JP2018172296A5 - - Google Patents
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Description
本発明は、焼酎製造において副成する焼酎蒸溜残液から得られる、生物学的に活性な新規なテトラペプチド化合物に関する。本発明においてテトラペプチドとは、4アミノ酸残基がペプチド結合によって環状に連結したと推定される化合物をいう。
焼酎を製造する際に副成する焼酎蒸溜残液については、大麦焼酎蒸溜残液から精製した特定の画分が有する脂肪肝抑制効果(特許文献1)、抗酸化作用(特許文献2)、血圧降下作用(特許文献3)等の種々の生理活性作用を有する画分が報告されている。また、黒糖焼酎蒸留残液からは、特定の精製画分のチロシナーゼ阻害活性(特許文献4)が報告されている。
また、生理活性を有する環状テトラペプチドとしては、免疫抑制活性(特許文献5)を有するものや、抗有糸分裂抑制活性(特許文献6)、タンパク質チロシンキナーゼ阻害活性(特許文献7)を有する環状テトラペプチドが報告されている。
The Journal of Immunology(2011)Vol.186,No.8,p.4762−4770
本発明は、有用な生理活性を有する画分が複数得られている大麦焼酎蒸溜残液から、今まで知られていない新規で有用な化合物を単離精製し、提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために、大麦焼酎蒸溜残液からの既知の有用な画分や、新たな精製工程による画分を種々作成して研究を行った結果、大麦焼酎蒸溜残液に含まれる新規テトラペプチド化合物を同定し、この化合物が活性酸素発生遺伝子(DUOX1)の発現抑制効果を有する物質であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
本発明は,以下の技術的事項から構成される。
(1)大麦焼酎蒸留残液の合成吸着剤吸着画分のエタノール溶出画分からのHPLC精製画分であって、分子量486、分子式C 24 H 30 N 4 O 7 のテトラペプチド化合物又はその薬学的に許容される塩。
(2)サイトカイン処理した正常ヒト表皮角化細胞におけるDUOX1遺伝子の発現を抑制する効果を有する、上記(1)に記載のテトラペプチド化合物又はその薬学的に許容される塩。
(3)上記(1)または(2)に記載のテトラペプチド化合物又はその薬学的に許容される塩を含む飲食品、サプリメント、または医薬品。
(1)大麦焼酎蒸留残液の合成吸着剤吸着画分のエタノール溶出画分からのHPLC精製画分であって、分子量486、分子式C 24 H 30 N 4 O 7 のテトラペプチド化合物又はその薬学的に許容される塩。
(2)サイトカイン処理した正常ヒト表皮角化細胞におけるDUOX1遺伝子の発現を抑制する効果を有する、上記(1)に記載のテトラペプチド化合物又はその薬学的に許容される塩。
(3)上記(1)または(2)に記載のテトラペプチド化合物又はその薬学的に許容される塩を含む飲食品、サプリメント、または医薬品。
本発明によれば、大麦焼酎蒸溜残液から新規なテトラペプチド化合物を提供することができる。本発明のテトラペプチド化合物は、アトピー性皮膚炎や喘息等の炎症性疾患との関連があることが知られている活性酸素制御機構のうちの活性酸素発生遺伝子(DUOX1)の発現抑制活性を有する。大麦焼酎蒸溜残液という発酵食品由来であるため毒性もなく、炎症性疾患の緩和、例えばアトピー性皮膚炎の症状の緩和や抗皮膚炎活性による美肌効果等が期待でき、食べるスキンケアとしての飲食品、医薬品としての活用が期待される。
本発明において、テトラペプチド化合物には、本発明のテトラペプチド化合物が有するDUOX1発現抑制活性を失わない範囲で、その薬学的に許容される塩、または誘導体も含まれる。薬学的に許容される塩としては、ナトリム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、硫酸塩、硝酸塩などの有機酸塩、フッ化水素酸塩、塩酸塩などのハロゲン化水素酸塩が例示される。誘導体としては、エステル化、アミド化、アシル化、カルボキシル化、ホルミル化、ホスホリル化、リン酸化、グリコシル化が例示される。
本発明のテトラペプチド化合物は、大麦焼酎蒸溜残液から単離精製して製造することができる。また、麹菌の液体及び固体培養からも単離精製して製造することができ、さらに、公知の方法で化学合成することもでき、例えば固相合成法で鎖状ペプチドを合成して製造できる。
大麦焼酎蒸溜残液を用いる場合には、大麦焼酎蒸留残液を固液分離して液体分を得てから、該液体分を合成吸着剤に吸着させる。その吸着した成分のうち20%エタノールで溶出後、40%エタノール溶出液により溶出する画分から、本発明のテトラペプチド化合物をさらに単離精製することができる。
大麦焼酎蒸留残液は、代表的には歩留まり60乃至70%の精白大麦を原料として大麦麹及び蒸麦を製造し、得られた大麦麹及び蒸麦中に含まれるでんぷんを該大麦麹の麹により糖化し、それらを酵母によるアルコール発酵に付して焼酎熟成もろみを得、得られた焼酎熟成もろみを減圧蒸留または常圧蒸留等の単式蒸留装置を用いて蒸留する際に蒸留残渣として副生する大麦焼酎の蒸留残液である。
大麦焼酎の製造に用いる大麦麹は、通常の大麦焼酎製造において行われている製麹条件で製造すればよく、用いる麹菌株としては、一般的に大麦焼酎製造で使用する白麹菌( Aspergillus kawachii) が好ましい。泡盛製造で使用する黒麹菌(Aspergillus awamori)などのAspergillus属の菌株を用いることもできる。また大麦焼酎の製造に用いる酵母は、一般的に焼酎製造の際に使用する各種の焼酎醸造用酵母を使用することができる。
大麦焼酎蒸留残液から固液分離して液体分を得ることにより、原料大麦または大麦麹由来の水不溶性の発酵残渣等を除去して清澄液を得る。固液分離は、スクリュープレス方式やローラープレス方式の固液分離方法により行うことができる。次いで、その液体分を合成吸着剤を用いる吸着処理に付して吸着させる。合成吸着剤としては、芳香族系、芳香族系修飾型、あるいはメタクリル系の合成吸着剤を用いることができ、好適な例としては、ダウ・ケミカル社製のアンバーライトFPX66、三菱化学社製のセパビーズSP850、及び同三菱化学社製のダイヤイオンHP20等が挙げられる。
その後、その合成吸着剤吸着画分を20容量%エタノールと40容量%エタノール溶出液により順次溶出させて、得られた溶出画分を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)にかける。得られたHPLCクロマトグラフの分子量486の画分をさらに精製するために、凍結乾燥させてから水に溶解させ、遠心分離後再び水で洗浄してからアセトニトリル溶液に溶解させて、再びHPLCにかけて精製することにより、本発明のテトラペプチド化合物を単離精製することができる。
本発明のテトラペプチド化合物は、炎症性疾患の緩和や治療、例えばアトピー性皮膚炎の緩和や抗皮膚炎活性による美肌のための飲食品、サプリメント、医薬品として様々な形態で利用することができる。「飲食品」には、通常の飲食品の他、経腸栄養食品、栄養機能食品、機能性表示食品、特定保健用食品などが含まれる。また、「飲食品」および「医薬品」の対象はヒトに限定されるものではなく、ペットや家畜のような哺乳動物用の医薬品および飼料も包含する。
本発明のテトラペプチド化合物は、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤などの経口用組成物とすることができる。種々の剤型の経口用組成物を製造するための各種成分および製造法は、サプリメント、医薬品等の製造分野で公知な成分から適宜選択することができる。本実施形態の錠剤には、錠剤を形成するための各種の添加剤として、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、その他の栄養素等を添加することができる。
経口用以外にも注射剤、点滴剤、外用剤、座薬剤等の非経口用投与剤としての各種製剤形態で使用できる。また、製剤中の本発明のテトラペプチド化合物の有効投与量は、治療もしくは予防すべき症状の程度、投与対象の状態(年齢、性別を含む)、剤型などによって異なる。テトラペプチド化合物の1日投与量が約10〜1000mg程度になる量とすればよい。
以下の実施例に供する目的で大麦焼酎の製造を行った。原料としては、大麦(70%精白)を用いた。
[大麦焼酎及び大麦焼酎蒸留残液の製造]
大麦を40%(w/w)吸水させ40分間蒸した後、40℃まで放冷し、大麦トンあたり1kgの種麹(白麹菌)を接種し、38℃、RH95%で24時間、32℃、RH92%で20時間保持することにより、大麦麹を製造した。1次仕込みでは、この大麦麹(大麦として3トン)に、水3.6kL及び酵母として焼酎酵母の培養菌体1kg(湿重量)を加えて1次もろみを得、得られた1次もろみを5日間の発酵(1段目の発酵)に付した。次いで、2次仕込みでは、上記1段目の発酵を終えた1次もろみに、水11.4kLと蒸麦(大麦として7トン)を加えて11日間の発酵(2段目の発酵)に付した。発酵温度は1次仕込み、2次仕込みとも25℃ とした。上記2段目の発酵を終えた2次もろみを常法により単式蒸留に付し、大麦焼酎10kLと大麦焼酎蒸留残液15kLを得た。該大麦焼酎蒸留残液を以下の実施例に用いた。
以下に、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
[大麦焼酎及び大麦焼酎蒸留残液の製造]
大麦を40%(w/w)吸水させ40分間蒸した後、40℃まで放冷し、大麦トンあたり1kgの種麹(白麹菌)を接種し、38℃、RH95%で24時間、32℃、RH92%で20時間保持することにより、大麦麹を製造した。1次仕込みでは、この大麦麹(大麦として3トン)に、水3.6kL及び酵母として焼酎酵母の培養菌体1kg(湿重量)を加えて1次もろみを得、得られた1次もろみを5日間の発酵(1段目の発酵)に付した。次いで、2次仕込みでは、上記1段目の発酵を終えた1次もろみに、水11.4kLと蒸麦(大麦として7トン)を加えて11日間の発酵(2段目の発酵)に付した。発酵温度は1次仕込み、2次仕込みとも25℃ とした。上記2段目の発酵を終えた2次もろみを常法により単式蒸留に付し、大麦焼酎10kLと大麦焼酎蒸留残液15kLを得た。該大麦焼酎蒸留残液を以下の実施例に用いた。
以下に、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
大麦焼酎製造の蒸留工程で得られた前記大麦焼酎蒸留残液を8000rpm,10minの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液の液体分を得、得られた液体分2.5Lを三菱化学社製の合成吸着剤ダイヤイオンHP20を充填したカラム(樹脂容量1L)に接触させ、当該カラムに吸着する合成吸着剤吸着画分を得た。さらに。この合成吸着剤吸着画分を吸着したカラムに脱イオン水6.25Lを接触させて得られた溶出液を除去後、該カラムに20(v/v)%nエタノール溶液2.5L、40(v/v)%のエタノール溶液2.5Lを順次接触させることにより、溶出液をそれぞれ2.5L分取した。
この溶出液を減圧濃縮して凍結乾燥させた。凍結乾燥物を0.1g/mLとなるように脱イオン水に溶解させ、Phenomenex Synergy 4 μm Hydro−RP 80Aカラム(21.2×250mm)を用いるHPLC(溶液A:0.05%TFA水溶液,溶液B:0.05%TFAアセトニトリル溶液)にかけた。分離条件は、B濃度15%、流速10mL/min、検出波長280nmとした。得られたHPLCクロマトグラフの分子量486付近の画分を分取して、再び減圧濃縮して凍結乾燥させてから、0.1g/mLとなるように脱イオン水に溶解させ、さらに遠心分離して得られた白色の沈殿物を脱イオン水で洗浄した。これを62.5%のアセトニトリル溶液に溶解させて、上記と同じ条件でHPLCにかけて精製した。
精製物の構造解析を行うため、フーリエ変換型赤外分光分析(FT−IR)、核磁気共鳴分析(NMR)、液体クロマトグラフ/質量分析(LC/MS)及びアミノ酸分析を行った。その結果、分子量が486であるL−チロシン1個、L−グルタミン酸1個及びL−プロリン2個の4アミノ酸からなると推定される新規なテトラペプチド化合物であることが判明した。
溶解性は、ジメチルスルフォキシドに易溶、水、メタノールに難溶、50%メタノールに可溶であり、分子式は、C24H30N4O7であった。
溶解性は、ジメチルスルフォキシドに易溶、水、メタノールに難溶、50%メタノールに可溶であり、分子式は、C24H30N4O7であった。
チロシン1個、グルタミン酸1個及びプロリン2個からなる環状テトラペプチド構造を推定するため、さらにLC/MS/MS分析を行った。その結果、隣接したチロシン及びグルタミン酸に由来すると推定されるプロダクトイオンd(m/z279)が検出されたことから、下記式Iまたは式IIのいずれかであると推定された。その他のプロダクトイオンについては、いずれの構造と考えても矛盾はなかった。
どちらの構造かを決定するために、それぞれを想定し、各種二次元NMRスペクトによる帰属を行った。HMBCスペクトルの結果を下記に示す。HMBCにおける1Hと13Cの遠隔相関は、通常2〜4結合にて検出される。下記に示したN−H間における遠隔相関に着目した場合、推定構造(1)のN−H間は2結合である一方で、推定構造(2)のN−H間は5結合となり、やや不自然な帰属となった。
どちらの構造かを決定するために、それぞれを想定し、各種二次元NMRスペクトによる帰属を行った。HMBCスペクトルの結果を下記に示す。HMBCにおける1Hと13Cの遠隔相関は、通常2〜4結合にて検出される。下記に示したN−H間における遠隔相関に着目した場合、推定構造(1)のN−H間は2結合である一方で、推定構造(2)のN−H間は5結合となり、やや不自然な帰属となった。
この化合物は上記構造解析結果によれば、下記式Iで示される環状テトラペプチドである可能性が高いものの、下記式IIで示される環状テトラペプチドである可能性もある。
本発明のテトラペプチド化合物のサイトカイン処理した正常ヒト表皮角化細胞におけるDUOX1遺伝子の発現抑制活性について試験した。
正常ヒト表皮角化細胞のサイトカイン処理
正常ヒト表皮角化細胞(NHEK:クラボウ)の培養には、10mLシャーレを用い、正常ヒト表皮角化細胞基礎培地(Humedia KB−2:クラボウ)に10μg/mLインスリン、0.1ng/mLヒト組換え型上皮成長因子(hEGF)、0.4%(v/v)ウシ脳下垂体抽出液、0.67μg/mLハイドロコーチゾン、50μg/mLゲンタマイシン、50ng/mLアンフォテリシン Bを添加して調製した表皮角化細胞増殖用無血清培地 (HuMedia−KG2)を用いた。凍結保存細胞を。2500cells/mLとなるように播種し、37℃、5%CO2、5日間培養した。その後、2×105cells/mLとなるように24穴シャーレに播種し、37℃、5%CO2、48時間培養した。コンフルエントになったのを確認後、1.8mMCa2+を含有した正常ヒト表皮角化細胞基礎培地に交換し、37℃、5%CO2、48時間培養した。培地を除去した後、100μg/mLの本発明のテトラペプチド化合物(以下、「486」という。)を含む1.8mMCa2+含有正常ヒト表皮角化細胞基礎培地に交換し、37℃、5%CO2、96時間培養した。培地除去後、486及びサイトカイン(IL−4及びIL−13を各50ng/mL)を含む1.8mMCa2+含有正常ヒト表皮角化細胞基礎培地に交換し、37℃、5%CO2、48時間培養した。
正常ヒト表皮角化細胞のサイトカイン処理
正常ヒト表皮角化細胞(NHEK:クラボウ)の培養には、10mLシャーレを用い、正常ヒト表皮角化細胞基礎培地(Humedia KB−2:クラボウ)に10μg/mLインスリン、0.1ng/mLヒト組換え型上皮成長因子(hEGF)、0.4%(v/v)ウシ脳下垂体抽出液、0.67μg/mLハイドロコーチゾン、50μg/mLゲンタマイシン、50ng/mLアンフォテリシン Bを添加して調製した表皮角化細胞増殖用無血清培地 (HuMedia−KG2)を用いた。凍結保存細胞を。2500cells/mLとなるように播種し、37℃、5%CO2、5日間培養した。その後、2×105cells/mLとなるように24穴シャーレに播種し、37℃、5%CO2、48時間培養した。コンフルエントになったのを確認後、1.8mMCa2+を含有した正常ヒト表皮角化細胞基礎培地に交換し、37℃、5%CO2、48時間培養した。培地を除去した後、100μg/mLの本発明のテトラペプチド化合物(以下、「486」という。)を含む1.8mMCa2+含有正常ヒト表皮角化細胞基礎培地に交換し、37℃、5%CO2、96時間培養した。培地除去後、486及びサイトカイン(IL−4及びIL−13を各50ng/mL)を含む1.8mMCa2+含有正常ヒト表皮角化細胞基礎培地に交換し、37℃、5%CO2、48時間培養した。
RNA抽出
培養細胞からの全RNA抽出は、TRIzol(登録商標) Plus RNA Purification Kit(Thermo Fisher Scientific)を用いた。操作手順は、メーカーのプロトコールに従った。抽出したRNAは−80℃で保存した。
逆転写反応
抽出したRNAは、ReverTra Ace(登録商標)qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(東洋紡)にて逆転写反応を行った。RNA鋳型0.1μgにNuclease free waterを添加して6μLとした反応液を65℃、5分で反応させ、その後、4℃で反応を停止した。次に、2μL4×DN Master Mixを加え、37℃、5分反応後、4℃で反応を停止した。最後に、2μL5×RT Master MixIIを加え、37℃ 15分、50℃ 5分、98℃ 5分で反応した。反応液は−20℃で保存した。
培養細胞からの全RNA抽出は、TRIzol(登録商標) Plus RNA Purification Kit(Thermo Fisher Scientific)を用いた。操作手順は、メーカーのプロトコールに従った。抽出したRNAは−80℃で保存した。
逆転写反応
抽出したRNAは、ReverTra Ace(登録商標)qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(東洋紡)にて逆転写反応を行った。RNA鋳型0.1μgにNuclease free waterを添加して6μLとした反応液を65℃、5分で反応させ、その後、4℃で反応を停止した。次に、2μL4×DN Master Mixを加え、37℃、5分反応後、4℃で反応を停止した。最後に、2μL5×RT Master MixIIを加え、37℃ 15分、50℃ 5分、98℃ 5分で反応した。反応液は−20℃で保存した。
定量RT−PCR
上記逆転写反応により作成したcDNAを鋳型として用いた。FastStart Essential DNA Green Master(Roche)と各遺伝子に対する特異的なプライマー(表1)を用いて、Light cycler Nanoシステムにより解析を行った。遺伝子の発現量はComparative Ct法にて比較定量し、GAPDHを内部標準として相対値として算出した。反応は、95℃、10分の反応後、95℃、10秒、60℃、10秒、72℃、15秒を45回繰り返す増幅反応を行い、最後に95℃、30秒、60℃、20秒、95℃、20秒の反応を行った。この時、DNAに結合するSYBR Greenの蛍光をモニタリングすることによってmRNA発現量の増幅を測定した。
上記逆転写反応により作成したcDNAを鋳型として用いた。FastStart Essential DNA Green Master(Roche)と各遺伝子に対する特異的なプライマー(表1)を用いて、Light cycler Nanoシステムにより解析を行った。遺伝子の発現量はComparative Ct法にて比較定量し、GAPDHを内部標準として相対値として算出した。反応は、95℃、10分の反応後、95℃、10秒、60℃、10秒、72℃、15秒を45回繰り返す増幅反応を行い、最後に95℃、30秒、60℃、20秒、95℃、20秒の反応を行った。この時、DNAに結合するSYBR Greenの蛍光をモニタリングすることによってmRNA発現量の増幅を測定した。
結果
正常ヒト表皮角化細胞をIL−4、IL−13で処理した場合のDUOX1遺伝子発現に対する本発明のテトラペプチド化合物(486)の効果を調べた(図1)。その結果、サイトカイン無処理群に比べ、サイトカイン添加区ではDUOX1遺伝子発現は上昇したが、486を100μg/mL添加した区では、DMSO添加区に比べて減少した。
以上の結果から、大麦焼酎蒸留残液に含まれるテトラペプチド化合物は、炎症によって高発現されるDUOX1遺伝子の発現量を、添加しない場合に比べて約3/5に抑制することが分かった。
正常ヒト表皮角化細胞をIL−4、IL−13で処理した場合のDUOX1遺伝子発現に対する本発明のテトラペプチド化合物(486)の効果を調べた(図1)。その結果、サイトカイン無処理群に比べ、サイトカイン添加区ではDUOX1遺伝子発現は上昇したが、486を100μg/mL添加した区では、DMSO添加区に比べて減少した。
以上の結果から、大麦焼酎蒸留残液に含まれるテトラペプチド化合物は、炎症によって高発現されるDUOX1遺伝子の発現量を、添加しない場合に比べて約3/5に抑制することが分かった。
アトピー性皮膚炎患者の多くは、皮膚組織でインターロイキン4(IL−4)やインターロイキン13(IL−13)が過剰に生産され、表皮ケラチノサイトの角化異常や表皮バリア機能異常の一因になっていることが知られている。Hirakawaらによると、IL−4/IL−13で刺激したヒト表皮ケラチノサイトにおいて、活性酸素産生にかかわるDUOX1の発現が誘導され、H2O2産生能が増加されることが報告されており(非特許文献1)、アトピー性皮膚炎と活性酸素制御機構との関連が示唆されている。
実施例2の試験によって、IL−4とIL−13で刺激した正常ヒト表皮角化細胞において、本発明のテトラペプチド化合物がDUOX1遺伝子の発現を有意に抑制する効果が確認された。
この本発明のテトラペプチド化合物のDUOX1発現抑制効果により、炎症性疾患の緩和や治療、例えばアトピー性皮膚炎や喘息の症状を緩和する可能性が示唆され、抗皮膚炎活性による美肌効果も期待できることから、食べるスキンケアとしての飲食品、医薬品における活用が期待される。
この本発明のテトラペプチド化合物のDUOX1発現抑制効果により、炎症性疾患の緩和や治療、例えばアトピー性皮膚炎や喘息の症状を緩和する可能性が示唆され、抗皮膚炎活性による美肌効果も期待できることから、食べるスキンケアとしての飲食品、医薬品における活用が期待される。
本発明によれば、大麦焼酎蒸溜残液から新規で有用なテトラペプチド化合物を単離、提供することができる。この化合物は、炎症性疾患、例えば、喘息やアトピー性皮膚炎等の皮膚の機能を改善するための飲食品、サプリメント、医薬品等の様々な用途、形態で利用できる可能性がある。
Claims (3)
- 大麦焼酎蒸留残液の合成吸着剤吸着画分のエタノール溶出画分からのHPLC精製画分であって、分子量486、分子式C 24 H 30 N 4 O 7 のテトラペプチド化合物又はその薬学的に許容される塩。
- サイトカイン処理した正常ヒト表皮角化細胞におけるDUOX1遺伝子の発現を抑制する効果を有する、請求項1に記載のテトラペプチド化合物又はその薬学的に許容される塩。
- 請求項1または2に記載のテトラペプチド化合物又はその薬学的に許容される塩を含む飲食品、サプリメント、または医薬品。
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