WO2010150867A1 - 穀類植物由来材料発酵物及び免疫調節剤 - Google Patents
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
- A61K2236/10—Preparation or pretreatment of starting material
- A61K2236/19—Preparation or pretreatment of starting material involving fermentation using yeast, bacteria or both; enzymatic treatment
Definitions
- the present invention relates to a koji fermented product of a cereal plant-derived material or a processed product thereof, and an immunomodulator containing the fermented product or a processed product thereof.
- the present invention also relates to a method for producing antigen-presenting cells and regulatory T cells, and the use of a cereal plant-derived material fermented product or processed product thereof or 14-dehydroergosterol in such a method.
- the present invention also relates to the use of a cereal plant-derived material fermented product or processed product thereof or 14-dehydroergosterol for the prevention or treatment of immune diseases.
- DCs Dendritic cells
- B cells Dendritic cells
- NK / NKT cells a control tower of the immune system.
- One of the central roles of DC is to induce the acquired immune system by taking in foreign substances, in vivo antigen proteins, etc., decomposing them and presenting them as antigens. Another function is that it produces various inflammatory cytokines in response to inflammatory stimuli.
- Inflammatory stimulants represented by LPS lipopolysaccharide
- TLR Toll-like receptor
- DCs which activates and / or matures DCs, and induces various inflammatory cytokines and chemokines. It is known to induce an inflammatory response through release.
- Many immune diseases have been reported to cause abnormal activation of innate immune systems such as DC and macrophages. Therefore, such a method for suppressing the activation of the innate immune system or a substance capable of suppressing the activation of the innate immune system is very effective for the prevention and treatment of the above immune diseases.
- IL-10 / TGF- ⁇ , rapamycin, vasoactive intestinal peptide (VIP), and the like are known as drugs that induce DC exhibiting reduced inflammatory activity.
- these drugs have many other biological effects, it is not practical to administer them to the human body for the prevention and treatment of immune diseases. Therefore, as a method of using these drugs for prevention and treatment of immune diseases, ex vivo method of inducing DC having reduced inflammatory activity in vitro from the collected blood and returning it to the human body. Can be considered.
- immunosuppressive agents such as FK506 are used.
- side effects due to nonspecific immunosuppression of existing drugs are regarded as a problem.
- regulatory T cells Treg
- Tregs are known to be induced through the secretion of cytokines from DCs. Therefore, if a method for inducing DC capable of producing Treg and a method for inducing Treg directly from naive T cells is developed, such a method is useful for suppression of rejection at the time of transplantation. It is predicted that.
- retinoic acid 1,25-dihydroxyvitamin D3, etc.
- Such a substance is considered to be useful in terms of anti-inflammatory action, suppression of transplant rejection, and the like, as well as a substance that induces DC exhibiting reduced inflammatory activity.
- Patent Document 1 describes an immune enhancing substance obtained from a fermented decomposition product obtained by fermenting a raw material containing soybean, wheat, rice or these by-products with a filamentous fungus or an enzyme obtained therefrom.
- a fraction insoluble in ethanol is separated from a fermented product obtained by fermenting soybean-derived material and wheat using Aspergillus oryzae or Aspergillus soya, and a higher molecular weight fraction is further separated from the fraction. It has been shown that the material obtained by removal enhances macrophage glucose consumption.
- Patent Document 2 describes a macrophage activator obtained by fermenting soybean-derived material with lactic acid bacteria.
- Patent Document 3 discloses that hyaluronidase inhibition, antiallergy obtained from fermented degradation products obtained by fermenting raw materials containing soybeans, wheat, citrus fruits, fruits or processed products thereof with filamentous fungi, natto bacteria or enzymes obtained therefrom. Activity and immunostimulatory substances are described.
- a material obtained by fermenting soybean-derived material and wheat using Aspergillus oryzae, separating a fraction insoluble in ethanol from the fermented product, and taking out a higher molecular weight fraction from the fraction. It has a hyaluronidase inhibitory activity and an immunostimulatory activity measured using IgA production from Peyer's patch cells as an index.
- Patent Document 4 describes an immunostimulatory substance obtained by fermenting plant components such as flour using Pantoea agglomerans, which is a gram-negative bacterium.
- Patent Document 5 discloses a fermented product obtained by fermenting a mixture of a steamed crushed product such as bagasse and wheat bran using Aspergillus soya, a xylo-oligosaccharide and an antioxidant active substance rich in xylobiose and xylotriose. Is included.
- the present inventors have made a material derived from a cereal plant, particularly a material fermented by allowing koji mold to act on wheat bran or a processed product thereof (hereinafter referred to as “cereal plant-derived material fermented product”). , Also referred to as “fermented product of cereal plant-derived material” or “fermented product of cereal plant-derived material or processed product thereof”) has found that the above-mentioned problems can be solved, and has completed the present invention.
- the present invention has the following features.
- a composition for modifying antigen-presenting cells comprising the fermented product according to any one of [1] to [10] above or a processed product thereof.
- An immunomodulator comprising the fermented product according to any one of [1] to [10] above or a processed product thereof.
- a method for preparing a processed product of a cereal plant-derived material fermented product comprising a step of fermenting a cereal plant-derived material using koji mold, a step of extracting a fermentation product with ethanol, and a step of fractionating the ethanol extract with hexane.
- a method for modifying an antigen-presenting cell comprising a step of bringing a fermented product or a processed product thereof according to any one of [1] to [10] above into contact with a cell collected from a subject.
- a method for producing controllable dendritic cells comprising a step of bringing a fermented product according to any one of [1] to [10] above or a processed product thereof into contact with cells collected from a subject.
- a pharmaceutical composition for preventing or treating an immune disease comprising the fermented product according to any one of [1] to [10] above or a processed product thereof.
- An immunomodulator comprising 14-dehydroergosterol.
- a method for modifying antigen-presenting cells comprising contacting 14-dehydroergosterol with cells collected from a subject.
- a method for producing regulatory dendritic cells comprising a step of bringing 14-dehydroergosterol into contact with cells collected from a subject.
- a pharmaceutical composition for preventing or treating an immune disease comprising 14-dehydroergosterol.
- a method for producing regulatory T cells comprising a step of bringing a fermented product or a processed product thereof according to any one of [1] to [10] above into contact with cells collected from a subject.
- a method for producing regulatory T cells comprising a step of bringing 14-dehydroergosterol into contact with cells collected from a subject.
- a regulatory T cell inducer containing 14-dehydroergosterol [31] A regulatory T cell inducer containing 14-dehydroergosterol.
- An inflammatory T cell proliferation inhibitor comprising 14-dehydroergosterol.
- novel materials and substances having an effect of preventing and treating immune diseases including graft rejection and graft-versus-host disease are provided by enhancing immune tolerance.
- FIG. 6 shows changes in cytokine production of CD4 + T cells induced by DCs treated with wheat bran fermented koji ferment extract. It is a figure showing the ratio (antigen non-specific reaction) of Treg induced
- FIG. 12A is a graph showing the effect (MHCII) of fermentation conditions of fermented wheat bran on DC maturation / differentiation.
- FIG. 12B is a graph showing the effect (CD86) of fermentation conditions of wheat bran fermented rice bran on DC maturation / differentiation.
- FIG. 12C is a graph showing the influence (IL-10) of fermentation conditions of fermented wheat bran on DC maturation / differentiation.
- FIG. 13A is a graph depicting the effect of 14-dehydroergosterol (14-DHE) and various control substances on DC maturation / differentiation (CD40).
- FIG. 13B is a graph showing the effect of 14-DHE and various control substances on DC maturation / differentiation (CD80).
- FIG. 13C is a graph showing the effect of 14-DHE and various control substances on DC maturation / differentiation (CD86).
- FIG. 13D is a graph showing the effect (IA / IE) of 14-DHE and various control substances on DC maturation / differentiation.
- FIG. 13E is a graph showing the effect (ICOS-L) of 14-DHE and various control substances on DC maturation / differentiation.
- FIG. 14A is a graph showing cytokine production (IL-10) from DCs treated with 14-DHE or various control substances.
- FIG. 10 cytokine production
- FIG. 14B is a graph showing cytokine production (IL-12p40) from DCs treated with 14-DHE or various control substances.
- FIG. 5 is a graph showing the ratio of Tregs induced by DCs treated with 14-DHE (antigen non-specific reaction (MLR) and antigen-specific reaction).
- FIG. 7 depicts a cytokine production profile from CD4 + T cells induced by DCs treated with 14-DHE.
- A Results of MLR
- B Results of antigen-specific T cell response. The amount of each cytokine in the culture supernatant was measured by ELISA.
- 14-DHE of DC treated with CD8 + regulatory T cells (CD8 + Treg) is a diagram representing the differentiation inducing ability.
- FIG. 6 represents the induction of CD8 + Treg by 14-DHE treated DCs and untreated control DCs in the presence of TGF- ⁇ . It is a figure showing the Treg induction
- CD25 + FoxP3 expression of CD3 + CD4 + total CD4 + cells is shown.
- 14-DHE treatment is performed at a concentration of 50 nM, 100 nM, 500 nM or 1000 nM and represents the induction of CD4 + Treg from CD4 + T cells in the presence of TGF- ⁇ .
- D It is a figure which shows the ratio of the proliferation CD4 ⁇ +> T cell at the time of MOG antigen restimulation. It is a figure showing the effect of 14-DHE with respect to multiple sclerosis.
- E It is a figure which shows the positive rate of the mDC (CD11b + CD11c + B220 ⁇ - > ) activation marker in a regional lymph node and a spinal cord (upper panel: lymph node; lower panel: spinal cord).
- FIG. 4 represents the effect of 14-DHE on human DC maturation factor cell surface expression.
- the present invention relates to a fermented cereal plant-derived material obtained by fermenting a cereal plant-derived material using koji mold or a processed product thereof.
- the present invention also relates to a method for producing antigen-presenting cells and regulatory T cells, and the use of a cereal plant-derived material fermented product or processed product thereof or 14-dehydroergosterol in such a method.
- the present invention also relates to the use of a cereal plant-derived material fermented product or processed product thereof or 14-dehydroergosterol for the prevention or treatment of immune diseases.
- the fermented cereal plant-derived material of the present invention or a processed product thereof can be obtained by adding koji mold to a cereal plant-derived material as a raw material and fermenting it.
- cereal plant-derived material fermented product or processed product thereof includes both a cereal plant-derived material fermented with koji mold and a part thereof (such as a solvent extraction fraction).
- cereal plant-derived material fermented product may be used to mean both a material obtained by fermenting a cereal plant-derived material and a processed product thereof.
- Favorable cereal plants in the present invention include all plants classified as Gramineae in the plant classification table. Specific examples include, but are not limited to, rice, barley, wheat, rye, millet, millet and corn. Of these, rice, barley, wheat and rye are preferred, and wheat is particularly preferred.
- the cereal plant-derived material in the present invention is a material derived from the seeds of a cereal plant, and is typically the whole seed of a cereal plant or a part thereof.
- the cereal plant-derived material in the present invention preferably contains a seed coat.
- the cereal plant-derived material including the seed coat include cereal seed whole grains, bran of cereal plants, and rice bran.
- a particularly preferred cereal plant-derived material of the present invention is a bran of a cereal plant, most preferably a wheat bran.
- the bran of the cereal plant can be obtained by collecting the outer part of the seed obtained by crushing or milling the cereal plant seeds.
- the koji mold that can be used in the present invention is not particularly limited as long as the cereal plant-derived material of the present invention can be fermented.
- black koji (Aspergillus awamori, Aspergillus niger), jaundice (Aspergillus oryzae) is used.
- the koji mold is an Aspergillus filamentous fungus, most preferably a black koji mold.
- the black koji mold in the present invention includes Aspergillus awamori and Aspergillus niger which are black koji molds in a narrow sense, Aspergillus kawachi which is referred to as white koji molds in a narrow sense, and subspecies derived from these bacterial species.
- These koji molds can be obtained from Akita Imano Co., Higuchi Moyashi Co., Nippon Brewing Industry, etc.
- the fermentation of the present invention can be carried out using methods known to those skilled in the art of inoculating and culturing koji molds as raw materials.
- a lid culling method, a box culling method, a floor culling method, a mechanical culling method and the like can be exemplified.
- the amount of koji added is preferably 0.005 to 5% by weight, more preferably 0.01 to 1% by weight, based on the cereal plant-derived material treated by adding water (for example, autoclave, steaming, etc.) More preferred is 0.05 to 0.5% by weight, and most preferred is 0.1% by weight.
- the fermentation temperature varies slightly depending on the koji used, it is generally 20 ° C. to 50 ° C., preferably 22 ° C. to 45 ° C., more preferably 30 ° C. to 40 ° C.
- the fermentation time is, for example, 24 hours to 14 days, preferably 48 hours to 10 days, more preferably 72 hours to 7 days.
- the humidity during fermentation can be appropriately adjusted by those skilled in the art according to the type of koji mold.
- the relative humidity is maintained at 80% or higher during fermentation.
- the relative humidity is kept high (for example, 90% or more) in the early stage of fermentation, and the relative humidity is slightly lowered (for example, 75% or more) in the late stage of fermentation (for example, 24 hours or more after inoculation).
- a cereal plant-derived material fermented product or a processed product thereof includes a product obtained by fermenting a cereal plant-derived material, or a fraction obtained therefrom by solvent extraction or the like.
- the extract of the fermentation material can be obtained by an extraction method known to those skilled in the art, and examples of the extraction method include organic solvent extraction, supercritical fluid extraction method, warm pressure extraction method and the like. The extraction methods exemplified above may be used alone or in combination.
- Solvent extraction can be performed using a general method known to those skilled in the art.
- the organic solvent used for solvent extraction is not limited, but ethanol, methanol, n-propanol, isopropanol, methyl acetate, ethyl acetate, acetone, hexane, heptane, cyclohexane, benzene, toluene, phenol, and the like can be used.
- Preferred organic solvents are ethanol, methanol, ethyl acetate, and hexane. Two or more kinds of these organic solvents may be used as a mixture, or two or more stages of solvent extraction steps using two or more kinds of organic solvents may be performed.
- fermented material dried by freeze-drying is pulverized, an organic solvent is added thereto, and sonication is performed with stirring at 20 to 50 ° C., preferably 25 to 45 ° C. Can be performed.
- the amount of the solvent to be added is 1 to 50 times, preferably 2 to 40 times, more preferably 10 to 30 times the weight of the fermentation material.
- the extraction time is 10 minutes to 2 hours, preferably 15 minutes to 1 hour, more preferably 20 to 50 minutes.
- the filtrate is then collected by filtration, centrifugation, etc., and the insoluble fraction contained in the residue is removed.
- the organic solvent fraction (ie, the extract fraction) is concentrated from the filtrate by evaporation under reduced pressure, and extracted in a fluid or dry form. You can get things.
- the organic solvent fraction can be further obtained from the residue after the first organic solvent extraction by repeating the extraction with the organic solvent for the insoluble fraction after the organic solvent extraction.
- fractionation using another solvent may be performed following the solvent extraction.
- a second organic solvent that is the same as or different from that used for solvent extraction is added to the organic solvent fraction obtained by solvent extraction, and a third organic that is not miscible with the second organic solvent is added thereto.
- a solvent can be added and extracted to obtain a fraction soluble in the third organic solvent.
- the substance present in the organic solvent fraction may be further purified, and in this case, known separation and purification methods can be combined appropriately.
- known separation and purification methods can be combined appropriately.
- liquid-liquid partition, organic solvent precipitation, various column chromatography (eg, HPLC, silica gel chromatography, molecular sieve chromatography, ion exchange chromatography, reverse phase chromatography, etc.), crystallization, etc. can be used.
- the cereal plant-derived fermented material of the present invention or the processed product thereof is an ethanol fraction obtained by separating an ethanol-soluble fraction by ethanol extraction after fermentation. More preferably, the fermented cereal plant-derived material of the present invention is a hexane fraction obtained by further separating a hexane-soluble fraction by hexane fraction after ethanol extraction.
- the cereal plant-derived fermented material of the present invention or the processed product thereof obtained as described above has an action of suppressing an immune reaction mediated by DC, as shown in the following Examples. Therefore, the fermented cereal plant-derived material of the present invention or a processed product thereof is useful for the prevention and treatment of immune diseases that are considered to be caused by excessive activation of the immune system.
- Diseases to be treated by the therapeutic method using the present invention include transplant rejection associated with cell or organ / tissue transplantation and graft-versus-host disease, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, type I diabetes, uveitis, autoimmunity Myocarditis, myasthenia gravis, systemic lupus erythematosus, autoimmune hemolytic anemia, systemic scleroderma, ulcerative colitis, Crohn's disease, Sjogren's syndrome, autoimmune liver disease (eg, primary biliary cirrhosis) , Psoriasis, idiopathic thrombocytopenic purpura, Goodpasture syndrome (eg, glomerulonephritis), pernicious anemia, Hashimoto's disease, viti
- the fermented cereal plant-derived material of the present invention can improve inflammation caused by immune diseases by ingestion. Moreover, it can prevent having an immune disease by daily ingestion. For this purpose, it is desirable to ingest 2 g or more, preferably 10 g or more, of the cereal plant-derived material fermented product or processed product thereof of the present invention per day. Since the cereal plant-derived material fermented product or the processed product thereof according to the present invention is a component obtained by fermenting the cereal plant-derived material with koji mold used for food, it can be incorporated into daily eating habits. Moreover, the time of administration or ingestion may be any time before, between and after meals.
- the cereal plant-derived material fermented product or processed product thereof according to the present invention can be provided by being blended with a specific composition, for example, a food or drink product or a pharmaceutical product.
- the cereal plant-derived material fermented product of the present invention or a processed product thereof When the cereal plant-derived material fermented product of the present invention or a processed product thereof is provided in a food or drink product, it can be processed into any food form.
- the food and drink that can be blended with the fermented cereal plant-derived material of the present invention or a processed product thereof include foods and drinks including natural products and processed products thereof.
- the compounding quantity can mix
- foods and drinks include, but are not limited to, functional foods such as tablets, powders, granules, capsules, jellies, cereals such as breads, confectionery, cookies, biscuits, milk Dairy products such as yogurt and ice cream, carbonated drinks, soft drinks, fruit juice drinks, drinks such as medicinal drinks, prepared foods and processed foods.
- the fermented cereal plant-derived material of the present invention or a processed product thereof When the fermented cereal plant-derived material of the present invention or a processed product thereof is provided in a pharmaceutical product, it can be formulated as an immunomodulator for treatment, improvement or prevention of immune diseases.
- the administration route of the preparation is not particularly limited, and examples thereof include oral administration and enteral administration.
- the fermented cereal plant-derived material of the present invention or a processed product thereof may be administered as it is, or together with a pharmaceutically acceptable carrier or excipient, solution, suspension, powder. , Granules, tablets, capsules and the like.
- the immunomodulator of the present invention includes a binder, a lubricant, a dispersant, a suspending agent, an emulsifier, a diluent, a buffer, an antioxidant, a bacterial inhibitor, and the like. Can be used. It can also be mixed or used in combination with other pharmaceutical products. The above preparation may be sterilized.
- the subject to which the immunoregulatory food / beverage product or immunomodulator of the present invention is applied is not particularly limited, and is a healthy person, a patient with an immune disease, a patient undergoing treatment for an immune disease, a healthy person considering the prevention of an immune disease, etc. Any of these may be used. Further, the subject is not limited to humans, and may be applied to animals other than humans.
- the immunoregulatory food / beverage product or immunomodulator of the present invention allows the induction of regulatory T cells by the modified antigen-presenting cells by modifying the antigen-presenting cells, and also directly regulates regulatory T cells. Can be guided. Furthermore, the immunoregulatory food or drink or the immunomodulator of the present invention can suppress the proliferation of inflammatory T cells. Therefore, this makes it possible to suppress an excessive immune reaction.
- the dose of the immunoregulatory food or drink or immunomodulator of the present invention varies depending on various factors such as the age, weight, sex, and obesity of the subject, but typically the cereal plant of the present invention.
- the amount of administration of the fermented material of the derived material or the processed product thereof per day is 2 g or more, preferably 10 g or more, and the administration interval is not particularly limited.
- the cereal plant-derived material fermented product or processed product thereof according to the present invention can improve immune diseases efficiently, and is a component obtained by fermenting the cereal plant with a koji mold used for food. It is highly safe and useful for use in foods and beverages or medicines. Furthermore, since the fermented cereal plant-derived material of the present invention or the processed product thereof can be produced from a relatively inexpensive raw material such as wheat bran, it is excellent in terms of cost.
- the present invention also relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating an immune disease, comprising the cereal plant-derived material fermented product of the present invention or a processed product thereof.
- the pharmaceutical composition can contain an additional component such as a pharmaceutically acceptable excipient as described above, in addition to the fermented cereal plant-derived material of the present invention or a processed product thereof.
- the present invention also includes a step of fermenting a cereal plant-derived material using koji mold, a step of extracting a fermentation product with ethanol, and a step of fractionating the ethanol extract with hexane to treat the cereal plant-derived material fermented product of the present invention. It also relates to a method for preparing the product. The fermentation method and the solvent extraction method can be performed as described above.
- the present invention also relates to a method for modifying antigen-presenting cells, which comprises the step of bringing the fermented cereal plant-derived material of the present invention or a processed product thereof into contact with cells collected from a subject.
- antigen-presenting cell refers to a cell that expresses MHC class II on the cell surface, such as a dendritic cell (DC), monocyte, macrophage, B cell, and the like, and to differentiate into such a cell. It means possible undifferentiated cells.
- the antigen presenting cell is a dendritic cell.
- DCs modified by the methods of the present invention show reduced activated cell surface markers and production of inflammatory cytokines and have the ability to induce regulatory T cells (Tregs).
- Tregs regulatory T cells
- the antigen-presenting cells modified using the method of the present invention are particularly ex vivo, in which cells removed from a subject are treated using the method of the present invention to obtain regulatory DCs and returned to the subject. Very useful in therapy.
- modifying antigen-presenting cells means changing gene expression (cell surface markers, cytokines, etc.) in antigen-presenting cells and changing its influence on other cell types such as T cells. means.
- gene expression is not only transcription of mRNA from chromosomal DNA of cells, translation of mRNA into protein, but also maturation by post-translational modification of expressed protein, change in subcellular localization of protein, protein from cell It is understood to mean changes in secretion.
- antigen presenting cells modified by the methods of the present invention have the ability to induce regulatory T cells.
- the present invention also relates to a method for producing controllable dendritic cells, which comprises the step of bringing the fermented cereal plant-derived material of the present invention or a processed product thereof into contact with cells collected from a subject.
- regulatory dendritic cell means a dendritic cell having the ability to suppress excessive activation / runaway of the immune system through its own action and induction of regulatory T cells.
- the definition of regulatory dendritic cells differs depending on the literature and is not uniquely determined.
- the expression of dendritic cell activation markers CD40, CD80, CD86, MHC class II and the like is reduced.
- IL-1 ⁇ , IL-6 which are inflammatory cytokines that produce IL-10, TGF- ⁇ , etc.
- inhibitory dendritic cell markers such as ICOSL, PD-L1, etc. It has features such as reduced production of TNF- ⁇ , IL-12, etc., and the ability to suppress excessive activation of the inflammatory signal NF- ⁇ B cascade against the action of pro-inflammatory substances.
- examples of the “cell” to be brought into contact with the fermented cereal plant-derived material of the present invention or a processed product thereof include dendritic cells, macrophages, monocytes And undifferentiated cells that can differentiate into antigen-presenting cells (for example, stem cells that can differentiate into dendritic cells, progenitor cells, etc., especially bone marrow-derived stem cells, peripheral blood mononuclear cells, etc.).
- a preferred cell is a cell whose differentiation has been induced by stimulating bone marrow-derived cells with cytokines such as Flt-3L.
- the present invention further relates to a method for producing regulatory T cells, which comprises the step of bringing the fermented material of the cereal plant-derived material of the present invention or a processed product thereof into contact with cells collected from a subject.
- regulatory T cells means a specific T cell subpopulation that suppresses an immune response and maintains homeostasis and self-tolerance.
- the definition of regulatory T cells varies depending on the literature and is not uniquely determined, but has characteristics such as constitutive expression of CD4, CD25 and FoxP3.
- examples of the “cell” to be brought into contact with the fermented cereal plant-derived material of the present invention or a processed product thereof include naive T cells.
- Naive T cells can be obtained, for example, by further sorting cells isolated from the spleen by expressing CD4 and CD62L.
- the fermented cereal plant-derived material of the present invention to be contacted with an isolated cell or a processed product thereof is 1 to A suitable culture medium or incubation solution at a concentration of 500 ⁇ g / mL, preferably at a concentration of 5-250 ⁇ g / mL, more preferably at a concentration of 10-150 ⁇ g / mL, particularly preferably at a concentration of 25-100 ⁇ g / mL.
- the contact time is 1 hour to 28 days, preferably 12 hours to 14 days, more preferably 1 to 12 days, and most preferably 3 to 10 days.
- this invention has the effect
- this invention has the effect
- the present invention also relates to a composition for inhibiting inflammatory T cell proliferation, which suppresses the proliferation of inflammatory T cells induced by an antigen in relation to autoimmune diseases or allergies.
- the composition is a pharmaceutically acceptable excipient as described above, or an additive that is commonly used in a reagent used in vitro. (Buffers, tonicity agents, etc.) can be included.
- ergosta-5,7,14,22-tetraen-3 ⁇ -ol which is a compound represented by the following structural formula from a wheat bran fermented product. , 7,14,22-tetraen-3 ⁇ -ol; referred to elsewhere in the specification as “14-dehydroergosterol” or “14-DHE”).
- 14-dehydroergosterol has been found for the first time that dehydroergosterol has the action of suppressing the immune response mediated by DC, similar to the fermented cereal plant-derived material of the present invention or its processed product.
- 14-dehydroergosterol is an active ingredient responsible for the immunomodulating action of the fermented cereal plant-derived material of the present invention or a processed product thereof.
- the cereal plant-derived material fermented product or processed product thereof of the present invention preferably contains 14-dehydroergosterol.
- 14-dehydroergosterol 14-dehydroergosterol was found in Aspergillus niger in 1951 (Barton, DHR., And Bruun, T., J. Chem. Soc., 2728-2733 (1951)), 2009. It was rediscovered as a component of kiwifruit peel in 1980 (compound 8 of Fiorentino, A. et al., J. Agric. Food Chem., 57: 4148-4155 (2009)), but its physiological activity has been studied so far. Not reported.
- the demonstration of the physiological activity of 14-dehydroergosterol by the present inventors provides a novel substance effective for preventing or treating a condition associated with excessive activation of the immune system such as an immune disease. It will be.
- the present invention also relates to an immunomodulator or immunomodulating food or drink containing 14-dehydroergosterol, and a pharmaceutical composition for preventing or treating an immune disease containing 14-dehydroergosterol.
- the dose of 14-dehydroergosterol varies depending on various factors such as the subject's age, weight, sex, degree of obesity, etc., but typically 14-dehydroergosterol is greater than 1 mg per day.
- the dose is preferably 5 mg or more, and the administration interval is not particularly limited.
- the present invention also relates to a method for modifying antigen-presenting cells and a method for producing regulatory dendritic cells, which comprises the step of bringing 14-dehydroergosterol into contact with cells collected from a subject.
- examples of the “cell” to be brought into contact with 14-dehydroergosterol include antigen-presenting cells such as dendritic cells, macrophages and monocytes, and antigen presentation.
- antigen-presenting cells such as dendritic cells, macrophages and monocytes
- antigen presentation examples include undifferentiated cells that can differentiate into cells (for example, stem cells, progenitor cells, etc. that can differentiate into dendritic cells, in particular, bone marrow-derived stem cells, peripheral blood mononuclear cells, etc.).
- a preferred cell is a cell whose differentiation has been induced by stimulating bone marrow-derived cells with cytokines such as Flt-3L.
- 14-dehydroergosterol to be contacted with the isolated cell is at a concentration of 0.1 to 100 ⁇ M, preferably 0.2 to 50 ⁇ M. At a concentration, more preferably at a concentration of 0.5-25 ⁇ M, particularly preferably at a concentration of 1-10 ⁇ M, it is added to a suitable culture medium or incubation solution and brought into contact with the cells.
- the contact time is 1 hour to 28 days, preferably 12 hours to 14 days, more preferably 1 to 12 days, and most preferably 3 to 10 days.
- the present invention relates to a method for producing regulatory T cells, which comprises the step of bringing 14-dehydroergosterol into contact with cells collected from a subject.
- examples of the “cell” to be contacted with 14-dehydroergosterol include naive T cells.
- Naive T cells can be obtained, for example, by further sorting cells isolated from the spleen by expressing CD4 and CD62L.
- 14-dehydroergosterol to be contacted with the isolated naive T cell is more preferably 0.01 to 10 ⁇ M, more preferably 0.02 to 5 ⁇ M. Is added at a concentration of 0.05 to 2.5 ⁇ M, particularly preferably at a concentration of 0.05 to 1 ⁇ M, in a suitable culture medium or incubation solution and brought into contact with the cells.
- the contact time is 1 hour to 28 days, preferably 12 hours to 14 days, more preferably 1 to 12 days, and most preferably 3 to 10 days.
- the present invention relates to a koji mold fermented product or a processed product thereof containing 14-dehydroergosterol and having an action of modifying antigen-presenting cells, and a composition containing the koji mold fermented product or the processed product thereof.
- the present invention also relates to a koji mold fermented product or a treated product thereof, which contains 14-dehydroergosterol and has an action of modifying regulatory T cells, and a composition containing the koji mold fermented product or the treated product thereof.
- the composition includes the above-mentioned pharmaceutically acceptable excipients, or additives usually used for reagents used in vitro (buffers, Tonicity agents and the like).
- 14-dehydroergosterol has an effect of inducing regulatory T cells by modifying DC and an effect of inducing regulatory T cells by directly acting on naive T cells. . Therefore, the present invention also relates to a regulatory T cell inducer containing 14-dehydroergosterol.
- the present invention also relates to an inflammatory T cell proliferation inhibitor containing 14-dehydroergosterol.
- the regulatory T cell inducer and inflammatory T cell proliferation inhibitor of the present invention can contain the above-mentioned pharmaceutically acceptable excipients in addition to 14-dehydroergosterol as an active ingredient. .
- the gonococcal fermented product of the present invention or a processed product thereof and a composition containing the same have an action of modifying antigen-presenting cells, for example, an immune reaction mediated by DC can be suppressed. Useful in the prevention or treatment of disease.
- the gonococcal fermented product of the present invention or a processed product thereof and a composition containing the same can induce regulatory T cells (Tregs) from naive T cells, and are useful in the prevention or treatment of immune diseases. It is.
- Tregs regulatory T cells
- the gonococcal fermented product or processed product thereof of the present invention and a composition containing the same can suppress the proliferation of inflammatory T cells whose proliferation is stimulated in the body by various antigen sensitizations. It is useful in the prevention or treatment of immune diseases.
- Example 1 Preparation of various cereal plant-derived materials and fermented products thereof Rice and barley fermented products were prepared as follows. Various kinds of commercial rice bran (Koji koji: Akita Imano, Aspergillus oryzae); Koji koji: Akita Imano, Kuroiso mild (Aspergillus) (Awamori); Red yeast: Akita Imano (Monascus Anka)) was inoculated at a rate of 0.1% by weight.
- Koji koji Akita Imano, Aspergillus oryzae
- Koji koji Akita Imano, Kuroiso mild (Aspergillus) (Awamori)
- Red yeast Akita Imano (Monascus Anka)
- the yellow and black koji fermented samples are kept at 35 ° C for 72 hours, the red koji fermented sample is 30 ° C for seven days, while being properly cared for (removing the lump that has become a lump). , Made ironmaking.
- Wheat bran and rice bran fermented rice bran were prepared as follows. 550 mL of demineralized water was added to 450 g of wheat bran (Nisshin Flour Milling Co., Ltd.) or rice bran, mixed well, and then sterilized using an autoclave at 121 ° C. for 50 minutes. Inoculated with 0.1% by weight of various sterilized seed varieties (Kuro Koji: Akita Imano, Kuroiso Mild (Aspergillus awamori); Tempe: Akita Imano (Rhizopus Oligosporus)) did. The relative humidity was maintained at 85% or higher, and the culture was performed at 35 ° C. Care was performed 24 hours and 48 hours after the start of the culture, and the culture was completed after 72 hours.
- the fermented fermented material sample was freeze-dried and then pulverized with a household pulverizer. 40 mL of 99.5% ethanol was added to 2 g of the obtained frozen sample, and the mixture was subjected to ultrasonication while stirring at 40 ° C. for 30 minutes to perform ethanol extraction. The supernatant was filtered through filter paper, 40 mL of 99.5% ethanol was further added to the residue, extraction was performed in the same manner, the supernatant was similarly filtered through filter paper, and the filtrates were combined. The obtained extract was concentrated with an evaporator, further dried with a freeze dryer, and the weight was measured.
- Example 2 Evaluation of regulatory DC-inducing activity For the purpose of obtaining substances having an activity effective for alleviating, preventing and treating various immune diseases including graft rejection and graft-versus-host disease, (A) Decrease in expression of cell surface maturation factors represented by CD86, (B) Decrease in the expression level of inflammatory cytokines such as IL-12 produced by DC, and (C) IL-10 produced by DC The sample prepared in Example 1 was evaluated using as an index the increase in the expression level of regulatory cytokines such as.
- Example 1 The cereal plant-derived materials prepared in Example 1 and their fermented koji products shown in Table 1 were tested.
- C57BL / 6 mouse bone marrow cells were collected from the femur according to a conventional method and subjected to erythrocyte removal treatment.
- the obtained bone marrow cells were suspended in RPMI medium (Gibco) containing 10% FCS, 2 ⁇ M ⁇ -mercaptoethanol so as to be 1 ⁇ 10 6 cells / mL.
- RPMI medium Gibco
- FCS 10% FCS
- 2 ⁇ M ⁇ -mercaptoethanol so as to be 1 ⁇ 10 6 cells / mL.
- Flt-3L R & D systems
- DC-inducing cytokine was added at a final concentration of 100 ng / mL.
- each sample shown in Table 1 was added at a final concentration of 50 ⁇ g / mL.
- LPS manufactured by Sigma Aldrich
- a sample without LPS was also prepared as a control.
- CD86 expression level was evaluated by analysis using a flow cytometer. Briefly, after harvesting and washing the cells, anti-CD11c-APC, anti-CD11b-FITC, anti-B220-PerCP, anti-CD86-PE antibodies (all from Becton Dickinson) for 30 minutes, 4 minutes The cells were stained at 0 ° C., washed, and analyzed using FACS Canto II (Becton Dickinson).
- mDC myeloid DC
- pDC plasmacytoid DC
- the culture supernatant was subjected to the ELISA assay for examining (B) IL-12 production amount and (C) IL-10 production amount.
- As an ELISA kit OptEIA Mouse ELISA Set (Becton Dickinson) was used, and measurement was performed according to the manufacturer's instructions.
- FIG. 1 shows the assay results for the samples listed in Table 1.
- the expression level of CD86 average fluorescence intensity: evaluated as MFI
- MFI average fluorescence intensity
- FIG. 2 shows the assay results for the samples listed in Table 1. No. Significant suppression of IL-12p70 expression was observed in all hexane extracted fractions from 1 to 10.
- FIG. 3 shows the assay results for the samples listed in Table 1. No. Only 8 showed significant IL-10 expression promoting activity.
- Example 3 Comparison of Fermented Wheat Bran and Other Controllable DC Inducing Methods Regarding the extract of fermented wheat bran that was found to have controllable DC-inducing activity in Example 2, it was compared with a known representative controllable DC inducer. A comparison was made.
- Example 1 The wheat bran fermented product hexane fraction (No. 8) prepared in Example 1 shown in Table 1 was used for the test.
- GM-CSF is used as a DC inducer. Therefore, DC is induced in each system of GM-CSF and Flt-3L, and each control DC inducer is evaluated. did.
- Rapamycin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added at 10 ng / mL 3 days after the start of culture. Culture was performed for 7 days, and LPS was added at a final concentration of 1 ng / mL for the last 24 hours.
- the expression intensity of DC activation markers CD40, CD86 and MHCII on the cell surface and the inhibitory marker PD1L was evaluated by analysis using a flow cytometer. As in Example 1, analysis was performed with a gate set in mDC. Anti-CD11c-APC, anti-CD11b-APC-Cy7, anti-B220-PerCP, anti-CD40-FITC and anti-CD86-PE, or anti-CD11c-APC, anti-CD11b-APC-Cy7, anti-B220-PerCP, anti-MHCII-FITC and Stained with anti-PD1L-PE (all obtained from Becton Dickinson) and analyzed.
- the expression intensity of DC activation markers CD40, CD86 and MHCII on the cell surface and the inhibitory marker PD1L was evaluated by analysis using a flow cytometer. Although only mDC is generated by DC induction with GM-CSF, analysis was performed by setting a CD11c + CD11b + B220 ⁇ mDC gate as in the case of Flt-3L.
- DC treated with the wheat bran fermented extract has a stronger expression of DC activation marker than the control even in the absence of LPS. In addition to being suppressed, it was shown to be almost unresponsive to LPS stimulation and tolerant to inflammatory stimulation. In the case of ⁇ -oryzanol, the expression of a strong activation marker was observed as in the control, and no regulatory DC-inducing effect was observed. Rapamycin was found to suppress the expression of CD40 and CD86 regardless of whether LPS was not added or not, but was not effective against MHCII, confirming the formation of limited regulatory DC.
- the fermented wheat bran extract which is derived from food and has significant advantages in terms of safety, side effects, and cost, is equivalent to rapamycin and IL-10 / TGF- ⁇ , which are known control DC inducers. It has been shown that regulatory DC can be induced with greater effectiveness.
- Example 4 Evaluation of T cell proliferation supporting ability and cytokine production ability of DC treated with wheat bran bran extract extract
- Example 1 The wheat bran fermented product (No. 8) prepared in Example 1 shown in Table 1 was used for the test.
- DC was induced by Flt-3L in the presence of a wheat bran fermented extract in the same manner as in the above example except that BALB / c mice were used as the bone marrow cell source, and the last 24 hours were treated with LPS. Stimulation by.
- As a control cells to which no wheat bran fermented extract was added were prepared.
- CD11b + CD11c + B220 ⁇ mDCs were sorted using a cell sorter (FACS Aria).
- mitomycin C treatment was performed to stop the growth of DC itself during the culture period. Briefly, cells were incubated in RPMI 1640 medium containing 10 ⁇ g / mL mitomycin C (Nacalai Tesque) for 30 minutes at 37 ° C. and washed twice with RPMI medium.
- CD3 + CD4 + CD62L + naive CD4 + T cells were sorted from C57BL / 6 mice with a cell sorter and fluorescently stained with a CFSE label. Briefly, cells were stained with anti-CD3-APC-Cy7, anti-CD4-APC, and anti-CD62L-PE, and after naive CD4 + T cells were sorted, CellTrace CFSE Cell Proliferation kit (Molecular Probes) was used. And stained according to the manufacturer's instructions.
- CD4 + T 1: 10 (cell number) and cultured for 7 days. did.
- the degree of division / proliferation of CD4 + T cells was evaluated by reducing the intensity of CFSE.
- production of inflammatory cytokines TNF- ⁇ and IL-17 from differentiated CD4 + T cells was determined by intracellular cytokine staining.
- Example 5 Evaluation of ability of DC treated with fermented wheat bran extract to induce regulatory T cells (Treg) Evaluation of ability of DC treated with fermented wheat bran extract to induce conversion of naive T cells to Treg To do this, an assay was performed.
- CD4 + T 1: 10 (cell number), and co-cultured.
- 0.5 ng / mL TGF- ⁇ 1 manufactured by Peprotech was added to the medium.
- Treg production increased more than 3 times compared to the control by co-culture with DC treated with wheat bran fermented extract. .
- DCreg increased more than 2-fold compared to the control.
- Example 6 Comparison of gonococcal species used It was examined by comparing various gonococcal species whether differences in gonococcal species used for wheat bran fermentation caused differences in controllable DC induction efficiency.
- Example preparation> Commercially available seed meals include black koji fungus (Akita Imano, Kuroiso Mild (Aspergillus awamori); Akita Imano, shochu white birch (Aspergillus kawachi); Neisseria gonorrhoeae (Akita Imano: Soy Sauce No.
- a fermented product and an extract were prepared in the same manner as in the method for preparing a fermented wheat bran and processed product thereof described in Example 1, except that Moreover, as a sample without fermentation, the sample sterilized by the same method and not inoculated with seed pods was used.
- Fig. 11 shows the IL-10 concentration. Stable IL-10 production was observed when any strain was used, and there was no difference due to the difference in strain. About 10% of IL-10 promoting activity was observed even in the unfermented product.
- black koji molds are generally preferable as a strain, and that the wheat bran itself as a raw material has a regulatory DC-inducing activity, but the activity can be enhanced by fermentation.
- Example preparation> A fermented product and an extract were prepared in the same manner as the wheat bran black koji preparation method described in Example 1, using Higuchi Black Koji from Higuchi Moyashi Co., Ltd. as a commercial seed koji. At that time, the culture temperature was 30, 35 or 37 ° C., the culture days were 2, 3 or 4 days, and the water content was 45% in addition to 55% of the basic conditions.
- Example 8 Isolation of Active Ingredient A compound considered to be an active ingredient for exerting an immunoregulatory effect in the above examples was isolated from a fermented wheat bran meal.
- the obtained extract was dissolved in hexane so as to be 200 mg / mL, and 3 mL was applied to Mega Bond Elute SI (20 g) (Varian) conditioned with hexane. Subsequently, the column was washed with 60 mL of hexane and eluted with 60 mL of ethyl acetate to recover the column adsorbate. The obtained eluate was dried with an evaporator. From 3 g of hexane extract, 2.8 g of SI column adsorbate was obtained.
- Example 9 Regulatory DC-inducing activity of 14-dehydroergosterol Regulatory DC-inducing activity of 14-dehydroergosterol (14-DHE) isolated and purified from the wheat bran fermented product as described above and its structure determined was evaluated. . As controls, ergosterol-related substances ergosterol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), 9 (11) -dehydroergosterol (9 (11) -DHE) (manufactured by Sigma-Aldrich) were used.
- CLA conjugated linoleic acid
- Example 2 bone marrow cells were prepared from femurs of C57BL / 6 mice, and dendritic cells were induced using Flt-3L.
- the test substance was added at 1 ⁇ M, 5 ⁇ M, or 10 ⁇ M simultaneously with the start of the culture.
- LPS from Salmonella typhosa
- CD11c + CD11b + was set as the gate of mDC, and the expression levels of CD40, CD80, CD86, IA / IE and ICOS-L were measured. In addition, IL-12p40 and IL-10 in the culture supernatant were measured by ELISA.
- the expression level of the marker ICOS-L which is an index of the immunosuppressive action of DC, was hardly changed by 14-DHE.
- the ratio of the immunostimulatory marker and the immunosuppressive marker on DC was drastically inclined to the suppressor side by adding 14-DHE.
- Example 10 Evaluation of the ability of DC treated with 14-DHE to induce regulatory T cells (Treg) ⁇ Experimental method> In the same manner as in Example 5, the Treg-inducing activity of mDC treated with 14-DHE was measured. As a control, similar measurements were performed using DC not treated with 14-DHE.
- Example 11 Cytokine profile produced by CD4 + T cells induced by 14-DHE treated DC (1) MLR Bone marrow cells were prepared from C57BL / 6 mouse femurs in the same manner as in the above-described Examples, and dendritic cells were induced using Flt-3L. Simultaneously with the start of the culture, 14-DHE was added at 3 ⁇ M. Seven days later, Salmonella typhosa-derived LPS (Sigma Aldrich) was added at 5 ng / mL, and cells were collected 24 hours later. Thereafter, CD11c + CD11b + was set as the gate of mDC, and the collected cells were sorted.
- CD4 + CD62L + T cells were separated from the BALB / c mouse spleen using CD4 + CD62L + T cell isolation kit II (mouse) (Miltenyi Biotech), and the ratio of mDC: CD4 + T cells was 1: 5 and mixed culture.
- mDC prepared in the absence of 14-DHE was used.
- the culture supernatant after 4 days of culture was collected, and TNF- ⁇ , IFN- ⁇ , IL-6, IL-10 and IL-17 were measured by ELISA.
- ELISA kit Mouse TNF- ⁇ Ready-SET-Go! (EBioscience), BD OptEIA Mouse IFN- ⁇ ELISA set (BD Life Science), Mouse IL-6 Ready-SET-Go! (EBioscience), BD OptEIA Mouse IL-10 ELISA set (BD Life Science), and Mouse IL-17 DuoSet ELISA (R & D Systems), respectively.
- mDC Antigen-specific T cell reaction mDC was prepared by the same method as the MLR experiment.
- Naive CD4 + T cells were prepared from OT-II mice (Charles River) with a C57BL / 6 background and a CD4 + T cell TCR specific for the OVA 323-339 epitope.
- the ratio of mDC: CD4 + T cells was 1: 5, and mixed culture was carried out in the presence of 0.1 ⁇ M of OVA 323-339 peptide.
- the culture supernatant on the 4th day of culture was collected, and TNF- ⁇ , IFN- ⁇ , IL-6, IL-10 and IL-17 were measured by ELISA.
- MLR As shown in FIG. 16A, compared to control mDCs, CD4 + T cells grown with 14-DHE-treated mDCs showed inflammatory cytokines TNF- ⁇ , IFN- ⁇ , IL-6 and A significant reduction in production was observed for IL-17. There was no statistically significant difference for IL-10, an anti-inflammatory cytokine.
- Example 12 The evaluation generally of 14-DHE CD8 + regulatory T cells (CD8 + Treg) processing DC differentiation-inducing ability, the term Treg often refer to a CD4 + FoxP3 + regulatory T cells.
- the term Treg often refer to a CD4 + FoxP3 + regulatory T cells.
- FosP3 + regulatory T cell populations not only in CD4 + T cells but also in CD8 + T cells (Cosmi, L. et al., Blood, 2003, 102 (12): 4107). -14), it exhibits a strong anti-inflammatory effect (Singh, RP. Et al., J. Immunol., 1007, 178 (12): 7649-57; Chaput, N. et al., Gut, 2009, 58 (4) : 520-9). It is clear from the results of Example 10 that 14-DHE-treated DC increases CD4 + regulatory T cells. In this example, the CD8 + regulatory T cell induction effect of 14-DHE-treated DC was examined.
- mDCs were sorted from DCs induced from C57BL / 6 mouse bone marrow cells in the presence of 14-DHE and Flt-3L.
- CD8 + T cells were separated from the BALB / c mouse spleen using CD8 ⁇ + T cell isolation kit (mouse) (Miltenyi Biotech). The cells were mixed at a ratio of mDC: CD8 + T cells of 1:10, and then cultured for 5 days in a medium containing 0.5 ng / mL TGF- ⁇ . After 5 days, the cells were collected, and the ratio of CD25 + FoxP3 + cells in CD8 + T cells was determined using a flow cytometer.
- cell staining was performed using CD8 ⁇ -PE-Cy7, CD25-APC-Cy7, and CD3e-PerCP, followed by cell membrane permeabilization using FoxP3 staining buffer set (eBioscience), followed by FoxP3-PE staining was performed.
- 14-DHE has an inductive effect not only on the conventionally proposed CD4 + Treg but also on CD8 + Treg.
- Example 13 Regulatory T cell inducing effect of 14-DHE on CD4 + naive T cells
- Examples 10 and 12 show that 14-DHE indirectly exerts a regulatory T cell inducing action by changing the DC trait. It was done.
- 14-DHE in order to clarify whether 14-DHE can directly act on T cells to induce regulatory T cells, 14-DHE is directly acted on naive CD4 + T cells, and CD25 The induction of + FoxP3 + cells was examined.
- CD4 + T cells were isolated from cells derived from BALB / c mouse spleen using CD4 + CD62L + T cell isolation kit II (mouse) (Miltenyi Biotech).
- CD4 + T cells were seeded in 48-well plates (2.5 ⁇ 10 5 cells per well) at a density of 5 ⁇ 10 5 cells / mL, 1 ⁇ g / mL anti-CD3 antibody and 0.2 ⁇ g / mL anti-CD28.
- Antibody was added.
- two types of media (those with and without TGF- ⁇ ) were used. 14-DHE was added at 0, 50, 100, 500 and 1000 nM.
- CD25 + FoxP3 + cells in CD4 + T cells were collected, and the ratio of CD25 + FoxP3 + cells in CD4 + T cells was determined using a flow cytometer. Prior to flow cytometry, cell surface staining was performed using CD4-APC, CD25-FITC and CD3e-PerCP, followed by cell membrane permeabilization using FoxP3 staining buffer set (eBioscience), followed by FoxP3-PE. Staining was performed.
- Example 14 In the experiment of Example 9, which showed that the action timing and duration of the 14-DHE DC activation inhibitory effect 14-DHE has a regulatory DC-inducing activity, 14-DHE was added simultaneously with the onset of DC differentiation, Since it existed until the final step of LPS induction, it was unclear to which stage of DC differentiation 14-DHE acts and how long the effect lasted. Therefore, in this example, the following points are examined: (1) When 14-DHE is added from the start of induction of DC differentiation, how long is the action time required to obtain the effect, (2) Is the effect obtained even if 14-DHE is added after the start of DC differentiation, and (3) how long is the duration of the effect?
- FIG. 19B the duration of the effect of 14-DHE was examined. It was shown that when 14-DHE was added from Day 0 and from Day 7, the effect was greatly reduced within 72 hours.
- the action time of 14-DHE is preferably 7 days or more
- 14-DHE suppresses an inflammatory response to DC after differentiation, and inflammation stimulation It was shown that it was important to be present at times, and (3) the duration of the effect was 72 hours.
- Example 15 Effect of 14-DHE on multiple sclerosis model From the above examples, it was proved that 14-DHE has an anti-inflammatory action in vitro. Furthermore, in order to verify the anti-inflammatory effect in vivo, 14-DHE was administered to a mouse multiple sclerosis model (Experimental Autoimmune Encephalomylic; EAE) often used as an autoimmune disease model.
- EAE Experimental Autoimmune Encephalomylic
- ⁇ Experiment method> C57BL / 6 mice, female 8 weeks old, were divided into 2 groups as follows: 5 per group: (1) Vehicle group (2) 14-DHE 10 ⁇ g / animal Day 0 was mixed with antigen myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55 peptide (MOG35-55, operon) with complete Freund's adjuvant (CFA, Difco). 200 ⁇ g / animal intradermally. Thereafter, pertussis toxin (Pertussis toxin, Wako Pure Chemical Industries) was intraperitoneally administered to Day 1 and Day 3 at 200 ng / animal to induce the onset of multiple sclerosis.
- Pertussis toxin Pertussis toxin, Wako Pure Chemical Industries
- 14-DHE was intraperitoneally administered once a day at 10 ⁇ g / mouse.
- the vehicle group was administered with 10% ethanol (Wako Pure Chemical Industries) / 10% Cremophor (Wako Pure Chemical Industries) / 80% PBS (Takara) as a solvent for 14-DHE.
- the disease score was determined from Day 0 to Day 20 according to the following criteria: Score 0: Normal Score 1: The tail does not move freely Score 2: Cannot walk normally Score 3: Paralysis of one hind limb Score 4: Paralysis of both hind limbs Score 5: Paralysis of the front and rear limbs Score 6: Death Inflammation in the body Mice were dissected at Day 11, which was considered to be occurring, for biochemical data acquisition.
- Spleen cells were prepared and cultured for 7 days with / without 2 ⁇ M MOG restimulation. The culture supernatant was collected, and the production amounts of IFN- ⁇ and TNF- ⁇ were measured using ELISA method.
- the cells were treated with FITC-IA / IE (MHC class II), PE-CD86, PerCP-B220, APC-CD80. Stained with APC-Cy7-CD11b and PE-Cy7-CD11c. The cells were gated using CD11b + CD11c + B220 ⁇ cells as mDC, and IA / IE (MHC class II), CD86 and CD80 were measured as activation markers.
- MHC class II MHC class II
- PE-CD86 PerCP-B220
- APC-CD80 APC-Cy7-CD11c
- the cells were gated using CD11b + CD11c + B220 ⁇ cells as mDC, and IA / IE (MHC class II), CD86 and CD80 were measured as activation markers.
- FIG. 20B shows the production amount of inflammatory cytokines from regional lymph node cells and spleen cells at Day 11 time point.
- the production of inflammatory cytokine TNF- ⁇ was significantly reduced in regional lymph node cells with or without MOG antigen restimulation, and TNF- ⁇ from spleen cells restimulated with MOG antigen was reduced. Production was also reduced.
- IFN- ⁇ a significant decrease was observed in regional lymph node cells without MOG antigen restimulation, and a trend toward a decrease in both cells with MOG antigen restimulation was observed.
- FIG. 20C shows cytokine production by CD4 + T cells in regional lymph node cells and spleen cells.
- TNF- ⁇ and IFN- ⁇ both lymph node cells and spleen cells showed a significant decrease in production in the 14-DHE administration group.
- IL-17 a significant decrease in production was observed in spleen cells by administration of 14-DHE.
- FIG. 20D shows the proliferation rate of CD4 + T cells in regional lymph node cells and spleen cells.
- spleen cells a significant decrease was observed in the 14-DHE administration group regardless of whether or not the MOG antigen was re-stimulated, and a decrease tendency was also observed in the lymph node cells. From this, it was shown that the proliferation of inflammatory T cells was suppressed by administration of 14-DHE.
- FIG. 20E shows the activation of mDC, which is an antigen-presenting cell in lymph nodes and spinal cord, at the time of dissection at Day11.
- IA / IE MHC class II
- CD86 showed a tendency to decrease
- CD80 showed a significant decrease.
- spinal cord a significant decrease in IA / IE was observed. From this, it can be inferred that suppression of inflammatory T cell proliferation by 14-DHE is mediated by inactivation of antigen-presenting cells.
- 14-DHE has an inhibitory effect on autoimmune diseases including multiple sclerosis even in vivo.
- Example 16 Human-regulated DC-inducing activity of 14-DHE The above examples revealed that 14-DHE can result in decreased expression of maturation factors on the cell surface relative to mouse DC. In this example, the effect of 14-DHE on human DC was evaluated.
- Mononuclear cells were prepared from human peripheral blood by density gradient centrifugation using Ficoll-Paque (GE Healthcare). CD14 positive cells were obtained by positive selection with anti-human CD14 MACS beads (Miltenyi Biotech).
- HLA-DR which is an MHC class II molecule on human DC
- CD80 and CD86 which are costimulatory molecules
- 14-DHE has an action of suppressing the cell surface expression of maturation factor on DC even in human cells.
- the present invention has utility in the health science field, medical field and food field.
Abstract
免疫疾患の予防及び治療のために有用な、低減された炎症性活性を有するDC、制御性T細胞を誘導することができるDC及び制御性T細胞の製造方法、並びにそのような方法に有用な物質を提供する。 本発明は、穀類植物由来材料を麹菌を用いて発酵させることにより得られる、穀類植物由来材料発酵物又はその処理物に関する。好ましくは、当該発酵物又は処理物は、14-デヒドロエルゴステロールを含有する。本発明によれば、植物由来の原料を用いて、制御性DC及び制御性T細胞を誘導することができ、また、炎症性T細胞の増殖を抑制することができる。
Description
本発明は、穀類植物由来材料の麹発酵物又はその処理物、及び該発酵物又はその処理物を含む免疫調節剤に関する。本発明はまた、抗原提示細胞及び制御性T細胞の製造方法、並びにそのような方法での穀類植物由来材料発酵物若しくはその処理物又は14-デヒドロエルゴステロールの使用に関する。さらに、本発明は、免疫疾患の予防又は治療のための穀類植物由来材料発酵物若しくはその処理物又は14-デヒドロエルゴステロールの使用にも関する。
樹状細胞(DC;Dendritic Cell)はB細胞及びマクロファージと共に抗原提示細胞の群を構成する細胞であり、その抗原提示能は種々の抗原提示細胞の中で最も高いことが知られている。DCは、T細胞、B細胞、NK/NKT細胞などによる獲得免疫を中心とした末梢免疫系を刺激・感作することから、免疫系の司令塔として機能していると考えられている。DCの中心的な役割のひとつは、生体外からの異物、生体内抗原タンパク質などを取り込んで、これらを分解し、抗原として提示することによって、獲得免疫系を誘導することである。別の機能として、炎症刺激に反応してそれ自身が各種炎症性サイトカインを産生する。
現在、世界中で各種の免疫疾患(アレルギー、自己免疫疾患、腸炎など)が爆発的に増加している。このような現象の原因として、腸内細菌のバランスの変化に着目した衛生仮説などが提案されているが、確立された理論はない。しかしながら、そのような免疫疾患では、TNF-α、IL-6、IL-12、IL-17などの炎症性サイトカイン産生の増加が共通の特徴として認められており、これらのサイトカインの産生及びその刺激を受けて増殖する炎症性免疫細胞を抑制することが、それらの免疫疾患の予防及び治療に有効であると予測されている。実際に、これらのサイトカインを標的とする抗体が、ヒトにおいて著明な効果を示すという報告が次々となされている。
LPS(リポ多糖)に代表される炎症誘発性の刺激物質は、DC上のToll-like receptor(TLR)によって認識され、これによりDCが活性化及び/又は成熟し、各種炎症性サイトカイン及びケモカインの放出を通して炎症反応を誘発することが知られている。多くの免疫疾患では、DC、マクロファージなどの自然免疫系の異常な活性化が起こっていることが報告されている。したがって、このような自然免疫系の活性化を抑制する方法、又は自然免疫系の活性化を抑制することが可能な物質は、上記のような免疫疾患の予防及び治療に非常に有効である。
低減された炎症性活性を示すDCを誘導する薬物として、現在までに、IL-10/TGF-β、ラパマイシン、血管作動性腸管ペプチド(VIP:Vasoactive Intestinal Peptide)などが知られている。しかしながら、これらの薬物は他の多くの生物学的作用も有するため、免疫疾患の予防及び治療のために人体に投与することは現実的ではない。したがって、免疫疾患の予防及び治療のためのこれらの薬剤の使用方法としては、採取した血液からin vitroで低減された炎症性活性を有するDCを誘導し、これを人体に戻すというex vivoの方法が考えられる。
組織又は臓器移植の際に問題となる拒絶反応を抑制するために、FK506をはじめとする免疫抑制剤が用いられている。しかしながら、既存の薬物の非特異的な免疫抑制による副作用が問題視されている。移植時の拒絶反応を抑制するために、免疫抑制剤以外に、制御性T細胞(Treg)が有用であることが示されている。Tregは、DCからのサイトカインの分泌を介して誘導されることが知られている。したがって、TregをもたらすことができるDCを誘導する方法、及びナイーブT細胞からTregを直接的に誘導する方法が開発されれば、そのような方法は、移植時の拒絶反応の抑制に対して有用であると予測される。
最近の研究で、CD4+T細胞に直接的に作用してTregを誘導し得る物質として、レチノイン酸、1,25-ジヒドロキシビタミンD3などが再発見された。このような物質は、低減された炎症性活性を示すDCを誘導する物質と同様に、抗炎症作用、移植拒絶反応抑制などの点で有用であると考えられる。
特許文献1には、ダイズ、コムギ、イネあるいはこれらの副産物を含有する原料を、糸状菌、又はこれらから得られる酵素により発酵させた発酵分解物から得られる免疫強化物質が記載されている。特許文献1では、ダイズ由来材料及びコムギをアスペルギルス・オリゼー又はアスペルギルス・ソーヤを用いて発酵させることにより得られた発酵物からエタノールに不溶の画分を分離し、該画分からさらに高分子量画分を取り出すことにより得られた物質が、マクロファージのグルコース消費を増強することが示されている。
特許文献2には、ダイズ由来材料を乳酸菌発酵することにより得られるマクロファージ活性化剤が記載されている。
特許文献3には、ダイズ、コムギ、柑橘類、果実あるいはこれらの加工品を含有する原料を、糸状菌、納豆菌又はこれらから得られる酵素により発酵させた発酵分解物から得られるヒアルロニダーゼ阻害、抗アレルギー活性及び免疫賦活物質が記載されている。特許文献3では、ダイズ由来材料及びコムギをアスペルギルス・オリゼーを用いて発酵させ、発酵物からエタノールに不溶な画分を分離し、該画分からさらに高分子量画分を取り出すことにより得られた物質が、ヒアルロニダーゼ阻害活性、及びパイエル板細胞からのIgA産生を指標として測定される免疫賦活活性を有することが記載されている。
特許文献4には、小麦粉等の植物成分を、グラム陰性菌であるパントエア・アグロメランスを用いて発酵させることにより得られる免疫賦活物質が記載されている。
特許文献5には、バガス等の蒸煮爆砕処理物と小麦フスマの混合物をアスペルギルス・ソーヤを用いて発酵させて得られた発酵物が、キシロビオースとキシロトリオースに富んだキシロオリゴ糖及び抗酸化活性物質を含むことが記載されている。
上記のように、低減された炎症性活性を有するDCを誘導する方法、TregをもたらすことができるDCを誘導することにより、Tregを誘導する方法、及びナイーブT細胞から直接的にTregを誘導する方法、炎症性T細胞の増殖を抑制する方法、並びにそれらの方法に有用な物質が所望されている。
本発明者らは、上記課題を解決すべく検討を重ねた結果、穀類植物由来材料、特に小麦フスマに麹菌を作用させて発酵した材料又はその処理物(以下、「穀類植物由来材料発酵物」、「穀類植物由来材料発酵物処理物」、又は「穀類植物由来材料発酵物又はその処理物」とも称する。)が上記の課題を解決することができることを見出し、本発明を完成させた。
具体的には、本発明は以下の特徴を有する。
〔1〕穀類植物由来材料を麹菌を用いて発酵させることにより得られる、穀類植物由来材料発酵物又はその処理物。
〔2〕前記穀類植物由来材料が、穀類植物種子の外皮を含む、上記〔1〕に記載の発酵物又はその処理物。
〔3〕前記穀類植物がイネ科植物より選択される1種以上である、上記〔1〕又は〔2〕に記載の発酵物又はその処理物。
〔4〕前記穀類植物がコムギである、上記〔1〕~〔3〕のいずれか1つに記載の発酵物又はその処理物。
〔5〕前記麹菌がアスペルギルス属糸状菌である、上記〔1〕~〔4〕のいずれか1つに記載の発酵物又はその処理物。
〔6〕前記麹菌が黒麹菌である、上記〔1〕~〔5〕のいずれか1つに記載の発酵物又はその処理物。
〔7〕発酵後にさらにエタノール抽出によるエタノール溶解画分の分離に供してある、上記〔1〕~〔6〕のいずれか1つに記載の発酵物又はその処理物。
〔8〕エタノール抽出に続いてヘキサン分画によるヘキサン溶解画分の分離に供してある、上記〔7〕に記載の発酵物又はその処理物。
〔9〕14-デヒドロエルゴステロールを含有する、上記〔1〕~〔8〕のいずれか1つに記載の発酵物又はその処理物。
〔10〕抗原提示細胞を修飾する作用を有する、上記〔1〕~〔9〕のいずれか1つに記載の発酵物又はその処理物。
〔11〕上記〔1〕~〔10〕のいずれか1つに記載の発酵物又はその処理物を含む、抗原提示細胞修飾用組成物。
〔12〕上記〔1〕~〔10〕のいずれか1つに記載の発酵物又はその処理物を含む飲料又は食品。
〔13〕上記〔1〕~〔10〕のいずれか1つに記載の発酵物又はその処理物を含む免疫調節剤。
〔14〕穀類植物由来材料を麹菌を用いて発酵させるステップ、発酵生成物をエタノール抽出するステップ、及びエタノール抽出物をヘキサン分画するステップを含む、穀類植物由来材料発酵物処理物の調製方法。
〔15〕前記穀類植物由来材料が、穀類植物種子の外皮を含む、上記〔14〕に記載の方法。
〔16〕前記穀類植物がイネ科植物より選択される1種以上である、上記〔14〕又は〔15〕に記載の方法。
〔17〕前記穀類植物がコムギである、上記〔14〕~〔16〕のいずれか1つに記載の方法。
〔18〕前記麹菌がアスペルギルス属糸状菌である、上記〔14〕~〔17〕のいずれか1つに記載の方法。
〔19〕前記麹菌が黒麹菌である、上記〔14〕~〔18〕のいずれか1つに記載の方法。
〔20〕被験体から採取した細胞に、上記〔1〕~〔10〕のいずれか1つに記載の発酵物又はその処理物を接触させるステップを含む、抗原提示細胞を修飾する方法。
〔21〕被験体から採取した細胞に、上記〔1〕~〔10〕のいずれか1つに記載の発酵物又はその処理物を接触させるステップを含む、制御性樹状細胞の製造方法。
〔22〕上記〔1〕~〔10〕のいずれか1つに記載の発酵物又はその処理物を含有する、免疫疾患の予防又は治療のための医薬組成物。
〔23〕14-デヒドロエルゴステロールを含有する免疫調節剤。
〔24〕被験体から採取した細胞に、14-デヒドロエルゴステロールを接触させるステップを含む、抗原提示細胞を修飾する方法。
〔25〕被験体から採取した細胞に、14-デヒドロエルゴステロールを接触させるステップを含む、制御性樹状細胞の製造方法。
〔26〕14-デヒドロエルゴステロールを含有する、免疫疾患の予防又は治療のための医薬組成物。
〔27〕14-デヒドロエルゴステロールを含有し、抗原提示細胞を修飾する作用を有する、麹菌発酵物又はその処理物。
〔28〕上記〔27〕に記載の麹菌発酵物又はその処理物を含有する組成物。
〔29〕被験体から採取した細胞に、上記〔1〕~〔10〕のいずれか1つに記載の発酵物又はその処理物を接触させるステップを含む、制御性T細胞の製造方法。
〔30〕被験体から採取した細胞に、14-デヒドロエルゴステロールを接触させるステップを含む、制御性T細胞の製造方法。
〔31〕14-デヒドロエルゴステロールを含有する、制御性T細胞誘導剤。
〔32〕14-デヒドロエルゴステロールを含有する、炎症性T細胞増殖抑制剤。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2009-288063号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
本発明によれば、免疫寛容を増強させることにより、移植片拒絶及び移植片対宿主病を含む免疫疾患の予防及び治療効果を有する新規な材料及び物質が提供される。
本発明は、穀類植物由来材料を麹菌を用いて発酵させることにより得られる穀類植物由来材料発酵物又はその処理物に関する。本発明はまた、抗原提示細胞及び制御性T細胞の製造方法、並びにそのような方法での穀類植物由来材料発酵物若しくはその処理物又は14-デヒドロエルゴステロールの使用に関する。さらに、本発明は、免疫疾患の予防又は治療のための穀類植物由来材料発酵物若しくはその処理物又は14-デヒドロエルゴステロールの使用にも関する。
本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物は、原料となる穀類植物由来材料に麹菌を添加して、発酵させることにより得ることができる。穀類植物由来材料発酵物又はその処理物との用語は、麹菌を用いて発酵させた穀類植物由来材料、及びその一部分(溶媒抽出画分など)の両者を包含する。また、穀類植物由来材料発酵物との用語は、穀類植物由来材料を発酵させた材料及びその処理物の両者を意味して用いられることもある。
本発明における好ましい穀類植物としては、植物分類表においてイネ科に分類されるすべての植物が挙げられる。具体的には、イネ、オオムギ、コムギ、ライムギ、アワ、ヒエ、トウモロコシ等が例示されるが、これらに限定されるものではない。このうち、イネ、オオムギ、コムギ及びライムギが好ましく、コムギが特に好ましい。
本発明における穀類植物由来材料とは、穀類植物の種子に由来する材料であり、典型的には、穀類植物の種子全体、又はその一部分である。
本発明における穀類植物由来材料は、好ましくは種子の外皮を含む。種子の外皮を含む穀類植物由来材料としては、例えば、穀類種子全粒粉、穀類植物のフスマ、米糠などが挙げられる。特に好ましい本発明の穀類植物由来材料は、穀類植物のフスマ、最も好ましくは小麦フスマである。
穀類植物のフスマは、穀類植物種子の粉砕又は搗精により得られる種子の外側の部分を回収することで得ることができる。
本発明に用いることができる麹菌は、本発明の穀類植物由来材料を発酵させることができれば特に限定されないが、好ましくは、黒麹(アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・ニガー)、黄麹(アスペルギルス・オリゼー)、紅麹(モナスカス・アンカ)、醤油用麹菌(アスペルギルス・ソーヤ)、白麹(アスペルギルス・カワチ)、テンペ菌(リゾプス・オリゴスポラス)などである。好ましくは、麹菌はアスペルギルス属糸状菌であり、最も好ましくは黒麹菌である。本発明における黒麹菌は、狭義の黒麹菌であるアスペルギルス・アワモリ及びアスペルギルス・ニガー、狭義には白麹菌と称されるアスペルギルス・カワチ、並びにこれらの菌種から誘導された亜種を含む。これらの麹菌の種麹は、秋田今野社、樋口もやし社、日本醸造工業などから入手することができる。
本発明の発酵は、原料に麹菌を接種して培養する当業者に公知の方法を用いて行うことができる。そのような方法としては、例えば、蓋麹法、箱麹法、床麹法、機械麹法などを挙げることができる。
麹の添加量は、水を加えて処理(例えば、オートクレーブ、蒸煮など)された穀類植物由来材料に対して、好ましくは0.005~5重量%、より好ましくは0.01~1重量%、さらに好ましくは0.05~0.5重量%、最も好ましくは0.1重量%の種麹である。
発酵温度は、使用する麹によっても若干異なるが、一般的には20℃~50℃、好ましくは22℃~45℃、より好ましくは30℃~40℃である。発酵時間は、例えば、24時間~14日間、好ましくは48時間~10日間、より好ましくは72時間~7日間である。発酵中に、一定時間ごと(例えば24時間ごと)に手入れ(塊になった麹をほぐす作業)を行うのが好ましい。
発酵方法の詳細については、例えば、発酵ハンドブック((財)バイオインダストリー協会 発酵と代謝研究会編、2001年)などに記載されている。
発酵時の湿度は、当業者であれば、麹菌の種類に応じて適切に調節することができる。例えば、発酵中、相対湿度を80%以上に維持する。又は、発酵初期には相対湿度を高く(例えば90%以上)保ち、発酵後期(例えば、麹菌接種後24時間以降)は相対湿度を若干下げて(例えば75%以上)、発酵を行う。
本明細書中、穀類植物由来材料発酵物又はその処理物は、穀類植物由来材料を発酵させたもの、又はそこから溶媒抽出などにより得られた画分を包含する。発酵材料の抽出物は、当業者に公知の抽出方法により得ることができ、抽出方法としては、例えば、有機溶媒抽出、超臨界流体抽出法、加温加圧抽出法などが挙げられる。上記で例示した抽出方法は、単独で用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよい。
溶媒抽出は当業者に公知の一般的な手法を用いて行うことができる。溶媒抽出に用いる有機溶媒として、限定するものではないが、エタノール、メタノール、n-プロパノール、イソプロパノール、酢酸メチル、酢酸エチル、アセトン、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、フェノールなどを用いることができる。好ましい有機溶媒は、エタノール、メタノール、酢酸エチル、及びヘキサンである。これらの有機溶媒は2種類以上を混合して用いてもよく、また2種類以上の有機溶媒を用いた2段階以上の溶媒抽出工程を行なってもよい。
具体的には、溶媒抽出は、例えば、凍結乾燥により乾燥させた発酵材料を粉砕し、これに有機溶媒を添加し、20~50℃、好ましくは25~45℃にて撹拌しながら超音波処理を施して行うことができる。添加する溶媒の量は、発酵材料の重量の1~50倍、好ましくは2~40倍、より好ましくは10~30倍である。抽出時間は、10分間~2時間、好ましくは15分間~1時間、より好ましくは20~50分間である。その後、濾過や遠心分離などにより濾液を回収し、残渣に含まれる不溶性画分を取り除き、例えば減圧蒸発により濾液から有機溶媒画分(すなわち、抽出画分)を濃縮し、流体又は乾燥形態で抽出物を得ることができる。また、有機溶媒抽出後の不溶性画分について有機溶媒による抽出を繰り返すことにより、第1回目の有機溶媒抽出後の残渣から有機溶媒画分をさらに取得することもできる。
また、溶媒抽出に続いてさらに別の溶媒を用いた分画を行ってもよい。例えば、溶媒抽出により得られた有機溶媒画分に、溶媒抽出に用いたものと同じか又は異なる第2の有機溶媒を添加し、これに、第2の有機溶媒とは混和しない第3の有機溶媒を添加して抽出し、第3の有機溶媒に溶解性の画分を得ることができる。
有機溶媒画分に存在する物質をさらに精製してもよく、この場合、公知の分離、精製法を適当に組み合わせて行うことができる。例えば、液-液分配、有機溶媒沈澱、各種カラムクロマトグラフィー(例えばHPLC、シリカゲルクロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなど)、結晶化などを使用することができる。
好ましくは、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物は、発酵後に、エタノール抽出によりエタノール溶解画分を分離することにより得られたエタノール画分である。より好ましくは、本発明の穀類植物由来材料発酵物は、エタノール抽出の後、さらにヘキサン分画によりヘキサン溶解画分を分離して得られたヘキサン画分である。
上記のようにして得られる本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物は、以下の実施例に示すとおり、DCにより仲介される免疫反応を抑制する作用を有する。したがって、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物は、免疫系の過剰な活性化により引き起こされると考えられる免疫疾患の予防及び治療に有用である。
DCは免疫応答において中心的な役割を果たすため、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物を用いて、DCにより仲介される免疫応答を病因とする種々の疾患を抑制する新規な治療方法の実現が期待される。本発明を用いる治療方法の対象となる疾患は、細胞又は臓器・組織移植に伴う移植片拒絶及び移植片対宿主病、関節リウマチ、多発性硬化症、I型糖尿病、ぶどう膜炎、自己免疫性心筋炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血、全身性強皮症、潰瘍性大腸炎、クローン病、シェーグレン症候群、自己免疫性肝疾患(例えば、原発性胆汁性肝硬変)、乾癬、突発性血小板減少性紫斑病、グッドパスチャー症候群(例えば、糸球体腎炎)、悪性貧血、橋本病、尋常性白斑、ベーチェット病、自己免疫性胃炎、天疱瘡、ギラン・バレー症候群、HTLV-1関連脊髄症をはじめとする自己免疫疾患、並びに接触過敏症、アレルギー性鼻炎、食物アレルギー、喘息をはじめとするアレルギー性疾患である。
本発明の穀類植物由来材料発酵物は、経口摂取することで、免疫疾患に由来する炎症を改善することができる。また、日常的に摂取することにより免疫疾患に罹ることを予防することができる。この目的のために、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物を、1日あたり2g以上、好ましくは10g以上摂取することが望ましい。本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物は、穀類植物由来材料を、食用に使用される麹菌により発酵処理して得られる成分であるので、日常の食生活に取り入れることができる。また、投与ないしは摂取の時期は、食前、食間及び食後のいずれの時期でもよい。
本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物は、特定の組成物、例えば飲食品又は医薬品に配合して提供することができる。
本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物を飲食品に配合して提供する場合、あらゆる食品形態に加工することが可能である。本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物を配合することができる飲食品としては、天然物及びその加工品を含む飲食物等を挙げることができる。またその配合量は、例えば飲食品100gに対し、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物を10g以上配合することができる。
飲食品の例としては、限定するものではないが、錠剤形、粉末状、顆粒状、カプセル状、ゼリー状等の機能性食品、パン類、菓子類、クッキー、ビスケット等の穀類加工品、牛乳、ヨーグルト、アイスクリーム等の乳製品類、炭酸飲料、清涼飲料、果汁入り飲料、薬系ドリンク等の飲料、惣菜や加工食品等が挙げられる。
本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物を医薬品に配合して提供する場合には、免疫疾患の治療、改善又は予防用の免疫調節剤として製剤化することができる。製剤の投与経路は特に限定されないが、例えば、経口投与、経腸投与等を挙げることができる。経口投与又は経腸投与の場合、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物をそのまま投与してもよく、又は製薬上許容される担体又は賦形剤と共に、液剤、懸濁剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤などの形態で投与してもよい。
製薬上許容される担体又は賦形剤としては、限定するものではないが、乳糖、ショ糖、ブドウ糖などの糖類、デンプン、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム等の無機物、結晶セルロース、蒸留水、精製水、ゴマ油、ダイズ油、トウモロコシ油、オリーブ油、綿実油等の一般的に使用されている担体又は賦形剤を例示することができる。また、本発明の免疫調節剤には、担体又は賦形剤の他に、結合剤、滑沢剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、希釈剤、緩衝剤、抗酸化剤、細菌抑制剤などの添加剤を使用することができる。他の医薬品と混合又は併用することも可能である。なお、上記の製剤は殺菌処理を行なってもよい。
本発明の免疫調節性飲食品又は免疫調節剤を適用する対象は特に限定されず、健常者、免疫疾患の患者、免疫疾患の治療中の患者、免疫疾患の予防を検討している健常者等のいずれであってもよい。またその対象はヒトに限らず、ヒト以外の動物に適用してもよい。
本発明の免疫調節性飲食品又は免疫調節剤は、抗原提示細胞を修飾することによって、修飾された抗原提示細胞による制御性T細胞の誘導を可能にし、また、直接的に制御性T細胞を誘導することができる。さらに、本発明の免疫調節性飲食品又は免疫調節剤は、炎症性T細胞の増殖を抑制することができる。したがって、これにより過剰な免疫反応を抑制することが可能となる。
本発明の免疫調節性飲食品又は免疫調節剤の投与量は、被験者の年齢、体重、性別、肥満の程度など、様々な要因に応じて変化するが、典型的には、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物を1日あたり、2g以上、好ましくは10g以上投与する量とし、投与間隔は特に制限されない。
本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物は、効率的に免疫疾患を改善することができ、かつ、穀類植物から食用に使用される麹菌により発酵処理して得られた成分であるので、安全性が高く、飲食品又は医薬における使用に有用である。さらに、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物は、小麦フスマといった、比較的安価な原料から製造することが可能であるため、コスト面においても優れている。
本発明は、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物を含有する、免疫疾患を予防又は治療するための医薬組成物にも関する。該医薬組成物は、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物の他に、上記のような製薬上許容される賦形剤などの追加の成分を含むことができる。
本発明はまた、穀類植物由来材料を麹菌を用いて発酵させるステップ、発酵生成物をエタノール抽出するステップ、及びエタノール抽出物をヘキサン分画するステップを含む、本発明の穀類植物由来材料発酵物処理物の調製方法にも関する。発酵方法、溶媒抽出方法は上記のように行うことができる。
さらに、本発明は、被験体から採取した細胞に、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物を接触させるステップを含む、抗原提示細胞を修飾する方法にも関する。
本発明において、「抗原提示細胞」とは、樹状細胞(DC)、単球、マクロファージ、B細胞などの、細胞表面にMHCクラスIIを発現する細胞、及びそのような細胞に分化することが可能な未分化細胞を意味する。好ましくは、抗原提示細胞は、樹状細胞である。
以下の実施例において示すように、本発明の方法により修飾されたDCは、低減した活性化細胞表面マーカー及び炎症性サイトカインの産生を示し、制御性T細胞(Treg)を誘導する能力を有する。したがって、本発明の方法により修飾されたDCは、免疫系の過剰な活性化により引き起こされると考えられる免疫疾患の予防及び治療に有用である。本発明の方法を用いて修飾された抗原提示細胞は、特に、被験体から取り出した細胞を本発明の方法を用いて処理して制御性DCを得て、これを該被験体に戻すex vivo治療において非常に有用である。
本発明において「抗原提示細胞を修飾する」とは、抗原提示細胞での遺伝子発現(細胞表面マーカー、サイトカイン等)を変化させ、T細胞等の他の細胞種に与えるその影響を変化させることを意味する。この場合、遺伝子発現とは、細胞の染色体DNAからのmRNAの転写、mRNAのタンパク質への翻訳のみならず、発現タンパク質の翻訳後修飾による成熟、タンパク質の細胞内局在の変化、細胞からのタンパク質分泌の変化なども意味するものと理解される。好ましくは、本発明の方法により修飾された抗原提示細胞は、制御性T細胞を誘導する能力を有する。
本発明はまた、被験体から採取した細胞に、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物を接触させるステップを含む、制御性樹状細胞の製造方法にも関する。
本発明において「制御性樹状細胞」とは、自身の作用及び制御性T細胞の誘導を介して免疫系の過剰な活性化・暴走を抑制する能力を有する樹状細胞を意味する。制御性樹状細胞の定義は文献により異なり、一義的には決定されていないが、例えば、樹状細胞活性化マーカーであるCD40、CD80、CD86、MHCクラスIIなどの発現が低下している、抑制性樹状細胞マーカーであるICOSL、PD-L1などの発現が見られる、抑制性サイトカインであるIL-10、TGF-βなどを産生する、炎症性サイトカインであるIL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12などの産生が低下している、炎症誘発物質の作用に対抗して炎症性シグナルNF-κBカスケードの過剰な活性化を抑制する能力を有する、などの特徴を有する。
本発明の抗原提示細胞修飾方法及び制御性樹状細胞製造方法において、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物と接触させる「細胞」としては、例えば、樹状細胞、マクロファージ、単球などの抗原提示細胞及び抗原提示細胞に分化し得る未分化細胞(例えば、樹状細胞に分化し得る幹細胞、前駆細胞等、特に、骨髄由来幹細胞、末梢血単核球等)が挙げられる。好ましい細胞は、骨髄由来細胞をFlt-3Lなどのサイトカインで刺激することにより分化誘導した細胞である。
本発明はさらに、被験体から採取した細胞に、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物を接触させるステップを含む、制御性T細胞の製造方法に関する。
本発明において「制御性T細胞」(Treg)とは、免疫反応を抑制し、恒常性と自己寛容性を維持する特定のT細胞サブポピュレーションを意味する。制御性T細胞の定義は文献により異なり、一義的には決定されていないが、例えば、CD4、CD25及びFoxP3を構成的に発現している、などの特徴を有する。
本発明の制御性T細胞製造方法において、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物と接触させる「細胞」としては、例えば、ナイーブT細胞が挙げられる。ナイーブT細胞は、例えば、脾臓から単離した細胞を、さらにCD4及びCD62Lの発現により選別することによって得ることができる。
本発明の抗原提示細胞修飾方法、制御性樹状細胞製造方法及び制御性T細胞製造方法において、単離された細胞と接触させる本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物は、1~500μg/mLの濃度で、好ましくは5~250μg/mLの濃度で、より好ましくは10~150μg/mLの濃度で、特に好ましくは25~100μg/mLの濃度で、適切な培養用培地又はインキュベーション溶液中に添加し、細胞と接触させる。接触時間は、1時間~28日間、好ましくは12時間~14日間、より好ましくは1~12日、最も好ましくは3~10日間である。
また、本発明は、抗原提示細胞を修飾する作用を有する、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物、及び該穀類植物由来材料発酵物又はその処理物を含有する抗原提示細胞修飾用組成物にも関する。さらに、本発明は、制御性T細胞を誘導する作用を有する、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物、及び該穀類植物由来材料発酵物又はその処理物を含有する制御性T細胞誘導用組成物に関する。さらにまた、本発明は、自己免疫疾患又はアレルギー等に関連して抗原によって誘導される炎症性T細胞の増殖を抑制する炎症性T細胞増殖阻害用組成物にも関する。当該組成物は、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物の他に、上記のような製薬上許容される賦形剤、又は、in vitroで使用される試薬に通常用いられる添加剤(バッファー、等張化剤等)を含むことができる。
以下の実施例に示すとおり、本発明者らは、小麦フスマ麹発酵物から、以下の構造式により示される化合物であるエルゴスタ-5,7,14,22-テトラエン-3β-オール(Ergosta-5,7,14,22-tetraen-3β-ol;本明細書中の他の箇所では、「14-デヒドロエルゴステロール」又は「14-DHE」と記す。)を単離し、さらに、精製された14-デヒドロエルゴステロールが、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物と同様にDCにより仲介される免疫反応を抑制する作用を有することを初めて見出した。また、この知見から、14-デヒドロエルゴステロールが、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物の免疫調節作用を担う有効成分であることが推測される。
したがって、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物は、好ましくは、14-デヒドロエルゴステロールを含有する。
14-デヒドロエルゴステロール(14-DHE)は、1951年にアスペルギルス・ニガーにおいて見出され(Barton,DHR.,and Bruun,T.,J.Chem.Soc.,2728-2733(1951))、2009年にキウイフルーツ果皮の一成分として再発見されたが(Fiorentino,A.ら,J.Agric.Food Chem.,57:4148-4155(2009)の化合物8)、その生理的活性についてはこれまで報告されていない。
すなわち、本発明者らによる14-デヒドロエルゴステロールの生理的活性の実証により、免疫疾患等の免疫系の過剰な活性化に関連する状態を予防又は治療するのに有効な新規な物質が提供されたこととなる。
したがって、本発明は、14-デヒドロエルゴステロールを含有する免疫調節剤又は免疫調節性飲食品、及び14-デヒドロエルゴステロールを含有する免疫疾患の予防又は治療のための医薬組成物にも関する。
14-デヒドロエルゴステロールの投与量は、被験者の年齢、体重、性別、肥満の程度など、様々な要因に応じて変化するが、典型的には、14-デヒドロエルゴステロールを1日あたり、1mg以上、好ましくは5mg以上投与する量とし、投与間隔は特に制限されない。
また、本発明は、被験体から採取した細胞に、14-デヒドロエルゴステロールを接触させるステップを含む、抗原提示細胞を修飾する方法及び制御性樹状細胞の製造方法に関する。
本発明の抗原提示細胞修飾方法及び制御性樹状細胞製造方法において、14-デヒドロエルゴステロールと接触させる「細胞」としては、例えば、樹状細胞、マクロファージ、単球などの抗原提示細胞及び抗原提示細胞に分化し得る未分化細胞(例えば、樹状細胞に分化し得る幹細胞、前駆細胞等、特に、骨髄由来幹細胞、末梢血単核球等)が挙げられる。好ましい細胞は、骨髄由来細胞をFlt-3Lなどのサイトカインで刺激することにより分化誘導した細胞である。
本発明の抗原提示細胞修飾方法及び制御性樹状細胞製造方法において、単離された細胞と接触させる14-デヒドロエルゴステロールは、0.1~100μMの濃度で、好ましくは0.2~50μMの濃度で、より好ましくは0.5~25μMの濃度で、特に好ましくは1~10μMの濃度で、適切な培養用培地又はインキュベーション溶液中に添加し、細胞と接触させる。接触時間は、1時間~28日間、好ましくは12時間~14日間、より好ましくは1~12日、最も好ましくは3~10日間である。
さらに、本発明は、被験体から採取した細胞に、14-デヒドロエルゴステロールを接触させるステップを含む、制御性T細胞の製造方法に関する。
本発明の制御性T細胞製造方法において、14-デヒドロエルゴステロールと接触させる「細胞」としては、例えば、ナイーブT細胞が挙げられる。ナイーブT細胞は、例えば、脾臓から単離した細胞を、さらにCD4及びCD62Lの発現により選別することによって得ることができる。
本発明の制御性T細胞製造方法において、単離されたナイーブT細胞と接触させる14-デヒドロエルゴステロールは、0.01~10μMの濃度で、好ましくは0.02~5μMの濃度で、より好ましくは0.05~2.5μMの濃度で、特に好ましくは0.05~1μMの濃度で、適切な培養用培地又はインキュベーション溶液中に添加し、細胞と接触させる。接触時間は、1時間~28日間、好ましくは12時間~14日間、より好ましくは1~12日、最も好ましくは3~10日間である。
本発明の有効成分である14-デヒドロエルゴステロールは、上記の通りアスペルギルス・ニガーにおいて見出されたので、穀類植物由来材料の発酵物に限らず、広範な麹菌の発酵物に含有される可能性がある。したがって、本発明は、14-デヒドロエルゴステロールを含有し、抗原提示細胞を修飾する作用を有する、麹菌発酵物又はその処理物、及び該麹菌発酵物又はその処理物を含有する組成物に関する。また、本発明は、14-デヒドロエルゴステロールを含有し、制御性T細胞を修飾する作用を有する、麹菌発酵物又はその処理物、及び該麹菌発酵物又はその処理物を含有する組成物にも関する。当該組成物は、本発明の麹菌発酵物又はその処理物の他に、上記のような製薬上許容される賦形剤、又は、in vitroで使用される試薬に通常用いられる添加剤(バッファー、等張化剤等)を含むことができる。
本明細書中に示す通り、14-デヒドロエルゴステロールは、DCを修飾することによって制御性T細胞を誘導する作用、及びナイーブT細胞に直接的に働きかけて制御性T細胞を誘導する作用を有する。したがって、本発明は、14-デヒドロエルゴステロールを含有する制御性T細胞誘導剤にも関する。
また、本明細書中に示す通り、14-デヒドロエルゴステロールは、抗原刺激による炎症性T細胞の増殖を抑制する作用を有する。したがって、本発明は、14-デヒドロエルゴステロールを含有する炎症性T細胞増殖抑制剤にも関する。
本発明の制御性T細胞誘導剤及び炎症性T細胞増殖抑制剤は、有効成分としての14-デヒドロエルゴステロールの他に、上記のような製薬上許容される賦形剤等を含むことができる。
本発明の麹菌発酵物又はその処理物、及びそれを含有する組成物は、抗原提示細胞を修飾する作用を有するため、例えば、DCにより仲介される免疫反応を抑制することが可能であり、免疫疾患の予防又は治療において有用である。
また、本発明の麹菌発酵物又はその処理物、及びそれを含有する組成物は、ナイーブT細胞から制御性T細胞(Treg)を誘導することが可能であり、免疫疾患の予防又は治療において有用である。
さらにまた、本発明の麹菌発酵物又はその処理物、及びそれを含有する組成物は、様々な抗原感作によって体内で増殖が刺激される炎症性T細胞の増殖を抑制することが可能であり、免疫疾患の予防又は治療において有用である。
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
[実施例1]
各種穀類植物由来材料の麹発酵物及びその処理物の調製
イネ、オオムギの麹発酵物は、以下のようにして調製した。定法に基づいて調製した蒸米又は蒸大麦に対して、各種の市販種麹(黄麹菌:秋田今野社、強力もと立用(アスペルギルス・オリゼー);黒麹菌:秋田今野社、黒麹マイルド(アスペルギルス・アワモリ);紅麹菌:秋田今野社(モナスカス・アンカ))を0.1重量%の割合で接種した。相対湿度80%以上に保持し、黄麹及び黒麹発酵試料は35℃、72時間、紅麹発酵試料は30℃、7日間、適宜、手入れ(塊となった麹をほぐす作業)を施しながら、製麹を行った。
各種穀類植物由来材料の麹発酵物及びその処理物の調製
イネ、オオムギの麹発酵物は、以下のようにして調製した。定法に基づいて調製した蒸米又は蒸大麦に対して、各種の市販種麹(黄麹菌:秋田今野社、強力もと立用(アスペルギルス・オリゼー);黒麹菌:秋田今野社、黒麹マイルド(アスペルギルス・アワモリ);紅麹菌:秋田今野社(モナスカス・アンカ))を0.1重量%の割合で接種した。相対湿度80%以上に保持し、黄麹及び黒麹発酵試料は35℃、72時間、紅麹発酵試料は30℃、7日間、適宜、手入れ(塊となった麹をほぐす作業)を施しながら、製麹を行った。
小麦フスマ、米糠の麹発酵物は、以下のようにして調製した。小麦フスマ(日清製粉社製)又は米糠450gに対して、550mLの脱塩水を添加し、よく混合した後、オートクレーブを用いて121℃、50分間滅菌した。滅菌後の原料に、各種の市販種麹(黒麹菌:秋田今野社、黒麹マイルド(アスペルギルス・アワモリ);テンペ菌:秋田今野社(リゾプス・オリゴスポラス))を0.1重量%の割合で接種した。相対湿度を85%以上に保持し、35℃にて培養を行った。培養開始後24時間後、及び48時間後に手入れを行い、72時間で培養終了とした。
麹発酵物試料は、凍結乾燥した後、家庭用粉砕装置にて粉砕した。得られた凍結試料2gに対して、99.5%エタノールを40mL添加し、40℃、30分間、撹拌しながら超音波処理を施して、エタノール抽出を行った。この上清を濾紙にて濾過し、残渣にさらに99.5%エタノールを40mL添加し、同様に抽出を行い、上清を同様に濾紙にて濾過し、濾液を合一した。得られた抽出液をエバポレーターにて濃縮し、さらに凍結乾燥機で乾燥後、重量を測定した。その後、80%メタノールを10mL添加し、よく溶解した後、10mLのヘキサンを用いた抽出を3回行い、上清を合一した。得られたヘキサン画分、および残った80%メタノール画分をエバポレーターにて濃縮し、さらに凍結乾燥機で乾燥後、重量を測定した。ヘキサン画分乾固物は100%エタノールに、80%メタノール画分乾固物は50%エタノール水溶液に溶解したものを原液として各種評価に用いた。
[実施例2]
制御性DC誘導活性の評価
移植片拒絶反応及び移植片対宿主病を含む各種免疫疾患を緩和、予防及び治療するために用いるのに有効な活性を有する物質を得る目的で、炎症刺激に対して(A)CD86に代表される細胞表面成熟化因子の発現の低下、(B)DCが産生するIL-12などの炎症性サイトカインの発現量の低下、及び(C)DCが産生するIL-10などの制御性サイトカインの発現量の上昇を指標として、実施例1で調製した試料を評価した。
制御性DC誘導活性の評価
移植片拒絶反応及び移植片対宿主病を含む各種免疫疾患を緩和、予防及び治療するために用いるのに有効な活性を有する物質を得る目的で、炎症刺激に対して(A)CD86に代表される細胞表面成熟化因子の発現の低下、(B)DCが産生するIL-12などの炎症性サイトカインの発現量の低下、及び(C)DCが産生するIL-10などの制御性サイトカインの発現量の上昇を指標として、実施例1で調製した試料を評価した。
以下の方法により、各試料が、マウス骨髄細胞からのDC誘導、及びDC分化に与える影響の評価を行った。
<実験方法>
表1に示される、実施例1で調製した穀類植物由来材料及びそれらの麹発酵物について試験した。まず、C57BL/6マウス骨髄細胞を大腿骨から常法に従って回収し、赤血球除去処理を行った。次に得られた骨髄細胞を、10%FCS、2μM β-メルカプトエタノールを含有するRPMI培地(Gibco)に、1×106細胞/mLになるように縣濁した。得られた細胞懸濁液に、DC誘導サイトカインとしてFlt-3L(R&D systems)を終濃度100ng/mLで添加した。続いて、表1に示す各試料を終濃度50μg/mLで添加した。CO2インキュベーター内で37℃、5%CO2にて1週間、細胞を培養した後、最後の24時間にLPS(シグマアルドリッチ社製)を終濃度1ng/mLで添加した。対照としてLPS非添加試料も作製した。
表1に示される、実施例1で調製した穀類植物由来材料及びそれらの麹発酵物について試験した。まず、C57BL/6マウス骨髄細胞を大腿骨から常法に従って回収し、赤血球除去処理を行った。次に得られた骨髄細胞を、10%FCS、2μM β-メルカプトエタノールを含有するRPMI培地(Gibco)に、1×106細胞/mLになるように縣濁した。得られた細胞懸濁液に、DC誘導サイトカインとしてFlt-3L(R&D systems)を終濃度100ng/mLで添加した。続いて、表1に示す各試料を終濃度50μg/mLで添加した。CO2インキュベーター内で37℃、5%CO2にて1週間、細胞を培養した後、最後の24時間にLPS(シグマアルドリッチ社製)を終濃度1ng/mLで添加した。対照としてLPS非添加試料も作製した。
培養8日目に細胞を回収し、上記(A)CD86発現量をフローサイトメーターを用いた解析により評価した。簡潔には、細胞を回収し、洗浄した後、抗CD11c-APC、抗CD11b-FITC、抗B220-PerCP、抗CD86-PEの各抗体(すべて、ベクトンディッキンソンから入手)を用いて30分間、4℃にて染色し、細胞を洗浄し、FACS CantoII(ベクトンディッキンソン社製)を用いて解析した。
Flt-3LによるDC培養では、ミエロイドDC(mDC)とプラスマサイトイドDC(pDC)が生成される。本実施例では、CD11c+CD11b+B220-で定義されるmDCにゲートを設定して解析を行った。
培養上清は、上記(B)IL-12産生量、及び(C)IL-10産生量を調べるELISAアッセイに供した。ELISAキットとして、OptEIA Mouse ELISA Set(ベクトンディッキンソン社製)を使用し、製造業者の使用説明書に従い測定を行なった。
<実験結果>
(A)LPS刺激に応答しての成熟マーカーCD86発現に対する各試料の影響
図1に、表1に挙げられた試料についてのアッセイ結果を示す。対照(試料溶媒であるエタノールのみを添加)では、LPS刺激により爆発的にCD86発現量(平均蛍光強度:MFIとして評価)が増大した。各試料を添加することにより、CD86の発現量の上昇が抑制される現象が観察された。特にサンプル7、8、9、10及び20によって、CD86発現量は対照の50%以下となり、顕著な低下が認められた。
(A)LPS刺激に応答しての成熟マーカーCD86発現に対する各試料の影響
図1に、表1に挙げられた試料についてのアッセイ結果を示す。対照(試料溶媒であるエタノールのみを添加)では、LPS刺激により爆発的にCD86発現量(平均蛍光強度:MFIとして評価)が増大した。各試料を添加することにより、CD86の発現量の上昇が抑制される現象が観察された。特にサンプル7、8、9、10及び20によって、CD86発現量は対照の50%以下となり、顕著な低下が認められた。
(B)LPS刺激に応答しての炎症性サイトカインIL-12p70発現に対する各試料の影響
図2に、表1に挙げられた試料についてのアッセイ結果を示す。No.1から10までのすべてのヘキサン抽出画分で、顕著なIL-12p70発現抑制が見られた。
図2に、表1に挙げられた試料についてのアッセイ結果を示す。No.1から10までのすべてのヘキサン抽出画分で、顕著なIL-12p70発現抑制が見られた。
(C)LPS刺激に応答しての制御性サイトカインIL-10発現に対する各試料の影響
図3に、表1に挙げられた試料についてのアッセイ結果を示す。No.8のみで、顕著なIL-10発現促進活性が見られた。
図3に、表1に挙げられた試料についてのアッセイ結果を示す。No.8のみで、顕著なIL-10発現促進活性が見られた。
以上の結果、(A)~(C)の条件を完全に満たすものとして、No.8の試料、すなわち小麦フスマ黒麹発酵物のエタノール抽出ヘキサン画分が特定された。これは制御性DCを誘導すると言うことができる。また、No.7、9、10及び20の試料は、IL-10産生促進効果は見られないものの、DCの活性化阻害効果(LPS刺激に応答しての成熟マーカー(CD86)発現低下、及び炎症性サイトカイン(IL-12)産生低下)が見られることから、抗炎症性を有することが明らかになった。
[実施例3]
小麦フスマ麹発酵物と他の制御性DC誘導法との比較
実施例2で制御性DC誘導活性が認められた小麦フスマ麹発酵物抽出物について、公知の代表的な制御性DC誘導剤との比較を行った。
小麦フスマ麹発酵物と他の制御性DC誘導法との比較
実施例2で制御性DC誘導活性が認められた小麦フスマ麹発酵物抽出物について、公知の代表的な制御性DC誘導剤との比較を行った。
ラパマイシンは、DC誘導中に添加することによって、低下したCD86/MHCII発現及び低下したIL-12p70産生を示すDCを分化させることが報告されている(Journal of Immunology,2007,178:7018-7031.)。一方、Satoらは、DC誘導開始とともにIL-10/TGF-βを添加することにより、一連のDC成熟マーカー発現が低下することを報告している(Immunity,2003,18:367-379.)。また、DCに関与するかどうかは不明であるが、米糠に含まれるγ-オリザノールには抗炎症効果があり、腸炎を改善することが報告されている(Br J Pharmacol,2008,154:812-824.)。小麦フスマ発酵物がこれらと比して同等な効果を有するかどうかを検討した。
<実験方法>
表1に示される、実施例1で調製した小麦フスマ麹発酵物ヘキサン画分(No.8)を試験に用いた。ラパマイシン及びIL-10/TGF-βの報告ではDC誘導剤としてGM-CSFを使用しているため、GM-CSF及びFlt-3Lそれぞれの系でDCを誘導し、各制御性DC誘導剤について評価した。
表1に示される、実施例1で調製した小麦フスマ麹発酵物ヘキサン画分(No.8)を試験に用いた。ラパマイシン及びIL-10/TGF-βの報告ではDC誘導剤としてGM-CSFを使用しているため、GM-CSF及びFlt-3Lそれぞれの系でDCを誘導し、各制御性DC誘導剤について評価した。
(A)Flt-3LによるDC誘導系
実施例2の実験方法と同様にして、C57BL/6マウス大腿骨から骨髄細胞を調製し、1×106細胞/mLで培地に縣濁し、Flt-3Lを100ng/mL添加した。小麦フスマ麹発酵物抽出物及びγ-オリザノール(和光純薬社製)は50μg/mL、IL-10/TGF-β(それぞれ、R&D systems社製、Peprotech社製)は各20ng/mLで、培養開始後0日目(day0)に添加した。ラパマイシン(和光純薬社製)は10ng/mLで培養開始3日後に添加した。培養は7日間行い、最後の24時間にLPSを終濃度1ng/mLで添加した。
実施例2の実験方法と同様にして、C57BL/6マウス大腿骨から骨髄細胞を調製し、1×106細胞/mLで培地に縣濁し、Flt-3Lを100ng/mL添加した。小麦フスマ麹発酵物抽出物及びγ-オリザノール(和光純薬社製)は50μg/mL、IL-10/TGF-β(それぞれ、R&D systems社製、Peprotech社製)は各20ng/mLで、培養開始後0日目(day0)に添加した。ラパマイシン(和光純薬社製)は10ng/mLで培養開始3日後に添加した。培養は7日間行い、最後の24時間にLPSを終濃度1ng/mLで添加した。
評価法として、細胞表面のDC活性化マーカーCD40、CD86、及びMHCII、並びに抑制性マーカーPD1Lの発現強度を、フローサイトメーターを用いた解析により評価した。実施例1と同様mDCにゲートを設定して解析を行った。抗CD11c-APC、抗CD11b-APC-Cy7、抗B220-PerCP、抗CD40-FITC及び抗CD86-PE、又は抗CD11c-APC、抗CD11b-APC-Cy7、抗B220-PerCP、抗MHCII-FITC及び抗PD1L-PE(すべてベクトンディッキンソンから入手)を用いて染色し、解析した。
(B)GM-CSFによるDC培養系
実施例1の実験方法と同様にして、C57BL/6マウス大腿骨から骨髄細胞を調製し、2×105細胞/mLで培地に縣濁し、20ng/mlのGM-CSF(R&D systems社製)を添加した。試験物質の添加濃度及び添加のタイミングは上記と同様に行った。
実施例1の実験方法と同様にして、C57BL/6マウス大腿骨から骨髄細胞を調製し、2×105細胞/mLで培地に縣濁し、20ng/mlのGM-CSF(R&D systems社製)を添加した。試験物質の添加濃度及び添加のタイミングは上記と同様に行った。
評価法として、細胞表面のDC活性化マーカーCD40、CD86、及びMHCII、並びに抑制性マーカーPD1Lの発現強度を、フローサイトメーターを用いた解析により評価した。GM-CSFによるDC誘導ではmDCしか生成されないが、Flt-3Lの場合と同様、CD11c+CD11b+B220-のmDCゲートを設定して解析を行った。
<実験結果>
(A)Flt-3LによるDC誘導系における結果
まず、IL-10/TGF-β添加ではDCが分化せず、評価が不能であった。図4に示すように、小麦フスマ麹発酵物抽出物(図中、単に「小麦フスマ発酵物」と記載。以下同じ。)ではLPS刺激に応答してのCD40、CD86、及びMHCIIの反応が顕著に抑制された。一方、γ-オリザノールではこれらの活性化マーカーに変動を認めず、効果がないことが示された。ラパマイシンではCD40及びCD86で若干の抑制効果が認められたが、小麦フスマ麹発酵物抽出物には大きく劣った。DC上の抑制性マーカーPD1Lについては、どのサンプルでも大きな変動を認めなかった。
(A)Flt-3LによるDC誘導系における結果
まず、IL-10/TGF-β添加ではDCが分化せず、評価が不能であった。図4に示すように、小麦フスマ麹発酵物抽出物(図中、単に「小麦フスマ発酵物」と記載。以下同じ。)ではLPS刺激に応答してのCD40、CD86、及びMHCIIの反応が顕著に抑制された。一方、γ-オリザノールではこれらの活性化マーカーに変動を認めず、効果がないことが示された。ラパマイシンではCD40及びCD86で若干の抑制効果が認められたが、小麦フスマ麹発酵物抽出物には大きく劣った。DC上の抑制性マーカーPD1Lについては、どのサンプルでも大きな変動を認めなかった。
(B)GM-CSFによるDC誘導系における結果
図5に示すように、小麦フスマ麹発酵物抽出物で処理したDCは、LPS非添加状態においてもDC活性化マーカーの発現が対照に比べて強く抑制されていることに加えて、LPS刺激に対してほぼ無反応で、炎症刺激に対して寛容状態となっていることが示された。γ-オリザノールでは、対照と同様に強い活性化マーカーの発現上昇が見られ、制御性DC誘導効果を認めなかった。ラパマイシンではLPS非添加・添加に関わらず、CD40及びCD86の発現抑制効果が認められたが、MHCIIに対しては効果が見られず、限定的な制御性DCの生成が確認された。IL-10/TGF-βでは、小麦フスマ麹発酵物抽出物と同様なCD40、CD86、及びMHCIIの発現抑制が観察されたが、DCの分化マーカーであるCD11cの発現度が低下しており、DC分化そのものが阻害されていることが考えられた。
図5に示すように、小麦フスマ麹発酵物抽出物で処理したDCは、LPS非添加状態においてもDC活性化マーカーの発現が対照に比べて強く抑制されていることに加えて、LPS刺激に対してほぼ無反応で、炎症刺激に対して寛容状態となっていることが示された。γ-オリザノールでは、対照と同様に強い活性化マーカーの発現上昇が見られ、制御性DC誘導効果を認めなかった。ラパマイシンではLPS非添加・添加に関わらず、CD40及びCD86の発現抑制効果が認められたが、MHCIIに対しては効果が見られず、限定的な制御性DCの生成が確認された。IL-10/TGF-βでは、小麦フスマ麹発酵物抽出物と同様なCD40、CD86、及びMHCIIの発現抑制が観察されたが、DCの分化マーカーであるCD11cの発現度が低下しており、DC分化そのものが阻害されていることが考えられた。
以上の結果から、食品由来で安全性・副作用・コストの点で大きく優位な小麦フスマ麹発酵物抽出物は、公知の制御性DC誘導剤であるラパマイシン及びIL-10/TGF-βと同等かそれ以上の有効性で制御性DCを誘導し得ることが示された。
[実施例4]
小麦フスマ麹発酵物抽出物で処理したDCのT細胞増殖支持能及びサイトカイン産生能の評価
小麦フスマ麹発酵物抽出物で処理したDCのT細胞増殖支持能を評価するために、混合リンパ球培養反応(mixed-lymphocyte reaction=MLR)試験を行った。
小麦フスマ麹発酵物抽出物で処理したDCのT細胞増殖支持能及びサイトカイン産生能の評価
小麦フスマ麹発酵物抽出物で処理したDCのT細胞増殖支持能を評価するために、混合リンパ球培養反応(mixed-lymphocyte reaction=MLR)試験を行った。
<実験方法>
表1に示される、実施例1で調製した小麦フスマ麹発酵物(No.8)を試験に用いた。骨髄細胞の供給源としてBALB/cマウスを用いた以外は上記実施例と同様にして、小麦フスマ麹発酵物抽出物存在下で、Flt-3LによってDCを誘導し、最後の24時間はLPS処理による刺激を行った。対照として、小麦フスマ麹発酵物抽出物を添加しない細胞を作製した。
表1に示される、実施例1で調製した小麦フスマ麹発酵物(No.8)を試験に用いた。骨髄細胞の供給源としてBALB/cマウスを用いた以外は上記実施例と同様にして、小麦フスマ麹発酵物抽出物存在下で、Flt-3LによってDCを誘導し、最後の24時間はLPS処理による刺激を行った。対照として、小麦フスマ麹発酵物抽出物を添加しない細胞を作製した。
続いてCD11b+CD11c+B220-のmDCをセルソーター(FACS Aria)を用いてソーティングした。次にDC自体の培養期間中における増殖を止めるため、マイトマイシンC処理を行った。簡潔には、細胞を10μg/mLのマイトマイシンC(ナカライテスク社製)を含有するRPMI1640培地中で37℃にて30分間インキュベートし、RPMI培地で2回洗浄した。
次に、C57BL/6マウスから、CD3+CD4+CD62L+のナイーブCD4+T細胞をセルソーターによってソーティングし、CFSEラベルで蛍光染色した。簡潔には、抗CD3-APC-Cy7、抗CD4-APC、及び抗CD62L-PEを用いて細胞を染色し、ナイーブCD4+T細胞をソーティング後、CellTrace CFSE Cell proliferation kit(Molecular Probes社製)を用いて、製造業者の使用説明書に従って染色を行なった。
最後に、マイトマイシン処理の終了したBALB/c由来DCと、C57BL/6由来ナイーブCD4+T細胞とを、DC:CD4+T=1:10(細胞数)となるように混合し、7日間培養した。培養終了後、CFSEの強度減少によってCD4+T細胞の分裂・増殖の程度を評価した。また、分化したCD4+T細胞からの炎症性サイトカインTNF-α及びIL-17産生を細胞内サイトカイン染色によって判定した。簡潔には、抗CD3-APC及び抗CD4-PerCP(いずれもベクトンディッキンソン社製)を用いた細胞表面マーカーの染色後、Cytofix/Cytoperm Fixation/Permiabilization kit(ベクトンディッキンソン社製)を用いて細胞膜透過処理を行い、抗TNFα-FITC及び抗IL-17-PE(いずれもベクトンディッキンソン社製)を用いてサイトカイン染色を行なった。
<実験結果>
(A)図6に示すように、小麦フスマ麹発酵物抽出物を用いて処理したDCは、対照と比較して、CD4+T細胞の分裂・増殖支持能を著明に低下させることが示され、急激なT細胞増加を防ぐ抗炎症効果を有することが示された。
(A)図6に示すように、小麦フスマ麹発酵物抽出物を用いて処理したDCは、対照と比較して、CD4+T細胞の分裂・増殖支持能を著明に低下させることが示され、急激なT細胞増加を防ぐ抗炎症効果を有することが示された。
(B)図7に示すように、小麦フスマ麹発酵物抽出物を用いて処理したDCと共培養したT細胞の炎症性サイトカインTNF-α及びIL-17陽性細胞率は、対照DCの場合と比較して、半分に低下していた。このことによっても、小麦フスマ麹発酵物抽出物の抗炎症作用が示された。
[実施例5]
小麦フスマ麹発酵物抽出物で処理したDCの制御性T細胞(Treg)誘導能の評価
小麦フスマ麹発酵物抽出物で処理したDCの、ナイーブT細胞からTregへの変換を誘導する能力を評価するために、アッセイを行った。
小麦フスマ麹発酵物抽出物で処理したDCの制御性T細胞(Treg)誘導能の評価
小麦フスマ麹発酵物抽出物で処理したDCの、ナイーブT細胞からTregへの変換を誘導する能力を評価するために、アッセイを行った。
<実験方法>
(A)抗原非特異的なTreg誘導能の検討
上記実施例と同様にして、小麦フスマ麹発酵物処理物存在下でBALB/cマウス骨髄細胞からFlt-3Lを用いてDCを誘導し、LPSで24時間処理した。得られた細胞から、実施例3と同様にしてmDCをソーティングし、マイトマイシンC処理によってDCの細胞増殖を止めた。
(A)抗原非特異的なTreg誘導能の検討
上記実施例と同様にして、小麦フスマ麹発酵物処理物存在下でBALB/cマウス骨髄細胞からFlt-3Lを用いてDCを誘導し、LPSで24時間処理した。得られた細胞から、実施例3と同様にしてmDCをソーティングし、マイトマイシンC処理によってDCの細胞増殖を止めた。
次に、C57BL/6からナイーブCD4+T細胞をソーティングし、DC:CD4+T=1:10(細胞数)で混合し、共培養した。この際、培地に0.5ng/mL TGF-β1(Peprotech社製)を添加した。
7日後に細胞を回収し、CD4+T細胞中のFoxP3+CD25+T細胞の割合をフローサイトメーターで求めた(抗CD25-FITC、抗CD3-APC-Cy7及び抗CD4-PerCPを用いた細胞表面マーカー染色後、Foxp3 Staining Buffer Set(e Bioscience社製)を用いて製造業者の使用説明書に従って細胞膜透過処理を行い、抗Foxp3-PE(e Bioscience社製)で細胞内Foxp3を染色した)。対照として、小麦フスマ麹発酵物抽出物非存在下(無添加)で作製したmDC、さらにSatoらの方法に従い、GM-CSFにIL-10/TGF-βを添加して誘導されるDCregを用いた。
(B)抗原特異的なTreg誘導能の検討
(A)と同様に各種DCを調製した。次にOVA特異的TCRを有するDO11.10マウス(チャールズリバーから入手)のナイーブCD4+T細胞をソーティングし、DC:CD4+T=1:10(細胞数)で混合し、共培養した。この際、培地に0.5ng/mL TGF-β1及び0.1μM OVA323-339ペプチドを添加し、5日間培養した。続いて、Tregの生成効率を、(A)と同様に求めた。
(A)と同様に各種DCを調製した。次にOVA特異的TCRを有するDO11.10マウス(チャールズリバーから入手)のナイーブCD4+T細胞をソーティングし、DC:CD4+T=1:10(細胞数)で混合し、共培養した。この際、培地に0.5ng/mL TGF-β1及び0.1μM OVA323-339ペプチドを添加し、5日間培養した。続いて、Tregの生成効率を、(A)と同様に求めた。
<実験結果>
(A)抗原非特異的なTreg誘導能
図8に示すように、Tregの生成は、小麦フスマ麹発酵物抽出物で処理したDCとの共培養により、対照と比較して3倍以上に増加した。一方、DCregでは、対照と比較して2倍以上の増加が見られた。
(A)抗原非特異的なTreg誘導能
図8に示すように、Tregの生成は、小麦フスマ麹発酵物抽出物で処理したDCとの共培養により、対照と比較して3倍以上に増加した。一方、DCregでは、対照と比較して2倍以上の増加が見られた。
(B)抗原特異的なTreg誘導能
図9に示すように、Tregの生成は、小麦フスマ麹発酵物抽出物で処理したDCとの共培養により、対照と比較して3倍以上に増加した。一方、DCregでは、対照と比較して2倍以上の増加が見られた。
図9に示すように、Tregの生成は、小麦フスマ麹発酵物抽出物で処理したDCとの共培養により、対照と比較して3倍以上に増加した。一方、DCregでは、対照と比較して2倍以上の増加が見られた。
以上の結果から、小麦フスマ麹発酵物抽出物で処理したDCは、Tregを効率的に誘導する能力を有することが示された。その効果は、公知の方法で作製したDCregと比較しても、より高いことが示された。このことは、小麦フスマ麹発酵物が、制御性DC誘導、それによるTreg増加を介して、各種免疫疾患を予防及び治療することができることを示唆している。
[実施例6]
使用麹菌種の比較
小麦フスマ発酵に使用する麹菌種の違いによって、制御性DC誘導効率に差が生じるかについて、様々な麹菌種を比較することによって検討した。
使用麹菌種の比較
小麦フスマ発酵に使用する麹菌種の違いによって、制御性DC誘導効率に差が生じるかについて、様々な麹菌種を比較することによって検討した。
<サンプル調製>
市販種麹として、黒麹菌(秋田今野社:黒麹マイルド(アスペルギルス・アワモリ);秋田今野社:焼酎用白麹(アスペルギルス・カワチ);樋口もやし社:ヒグチ黒麹(アスペルギルス・アワモリ))、醤油用麹菌(秋田今野社:醤油1号(アスペルギルス・ソーヤ))、黄麹菌(秋田今野社:強力もと立用(アスペルギルス・オリゼー))、及びテンペ菌(秋田今野社:リゾプス・オリゴスポラス)を用いた以外は、実施例1に記載の小麦フスマ黒麹発酵物及びその処理物の調製法と同様にして、発酵物及び抽出物を調製した。また、発酵なしの試料としては、同じ方法で滅菌し、種麹を接種していないものを用いた。
市販種麹として、黒麹菌(秋田今野社:黒麹マイルド(アスペルギルス・アワモリ);秋田今野社:焼酎用白麹(アスペルギルス・カワチ);樋口もやし社:ヒグチ黒麹(アスペルギルス・アワモリ))、醤油用麹菌(秋田今野社:醤油1号(アスペルギルス・ソーヤ))、黄麹菌(秋田今野社:強力もと立用(アスペルギルス・オリゼー))、及びテンペ菌(秋田今野社:リゾプス・オリゴスポラス)を用いた以外は、実施例1に記載の小麦フスマ黒麹発酵物及びその処理物の調製法と同様にして、発酵物及び抽出物を調製した。また、発酵なしの試料としては、同じ方法で滅菌し、種麹を接種していないものを用いた。
<実験方法>
上記実施例と同様にして、C57BL/6マウス骨髄細胞にFlt-3Lを添加してDCへと分化誘導し、同時に各種麹菌種を用いて発酵させた小麦フスマ麹発酵物抽出物を50μg/mL添加して、7日間培養した。最後の24時間にLPSで細胞を刺激し、続いて細胞活性化マーカーCD86及びMHCII、並びに培養上清中のIL-10濃度を測定した。
上記実施例と同様にして、C57BL/6マウス骨髄細胞にFlt-3Lを添加してDCへと分化誘導し、同時に各種麹菌種を用いて発酵させた小麦フスマ麹発酵物抽出物を50μg/mL添加して、7日間培養した。最後の24時間にLPSで細胞を刺激し、続いて細胞活性化マーカーCD86及びMHCII、並びに培養上清中のIL-10濃度を測定した。
<実験結果>
図10に示すように、CD86抑制活性についてはどの菌株を用いた場合でも大差はなかった。また、未発酵物でも若干劣るが抑制活性が見られた。MHCII抑制活性については、黒麹が他と比べて若干活性が高かった。
図10に示すように、CD86抑制活性についてはどの菌株を用いた場合でも大差はなかった。また、未発酵物でも若干劣るが抑制活性が見られた。MHCII抑制活性については、黒麹が他と比べて若干活性が高かった。
図11にIL-10濃度を示す。どの菌株を用いた場合でも安定したIL-10産生が見られ、菌株の違いによる差はなかった。未発酵物でも半分程度のIL-10促進活性が見られた。
以上の結果から、菌株として総合的に黒麹菌が好ましいこと、及び、原料である小麦フスマそのものにも制御性DC誘導活性が見られるが、発酵によって活性を高めることができることが示された。
[実施例7]
発酵条件と活性との関連
小麦フスマを黒麹で発酵させる際の温度、培養日数、及び水分条件が、発酵物の効果に影響を与えるかについて検討を行った。
発酵条件と活性との関連
小麦フスマを黒麹で発酵させる際の温度、培養日数、及び水分条件が、発酵物の効果に影響を与えるかについて検討を行った。
<サンプル調製>
市販種麹として樋口もやし社のヒグチ黒麹を用いて、実施例1に記載の小麦フスマ黒麹調製法と同様にして、発酵物及び抽出物を調製した。その際、培養温度を30、35又は37℃、培養日数を2、3又は4日とし、水分量は基本条件の55%の他に45%としたものを設けた。
市販種麹として樋口もやし社のヒグチ黒麹を用いて、実施例1に記載の小麦フスマ黒麹調製法と同様にして、発酵物及び抽出物を調製した。その際、培養温度を30、35又は37℃、培養日数を2、3又は4日とし、水分量は基本条件の55%の他に45%としたものを設けた。
<実験方法>
上記実施例と同様にして、C57BL/6マウス骨髄細胞にFlt-3Lを添加して、DCへと分化誘導し、同時に各培養条件によって発酵させた小麦フスマ麹発酵物抽出物を50μg/mL添加し、7日間培養した。最後の24時間にLPSで細胞を刺激し、細胞活性化マーカーCD86及びMHCII、並びに培養上清中のIL-10濃度を測定した。
上記実施例と同様にして、C57BL/6マウス骨髄細胞にFlt-3Lを添加して、DCへと分化誘導し、同時に各培養条件によって発酵させた小麦フスマ麹発酵物抽出物を50μg/mL添加し、7日間培養した。最後の24時間にLPSで細胞を刺激し、細胞活性化マーカーCD86及びMHCII、並びに培養上清中のIL-10濃度を測定した。
<実験結果>
図12に示すように、30℃・2日間培養では若干IL-10産生誘導が低下していたが、その他の条件では特に大きな効果の差異は見出されなかった。
図12に示すように、30℃・2日間培養では若干IL-10産生誘導が低下していたが、その他の条件では特に大きな効果の差異は見出されなかった。
以上の結果から、特に30℃で3日以上発酵させることによって、安定した活性を有する物質が産生されることが示唆された。
[実施例8]
有効成分の単離
小麦フスマ麹発酵物から、上記実施例での免疫制御作用を発揮するための有効成分と考えられる化合物を単離した。
有効成分の単離
小麦フスマ麹発酵物から、上記実施例での免疫制御作用を発揮するための有効成分と考えられる化合物を単離した。
<実験方法>
黒麹菌(秋田今野社:黒麹マイルド(アスペルギルス・アワモリ))を用いて、培養温度30℃、培養日数3日、水分量55%として、実施例1と同様の方法により小麦フスマ麹発酵物を調製した。得られた発酵物をさらにエタノール抽出及びヘキサン抽出に供し、ヘキサン抽出物を調製した。発酵物の凍結乾燥物100gから、抽出物3gが得られた。
黒麹菌(秋田今野社:黒麹マイルド(アスペルギルス・アワモリ))を用いて、培養温度30℃、培養日数3日、水分量55%として、実施例1と同様の方法により小麦フスマ麹発酵物を調製した。得られた発酵物をさらにエタノール抽出及びヘキサン抽出に供し、ヘキサン抽出物を調製した。発酵物の凍結乾燥物100gから、抽出物3gが得られた。
得られた抽出物を200mg/mLとなるようにヘキサンに溶解し、ヘキサンでコンディショニングしたMega Bond Elute SI(20g)(Varian社製)に、1本あたり3mLアプライした。続いて60mLのヘキサンでカラムを洗浄し、60mLの酢酸エチルで溶出して、カラム吸着物を回収した。得られた溶出液をエバポレーターで乾固した。3gのヘキサン抽出物から、2.8gのSIカラム吸着物が得られた。
得られたSIカラム吸着物を、200mg/mLとなるようにヘキサン/エタノール(80/20;v/v)に溶解し、UK-Slica(10×250mm)(インタクト社製)を用いた高速液体クロマトグラフィー(ヘキサン/イソプロパノール=98/2)にかけた。保持時間18~19分の画分を分取し、濃縮乾固した。これをさらにヘキサン/エタノール(20/80;v/v)に溶解し、Develosil C30-UG-5(10×250mm)(野村化学社製)を用いた高速液体クロマトグラフィー(アセトニトリル/イソプロパノール=99/1)にかけ、保持時間32.5~33.5分の画分を分取した。この画分に含まれる化合物を定法に従いさらに分析すると、以下の構造式及び物理化学的特性を有する14-デヒドロエルゴステロール(14-dehydroergosterol)が検出された。
(1)分子量:394.32275(高分解能APCI-Orbitrap法による観測値:m/z 395.33057(M+H)+)
(2)分子式:C28H42O(精密分子量:394.323565)
(3)溶剤に対する溶解性:水に不溶、エタノールに難溶、クロロホルムに易溶
(4)紫外部吸収スペクトル(MeCN):391nm
(5)1H-NMR(CD3OD)ppm: 6.15 (1H, m), 5.75 (1H, m), 5.65 (1H, dd, J = 2.2, 5.9 Hz), 5.27 (1H, dd, J = 7.0, 15.1 Hz), 5.21 (1H, dd, J = 7.9, 15.1 Hz), 3.64 (1H, m), 2.51 (1H, ddd, J = 2.2, 5.1, 10.6 Hz), 2.30 (1H, m), 2.20 (1H, m), 2.20 (1H, dd, J = 3.2, 7.8 Hz), 2.06 (1H, m), 2.05 (1H, m), 1.94 (1H, m), 1.90 (1H, m), 1.87 (2H, m), 1.87 (1H, ddd, J = 3.2, 7.0, 7.3 Hz), 1.71 (1H, m), 1.59 (1H, m), 1.57 (1H, m), 1.45 (1H, m), 1.45 (1H, ddd, J = 3.2, 6.3, 6.5 Hz), 1.30 (1H, m), 1.05 (3H, d, J = 6.8 Hz ), 0.93 (3H, d, J = 7.3 Hz), 0.92 (3H, s,), 0.89 (3H, s), 0.85 (3H, d, J = 6.5 Hz), 0.83 (3H, d, J = 6.3 Hz).
(6)13C-NMR(CD3OD)ppm: 149.2 (s), 143.0 (s), 135.4 (s), 132.2 (s), 132.0 (s), 120.5 (s), 120.4 (s), 117.4 (s), 70.4 (s), 58.1 (s), 46.3 (s), 45.4 (s), 42.8 (s), 41.0 (s), 39.0 (s), 38.9 (s), 37.8 (s), 37.0 (s), 36.0 (s), 33.1 (s), 32.0 (s), 21.1 (s), 19.9 (s), 19.7 (s), 19.6 (s), 17.6 (s), 16.8 (s), 14.5 (s).
(2)分子式:C28H42O(精密分子量:394.323565)
(3)溶剤に対する溶解性:水に不溶、エタノールに難溶、クロロホルムに易溶
(4)紫外部吸収スペクトル(MeCN):391nm
(5)1H-NMR(CD3OD)ppm: 6.15 (1H, m), 5.75 (1H, m), 5.65 (1H, dd, J = 2.2, 5.9 Hz), 5.27 (1H, dd, J = 7.0, 15.1 Hz), 5.21 (1H, dd, J = 7.9, 15.1 Hz), 3.64 (1H, m), 2.51 (1H, ddd, J = 2.2, 5.1, 10.6 Hz), 2.30 (1H, m), 2.20 (1H, m), 2.20 (1H, dd, J = 3.2, 7.8 Hz), 2.06 (1H, m), 2.05 (1H, m), 1.94 (1H, m), 1.90 (1H, m), 1.87 (2H, m), 1.87 (1H, ddd, J = 3.2, 7.0, 7.3 Hz), 1.71 (1H, m), 1.59 (1H, m), 1.57 (1H, m), 1.45 (1H, m), 1.45 (1H, ddd, J = 3.2, 6.3, 6.5 Hz), 1.30 (1H, m), 1.05 (3H, d, J = 6.8 Hz ), 0.93 (3H, d, J = 7.3 Hz), 0.92 (3H, s,), 0.89 (3H, s), 0.85 (3H, d, J = 6.5 Hz), 0.83 (3H, d, J = 6.3 Hz).
(6)13C-NMR(CD3OD)ppm: 149.2 (s), 143.0 (s), 135.4 (s), 132.2 (s), 132.0 (s), 120.5 (s), 120.4 (s), 117.4 (s), 70.4 (s), 58.1 (s), 46.3 (s), 45.4 (s), 42.8 (s), 41.0 (s), 39.0 (s), 38.9 (s), 37.8 (s), 37.0 (s), 36.0 (s), 33.1 (s), 32.0 (s), 21.1 (s), 19.9 (s), 19.7 (s), 19.6 (s), 17.6 (s), 16.8 (s), 14.5 (s).
[実施例9]
14-デヒドロエルゴステロールの制御性DC誘導活性
上記のように小麦フスマ麹発酵物から単離・精製され、構造決定された14-デヒドロエルゴステロール(14-DHE)について制御性DC誘導活性を評価した。対照として、エルゴステロール関連物質であるエルゴステロール(和光純薬社製)、9(11)-デヒドロエルゴステロール(9(11)-DHE)(シグマアルドリッチ社製)を用いた。また、過去にDC活性化阻害について報告がある共役リノール酸(CLA)として、CLA(9Z,11E)及びCLA(10E,12Z)(いずれもCayman chemical社製)、並びにリノール酸(和光純薬社製)についても測定を行なった(J.Immunol.,175(8):4990-8,Oct 15,2005)。陰性対照として、化合物を投与しない試料(none)、及びLPSのみを投与した試料(ctrl)について測定を行なった。
14-デヒドロエルゴステロールの制御性DC誘導活性
上記のように小麦フスマ麹発酵物から単離・精製され、構造決定された14-デヒドロエルゴステロール(14-DHE)について制御性DC誘導活性を評価した。対照として、エルゴステロール関連物質であるエルゴステロール(和光純薬社製)、9(11)-デヒドロエルゴステロール(9(11)-DHE)(シグマアルドリッチ社製)を用いた。また、過去にDC活性化阻害について報告がある共役リノール酸(CLA)として、CLA(9Z,11E)及びCLA(10E,12Z)(いずれもCayman chemical社製)、並びにリノール酸(和光純薬社製)についても測定を行なった(J.Immunol.,175(8):4990-8,Oct 15,2005)。陰性対照として、化合物を投与しない試料(none)、及びLPSのみを投与した試料(ctrl)について測定を行なった。
<実験方法>
実施例2と同様にして、C57BL/6マウス大腿骨から骨髄細胞を調製し、Flt-3Lを用いて樹状細胞を誘導した。培養開始と同時に被験物質を1μM、5μM又は10μMで添加した。7日後に、LPS(Salmonella typhosa由来)(シグマアルドリッチ社製)を5ng/mLで添加し、24時間後に細胞を回収した。続いて、以下の細胞マーカーについて細胞を染色し、フローサイトメトリー解析に供した。抗体はすべてベクトンディッキンソン社製のものを用いた。mDCのゲートとしてCD11c+CD11b+を設定し、CD40、CD80、CD86、I-A/I-E及びICOS-Lの発現レベルを測定した。また、培養上清中のIL-12p40及びIL-10をELISAによって測定した。
実施例2と同様にして、C57BL/6マウス大腿骨から骨髄細胞を調製し、Flt-3Lを用いて樹状細胞を誘導した。培養開始と同時に被験物質を1μM、5μM又は10μMで添加した。7日後に、LPS(Salmonella typhosa由来)(シグマアルドリッチ社製)を5ng/mLで添加し、24時間後に細胞を回収した。続いて、以下の細胞マーカーについて細胞を染色し、フローサイトメトリー解析に供した。抗体はすべてベクトンディッキンソン社製のものを用いた。mDCのゲートとしてCD11c+CD11b+を設定し、CD40、CD80、CD86、I-A/I-E及びICOS-Lの発現レベルを測定した。また、培養上清中のIL-12p40及びIL-10をELISAによって測定した。
<結果>
図13に示すように、MHCクラスII分子であるI-A/I-E、並びに共刺激分子であるCD40、CD80及びCD86の発現レベルは、14-DHEにより大きく低下した。対照物質のうちでは、9(11)-DHEについて、最大濃度(10μM)での添加によってこれらの分子の発現レベルの若干の低下が観察された。このことから、本発明の穀類植物由来材料から見出された14-DHEは、LPSをはじめとする炎症刺激に対する不応答性を誘導する活性が極めて高いことが示され、デヒドロエルゴステロールのうちでも、二重結合の位置が活性において重要な役割を果たすことが示唆された。
図13に示すように、MHCクラスII分子であるI-A/I-E、並びに共刺激分子であるCD40、CD80及びCD86の発現レベルは、14-DHEにより大きく低下した。対照物質のうちでは、9(11)-DHEについて、最大濃度(10μM)での添加によってこれらの分子の発現レベルの若干の低下が観察された。このことから、本発明の穀類植物由来材料から見出された14-DHEは、LPSをはじめとする炎症刺激に対する不応答性を誘導する活性が極めて高いことが示され、デヒドロエルゴステロールのうちでも、二重結合の位置が活性において重要な役割を果たすことが示唆された。
DCの免疫抑制作用の指標となるマーカーICOS-Lの発現レベルは、14-DHEによってほとんど変化しなかった。結果として、DC上の免疫活性化マーカーと免疫抑制マーカーの比率は、14-DHEの添加により飛躍的に抑制側に傾いた。
図14に示すように、炎症性サイトカインであるIL-12p40の発現は、14-DHEの添加により劇的に低下した。この場合も、対照物質のうち9(11)-DHEで若干の低下が見られたが、14-DHEによる低下と比較して効果は大きく劣っていた。さらに、抗炎症性サイトカインであるIL-10の発現は、14-DHEの添加により若干上昇した。このことは、14-DHEが全体として炎症を抑制し、抗炎症作用を高めることを示唆している。
図13及び14の結果から分かるように、DC活性化阻害の報告がある共役リノール酸等は、用いた濃度では一連のDCの細胞表面マーカー及びサイトカインの発現には影響を及ぼさなかった。先行文献でこれらの物質の効果が示されたのは50μMで用いた場合であり、14-DHEはこれらの物質と比較して低濃度で突出した効果を示すことが明らかとなった。
[実施例10]
14-DHEで処理したDCの制御性T細胞(Treg)誘導能の評価
<実験方法>
実施例5と同様にして、14-DHEで処理したmDCのTreg誘導活性を測定した。対照として、14-DHEで処理していないDCを用いた同様の測定も行なった。
14-DHEで処理したDCの制御性T細胞(Treg)誘導能の評価
<実験方法>
実施例5と同様にして、14-DHEで処理したmDCのTreg誘導活性を測定した。対照として、14-DHEで処理していないDCを用いた同様の測定も行なった。
<結果>
(A)抗原非特異的Treg誘導能(混合リンパ球培養反応(MLR))
図15Aに示すように、Tregの生成は、14-DHEで処理したDCとの共培養により、対照と比較して2倍程度増加した。
(A)抗原非特異的Treg誘導能(混合リンパ球培養反応(MLR))
図15Aに示すように、Tregの生成は、14-DHEで処理したDCとの共培養により、対照と比較して2倍程度増加した。
(B)抗原特異的Treg誘導能
図15Bに示すように、Tregの生成は、14-DHEで処理したDCとの共培養により、対照と比較して2倍程度増加した。
図15Bに示すように、Tregの生成は、14-DHEで処理したDCとの共培養により、対照と比較して2倍程度増加した。
以上の結果から、14-DHEは、DCの性質を変化させることにより、Treg生成能を高めることができることが示された。
[実施例11]
14-DHE処理DCにより誘導されるCD4+T細胞により産生されるサイトカインプロフィール
<実験方法>
(1)MLR
上述の実施例と同様にしてC57BL/6マウス大腿骨から骨髄細胞を調製し、Flt-3Lを用いて樹状細胞を誘導した。培養開始と同時に14-DHEを3μMで添加した。7日後に、サルモネラ・タイフォサ(Salmonella typhosa)由来LPS(シグマアルドリッチ)を5ng/mLで添加し、24時間後に細胞を回収した。その後、mDCのゲートとしてCD11c+CD11b+を設定し、回収した細胞をソーティングした。次に、BALB/cマウス脾臓より、CD4+CD62L+T細胞アイソレーションキットII(マウス)(ミルテニーバイオテク)によりCD4+CD62L+T細胞を分離し、mDC:CD4+T細胞の比率を1:5として混合培養した。対照として、14-DHE非存在下で作製したmDCを用いた。培養4日後の培養上清を回収し、ELISA法にてTNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10及びIL-17を測定した。ELISAキットとして、Mouse TNF-α Ready-SET-Go!(eBioscience)、BD OptEIA Mouse IFN-γ ELISAセット(BDライフサイエンス)、Mouse IL-6 Ready-SET-Go!(eBioscience)、BD OptEIA Mouse IL-10 ELISAセット(BDライフサイエンス)、及びMouse IL-17 DuoSet ELISA(R&D Systems)をそれぞれ用いた。
14-DHE処理DCにより誘導されるCD4+T細胞により産生されるサイトカインプロフィール
<実験方法>
(1)MLR
上述の実施例と同様にしてC57BL/6マウス大腿骨から骨髄細胞を調製し、Flt-3Lを用いて樹状細胞を誘導した。培養開始と同時に14-DHEを3μMで添加した。7日後に、サルモネラ・タイフォサ(Salmonella typhosa)由来LPS(シグマアルドリッチ)を5ng/mLで添加し、24時間後に細胞を回収した。その後、mDCのゲートとしてCD11c+CD11b+を設定し、回収した細胞をソーティングした。次に、BALB/cマウス脾臓より、CD4+CD62L+T細胞アイソレーションキットII(マウス)(ミルテニーバイオテク)によりCD4+CD62L+T細胞を分離し、mDC:CD4+T細胞の比率を1:5として混合培養した。対照として、14-DHE非存在下で作製したmDCを用いた。培養4日後の培養上清を回収し、ELISA法にてTNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10及びIL-17を測定した。ELISAキットとして、Mouse TNF-α Ready-SET-Go!(eBioscience)、BD OptEIA Mouse IFN-γ ELISAセット(BDライフサイエンス)、Mouse IL-6 Ready-SET-Go!(eBioscience)、BD OptEIA Mouse IL-10 ELISAセット(BDライフサイエンス)、及びMouse IL-17 DuoSet ELISA(R&D Systems)をそれぞれ用いた。
(2)抗原特異的T細胞反応
mDCはMLRの実験と同じ方法で調製した。ナイーブCD4+T細胞は、C57BL/6バックグラウンドでCD4+T細胞のTCRがOVA323-339エピトープに特異的なOT-IIマウス(チャールズリバー)から調製した。mDC:CD4+T細胞の比率を1:5として、0.1μMのOVA323-339ペプチド存在下で混合培養した。培養4日目の培養上清を回収し、ELISA法にて、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10及びIL-17を測定した。
mDCはMLRの実験と同じ方法で調製した。ナイーブCD4+T細胞は、C57BL/6バックグラウンドでCD4+T細胞のTCRがOVA323-339エピトープに特異的なOT-IIマウス(チャールズリバー)から調製した。mDC:CD4+T細胞の比率を1:5として、0.1μMのOVA323-339ペプチド存在下で混合培養した。培養4日目の培養上清を回収し、ELISA法にて、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10及びIL-17を測定した。
<結果>
(1)MLR
図16Aに示すように、対照mDCの場合と比較して、14-DHE処理mDCを用いて増殖させたCD4+T細胞では、炎症性サイトカインであるTNF-α、IFN-γ、IL-6及びIL-17について有意な産生の低下が認められた。抗炎症性サイトカインであるIL-10については、統計学的な有意差は認められなかった。
(1)MLR
図16Aに示すように、対照mDCの場合と比較して、14-DHE処理mDCを用いて増殖させたCD4+T細胞では、炎症性サイトカインであるTNF-α、IFN-γ、IL-6及びIL-17について有意な産生の低下が認められた。抗炎症性サイトカインであるIL-10については、統計学的な有意差は認められなかった。
(2)抗原特異的T細胞反応
図16Bに示すように、対照mDCの場合と比較して、14-DHE処理mDCを用いて増殖させたCD4+T細胞では、TNF-α及びIL-6について有意な産生の低下が認められた。IFN-γ及びIL-17については統計学的な有意差は認められなかった。抗炎症性サイトカインであるIL-10については、有意な産生の増加が見られた。
図16Bに示すように、対照mDCの場合と比較して、14-DHE処理mDCを用いて増殖させたCD4+T細胞では、TNF-α及びIL-6について有意な産生の低下が認められた。IFN-γ及びIL-17については統計学的な有意差は認められなかった。抗炎症性サイトカインであるIL-10については、有意な産生の増加が見られた。
(3)まとめ
以上の結果から、14-DHEで処理したmDCと共に増殖させたCD4+T細胞では、炎症性サイトカインの産生が低下することが示された。このことは、14-DHEが炎症反応を抑制する作用を有することを示唆しており、この物質は抗炎症剤として有用であると考えられる。
以上の結果から、14-DHEで処理したmDCと共に増殖させたCD4+T細胞では、炎症性サイトカインの産生が低下することが示された。このことは、14-DHEが炎症反応を抑制する作用を有することを示唆しており、この物質は抗炎症剤として有用であると考えられる。
[実施例12]
14-DHE処理DCのCD8 + 制御性T細胞(CD8 + Treg)分化誘導能の評価
一般には、Tregという用語は、CD4+FoxP3+制御性T細胞を指すことが多い。しかし、近年、CD4+T細胞のみならず、CD8+T細胞の中にもFosP3+の制御性T細胞集団が存在しており(Cosmi,L.ら,Blood,2003,102(12):4107-14)、それが強い抗炎症作用を示すこと(Singh,RP.ら,J.Immunol.,1007,178(12):7649-57;Chaput,N.ら,Gut,2009,58(4):520-9)が報告された。14-DHE処理DCがCD4+制御性T細胞を増加させることは実施例10の結果より明らかである。本実施例では、14-DHE処理DCのCD8+制御性T細胞誘導作用について検討した。
14-DHE処理DCのCD8 + 制御性T細胞(CD8 + Treg)分化誘導能の評価
一般には、Tregという用語は、CD4+FoxP3+制御性T細胞を指すことが多い。しかし、近年、CD4+T細胞のみならず、CD8+T細胞の中にもFosP3+の制御性T細胞集団が存在しており(Cosmi,L.ら,Blood,2003,102(12):4107-14)、それが強い抗炎症作用を示すこと(Singh,RP.ら,J.Immunol.,1007,178(12):7649-57;Chaput,N.ら,Gut,2009,58(4):520-9)が報告された。14-DHE処理DCがCD4+制御性T細胞を増加させることは実施例10の結果より明らかである。本実施例では、14-DHE処理DCのCD8+制御性T細胞誘導作用について検討した。
<実験方法>
実施例11と同様に、C57BL/6マウス骨髄細胞より14-DHE及びFlt-3L存在下で誘導したDCから、mDCをソーティングした。次にBALB/cマウス脾臓からCD8α+T細胞アイソレーションキット(マウス)(ミルテニーバイオテク)を用いてCD8+T細胞を分離した。mDC:CD8+T細胞の比率を1:10として細胞を混合した後、0.5ng/mLのTGF-βを含む培地にて5日間培養した。5日後に細胞を回収し、CD8+T細胞中のCD25+FoxP3+細胞の割合をフローサイトメーターを用いて求めた。フローサイトメトリーに先立って、CD8α-PE-Cy7、CD25-APC-Cy7、CD3e-PerCPを用いて細胞染色を行なった後、FoxP3染色バッファーセット(eBioscience)を用いて細胞膜透過処理を行ない、続いてFoxP3-PE染色を行なった。
実施例11と同様に、C57BL/6マウス骨髄細胞より14-DHE及びFlt-3L存在下で誘導したDCから、mDCをソーティングした。次にBALB/cマウス脾臓からCD8α+T細胞アイソレーションキット(マウス)(ミルテニーバイオテク)を用いてCD8+T細胞を分離した。mDC:CD8+T細胞の比率を1:10として細胞を混合した後、0.5ng/mLのTGF-βを含む培地にて5日間培養した。5日後に細胞を回収し、CD8+T細胞中のCD25+FoxP3+細胞の割合をフローサイトメーターを用いて求めた。フローサイトメトリーに先立って、CD8α-PE-Cy7、CD25-APC-Cy7、CD3e-PerCPを用いて細胞染色を行なった後、FoxP3染色バッファーセット(eBioscience)を用いて細胞膜透過処理を行ない、続いてFoxP3-PE染色を行なった。
<結果>
図17に示すように、14-DHE処理mDCは、対照mDCと比較して3倍以上のCD8+CD25+FoxP3+細胞を誘導した。
図17に示すように、14-DHE処理mDCは、対照mDCと比較して3倍以上のCD8+CD25+FoxP3+細胞を誘導した。
以上の結果から、14-DHEは、従来提唱されているCD4+Tregのみならず、CD8+Tregについても誘導効果を有することが示された。
[実施例13]
14-DHEのCD4 + ナイーブT細胞に対する制御性T細胞誘導効果
実施例10及び12から、14-DHEはDCの形質を変化させることにより間接的に制御性T細胞誘導作用を発揮することが示された。本実施例では、14-DHEがT細胞に直接的に作用して制御性T細胞を誘導できるか否かを明らかにするために、14-DHEをナイーブCD4+T細胞に直接作用させ、CD25+FoxP3+細胞の誘導を調べた。
14-DHEのCD4 + ナイーブT細胞に対する制御性T細胞誘導効果
実施例10及び12から、14-DHEはDCの形質を変化させることにより間接的に制御性T細胞誘導作用を発揮することが示された。本実施例では、14-DHEがT細胞に直接的に作用して制御性T細胞を誘導できるか否かを明らかにするために、14-DHEをナイーブCD4+T細胞に直接作用させ、CD25+FoxP3+細胞の誘導を調べた。
<実験方法>
BALB/cマウス脾臓由来の細胞から、CD4+CD62L+T細胞アイソレーションキットII(マウス)(ミルテニーバイオテク)を用いて、ナイーブCD4+T細胞を分離した。CD4+T細胞を5×105細胞/mLの密度で48穴プレート(1ウェルあたり2.5×105細胞)に播種し、1μg/mLの抗CD3抗体及び0.2μg/mLの抗CD28抗体を添加した。このとき、2種類の培地(TGF-βを添加したもの及び未添加のもの)を用いた。14-DHEを0、50、100、500及び1000nMで添加した。5日後に細胞を回収し、CD4+T細胞中のCD25+FoxP3+細胞の割合を、フローサイトメーターを用いて求めた。フローサイトメトリーに先立って、CD4-APC、CD25-FITC及びCD3e―PerCPを用いて細胞表面染色を行なった後、FoxP3染色バッファーセット(eBioscience)を用いて細胞膜透過処理を行ない、続いてFoxP3-PE染色を行なった。
BALB/cマウス脾臓由来の細胞から、CD4+CD62L+T細胞アイソレーションキットII(マウス)(ミルテニーバイオテク)を用いて、ナイーブCD4+T細胞を分離した。CD4+T細胞を5×105細胞/mLの密度で48穴プレート(1ウェルあたり2.5×105細胞)に播種し、1μg/mLの抗CD3抗体及び0.2μg/mLの抗CD28抗体を添加した。このとき、2種類の培地(TGF-βを添加したもの及び未添加のもの)を用いた。14-DHEを0、50、100、500及び1000nMで添加した。5日後に細胞を回収し、CD4+T細胞中のCD25+FoxP3+細胞の割合を、フローサイトメーターを用いて求めた。フローサイトメトリーに先立って、CD4-APC、CD25-FITC及びCD3e―PerCPを用いて細胞表面染色を行なった後、FoxP3染色バッファーセット(eBioscience)を用いて細胞膜透過処理を行ない、続いてFoxP3-PE染色を行なった。
<結果>
図18に示すように、TGF-β非存在下では14-DHE添加によるCD25+FoxP3+細胞比率の変化は認められなかった。TGF-β存在下では、50nMの最低濃度で、未添加の場合と比較して5倍以上のCD25+FoxP3+細胞比率の増加が認められた。
図18に示すように、TGF-β非存在下では14-DHE添加によるCD25+FoxP3+細胞比率の変化は認められなかった。TGF-β存在下では、50nMの最低濃度で、未添加の場合と比較して5倍以上のCD25+FoxP3+細胞比率の増加が認められた。
以上の結果から、14-DHEはDCに作用してその形質を変化させるだけでなく、T細胞に対して直接的に作用して、Tregを誘導し得ることが明らかになった。その有効濃度は、DCの場合(1μM)と比較して20倍以上低い。このことは、T細胞の14-DHEへの感受性が、DCよりも高いことを示し、また、ヒトに投与する場合、用量を大きく低減させることができることを示唆している。
[実施例14]
14-DHEのDC活性化抑制効果の作用タイミング及び効果持続時間
14-DHEが制御性DC誘導活性を有することを示した実施例9の実験では、14-DHEはDC分化開始と同時に添加し、LPS誘導の最終ステップまで存在していたため、14-DHEがDC分化のどのステージに作用するのか、その効果はどの位の時間、持続するのか不明であった。そこで、本実施例では、以下の点について検討する:(1)DC分化誘導開始時から14-DHEを添加する場合、効果を得るのに必要な作用時間はどの程度であるか、(2)DC分化開始後に14-DHEを添加しても、効果は得られるのか、及び(3)効果の持続時間の長さはどの程度か。
14-DHEのDC活性化抑制効果の作用タイミング及び効果持続時間
14-DHEが制御性DC誘導活性を有することを示した実施例9の実験では、14-DHEはDC分化開始と同時に添加し、LPS誘導の最終ステップまで存在していたため、14-DHEがDC分化のどのステージに作用するのか、その効果はどの位の時間、持続するのか不明であった。そこで、本実施例では、以下の点について検討する:(1)DC分化誘導開始時から14-DHEを添加する場合、効果を得るのに必要な作用時間はどの程度であるか、(2)DC分化開始後に14-DHEを添加しても、効果は得られるのか、及び(3)効果の持続時間の長さはどの程度か。
<実験方法>
上記の実施例と同様に、C57BL/6マウス骨髄細胞を調製し、Flt-3を用いてDCを誘導した。14-DHEの添加濃度は全ての場合で3μMであり、培養系における薬剤の存在時間は培地交換によって制御した。5ng/mLのLPSで炎症を誘導し、フローサイトメーターを用いてCD86の発現量を測定することにより制御性DCの形質を判定した。この際、14-DHEを添加せずLPS処理した細胞を対照として用いた。14-DHE処理細胞についてのCD86の蛍光強度中央値(Median Fluorescence Intensity:MFI)を、未処理細胞のMFIで除した値が、1以上:効果なし(スコア:-);0.7~0.99:弱い効果あり(スコア:+);0.4~0.69:中程度の効果あり(スコア:++);0.4以下:強い効果あり(スコア:+++)と判定した。
上記の実施例と同様に、C57BL/6マウス骨髄細胞を調製し、Flt-3を用いてDCを誘導した。14-DHEの添加濃度は全ての場合で3μMであり、培養系における薬剤の存在時間は培地交換によって制御した。5ng/mLのLPSで炎症を誘導し、フローサイトメーターを用いてCD86の発現量を測定することにより制御性DCの形質を判定した。この際、14-DHEを添加せずLPS処理した細胞を対照として用いた。14-DHE処理細胞についてのCD86の蛍光強度中央値(Median Fluorescence Intensity:MFI)を、未処理細胞のMFIで除した値が、1以上:効果なし(スコア:-);0.7~0.99:弱い効果あり(スコア:+);0.4~0.69:中程度の効果あり(スコア:++);0.4以下:強い効果あり(スコア:+++)と判定した。
<結果>
結果を図19に示す。図19A1~8から、DC分化開始時から14-DHEを添加した場合、強い効果を得るには分化開始から7日間添加することが必要であることが示された。5又は6日間の添加でも効果は見られるが、大きく低下した。
結果を図19に示す。図19A1~8から、DC分化開始時から14-DHEを添加した場合、強い効果を得るには分化開始から7日間添加することが必要であることが示された。5又は6日間の添加でも効果は見られるが、大きく低下した。
図19A9~11から、DC分化終了時であるDay7から14-DHEを添加した場合でも、Day0から添加した場合と同程度の強い効果が得られることが明らかになった。また、LPS添加時に14-DHEが存在しない場合、効果の低下が見られた。このことは、14-DHEの作用が炎症誘導時に生じている可能性を示唆する。
図19Bでは、14-DHEの効果の持続時間について検討した。14-DHEをDay0から添加した場合、及びDay7から添加した場合、いずれにおいても72時間以内に効果が大きく低下することが示された。
以上の結果から、(1)14-DHEの作用時間は好ましくは7日間以上であること、(2)14-DHEは分化後のDCに対して炎症性反応を抑制すること、及び、炎症刺激時に存在することが重要であること、並びに(3)効果の持続時間は72時間であることが示された。
これらのことから、14-DHEをヒトに投与する場合、14-DHEは、既に体内に存在しているDCに作用して炎症刺激を減弱させる抗炎症剤として機能することが示唆された。
[実施例15]
多発性硬化症モデルに対する14-DHEの効果
上記の実施例から、14-DHEがin vitroで抗炎症作用を有することが証明された。さらに、in vivoでの抗炎症作用について検証するため、自己免疫疾患モデルとしてしばしば用いられるマウス多発性硬化症モデル(Experimental Autoimmune Encephalomyelitic;EAE)に14-DHEを投与した。
多発性硬化症モデルに対する14-DHEの効果
上記の実施例から、14-DHEがin vitroで抗炎症作用を有することが証明された。さらに、in vivoでの抗炎症作用について検証するため、自己免疫疾患モデルとしてしばしば用いられるマウス多発性硬化症モデル(Experimental Autoimmune Encephalomyelitic;EAE)に14-DHEを投与した。
<実験方法>
C57BL/6マウス、雌性8週齢を1群5匹として以下の2群に分けた:
(1)ビヒクル群
(2)14-DHE 10μg/匹
Day0に、抗原であるミエリン稀突起膠細胞糖タンパク質35-55ペプチド(MOG35-55、オペロン)を完全フロイントアジュバント(CFA、Difco)と混合し、200μg/匹で皮内投与した。その後、Day1及びDay3に百日咳毒素(Pertussis toxin、和光純薬工業)を200ng/匹で腹腔内投与して、多発性硬化症の発症を誘発した。Day7~18に、14-DHEを10μg/匹で1日1回、腹腔内投与した。ビヒクル群には、14-DHEの溶媒である10%エタノール(和光純薬工業)/10%クレモホール(和光純薬工業)/80%PBS(Takara)を投与した。
C57BL/6マウス、雌性8週齢を1群5匹として以下の2群に分けた:
(1)ビヒクル群
(2)14-DHE 10μg/匹
Day0に、抗原であるミエリン稀突起膠細胞糖タンパク質35-55ペプチド(MOG35-55、オペロン)を完全フロイントアジュバント(CFA、Difco)と混合し、200μg/匹で皮内投与した。その後、Day1及びDay3に百日咳毒素(Pertussis toxin、和光純薬工業)を200ng/匹で腹腔内投与して、多発性硬化症の発症を誘発した。Day7~18に、14-DHEを10μg/匹で1日1回、腹腔内投与した。ビヒクル群には、14-DHEの溶媒である10%エタノール(和光純薬工業)/10%クレモホール(和光純薬工業)/80%PBS(Takara)を投与した。
実験期間中、Day0からDay20まで、疾患スコアを以下の基準で判定した:
スコア0:正常
スコア1:尻尾が自由に動かない
スコア2:正常に歩行ができない
スコア3:片側後肢の麻痺
スコア4:両後肢の麻痺
スコア5:前後肢の麻痺
スコア6:死亡
体内で炎症が起こっていると考えられるDay11に、生化学データ取得のためにマウスを解剖した。
スコア0:正常
スコア1:尻尾が自由に動かない
スコア2:正常に歩行ができない
スコア3:片側後肢の麻痺
スコア4:両後肢の麻痺
スコア5:前後肢の麻痺
スコア6:死亡
体内で炎症が起こっていると考えられるDay11に、生化学データ取得のためにマウスを解剖した。
(1)脾臓細胞を調製し、2μM MOG再刺激あり/なしで7日間培養した。培養上清を回収し、IFN-γ及びTNF-α産生量をELISA法を用いて測定した。
(2)脾臓細胞及び所属リンパ節(腋化、鼠頸部)細胞を調製し、2μM MOG再刺激ありで3日間培養した。1μL/mLのGolgi plug(ベクトンディッキンソン)を添加し、さらに4.5時間インキュベートした。細胞を回収し、CD4-PerCP、CD3-APC-Cy7で細胞表面染色を行なった。次に、Cytofix/CytoPermキット(ベクトンディッキンソン)を用いて細胞膜透過処理を行ない、TNF-α-FITC、IL-17-PE、IL-10-APC、IFN-γ-PE-Cy7抗体で細胞内サイトカイン染色を行なって、CD4+T細胞の細胞内サイトカイン陽性率をFACSを用いて測定した。
(3)所属リンパ節細胞及び脾臓細胞を、CellTrace CFSE Proliferationキット(Molecular Probes)を用いて染色した。染色した細胞を1×106細胞/mLで播種し、2μM MOG刺激ありで3日間培養した。細胞を回収後、CD3-PerCP、CD4-APCで染色し、FACS解析に供した。細胞増殖は、全体のうちのCFSE蛍光強度が低下した細胞の割合として評価した。
(4)所属リンパ節細胞及び脾臓細胞中のmDCの活性化を評価するために、細胞をFITC-I-A/I-E(MHCクラスII)、PE-CD86、PerCP-B220、APC-CD80、APC-Cy7-CD11b、PE-Cy7-CD11cで染色した。CD11b+CD11c+B220-細胞をmDCとして細胞をゲートし、活性化マーカーとしてI-A/I-E(MHCクラスII)、CD86及びCD80を測定した。
<結果>
結果を図20に示す。図20Aにおいて、14-DHE投与群では、累積疾患スコア、最大スコア、発症率のいずれにおいても低下が示され、発症の遅延も観察された。
結果を図20に示す。図20Aにおいて、14-DHE投与群では、累積疾患スコア、最大スコア、発症率のいずれにおいても低下が示され、発症の遅延も観察された。
図20Bは、Day11時点での所属リンパ節細胞及び脾臓細胞からの炎症性サイトカインの産生量を示す。14-DHE投与群では、所属リンパ節細胞でMOG抗原再刺激の有無にかかわらず炎症性サイトカインTNF-αの産生が有意に低下し、MOG抗原で再刺激された脾臓細胞からのTNF-αの産生も低下した。IFN-γについては、所属リンパ節細胞でMOG抗原再刺激なしの場合に有意な低下が見られ、MOG抗原再刺激ありの場合に両者の細胞で低下傾向が見られた。
図20Cは、所属リンパ節細胞及び脾臓細胞中のCD4+T細胞によるサイトカイン産生を示す。TNF-α及びIFN-γについて、リンパ節細胞及び脾臓細胞の両者で14-DHE投与群での産生の有意な低下が見られた。また、IL-17について、脾臓細胞で14-DHE投与により産生の有意な低下が観察された。
図20Dは、所属リンパ節細胞及び脾臓細胞でのCD4+T細胞の増殖率を示す。脾臓細胞ではMOG抗原再刺激の有無にかかわらず14-DHE投与群で有意な低下が見られ、リンパ節細胞でも低下傾向が観察された。このことから、14-DHE投与によって炎症性T細胞の増殖が抑制されていることが示された。
図20Eは、Day11での解剖の時点での、リンパ節及び脊髄における抗原提示細胞であるmDCの活性化を示す。リンパ節においては、DC活性化の指標であるI-A/I-E(MHCクラスII)及びCD86の低下傾向が見られ、CD80については有意な低下が観察された。脊髄では、I-A/I-Eの有意な低下が見られた。このことから、14-DHEによる炎症性T細胞増殖抑制は、抗原提示細胞の不活性化を介したものであると推測することができる。
以上の結果から、14-DHEは、in vivoにおいても、多発性硬化症をはじめとする自己免疫疾患に対する抑制効果を有することが示された。
[実施例16]
14-DHEのヒト制御性DC誘導活性
上記の実施例により、14-DHEは、マウスDCに対して、細胞表面での成熟化因子の発現低下をもたらし得ることが明らかとなった。本実施例では、ヒトDCに対する14-DHEの作用を評価した。
14-DHEのヒト制御性DC誘導活性
上記の実施例により、14-DHEは、マウスDCに対して、細胞表面での成熟化因子の発現低下をもたらし得ることが明らかとなった。本実施例では、ヒトDCに対する14-DHEの作用を評価した。
<実験方法>
ヒト末梢血から、Ficoll-Paque(GEヘルスケア)を用いた密度勾配遠心により単核球を調製した。これを抗ヒトCD14 MACSビーズ(ミルテニーバイオテク)でポジティブセレクションすることにより、CD14陽性細胞を取得した。CD14陽性細胞を、組み換え型ヒトGM-CSF(800U/mL、Leukine、Berlex)及び組み換えヒトIL-4(100ng/mL、Peprotech)を添加した、10%FBS(Invitrogen)、50μmol/L 2-メルカプトエタノール(和光純薬工業)、50U/mLペニシリン、50μg/mLストレプトマイシン(Gibco)を含むRPMI1640培地(シグマアルドリッチ)中で培養した。培養中は、2日に一度、培地交換を行なった。培養7日目に、1μM、3μM又は10μMの14-DHEを添加した。対照には、関連物質である10μMのエルゴステロールを添加した。また、陰性対照には、14-DHEの溶媒である1%エタノールを添加した。培養8日目に細胞を回収し、細胞数をカウントし、上記培地に3×105細胞/mLの密度で懸濁した。細胞懸濁液に、1μg/mLのLPS及び100ng/mLのIFN-γ(いずれもシグマアルドリッチ)、又はサイトカインカクテル(1μg/mL PGE2(シグマアルドリッチ)、10ng/mL TNF-α、2μg/mL IL-6及び10ng/mL IL-1β(いずれもBDバイオサイエンス))を添加して24時間培養した。培養後、CD86、HLA-DR及びCD80について細胞を染色した。抗体は全てBDバイオサイエンス社製のものを用いた。FSC及びSSCによりDCのゲートを設定し、これらの細胞表面マーカーの発現レベルを解析した。
ヒト末梢血から、Ficoll-Paque(GEヘルスケア)を用いた密度勾配遠心により単核球を調製した。これを抗ヒトCD14 MACSビーズ(ミルテニーバイオテク)でポジティブセレクションすることにより、CD14陽性細胞を取得した。CD14陽性細胞を、組み換え型ヒトGM-CSF(800U/mL、Leukine、Berlex)及び組み換えヒトIL-4(100ng/mL、Peprotech)を添加した、10%FBS(Invitrogen)、50μmol/L 2-メルカプトエタノール(和光純薬工業)、50U/mLペニシリン、50μg/mLストレプトマイシン(Gibco)を含むRPMI1640培地(シグマアルドリッチ)中で培養した。培養中は、2日に一度、培地交換を行なった。培養7日目に、1μM、3μM又は10μMの14-DHEを添加した。対照には、関連物質である10μMのエルゴステロールを添加した。また、陰性対照には、14-DHEの溶媒である1%エタノールを添加した。培養8日目に細胞を回収し、細胞数をカウントし、上記培地に3×105細胞/mLの密度で懸濁した。細胞懸濁液に、1μg/mLのLPS及び100ng/mLのIFN-γ(いずれもシグマアルドリッチ)、又はサイトカインカクテル(1μg/mL PGE2(シグマアルドリッチ)、10ng/mL TNF-α、2μg/mL IL-6及び10ng/mL IL-1β(いずれもBDバイオサイエンス))を添加して24時間培養した。培養後、CD86、HLA-DR及びCD80について細胞を染色した。抗体は全てBDバイオサイエンス社製のものを用いた。FSC及びSSCによりDCのゲートを設定し、これらの細胞表面マーカーの発現レベルを解析した。
<結果>
図21に示すように、ヒトDC上のMHCクラスII分子であるHLA-DR並びに共刺激分子であるCD80及びCD86の細胞表面発現レベルは、14-DHE処理により低下した。対照であるエルゴステロールは、これらの分子の細胞表面発現レベルに影響を及ぼさなかった。
図21に示すように、ヒトDC上のMHCクラスII分子であるHLA-DR並びに共刺激分子であるCD80及びCD86の細胞表面発現レベルは、14-DHE処理により低下した。対照であるエルゴステロールは、これらの分子の細胞表面発現レベルに影響を及ぼさなかった。
以上の結果から、14-DHEは、ヒト細胞においても、DC上の成熟化因子の細胞表面発現を抑制する作用を有していることが明らかになった。
14-DHEを用いたこれらの実験の結果は、上記実施例において証明された穀類植物由来材料発酵物処理物の免疫調節作用が、14-DHEによりもたらされたものであることを強く支持しており、また14-DHEは新規な免疫調節剤として利用できるものであることを示している。
本発明によれば、炎症反応の予防及び改善に用いることができる新規な食品由来材料が提供される。したがって、本発明は、健康科学分野、医療分野及び食品分野において有用性を有する。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
Claims (32)
- 穀類植物由来材料を麹菌を用いて発酵させることにより得られる、穀類植物由来材料発酵物又はその処理物。
- 前記穀類植物由来材料が、穀類植物種子の外皮を含む、請求項1に記載の発酵物又はその処理物。
- 前記穀類植物がイネ科植物より選択される1種以上である、請求項1又は2に記載の発酵物又はその処理物。
- 前記穀類植物がコムギである、請求項1~3のいずれか1項に記載の発酵物又はその処理物。
- 前記麹菌がアスペルギルス属糸状菌である、請求項1~4のいずれか1項に記載の発酵物又はその処理物。
- 前記麹菌が黒麹菌である、請求項1~5のいずれか1項に記載の発酵物又はその処理物。
- 発酵後にさらにエタノール抽出によるエタノール溶解画分の分離に供してある、請求項1~6のいずれか1項に記載の発酵物又はその処理物。
- エタノール抽出に続いてヘキサン分画によるヘキサン溶解画分の分離に供してある、請求項7に記載の発酵物又はその処理物。
- 14-デヒドロエルゴステロールを含有する、請求項1~8のいずれか1項に記載の発酵物又はその処理物。
- 抗原提示細胞を修飾する作用を有する、請求項1~9のいずれか1項に記載の発酵物又はその処理物。
- 請求項1~10のいずれか1項に記載の発酵物又はその処理物を含む、抗原提示細胞修飾用組成物。
- 請求項1~10のいずれか1項に記載の発酵物又はその処理物を含む飲料又は食品。
- 請求項1~10のいずれか1項に記載の発酵物又はその処理物を含む免疫調節剤。
- 穀類植物由来材料を麹菌を用いて発酵させるステップ、発酵生成物をエタノール抽出するステップ、及びエタノール抽出物をヘキサン分画するステップを含む、穀類植物由来材料発酵物処理物の調製方法。
- 前記穀類植物由来材料が、穀類植物種子の外皮を含む、請求項14に記載の方法。
- 前記穀類植物がイネ科植物より選択される1種以上である、請求項14又は15に記載の方法。
- 前記穀類植物がコムギである、請求項14~16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記麹菌がアスペルギルス属糸状菌である、請求項14~17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記麹菌が黒麹菌である、請求項14~18のいずれか1項に記載の方法。
- 被験体から採取した細胞に、請求項1~10のいずれか1項に記載の発酵物又はその処理物を接触させるステップを含む、抗原提示細胞を修飾する方法。
- 被験体から採取した細胞に、請求項1~10のいずれか1項に記載の発酵物又はその処理物を接触させるステップを含む、制御性樹状細胞の製造方法。
- 請求項1~10のいずれか1項に記載の発酵物又はその処理物を含有する、免疫疾患の予防又は治療のための医薬組成物。
- 14-デヒドロエルゴステロールを含有する免疫調節剤。
- 被験体から採取した細胞に、14-デヒドロエルゴステロールを接触させるステップを含む、抗原提示細胞を修飾する方法。
- 被験体から採取した細胞に、14-デヒドロエルゴステロールを接触させるステップを含む、制御性樹状細胞の製造方法。
- 14-デヒドロエルゴステロールを含有する、免疫疾患の予防又は治療のための医薬組成物。
- 14-デヒドロエルゴステロールを含有し、抗原提示細胞を修飾する作用を有する、麹菌発酵物又はその処理物。
- 請求項27に記載の麹菌発酵物又はその処理物を含有する組成物。
- 被験体から採取した細胞に、請求項1~10のいずれか1項に記載の発酵物又はその処理物を接触させるステップを含む、制御性T細胞の製造方法。
- 被験体から採取した細胞に、14-デヒドロエルゴステロールを接触させるステップを含む、制御性T細胞の製造方法。
- 14-デヒドロエルゴステロールを含有する、制御性T細胞誘導剤。
- 14-デヒドロエルゴステロールを含有する、炎症性T細胞増殖抑制剤。
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