JP2011168573A

JP2011168573A - フコキサンチン由来の免疫賦活剤、活性化酸素阻害剤又は血管新生抑制剤

Info

Publication number: JP2011168573A
Application number: JP2010055094A
Authority: JP
Inventors: Kunio Suetsuna; 邦男末綱
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-02-22
Filing date: 2010-02-22
Publication date: 2011-09-01

Abstract

【課題】フコキサンチンを有効成分とする免疫賦活剤、活性化酸素阻害剤又は血管新生抑制剤を提供する。
【解決手段】オキナワモズクを凍結乾燥、更に微粉砕した後、イソプロパノール処理し、合成吸着樹脂カラムクロマトグラフィーで分離分画して得たフコキサンチンは、免疫賦活作用、活性化酸素阻害作用又は血管新生抑制作用を有し、毒性も極めて低い。
【選択図】なし

Description

本発明は、フコキサンチンを有効成分とする免疫賦活剤、活性化酸素阻害剤又は血管新生抑制剤に関する。

フコキサンチンは免疫賦活剤、活性化酸素阻害剤又は血管新生抑制剤としての利点を持つ。
特許第２０１５８０５号特許第２８６３８９８号特許第２８７３４３４号特許第３８１１９２２号特許第２６７８１８１号特許第２８３５５０号特許第２８６０６３７号特許第２９０３４６４号特許第２９０３４６５号特許第２９２０８２７号特許第３１０１８７５号Ｈ．Ｍａｅｄａｅｔａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，３３２，３９２−３９７（２００５）細川：バイオインダストリー，２１巻，５２−５７頁（２００４年）Ｉ．Ｋｏｎｉｓｈｉｅｔａｌ．：ＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．ＰａｒｔＣ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ＆ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４２，５３−５９（２００６）Ｊ．Ｌ．Ｄｅｃｋｅｒｅｔａｌ．：Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１０１，８１０−８２４（１９８４）ＭｃＣｏｒｄ，Ｊ．Ｍ．＆Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ，Ｉ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４４，６０４９（１９６９）Ｊ．Ｆｏｌｋｍａｎ：Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２８５，１１８２−１１８６（１９７１）Ｍ．Ｊ．Ｃｒｏｄｄ，Ｊ．Ｄｉｘｅｌｉｕｓ，Ｔ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｌ．Ｃｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈ：ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２８，４８８−４９４（２００３）Ｊ．Ｍ．Ｓｃｈｌａｅｐｐｉ，Ｊ．Ｍ．Ｗｏｏｄｓ：ＣａｎｃｅｒＭｅｔａｓｔａｓｉｓＲｅｖ．，１８，４７３−４８１（１９９９）Ａ．Ｊ．Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｔａｌ．：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１４，５９９（１９６８）藤原等：栄食誌，４３巻（３号），２０３−２０８頁（１９９０年）受田等、日本農芸化学会誌，７２巻，１１８１頁（１９９８年）Ｅ．Ｔ．Ｂｉｓｈｏｐ，Ｎ．Ｄｅｎｇｓ：Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，３（４），３３５−３４４（２０００）

フコキサンチンは、天然色素の一種であるカロテノイドに含まれる化合物の一つであり、海藻、特に褐色の掲藻類に多く含まれている。近年、フコキサンチンのもつ様々な生理機能が脚光を浴び、抗肥満作用［非特許文献１］やガン細胞に対するアポトーシス誘導作用［非特許文献２，３］等の報告がなされてきた。しかしながら、フコキサンチンが下記で説明する免疫賦活作用、活性化酸素阻害作用又は血管新生抑制作用を有することは知られていない。

摂取された食品は消化管の中で分解、吸収される過程で宿主免疫系への種々の影響を与えることが知られている［非特許文献４〕。宿主の免疫反応は免疫担当細胞てあるリンパ球及びマクロファージから分泌される生理活性物質によって調節、制御されているが、食品成分中にも宿主免疫系を調節する物質の存在が知られている。すなわち免疫応答系を調節する本来の生体内物質としてインターロイキンをはじめとするサイトカインと呼ばれるポリペプチドに対して、食品蛋白質由来の外因性免疫賦活剤として発明者等は多くの免疫賦活ペプチド［特許文献１〜４］を報告してきた。一方、天然物由来の生理活性物質て免疫調節機能を持つものは多くはなく、未だ医薬品としての開発が進んでいるとの報告はなく、更に本発明におけるフコキサンチンに免疫賦活作用を持つことは未だ知られていない。

活性化酸素が関与する疾病は、火傷、関節炎などの炎症、再環流障害、抗癌剤の副作用、放射線障害、消化性潰瘍、細菌性ショック、悪液質、自己免疫疾患等幅広く存在する。好中球やマクロファージ等の活性化によって、発生する大量の活性化酸素が引き起こす疾患は、すべて対象となる。一般に、酸素には動物に必須の酸素（三重項酸素分子：^３Ｏ_２）と、特定の条件あるいは体の不調時に生じるラジカル（活性化酸素）とが存在する。ラジカルは直接又は間接的（過酸化反応という形で）に細胞膜、細胞内顆粒膜、あるいはＤＮＡをはじめ種々の細胞成分を変質、損傷させたりする。このラジカルは体内で生産され、その種類はスーパーオキシドアニオン（⁻Ｏ_２・）、一重項酸素（^１Ｏ_２・）、水酸化ラジカル（・ＯＨ）等が存在する。このうちスーパーオキシドアニオン（⁻Ｏ_２・）は細胞膜の不飽和脂肪酸等に作用して過酸化反応を引き起こし、脂質に対する酸化力は動物に必須な酸素の数千倍も高いといわれている。活性化酸素阻害剤としてのスーパーオキシドジムスターゼ（ＳＯＤ、酵素番号ＥＣｌ．１５．１．１）は、１９６９年マクコルド等［非特許文献５］によってその作用が発見された酵素であり、酸素分子が一電子還元されて生じるスーパーオキシドアニオン（⁻Ｏ_２・）を不均化する
２⁻Ｏ_２・＋２Ｈ^＋→ Ｈ_２Ｏ_２＋Ｏ_２
を触媒する。人体が正常なときにはＳＯＤが働いてスーパーオキシドアニオンの発生を抑えている。このＳＯＤ活性は加齢と共に低下し、すなわち壮年期から老年期になると活性が低下し、ＳＯＤ活性の増減は生体の老化、癌化のバロメーターともいわれている。このようなＳＯＤ活性が低下するとラジカルの発生は抑えにくくなりＳＯＤを摂取補強するか、又はラジカルを捕捉除去する活性化酸素阻害剤の摂取が必要となってくる。今日、抗癌、老化防止に対する特効薬がない状況で、環境中からＤＮＡ損傷因子、突然変異因子、発癌因子、老化因子等を取り除き不活性化し、活性化酸素フリーラジカル消去作用並びに抗酸化作用を示す天然物由来の生理活性物質に関する研究や検討が進められており、本発明者等はこれまで活性酸素阻害ペプチド［特許文献５〜１１］を報告してきてはいるが、未だ医薬品としての開発が進んでいるとの報告はなく、更に本発明におけるフコキサンチンに活性酸素阻害作用を持つことは未だ知られていない。

血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）は、既存の血管から新しい血管が形成される現象である。通常、血管新生の促進と抑制の両バランスは保たれているが、バランスが促進側に傾くと、血管新生が惹起される。血管新生と腫瘍の関りとして、腫瘍がある一定以上の大きさ（１〜２ｎｍ^３）になるには、腫瘍に栄養成分や酸素を供給するため血管新生が必要であることが唱えられ、血管新生の抑制による制ガンの可能性が始めて示唆された［非特許文献６］。その後、血管内皮細胞の培養系確立に伴い、血管新生研究が本格化し、種々の血管新生促進因子として、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ：ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤＥＣＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ：ｐｌａｔｅｌｅｔｄｅｒｉｖｅｄｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、腫瘍懐死因子（ＴＮＦ−α：ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｔｉｃｆａｃｔｏｒ−α）、インターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ８，ＩＬ８）等が次々に同定されてきた。腫瘍血管は、血管周皮細胞（ペリサイト）の欠如あるいは減少により、血管新生因子、特にＶＥＧＦの影響を受け易い状態にある。このため、未成熟な新生血管の形成が繰り返し行われている。腫瘍血管新生のメカニズムは、腫瘍などから分泌されたＶＥＧＦが内皮細胞、特にペリサイトが失われている内皮細胞膜上のＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）に結合し、ＶＥＧＦＲのチロシンキナーゼドメインの活性化、自己リン酸化、細胞内シグナル伝達を経て、内皮細胞の増殖・遊走・管腔形成につながると考えられている［非特許文献７］。従って、血管新生抑制の観点からＶＥＧＦは最も有望な治療ターゲットといえる［非特許文献８］。このような背景のもとで開発されている血管新生抑制剤として特に注目を浴びている、例えば、組み換えヒト抗ＶＥＧＦであるアバスチン（米国ジェネンテック社製）やＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）チロシンキナーゼ阻害剤であるイレッサ（アストラゼネカ社製）等が使用されてきてはいるが、細胞毒性が高く、副作用の発生が懸念されており、このような疾病の予防又は治療にあたっては、長期間に継続して行うことが必要なため、より効果的な血管新生の抑制と副作用の回避との両方を達成し得る血管新生抑制剤の開発が望まれている。

本発明者等は、天然物由来のフコキサンチンが強い免疫賦活作用、活性酸素阻害作用又は血管新生抑制作用を有することを見出し、これらフコキサンチンを医薬品として実用化するための研究を鋭意行った。その結果、これらフコキサンチンが免疫賦活剤、活性酸素阻害剤又は血管新生抑制財としての有用性を見出した。本発明は係る知見に基づくものである。以下に本発明を詳細に説明する。

本発明で用いられるフコキサンチンは、その化学式がＣ_４２Ｈ_５８Ｏ_６（ＭＷ＝６５８．９１）公知の物質であり、純度の高いものは橙色の柱状化結晶構造を有す。
フコキサンチンを天然物から抽出する場合、その原料は特に限定されないが、例えば、海藻類が挙げられる。海藻類は特に限定されないが、例えば、コンブ、ワカメ、アラメ、ホンダワラ、アカモク、ヒジキ等の褐藻類を用いることが望ましい。

上記褐藻類からフコキサンチンを得る抽出方法は特に限定されないが、例えば、極性有機溶媒、水と極性有機溶媒の混合液等の極性溶媒と原料とを接触させることによりなされる。極性有機溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ブタノール、イソプロパノール等の炭素数１〜５の低級アルコール；プロピレングリコール；アセトン；酢酸エチル；ヘキサン；ジクロロメタン；クロロホルム等の単独あるいは２種類以上の組み合わせを挙げることが出来る。抽出方法は常法により行えばよい。例えば、原料に対し１．５〜１５０倍容の上記抽出溶媒を加え、原料を浸漬、撹拌することにより、フコキサンチンの抽出が容易となる。抽出されたフコキサンチンは、減圧蒸留、減圧濃縮等により有機溶媒を取り除くことが好ましい。又、必要に応じて、更に、減圧乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥等の乾燥処理に施すこともできる。

上記で得られたフコキサンチンを含む褐藻類由来の着色成分は、次に、合成吸着樹脂に吸着させ、その後、当該樹脂から濃度勾配を用いた有機溶媒で選択的にフコキサンチンを溶離させる。ここで用いられる合成吸着樹脂は、フコキサンチンを吸着させることが可能であれば、特に種類を制限するものでないが、例えば、スチレンジビニルベンゼン系合成樹脂（三菱化学社製ダイヤイオンＨＰ、セパビーズＳＰ、オルガノ社製アンバーライトＸＡＤ）、メタクリル系合成樹脂（三菱化学社製ダイヤイオンＨＰ−ＭＧ、オルガノ社製アンバーライトＸＡＤ−ＨＰ）等を使用することができる。次に、フコキサンチンを含む掲藻類由来の着色成分を吸着させた合成吸着樹脂から溶離液を用いて選択的にフコキサンチンを溶離する。この溶離液の例としては、メタノール、エタノール等のアルコール類、アセトン等のケトン類等の有機溶媒、少なくとも１種以上又は有機溶媒と水との混液が挙げられ、これら溶離液を組み合わせた濃度勾配法でフコキサンチンを選択的に溶離する。

本発明に係るフコキサンチンは、静脈内への繰り返し投与を行った場合、抗体産生を惹起せず、アナフィラキシーショックを起こさせない。又、これらフコキサンチンは投与後、生体内の分解酵素により徐々に分解される為、毒性は極めて低く安全性は極めて高い（ＬＤ_５０＞６０ｍｇ／ｋｇ：ラット経口投与）。これらフコキサンチンは、通常用いられる賦形剤等の添加物を用いて注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等に調整することができる。投与法としては、通常は免疫不全症又は活性化酸素が関与する疾病を有している哺乳類（例えば、ヒト、イヌ、ラット等）に注射すること、あるいは経口投与することがあげられる。投与量は、例えば、動物体重１ｋｇ当たりこれらフコキサンチンを０．１〜１０ｍｇの量である。投与回数は、通常、１日１〜４回程度であるが、投与経路によって、適宜、調整することができる。上記の各種製剤において用いられる賦形剤、結合剤、滑沢剤の種類は、特に限定されず、通常の注射剤、散剤、顆粒剤、錠剤あるいはカプセル剤に用いられるものを使用することができる。

錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤に用いる添加剤としては、下記のものをあげることができる。賦形剤としては、結晶セルロース等の糖類、マンニトール等の糖アルコール類、でんぷん類、無水リン酸カルシウム等；結合材としてはでんぷん類、ヒドロキシルプロピルメチルセルローズ等；崩壊剤としてはカルボキシメチルセルロース及びそのカリウム塩類；滑沢剤としてはステアリン酸及びその塩類、タルク、ワックス類をあげることができる。又、製剤の調整にあたっては、必要に応じメントール、クエン酸およびその塩類、香料等の矯臭剤を用いることができる。注射用の無菌組成物は、常法により、本発明に係るフコキサンチンを、注射用水、生理食塩液及びキシリトールやマンニトールなどの糖アルコール注射液、プロピレングリコールやポリエチレングリコール等のグリコールに溶解又は懸濁させて注射剤とすることができる。この際、緩衝液、防腐剤、酸化防止剤等を必要に応じて添加することができる。これらフコキサンチンを含有する製剤は凍結乾燥品又は乾燥粉末の形とし、用時、通常の溶解剤、例えば、水又は生理食塩液にて溶解して用いることもできる。

本発明に係るフコキサンチンは、優れた免疫賦活作用を有し、これらフコキサンチンをウサギに経口投与すると、末梢血リンパ球のコンカナバリンＡ（以下、ＣｏｎＡと略記する）刺激に対する幼若化反応が有意に上昇し、又、これらフコキサンチンをＣ５７ＢＬ／６マウスに経口投与すると抗体産生能が上昇した。更に、これらフコキサンチンのｉｎｖｉｔｒｏにおける優れた免疫賦活作用として、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスより得た脾細胞に対してこれらフコキサンチンは強い幼若化能（マイトジェン活性）を示した。

本発明に係るフコキサンチンは、優れた活性化酸素フリーラジカル消去作用並びに抗酸化作用を有し、活性化酸素阻害作用を示すことから、組織障害を引き起こす過剰な活性酸素を分解して組織を守る作用を持ち、例えば、抗炎症剤として関節炎やリュウマチ等に有効であるほか、ベーチュット病、心筋梗塞等に対しても有用である。

本発明に係るフコキサンチンは、固形ガンが既存の血管から新しい血管を誘引し、栄養分や酸素を得て増殖するとともに、血管系に進入して別の場所へ転移することを抑制することができることから、ガンの成長を特異的に抑制することができる。

発明を実施するための最良の形態・実施例

（１）本発明は、医薬品として有用性を有する本発明に係るフコキサンチンを有効成分とする免疫賦活剤に関する。
（２）本発明は、医薬品として有用性を有する本発明に係るフコキサンチンを有効成分とする活性化酸素阻害剤に関する。
（３）本発明は、医薬品として有用性を有する本発明に係るフコキサンチンを有効成分とする血管新生抑制剤に関する。
以下に実施例として、製造例及び試験例を記載し本発明を更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

製造例１
生オキナワモズク３０ｋｇを凍結乾燥にかけ、凍結乾燥オキナワモズクを得、更にジェットミルを用い凍結乾燥したオキナワモズクを微粉砕化し、メッシュ２００以上のオキナワモズク粉末１．４ｋｇを得た。微粉砕化されたオキナワモズク粉末に。等量の７０％エタノールを加え撹拌してホモジネイト液を得た。このホモジネイト液を１規定の塩酸にてｐＨ２．０に調整して、生じる沈殿物（主に、アルギン酸）を超遠心分離機（シャープレス）にて遠心分離（５，０００〜１５，０００ｒｐｍ）し、沈殿物（主に、アルギン酸）を除去した。次に、アルギン酸除去された遠心上清液に対し、冷所（５℃）にて５％〜９５％のイソプロパノール分画を行った。その後、再度、遠心分離（５，０００〜１５，０００ｒｐｍ）し遠心上清液を得た。このようにイソプロパノール分画によって得られた上清液を減圧濃縮して、イソプロパノール除去した。前記工程で得られたモズクエキス５００ｍＬを、予め脱イオン水で平衡化していた三菱化学製ダイヤイオンＨＰ２０カラム（カラムサイズ；６０×１００ｃｍ）に負荷した。脱イオン水でカラムを十分洗浄後、溶離液としてアセトン水を用い濃度勾配法でカラムクロマトグラフィーした。溶離してきたフコキサンチン画分を集めて減圧濃縮乾固してメタノールに溶解した後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行った。ＨＰＬＣ条件は、カラムとして野村化学社製ＤｅｖｅｌｏｓｉｌＯＤＳ−５（φ４．６ｍｍＩＤ×２５０ｍｍＬ）を使用し、カラム温度：４０℃、移動相として（Ａ）メタノール：０．５Ｍ酢酸アンモニウム溶液（ｐＨ＝７．２）＝８０：２０から（Ｂ）アセトニトリル：水＝９０：１０での濃度勾配法により、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長４４５ｎｍでクロマトグラフィー処理し、溶出時間９．４分にフコキサンチンのピークを得た。これら分離精製によって得られた本発明に係るフコキサンチンは、以下に示す試験によって薬理効果が確認された

試験例１

（ウサギ末梢血リンパ球のコンカナバリンＡ刺激に対する幼若化反応の測定）ウサギは成熟雄性日本白色種（ＫＢＬ：ＪＷ、ＳＰＦ、体重２．０ｋｇ）を（株）北山ラベスより購入し、１週間予備飼育を行った後、健常な動物を試験に供した。飼育は温度２３±２℃、湿度５５±１０％に保った飼育室内の金属製個別ゲージで行った。飼料はオリエンタル酵母社製ＲＣ４を１日１２０ｇ給餌し、水は自家揚水（水道法、水質基準適合）を自由に摂取させた。１群３例のウサギを用い、製造例１におけるフコキサンチン２０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙを体重１ｋｇ当たり５ｍＬの割合で３０日間連続投与した。対照群には同容量の溶媒を投与した。投与開始日並びに最終投与の翌日、各ウサギの耳静脈からヘパリン処理した注射器で１０ｍＬの血液を採取し、３時間以内に、リンパ球分離並びに^３Ｈ−サイミジン取り込み能測定法による幼若化反応を実施した。各リンパ球の取り込んだ放射能から次式により刺激指数（Ｓ．Ｉ．）を算出した。
Ｓ．Ｉ．＝（ＣｏｎＡを加えた培養系）／（ＣｏｎＡを加えない培養系）
本発明に係るフコキサンチン（２０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を３０日間経口投与した後の、ウサギ末梢血リンパ球のＣｏｎＡ刺激による幼若化反応（Ｓ．Ｉ．値）で表わし、その結果を表１に示した。

試験例２

（マウス脾細胞の抗体産生能測定）マウスは雄性、５週齢（Ｓｌｃ：Ｃ５７ＢＬ／６、ＳＰＦ）を日本エスエルシー（株）より購入し、１週間予備飼育を行った後、健常な動物を試験に供した。マウスの飼育は温度２３±２℃、湿度５５±１０％に保った飼育室内のエアコンゲージで行った。飼料はオリエンタル酵母社製ＭＦ、水は自家揚水（水道法、水質基準適合）を自由に摂取させた。１群３例のマウスを用い、製造例１におけるフコキサンチン２０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙを体重１０ｇ当たり０．１ｍＬの割合で１０日間連続経口投与した。投与開始から５日後、それぞれのマウスの尾静脈にヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ、デンカ生研社製）５×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌを０．２ｍＬ投与して免疫した。免疫の５日後、各群のマウスから脾臓を採取し、Ｅａｇｌｅ’ｓｍｉｎｉｍａｌｅｓｓｅｎｔｉａｌｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＮ、日水製薬社製）を入れたシャーレ内で脾細胞を遊離させた。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で３回洗浄した後、ＥＭＥＭで２．５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した脾細胞と５０％ＳＲＢＣ浮遊液及びモルモット乾燥補体（デンカ生研社製）を８：１：１の割合で混合した。Ａ．Ｊ．Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ等の方法〔非特許文献９〕に準じて３７℃で９０分反応後、溶血斑（ＰＦＣ；ｐｌａｑｕｅｆｏｒｍｉｎｇｃｅｌｌ）を計測した。本発明に係るフコキサンチン（２０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を１０日間経口投与したマウス脾細胞での抗体産生能を抗体産生細胞数で表わし、その結果を表２に示した。

試験例３

（マウス脾細胞幼若化能の測定）藤原等の方法〔非特許文献１０〕に準じて脾細胞の幼若化反応（マイトジェン活性）を測定した。製造例１におけるフコキサンチンを、２５ｍＭＨＥＰＥＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）に対して溶解（最大濃度１ｍｇ／ｍＬ）し、０．２μのフィルター濾過滅菌後、同培地により２倍ごと段階希釈を行ったものを供試サンプルとした。Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス（６週齢、雄性）の脾臓を無菌的に摘出し、ワイヤーメッシュ上で２５ｍＭＨＥＰＥＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地を滴下しながら穏やかに磨砕し、通過液をさらにもう一組のワイヤーメッシュを通すことにより単一細胞浮遊液を調製した。脾細胞は同培地にて３回洗浄後、牛胎児血清１０％を含む２５ｍＭＨＥＰＥＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊させ、９６ウェルマイクロプレートに５×１０５個／１００μＬ／ウェルとなるように分注した。その後、前記の供試サンプル１０μＬを加え、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養した。尚、陰性対照には２５ｍＭＨＥＰＥＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地１０μＬを、陽性対照にはコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ、終濃度１μｇ／ｍＬ）並びにリポポリサッカライド（ＬＰＳ、終濃度１００μｇ／ｍＬ）を供試サンプルの代わりに加えている。その後、０．５％の３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５ジフェニル−２Ｈテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）溶液を１０μι加え、さらに３時間培養を行い、しかる後、生じたＭＴＴ−フォルマザンを酸−イソプロパノール溶液（０．０４Ｎ濃度に塩酸を添加）１００μＬを加えて溶解し、ＥＩＡリーダーにて５９５ｎｍの吸光度を測定した。データは陰性対照の値を１００とした相対値にて表示している。本発明に係るフコキサンチンのマイトジェン活性の結果は表３に示した。

試験例４

（活性化酸素フリーラジカル消去作用の測定）受田等の方法［非特許文１１］に従って測定した。即ち、２．５ｍＬの緩衝液（５０ｍＭ）が入った試験管に３ｍＭキサンチン、３ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＸＴＴ及び試料溶液をそれぞれ０．１ｍＬ加え、直ちにトリガーとして５７ｍＵ／ｍＬＸＯＤを０．１ｍＬ加えた。２５℃で正確に２０分間反応させた後、４７０ｎｍにおける吸光度を測定した。活性化酸素フリーラジカル（スーパーオキシドアニオン）によるＸＴＴの還元を５０％阻害する濃度をＩＣ_５０値とした。その結果、本発明に係るフコキサンチンの活性化酸素フリーラジカル消去活性すなわち活性化酸素阻害活性（ＩＣ_５０値）は、２．３４×１０^−６である。

試験例５

（血管新生抑制作用）Ｔ．Ｂｉｓｈｏｐ等の方法［非特許文献１２］により開発された倉敷紡績（株）製血管新生キット（ＡｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ）を用いた。培養操作：ウェル培地中の本発明に係るフコキサンチンの最終濃度が３５μｇ／ｍＬとなるよう、及びウェル培地中ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子：ＶａｓｃｕｌａｒＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ）の最終濃度が１０ｎｇ／ｍＬとなるよう調製した培地を３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で培養し、４日目、７日目、及び９日目で新しい培地への交換を行った。細胞層の固定と染色方法：培養開始１１日目に、各ウェルに対し、管腔染色キット（ＣＤ３１染色用）を用いて染色を行った。即ち、１次抗体添加後インキュベート（３７℃、６０分間）、次に２次抗体添加後インキュベート（３７℃、６０分間）した後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（ブロモクロロインドリン酸／ニトロブルーテトラゾリウム）基質溶液を用いて染色し、管腔が深紫色になるまでインキュベート（３７℃）した。顕微鏡観察と画像の解析：管腔の染色画像を倉敷紡績製血管新生ソフトウェアＶｅｒ２を用いて、管腔の面積、長さ、管腔ジョイント数（分岐点の数）、管腔パス数（分岐して得られた枝の数）を、陽性対照ＶＥＧＦ添加区（コントロール）を１００％として再算出した。本発明に係るフコキサンチンのコントロールに対する％（ｎ＝３）を表４に示した。

以上の試験の結果、本発明に係るフコキサンチンは、ｉｎｖｉｔｒｏ（試験管内）、ｉｎｖｉｖｏ（生体内）において優れた免疫賦活作用を有することが確認され、免疫不全症の治療又は予防薬として有用である。更に、本発明に係るフコキサンチンは、強力な活性化酸素阻害作用を有することが確認され、活性化酸素阻害剤の対象となる虚血性心疾患者、慢性関節リュウマチ及び重症火傷患者の治療又は予防薬として有用である。更に、本発明に係るフコキサンチンは、強力な血管新生抑制作用を有することにより抗腫瘍活性を十分に発現させると同時に副作用の少ない抗ガン剤として有用である。尚、本発明に係るフコキサンチンは、構造的にそのカロテノイド類において、構造中に採用することもできる。

Claims

フコキサンチンを有効成分とする免疫賦活剤。
フコキサンチンを有効成分とする活性酸素阻害剤。
フコキサンチンを有効成分とする血管新生抑制剤。