグナルは通常、αおよびβアノマー型単
糖類の溶液中に同時に存在するために二重となる。図３
のスペクトルは、7:2:1の比で３種の単糖類に関する３
対のダブレットを示している。EPS IIの多糖画分を形成
する単糖類を同定するために、予備的酸加水分解を行っ
た。まず第一に、種々の濃度のHClを用い、100℃にて種
々の時間でEPS IIのアリコットをインキュベートするこ
とにより、最適な加水分解条件を決定した。この加水分
解に続いて、アミノ化糖と還元糖双方を測定した[J. T.
ParkおよびM. J. Johnson, J. Biol. Chem., 181, 149
(1949)]。最適条件は、HCl 0.5Mでの6時間の加水分解
であると確認された。これらの結果に基づいて、500mg
のEPS IIを500mlのHCl 0.5Mに溶解し、N２のガス封入下
で6時間還流沸騰した。次いで、この溶液を冷却し、真
空下で50mlに濃縮し、等容量のエチルエーテルで3回抽
出した。得られた溶液を10mlまで蒸発させ、水で100ml
に希釈し、真空下で再び10mlに濃縮した。ロータベーパ
ーで乾燥させる前に、この処理を3回繰り返した。200ml
のH２Oにこの乾燥産物を加え、次いで、R. W. Weath[Me
thods Enzymol.,8, 60-78 (1966)]によって記載された
スキームに従い処理を行った。加水分解産物をDowex(登
録商標)50 X-4、H+型の200-400メッシュの強力な陽イオ
ン性樹脂カラム(径1.2 cm x 高さ50 cm)に装填し、次い
で、溶出液のpHが中性となるまでこのカラムを水で溶出
した。樹脂により保持されない溶出液中に存在する画分
は中性糖および／または酸からなり、総量の約20%にな
る。その特性はDubois試験については陽性反応を、アミ
ノ化糖試験については陰性を、そしてウロン酸について
は陽性を示した[T. BitterおよびH.H. Muir, Anal. Bio
chem., 4, 330-334 (1962)]。アミノ糖を固定化したカ
ラムについてHCl 0.3Mを用いてイスクラティク溶出を行
った。回収した画分を還元糖について分析し、２つのク
ロマトグラフィーピークを得た。これらのピークに関す
る画分を合わせ、乾燥し、数回水に加えてHClを除去し
た。次いでこの画分を凍結乾燥し、NMR分析にかけた。
第一のピークは総量の約10%であり、グルコサミンと同
定され、このプロトンのNMRスペクトルは塩酸グルコサ
ミンの市販サンプル(Fluka)のそれと同一であった。第
二のピークのスペクトル（図４）は、6位にメチルを有
するアミノヘキソースのそれと一致していた。さらに具
体的には、この化合物は2-アミノ-2,6-ジデオキシ-アル
ドヘキソースであることがわかった。また、2位におけ
るアミノ基の存在は、530nmに最大吸収を有する発色団
を生じるRondle-Morgan反応によって確認された[C. J.
M. RondleおよびW. T. J. Morgan, Biochem. J., 61, 5
86 (1955); N. Suzuki, Biochem. Biophys. Acta, 177,
371-373 (1969)]。
め、Association of Official Analytical Chemistsの
プロトコールNr. 969.33を用いた["Official Methods o
f Analysis of AOAC International". P. Cunnif編, 第
16版, 第II巻, #41.1.28, AOAC Int.(1995)]。実際に
は、脂肪酸のメチルエステルの形成に関する触媒として
の三フッ化ホウ素の存在下、沸点にてメタノールソーダ
でEPS IIを処理した。次いでn-ヘプタン中でこのエステ
ルを抽出し、ガスクロマトグラフィー／マススペクトロ
メトリーによって脂肪酸を同定した。前記のように操作
して以下の生成物： -主生成物としてのドデカン酸（ラウリン酸）； -副生成物としての3-ヒドロキシ-ドデカン酸および -より少量の2-ヒドロキシドデカン酸、ヘキサデカン酸
（パルミチン酸）、オクタデカン酸（ステアリン酸）お
よびオクタデセン酸（オレイン酸）を同定した。EPS II
の多糖骨格の特徴付けは、このポリマーの酸加水分解に
より行った。80mgのEPS IIを8mlのHCl 5Mに溶解し、105
℃の不活性雰囲気下で4時間インキュベートした。室温
まで冷却後、真空下でHClを除去した。得られた沈殿を
破砕してエチルエーテルで抽出し、次いでD２O中に溶解
し、NMR分析にかけた。完全なプロトンのNMRスペクトル
は図２に示されている。図３は、一般に単糖類の炭素１
位に関するプロトンのシグナルを含む、4.5ないし5.5p.
p.m.の間という以前のスペクトル領域の拡張を示してい
る。これらのシグナルは通常、αおよびβアノマー型単
糖類の溶液中に同時に存在するために二重となる。図３
のスペクトルは、7:2:1の比で３種の単糖類に関する３
対のダブレットを示している。EPS IIの多糖画分を形成
する単糖類を同定するために、予備的酸加水分解を行っ
た。まず第一に、種々の濃度のHClを用い、100℃にて種
々の時間でEPS IIのアリコットをインキュベートするこ
とにより、最適な加水分解条件を決定した。この加水分
解に続いて、アミノ化糖と還元糖双方を測定した[J. T.
ParkおよびM. J. Johnson, J. Biol. Chem., 181, 149
(1949)]。最適条件は、HCl 0.5Mでの6時間の加水分解
であると確認された。これらの結果に基づいて、500mg
のEPS IIを500mlのHCl 0.5Mに溶解し、N２のガス封入下
で6時間還流沸騰した。次いで、この溶液を冷却し、真
空下で50mlに濃縮し、等容量のエチルエーテルで3回抽
出した。得られた溶液を10mlまで蒸発させ、水で100ml
に希釈し、真空下で再び10mlに濃縮した。ロータベーパ
ーで乾燥させる前に、この処理を3回繰り返した。200ml
のH２Oにこの乾燥産物を加え、次いで、R. W. Weath[Me
thods Enzymol.,8, 60-78 (1966)]によって記載された
スキームに従い処理を行った。加水分解産物をDowex(登
録商標)50 X-4、H+型の200-400メッシュの強力な陽イオ
ン性樹脂カラム(径1.2 cm x 高さ50 cm)に装填し、次い
で、溶出液のpHが中性となるまでこのカラムを水で溶出
した。樹脂により保持されない溶出液中に存在する画分
は中性糖および／または酸からなり、総量の約20%にな
る。その特性はDubois試験については陽性反応を、アミ
ノ化糖試験については陰性を、そしてウロン酸について
は陽性を示した[T. BitterおよびH.H. Muir, Anal. Bio
chem., 4, 330-334 (1962)]。アミノ糖を固定化したカ
ラムについてHCl 0.3Mを用いてイスクラティク溶出を行
った。回収した画分を還元糖について分析し、２つのク
ロマトグラフィーピークを得た。これらのピークに関す
る画分を合わせ、乾燥し、数回水に加えてHClを除去し
た。次いでこの画分を凍結乾燥し、NMR分析にかけた。
第一のピークは総量の約10%であり、グルコサミンと同
定され、このプロトンのNMRスペクトルは塩酸グルコサ
ミンの市販サンプル(Fluka)のそれと同一であった。第
二のピークのスペクトル（図４）は、6位にメチルを有
するアミノヘキソースのそれと一致していた。さらに具
体的には、この化合物は2-アミノ-2,6-ジデオキシ-アル
ドヘキソースであることがわかった。また、2位におけ
るアミノ基の存在は、530nmに最大吸収を有する発色団
を生じるRondle-Morgan反応によって確認された[C. J.
M. RondleおよびW. T. J. Morgan, Biochem. J., 61, 5
86 (1955); N. Suzuki, Biochem. Biophys. Acta, 177,
371-373 (1969)]。
【００９７】実施例１２ EPSによる海水中の原油の生物分解 遠心分離によって細胞を除去した後に、実施例４に記載
したようにして得られた培養ブロスを凍結乾燥すること
によって調製した粗EPSのアリコット(7.5mg)を、各々総
量1.1・103UFC(Colony Forming Units)/mlの従属栄養菌
とそれぞれ含量4および0.9ppmの窒素およびリンを加え
た海水50mlを含有する一連の250mlフラスコに入れた。1
50mgの「Belahim blend」原油を、その最も揮発性の高
い画分を80℃２時間の加熱によって予め除去し、次いで
このフラスコに入れた。EPSを含まない対照および、海
中での石油流出処理のためにイタリア港湾管理委員会に
よって用いられる市販の分散剤を含有する第二のシリー
ズのフラスコを並行して準備した。これらのフラスコを
好気条件下、22℃にて100回転／分のオービタルスター
ラーでインキュベートし、ゼロ時および種々の時間間隔
で試験サンプルを採取してバイオマスと炭化水素の含量
を測定した。バイオマスは、大豆トリプトン-ペプトン
(Oxoid, CM 131)を添加し寒天を含有させた培地上で得
られた従属栄養菌の総量によって測定した。炭化水素
は、1,2-トリクロロ-1,2,2-トリフルオロエタン(Freon
(登録商標)-113)で各単１個のフラスコを抽出し、最大
吸収に相当する2930cm-1にて吸光度を測定し、次いで容
量測定比15/15/10のn-ヘキサデカン／イソオクタン／ク
ロロベンゼンからなる標準で作成した検量線により炭化
水素濃度を得ることによって与えた。結果を表４に示
す。残存炭化水素量は、ゼロ時間の存在量に対するパー
センテージで表される。
したようにして得られた培養ブロスを凍結乾燥すること
によって調製した粗EPSのアリコット(7.5mg)を、各々総
量1.1・103UFC(Colony Forming Units)/mlの従属栄養菌
とそれぞれ含量4および0.9ppmの窒素およびリンを加え
た海水50mlを含有する一連の250mlフラスコに入れた。1
50mgの「Belahim blend」原油を、その最も揮発性の高
い画分を80℃２時間の加熱によって予め除去し、次いで
このフラスコに入れた。EPSを含まない対照および、海
中での石油流出処理のためにイタリア港湾管理委員会に
よって用いられる市販の分散剤を含有する第二のシリー
ズのフラスコを並行して準備した。これらのフラスコを
好気条件下、22℃にて100回転／分のオービタルスター
ラーでインキュベートし、ゼロ時および種々の時間間隔
で試験サンプルを採取してバイオマスと炭化水素の含量
を測定した。バイオマスは、大豆トリプトン-ペプトン
(Oxoid, CM 131)を添加し寒天を含有させた培地上で得
られた従属栄養菌の総量によって測定した。炭化水素
は、1,2-トリクロロ-1,2,2-トリフルオロエタン(Freon
(登録商標)-113)で各単１個のフラスコを抽出し、最大
吸収に相当する2930cm-1にて吸光度を測定し、次いで容
量測定比15/15/10のn-ヘキサデカン／イソオクタン／ク
ロロベンゼンからなる標準で作成した検量線により炭化
水素濃度を得ることによって与えた。結果を表４に示
す。残存炭化水素量は、ゼロ時間の存在量に対するパー
センテージで表される。
【００９８】 表４ 分解された炭化水素(%) バイオマス(UFC) 時間 対照 ESP 市販の 対照 EPS 市販の (時) 分散剤 分散剤 分散剤 分散剤 なし なし 0 0 0 0 1.1 x 103 1.1 x 103 1.1 x 103 7 12.2 52.6 19.4 n.d. n.d. n.d. 14 12.5 73.5 23.5 14 x 10 3 2.4 x 10 5 1.5 x 10 5 *n.d.= not determined（測定されず） 表に示された値は、14日後のEPSでの分解が対照よりも
5.9倍高く、市販の分散剤に対しても3.1倍高いことを示
している。
5.9倍高く、市販の分散剤に対しても3.1倍高いことを示
している。
【００９９】実施例１３ ESPによる原油の生物分解 バイオサーファクタントに関する発酵ブロス中に存在し
得る栄養物質による効果を分離するために、実施例８に
記載したように調製したEPSを用いた。この実験では、1
50mgの原油を加えた、総量1・104U.F.C./mlの従属栄養
菌を含む海水50mlにつき0.75ないし7.5mgまでの種々の
量のEPSを用いた。インキュベーション45日後、以下の
パラメーターを測定した：バイオマス、原油分解量およ
び、Freonにおける抽出物のガスクロマトグラフィー分
析（Supelco SPB1キャピラリーカラム）を用いて測定さ
れた、(a)n-ヘプタデカン(n-C１７)とプリスタンの量、
並びに(b)n-オクタデカン(n-C１８)とフィタンの量との
比率。一般に、これら比率は重要な生物分解指標である
と考えられている[P. Sveumら, R. H. Hincheeら, Lewi
s Publisher, Boca Ratonの責任の下にある"Hydrocarbo
n bioremediation"中 163-174頁(1994)]。以下の混合物
の各々について７個のフラスコを準備した： 1)海水(50ml)+オイル(150mg) 2)海水(50ml)+オイル(150mg)+EPS(0.75mg) 3)海水(50ml)+オイル(150mg)+EPS(3.75mg) 4)海水(50ml)+オイル(150mg)+EPS(7.50mg) 結果を表５−７に示す。
得る栄養物質による効果を分離するために、実施例８に
記載したように調製したEPSを用いた。この実験では、1
50mgの原油を加えた、総量1・104U.F.C./mlの従属栄養
菌を含む海水50mlにつき0.75ないし7.5mgまでの種々の
量のEPSを用いた。インキュベーション45日後、以下の
パラメーターを測定した：バイオマス、原油分解量およ
び、Freonにおける抽出物のガスクロマトグラフィー分
析（Supelco SPB1キャピラリーカラム）を用いて測定さ
れた、(a)n-ヘプタデカン(n-C１７)とプリスタンの量、
並びに(b)n-オクタデカン(n-C１８)とフィタンの量との
比率。一般に、これら比率は重要な生物分解指標である
と考えられている[P. Sveumら, R. H. Hincheeら, Lewi
s Publisher, Boca Ratonの責任の下にある"Hydrocarbo
n bioremediation"中 163-174頁(1994)]。以下の混合物
の各々について７個のフラスコを準備した： 1)海水(50ml)+オイル(150mg) 2)海水(50ml)+オイル(150mg)+EPS(0.75mg) 3)海水(50ml)+オイル(150mg)+EPS(3.75mg) 4)海水(50ml)+オイル(150mg)+EPS(7.50mg) 結果を表５−７に示す。
【０１００】
【０１０１】 表６：n-C １７ ／プリスタンおよびn-C １８ ／フィタン比率 時間 サンプル （日） 1 2 3 4 C17/P C18/Ph C17/P C18/Ph C17/P C18/Ph C17/P C18/Ph 0 2.41 1.70 2.43 1.70 2.40 1.73 2.46 1.70 7 2.41 1.65 2.42 1.66 2.35 1.68 2.43 1.68 14 2.38 1.70 2.41 1.66 2.28 1.57 2.41 1.61 21 2.38 1.70 2.40 1.70 2.32 1.57 2.12 1.52 28 2.37 1.70 2.25 1.62 2.29 1.61 2.17 1.57 35 2.34 1.63 2.23 1.52 2.19 1.47 2.17 1.52 45 2.34 1.63 1.99 1.38 1.91 1.35 2.00 1.49
【０１０２】 表７：微生物数 （従属栄養菌総量、UFC/ml） 時間 サンプル （日） 1 2 3 4 0 1.0 x 104 1.0 x 104 1.0 x 104 1.0 x 104 7 3.7 x 105 3.2 x 105 1.2 x 106 5.6 x 106 14 1.3 x 106 8.7 x 106 2.4 x 108 2.7 x 108 21 3.5 x 10 6 3.4 x 10 9 5.0 x 10 8 7.1 x 10 8
【０１０３】実施例１４ アルスロバクター(Arthrobacter)sp.FA-17細胞のn-ヘキ
サデカンへの付着を促すEPSの能力 細菌細胞の炭化水素への付着を促すEPSの能力をE. Rose
nbergら[Infect. Immun., 39, 1024-1028 (1983)]の試
験を用いて測定した。この試験は、一定量のn-ヘキサデ
カンと共に細胞懸濁液を激しく攪拌し、次いで該懸濁液
の濁度の低下を測定することにより、水-油界面へ付着
したままの細胞数を計測することからなる。この目的
で、アルスロバクターsp.FA-17株(Eniricerche Collect
ion)の単離のコロニー単位をNutrient Aga(Oxoid, CM 0
03B)上の維持培養から採取し、フラスコ中、50ml Brain
Hearth Infusion Broth(Oxoid, CM 225B)中での継代培
養の接種材料として用いた。50ml Brain Hearth Infusi
on Brothを含有する125mlフラスコ中での培養のさらな
る接種材料には、30℃にて150rpmのオービタルスターラ
ーで一晩インキュベートしたこの継代培養物から0.1ml
のブロスを取った。このフラスコを、定常増殖期に達す
るまで、30℃150rpmにて18時間、オービタルスターラー
で維持した。次いで遠心分離によって細胞を回収し、50
mlのPUM緩衝溶液（１リットル当たり、K２HPO４・3H２O
22.2g; K２PO４ 7.26g; 尿素 1.8g; MgSO４・7H２O 0.
2g; pH 7.1を含有）で洗浄、再懸濁を２回行った。次い
で洗浄した細胞のアリコットを種々の割合で４本の珪硼
酸塩ガラス管(14x 140 mm)中のPUM緩衝液に再懸濁し
（最終容量4ml）、４００ｎｍで０〜１．５の吸光度値
が得られた。次いで2.1mg/mlの粗EPS含有溶液および1ml
のn-ヘキサデカンを全ての試験管に添加した。同様にし
て、同濃度の細胞を用い、再び1mlのn-ヘキサデカンを
含有する４つの反復（duplicates）を調製し、一方、EP
Sと0.2mlの緩衝液の代わりに、4.2mlの緩衝液と1mlのn-
ヘキサデカンだけを別の試験管に入れ、これをブランク
とした。この管をボルテックス（vortex）ミキサーで12
0秒間攪拌し、次いで、サーモスタットで30℃に調節し
たオーブン中で15分間静置して、水／炭化水素相を分離
させた。各管から水相を除去し、その光学濃度を400nm
にて測定した。結果は表８に示されている。 表８ サンプル 細胞 ＥＰＳを用いた付着 ＥＰＳなしでの付着 （ＵＦＣ） （％） （％） １ 0.5 x 106 ８９ ２８ ２ 1 x 107 ６０ ２４ ３ 2 x 107 ５１ ２２ ４ 4 x 10 7 ４４ １７
サデカンへの付着を促すEPSの能力 細菌細胞の炭化水素への付着を促すEPSの能力をE. Rose
nbergら[Infect. Immun., 39, 1024-1028 (1983)]の試
験を用いて測定した。この試験は、一定量のn-ヘキサデ
カンと共に細胞懸濁液を激しく攪拌し、次いで該懸濁液
の濁度の低下を測定することにより、水-油界面へ付着
したままの細胞数を計測することからなる。この目的
で、アルスロバクターsp.FA-17株(Eniricerche Collect
ion)の単離のコロニー単位をNutrient Aga(Oxoid, CM 0
03B)上の維持培養から採取し、フラスコ中、50ml Brain
Hearth Infusion Broth(Oxoid, CM 225B)中での継代培
養の接種材料として用いた。50ml Brain Hearth Infusi
on Brothを含有する125mlフラスコ中での培養のさらな
る接種材料には、30℃にて150rpmのオービタルスターラ
ーで一晩インキュベートしたこの継代培養物から0.1ml
のブロスを取った。このフラスコを、定常増殖期に達す
るまで、30℃150rpmにて18時間、オービタルスターラー
で維持した。次いで遠心分離によって細胞を回収し、50
mlのPUM緩衝溶液（１リットル当たり、K２HPO４・3H２O
22.2g; K２PO４ 7.26g; 尿素 1.8g; MgSO４・7H２O 0.
2g; pH 7.1を含有）で洗浄、再懸濁を２回行った。次い
で洗浄した細胞のアリコットを種々の割合で４本の珪硼
酸塩ガラス管(14x 140 mm)中のPUM緩衝液に再懸濁し
（最終容量4ml）、４００ｎｍで０〜１．５の吸光度値
が得られた。次いで2.1mg/mlの粗EPS含有溶液および1ml
のn-ヘキサデカンを全ての試験管に添加した。同様にし
て、同濃度の細胞を用い、再び1mlのn-ヘキサデカンを
含有する４つの反復（duplicates）を調製し、一方、EP
Sと0.2mlの緩衝液の代わりに、4.2mlの緩衝液と1mlのn-
ヘキサデカンだけを別の試験管に入れ、これをブランク
とした。この管をボルテックス（vortex）ミキサーで12
0秒間攪拌し、次いで、サーモスタットで30℃に調節し
たオーブン中で15分間静置して、水／炭化水素相を分離
させた。各管から水相を除去し、その光学濃度を400nm
にて測定した。結果は表８に示されている。 表８ サンプル 細胞 ＥＰＳを用いた付着 ＥＰＳなしでの付着 （ＵＦＣ） （％） （％） １ 0.5 x 106 ８９ ２８ ２ 1 x 107 ６０ ２４ ３ 2 x 107 ５１ ２２ ４ 4 x 10 7 ４４ １７
【０１０４】実施例１５ 海洋細菌フロラの付着を促進するＥＰＳの能力 内因性の海洋細菌フロラのｎ−ヘキサデカンへの付着を
促進するＥＰＳの能力を測定するため、オスティア・リ
ド（ローマ）から採取した海水の試料から単離した混合
培養物の使用以外は実施例１３と同様の実験を行った。
この目的のため、除去後直ちに０．１ｍｌの海水を、Ｎ
ａＣｌ ２４ｇ／ｌを含む大豆トリプトン−ペプトン
（OX0ID CM 131）を含有する寒天培地の表面にスパチュ
ラで接種した。成育コロニーを、滅菌ループを用いて１
９×１８０ｍｍの細菌学的管中のＰＵＭ緩衝液中に、適
切な細胞懸濁濃度が得られるまで収集した。ｎ−ヘキサ
デカンに対する細胞の付着の測定は、実施例１４に記載
のように行った。結果は表９に示されている。 表９ サンプル 細胞 ＥＰＳを用いた付着 ＥＰＳなしでの付着 （ＵＦＣ） （％） （％） １ 1 x 105 ７６ ０ ２ 1 x 106 ６８ １７ ３ 2 x 106 ５２ ２５ ４ 4 x 10 6 ３８ １５
促進するＥＰＳの能力を測定するため、オスティア・リ
ド（ローマ）から採取した海水の試料から単離した混合
培養物の使用以外は実施例１３と同様の実験を行った。
この目的のため、除去後直ちに０．１ｍｌの海水を、Ｎ
ａＣｌ ２４ｇ／ｌを含む大豆トリプトン−ペプトン
（OX0ID CM 131）を含有する寒天培地の表面にスパチュ
ラで接種した。成育コロニーを、滅菌ループを用いて１
９×１８０ｍｍの細菌学的管中のＰＵＭ緩衝液中に、適
切な細胞懸濁濃度が得られるまで収集した。ｎ−ヘキサ
デカンに対する細胞の付着の測定は、実施例１４に記載
のように行った。結果は表９に示されている。 表９ サンプル 細胞 ＥＰＳを用いた付着 ＥＰＳなしでの付着 （ＵＦＣ） （％） （％） １ 1 x 105 ７６ ０ ２ 1 x 106 ６８ １７ ３ 2 x 106 ５２ ２５ ４ 4 x 10 6 ３８ １５
【図１】ＫＢｒペレット中の固状ＥＰＳＩＩのＦＴ−Ｉ
Ｒスペクトルを示した説明図である。
Ｒスペクトルを示した説明図である。
【図２】５ＭのＨＣｌを用いて１０５°で４時間加水分
解し，次いでエーテルで抽出したＥＰＳＩＩのＮＭＲス
ペクトルを示した説明図である。
解し，次いでエーテルで抽出したＥＰＳＩＩのＮＭＲス
ペクトルを示した説明図である。
【図３】４．５から５．５ｐｐｍ範囲の図２の一部を示
した説明図である。αおよびβ形態に係わるダブレット
の３対から三つの炭水化物が観察でき，この場合，Ａ，
Ａ’＝２−アミノ−２，６−ジデオキシアルドヘキソー
ス，Ｂ，Ｂ’＝グルコサミンおよびＣ，Ｃ’＝非同定炭
水化物，Ｓ＝溶剤である。
した説明図である。αおよびβ形態に係わるダブレット
の３対から三つの炭水化物が観察でき，この場合，Ａ，
Ａ’＝２−アミノ−２，６−ジデオキシアルドヘキソー
ス，Ｂ，Ｂ’＝グルコサミンおよびＣ，Ｃ’＝非同定炭
水化物，Ｓ＝溶剤である。
【図４】ＥＰＳＩＩの多糖骨格の主構成部分を示す２−
アミノ−２，６−ジデオキシアルドヘキソースのプロト
ンのＮＭＲスペクトルを示した説明図である。
アミノ−２，６−ジデオキシアルドヘキソースのプロト
ンのＮＭＲスペクトルを示した説明図である。
フロントページの続き (72)発明者 フランチェスコ、クレッシェンツィー イタリー国ローマ、ビアーレ、マルコー ニ、590 (72)発明者 エウジェニオ、ファッシェッティー イタリー国ローマ、ビア、コッラティー ナ、443、ビ／ア６ (72)発明者 フィリッポ、ポルチェッリ イタリー国ローマ、ビア、モンティー、デ ィ、プリマバッレ、67 (72)発明者 パスクアレ、サッチェッドゥ イタリー国ローマ、モンテロトンド、ビ ア、ニロ、２
Claims (17)
- 【請求項１】リポ多糖が大部分２−アミノ−２，６−ジ
デオキシアルドヘキソース糖およびグルコサミンおよび
一種または二種以上の非アミノ化糖とからなる多糖鎖か
ら構成されるタンパク分子を随伴してなるリポ多糖バイ
オサーファクタントであって，上記アミノ化糖がアミン
基の全てもしくはほとんど全てがアセチル化された形態
であり，上記多糖鎖がエステル結合により脂質フラクシ
ョンに結合されてなり，上記脂質フラクションが炭素原
子１０から１８の親油性鎖長の飽和および／または不飽
和酸基からなり，その９５−５０％がドデカン酸および
３−ヒドロキシ−ドデカン酸からなり，上記ドデカン酸
が３−ヒドロキシ−ドデカン酸に対して優勢であること
を特徴とする，リポ多糖バイオサーファクタント。 - 【請求項２】上記多糖鎖の７０−８０％が２−アミノ−
２，６−ジデオキシアルドヘキソース，５−１０％がグ
ルコサミンおよび１５−２０％が一種または２種以上の
アミノ化糖からなる，請求項１記載のバイオサーファク
タント。 - 【請求項３】ドデカン酸が脂質フラクションの７０−８
０％を構成する，請求項１記載のバイオサーファクタン
ト。 - 【請求項４】無タンパク質である，請求項１記載のバイ
オサーファクタント。 - 【請求項５】タンパク分子を随伴してリポ多糖系バイオ
サーファクタントを産生する Acinetobacter calcoacet
icus 菌株であって、上記リポ多糖が，大部分の２−ア
ミノ−２，６−ジデオキシアルドヘキソース糖およびの
グコサミンおよび一種または２種以上の非アミノ化糖と
からなる多糖鎖から構成され，上記アミノ化糖のアミン
基の全てもしくはほとんど全てがアセチル化された形態
であり，上記多糖鎖がエステル結合により脂質フラクシ
ョンに結合されてなり，上記脂質フラクションが炭素原
子１０から１８の親油性鎖長の飽和および／または不飽
和酸基からなり，その９５−５０％がドデカン酸および
３−ヒドロキシ−ドデカン酸からなり，上記ドデカン酸
が３−ヒドロキシ−ドデカン酸に対して優勢であること
を特徴とする，菌株。 - 【請求項６】Acinetobacter calcoaceticus CBS 962.97
である，請求項５記載の Acinetobacter calcoaceticus
菌株。 - 【請求項７】タンパク分子を随伴するリポ多糖系バイオ
サーファクタントの調製方法であって、上記リポ多糖
が、大部分の２−アミノ−２，６−ジデオキシアルドヘ
キソース糖およびグコサミンおよび一種または２種以上
の非アミノ化糖とからなる多糖鎖から構成され，上記ア
ミノ化糖のアミン基の全てもしくはほとんど全てがアセ
チル化された形態であり，上記多糖鎖がエステル結合に
より脂質フラクションに結合されてなり，上記脂質フラ
クションが炭素原子１０から１８の親油性鎖長の飽和お
よび／または不飽和酸基からなり，その９５−５０％が
ドデカン酸および３−ヒドロキシ−ドデカン酸からな
り，上記ドデカン酸が３−ヒドロキシ−ドデカン酸に対
して優勢であることを特徴とし，上記調製方法が： （ａ）炭素源，窒素源および微量元素を含む適切な培養
基中で，上記リポ多糖系バイオサーファクタントを産生
する Acinetobacter calcoaceticus菌株を培養し； （ｂ）培養基から細胞を除き，乳化活性を特徴とする無
細胞上清を回収する，ことを特徴とする調製方法。 - 【請求項８】菌株がAcinetobacter calcoaceticus CBS
962.97である，請求項７記載の調製方法。 - 【請求項９】工程（ａ）の培養を温度範囲２５から３７
℃で行う，請求項７記載の調製方法。 - 【請求項１０】温度範囲が２８から３２℃である，請求
項９記載の調製方法。 - 【請求項１１】工程（ａ）の培養をｐＨ範囲６．５から
７．５で行う，請求項７記載の調製方法。 - 【請求項１２】ｐＨ範囲が６．８から７．２である，請
求項１１記載の調製方法。 - 【請求項１３】微生物細胞の除去（工程ｂ）後，リポ多
糖系バイオサーファクタントを精製し，醗酵培地から単
離する，請求項７記載の調製方法。 - 【請求項１４】硫酸アンモニウムを用いた選択的沈殿法
により精製を行い，中空繊維もしくは平膜等の螺旋状限
外濾過膜の手段によるかまたは固体担体上の選択吸着の
手段により醗酵ブロスの濃縮および脱塩を行う，請求項
１３記載の調製方法。 - 【請求項１５】精製リポ多糖バイオサーファクタントを
脱タンパクする，請求項１３記載の調製方法。 - 【請求項１６】エネルギーおよび環境の分野における，
請求項１記載のリポ多糖系バイオサーファクタントの使
用。 - 【請求項１７】請求項１記載のリポ多糖系バイオサーフ
ァクタントを含む組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT97A002809 | 1997-12-19 | ||
| IT97MI002809A IT1296987B1 (it) | 1997-12-19 | 1997-12-19 | Biosurfattante lipopolisaccaridico |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11269203A true JPH11269203A (ja) | 1999-10-05 |
Family
ID=11378399
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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