KR20150134491A - 해양 진균에서 분리한 페니실리놀라이드 a를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 페니실리움 속(Penicillium sp.) SF-5292 균주로부터 분리한 항염활성을 갖는 신규한 페니실리놀라이드(Penicillinolide) A 화합물 및 이의 용도에 관한 것으로서, 본 발명의 해양 진균에서 분리한 페니실리놀라이드 A는 염증과 관련된 사이토카인인 IL-1β, TNF-α, IL-6, NO 및 PGE₂의 생성 및 활성화를 효과적으로 억제하고, 염증을 직접적으로 유도할 수 있는 NO의 분비를 효과적으로 억제하며, 염증 유도 단백질 발현 억제 물질의 핵 내로의 이동을 억제하고, 산화적 스트레스로 인한 손상으로부터의 세포보호효과를 나타내는 효소로 알려진 HO-1의 발현 및 활성을 증가시키며, 천연물 유래 물질로 세포 독성도 낮아 안전성 및 부작용 관련 문제가 발생될 가능성도 낮으므로, 본 발명의 화합물은 염증성 질환 예방 또는 치료를 위한 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

해양 진균에서 분리한 페니실리놀라이드 A를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물{Composition for the prevention and treatment of inflammatory diseases comprising the penicillinolide A isolated from marine fungi}

본 발명은 해양 진균에서 분리한 신규한 화합물, 이의 용도, 및 상기 화합물의 분리방법에 관한 것이다.

염증은 외부에서 들어온 해로운 물질이나 유기체 등과 같은 여러 요인에 의하여 세포나 조직이 손상을 입거나 파괴되었을 때 그 손상을 최소화하고 손상된 부위를 원상으로 회복시키기 위하여 국소적으로 일어나는 면역반응으로서, 생체를 보호하고 조직 손상으로 생성된 산물들을 제거하는데 유용한 방어 메카니즘이다. 상기 방어 메카니즘에 의해, 결과적으로 통증, 부종, 발적 또는 발열 등이 일어나 기능장애가 유발되기도 한다. 상기 염증을 유발하는 여러 요인에는 외상, 화상, 동상, 방사능 등에 의한 물리적 요인, 산(acid)과 같은 화학물질에 의한 화학적 요인 및 항체반응에 의한 면역학적 요인들이 있으며, 그 외에 혈관이나 호르몬 불균형에 의해 발생되기도 한다.

상기 염증은 정상적인 경우에는 생체 내에서 염증반응을 통하여 발병 요인을 중화시키거나 제거하고 상한 조직을 재생시켜서 정상적인 구조와 기능을 회복시키는 작용을 하지만, 염증의 정도가 일정 수준 이상이 되거나 만성화되어 만성염증과 같은 질병 상태로 진행되는 경우 문제가 된다. 임상질환 가운데 거의 모든 질환에서 염증 반응을 관찰할 수 있을 뿐만 아니라, 암발생과정(carcinogenesis)에서도 염증 반응과 관련된 효소들이 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

최근 밝혀진 바에 의하면, 체내에서의 염증반응의 진행은 COX(cyclooxygenase) 효소 활성과 관련된 것으로 알려져 있다. 상기 COX 효소는 생체 내에 존재하는 프로스타그란딘(prostaglandin)의 생합성에 관련하는 주 효소로서(Smith 등, J. Biol.Chem., 271, 33157(1996)), 두 종류의 이성 효소인 COX-1과 COX-2가 존재하는 것으로 알려져 있다. 상기 COX-1은 위나 신장과 같은 조직에 일정하게 존재하며, 정상적인 항상성을 유지하는데 관여하는 반면, 상기 COX-2는 염증이나 기타 면역 반응시 세포분열인자(mitogen)나 사이토카인(cytokines)류에 의해 세포 내에서 일시적이고 빠르게 발현되는 효소이다.

또 하나의 강력한 염증 매개물인 나이트릭 옥사이드(Nitric oxide, NO)는 NO 합성효소(NOS)에 의해 L-알지닌으로부터 생성되며, UV와 같은 외부 스트레스나 엔도톡신 또는 사이토카인과 같은 물질에 의해 많은 종류의 세포에서 생성된다. 상기와 같은 염증 자극들은 세포 내의 유도성 NOS(iNOS)의 발현을 증가시키고, 이를 통하여 세포내에서 NO 생성을 유도하여, 대식 세포를 활성화시킴으로써 염증 반응을 일으킬 수 있다.

또한, 세포보호기전과 밀접하게 관련되어 있는 효소로 알려진 헤마틴 산화효소-1(Heme Oxygenase-1, HO-1)의 발현 또는 활성의 증가는 항산화 및 항염증과 관련된 기작과 밀접하게 관련이 있는 것으로 알려져 있다.

상기 헤마틴 산화효소-1(Heme Oxygenase-1, HO-1)의 주요 기능은 헤마틴(Heme)의 산화를 유도하여 상기 헤마틴(Heme)을 담록소(biliverdin), 유리형 철분(free iron)과 일산화탄소(carbon monoxide)로 분열시키는 것이다. 상기 담록소는 빌리베르딘 리덕타아제(biliverdin reductase)에 의해서 빌리루빈(bilirubin)으로 변환되고, 이는 활성산소종(Reactive Oxygen Species, ROS) 소거제 역할을 하여 항산화 효과를 나타내는 것으로 보고되고 있다.

특히, 상기 헤마틴 산화효소-1에 의해 생성되는 일산화탄소는 항염 효과를 가지고, 상기 유리형 철분은 페레틴 합성(ferritin synthesis)에 관여하며, 세포보호효과를 갖는 것으로 알려져 있다. 이러한 작용에 의하여, 상기 헤마틴 산화효소-1(HO-1)는 상기 헤마틴(Heme)의 산화유도를 통해 담록소(biliverdin), 궁극적으로는 빌리루빈(bilirubin), 유리 철(free iron) 및 일산화탄소(carbon monoxide)의 분해산물을 생산하여, 외부 자극에 대한 세포보호효과를 발휘하며, 항염 효과를 가지는 것으로 알려져 있다.

따라서, 헤마틴 산화효소-1의 발현 또는 활성의 증가는 외부 자극에 대한 세포 보호뿐만 아니라 항염 작용과 관련하여, 중요한 세포적인 메커니즘을 가지고 있는 것으로 보고되고 있다.

따라서, 최근 효과적인 염증 완화를 위하여, NO의 생성을 억제하고, 헤마틴 산화효소-1를 발현 또는 활성화시킬 수 있는 물질에 대한 연구가 진행되고 있다.

최근 천연물의 탐색과 이용에 관한 연구는 바로 유기체의 생합성 능력을 탐색하고 이용하는 것으로서, 지금까지 주로 식물과 미생물이 그 대상의 주종을 이루어 왔다. 특히 미생물은 종의 다양성과 함께 독특하고 흥미로운 생리활성 물질을 생산하는 예가 많고 세대기간이 짧으며 대량생산이 용이하고 산업적 이용가능성이 높아서 매력 있는 생리활성물질의 탐색원이 되어왔다. 미생물로부터 탐색된 많은 생리활성물질들은 방선균, 곰팡이, 세균들로부터 기인하며 그 중 곰팡이로부터 약 25%가 발견되어 항암물질을 비롯한 생리활성물질의 생산균으로서 산업적 또는 의학적인 측면에서 매우 중요한 미생물 자원으로 알려져 있다.

이에, 본 발명자들은 해양미생물의 대사산물로부터 항염증활성이 우수한 물질을 탐색하던 중, 해양 무척추동물로부터 항염증활성이 우수한 물질을 생산하는 균주 페니실리움 속(Penicillium sp.) SF-5292를 선별하였고, 이로부터 새로운 구조의 페니실리놀라이드(Penicillinolide) A 화합물을 순수하게 분리 및 정제하였으며, 상기 화합물은 염증과 관련된 사이토카인인 IL-1β, TNF-α, IL-6, NO 및 PGE₂의 생성 및 활성화를 효과적으로 억제하고, 염증을 직접적으로 유도할 수 있는 NO의 분비를 효과적으로 억제하며, 염증 유도 단백질의 발현 억제 물질의 핵 내로의 이동을 억제하고, 산화적 스트레스로 인한 손상으로부터의 세포보호효과를 나타내는 효소로 알려진 HO-1의 발현 및 활성을 증가시킬 뿐 아니라, 천연물 유래 물질로 세포 독성도 낮아 안전성 및 부작용 관련 문제가 발생될 가능성도 낮음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 해양 진균에서 분리한 신규한 화합물, 이의 용도, 및 상기 화합물의 분리방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 이의 입체 이성질체를 제공한다:

또한, 본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 페니실리놀라이드(Penicillinolide) A 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:

또한, 본 발명은 1) 페니실리움 속(Penicillium sp.) 균주를 배양하는 단계;

2) 상기 1) 단계에서 얻어진 균주 배양물을 메틸에틸케톤으로 추출하는 단계; 및,

3) 상기 2) 단계에서 얻어진 메틸에틸케톤 추출물을 컬럼 크로마토그래피로 분리하는 단계를 포함하는 페니실리놀라이드 A 화합물의 분리 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 수탁번호 KCTC 18284P로 기탁된 페니실리움 속 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 2로 표시되는 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 이의 입체 이성질체를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 2로 표시되는 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 이의 입체 이성질체를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.

본 발명의 신규 페니실리놀라이드(Penicillinolide) A 화합물은 염증과 관련된 사이토카인인 IL-1β, TNF-α, IL-6, NO 및 PGE₂의 생성 및 활성화를 효과적으로 억제하고, 염증을 직접적으로 유도할 수 있는 NO의 분비를 효과적으로 억제하며, 염증 유도 단백질의 발현 억제 물질의 핵 내로의 이동을 억제하고, 산화적 스트레스로 인한 손상으로부터의 세포보호효과를 나타내는 효소로 알려진 HO-1의 발현 및 활성을 증가시키며, 천연물 유래 물질로 안전성 및 부작용 관련 문제가 발생될 가능성도 낮으므로, 페니실리놀라이드 A는 염증성 질환 예방 또는 치료를 위한 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에서 분리한 화합물(페니실리놀라이드 A)의 ¹H NMR 스펙트럼(400 MHz, pyridine-d ₆)을 보여주는 도이다.
도 2는 본 발명에서 분리한 화합물(페니실리놀라이드 A)의 ¹³C NMR 스펙트럼(100 MHz, pyridine-d ₆)을 보여주는 도이다.
도 3은 본 발명에서 분리한 화합물(페니실리놀라이드 A)을 처리하였을 때, 염증관련 물질(IL-1β, TNF-α, IL-6, NO 및 PGE₂)의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다:
(A)는 IL-1β의 함량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이고, (B)는 TNF-α의 함량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이고, (C)는 IL-6의 함량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이고, (D)는 NO의 함량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이며, (E)는 PGE₂의 함량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
상기 그래프의 가로축에서 ‘-’는 아무런 처리를 하지 않은 것을 의미하고, ‘+’는 처리한 것을 의미하고, 수치는 페니실리놀라이드 A의 처리량(μM)을 의미하고, 나머지 표시는 처리한 시료의 종류를 의미하며, 상기 그래프의 세로축은 분석 대상인 염증 관련 물질의 함량을 나타낸다.
도 4는 본 발명에서 분리한 화합물(페니실리놀라이드 A)을 처리하였을 때, iNOS 단백질 발현량 및 COX-2 단백질 발현량을 웨스턴 블롯 분석법을 통하여 확인한 결과를 나타낸 도이다:
(A)는 단백질 발현량을 확인한 사진이고, (B)는 (A)의 결과 중 iNOS에 대한 것을 그래프로 나타낸 것이며, (C)는 (A)의 결과 중 COX-2에 대한 것을 그래프로 나타낸 것이다.
상기 사진에서 ‘-’는 아무런 처리를 하지 않은 것을 의미하고, ‘+’는 처리한 것을 의미하고, 수치는 페니실리놀라이드 A의 처리량(μM)을 의미하며, 나머지 표시는 처리한 시료 또는 분석된 단백질의 종류를 나타낸다.
도 5는 본 발명에서 분리한 화합물(페니실리놀라이드 A)을 처리하였을 때, IκB-α 및 NF-κB와 관련된 함량 및 활성화 정도를 나타낸 도이다:
(A)와 (B)는 세포질 분획에서 IκB-α 및 인산화된 IκB-α(phosphorylated IκB-α, p-IκB-α)의 함량과 핵 분획에서 p65의 함량을 각각에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석법을 통하여 확인한 결과를 나타낸 사진이고, (C)는 핵 분획에서 NF-κB의 결합 활성(binding activity)를 나타낸 그래프이다.
사진의 수치는 페니실리놀라이드 A의 처리량(μM)을 의미하고, p-IκB-α는 인산화된 IκB-α(phosphorylated IκB-α)를 의미하고, p65는 NF-κB를 의미하며, 상기 그래프의 가로축에서 ‘-’는 아무런 처리를 하지 않은 것을 의미하고, ‘+’는 처리한 것을 의미하고, 수치는 페니실리놀라이드 A의 처리량(μM)을 의미하며, 세로축은 음성 대조군을 기준으로 NF-kB의 결합 활성(binding activity)을 상대값으로 나타낸 것을 의미한다.
도 6은 본 발명에서 분리한 화합물(페니실리놀라이드 A)을 처리하였을 때, 헤마틴 산화효소-1(Heme oxygenase)의 생성량을 나타낸 도이다:
(A)와 (B)는 페니실리놀라이드 A의 농도별 사용량(가로축, μM) 또는 CoPP 사용 여부에 따른 HO-1의 생성 정도를 페니실리놀라이드 A을 처리하지 않은 대조군(control)에서의 HO-1 생성량과 비교한 도이며, (C)는 페니실리놀라이드 A을 40 μM씩 처리한 시간(가로축, hour(h))에 따라 HO-1의 발현 유도 효과를 페니실리놀라이드 A을 처리하지 않은 대조군(control)에서의 HO-1 생성정도를 비교한 도이다.
(A)와 (B)의 수치는 페니실리놀라이드 A의 사용량을 의미하고, (C)의 수치는 페니실리놀라이드 A를 처리한 후 경과한 시간(h)을 의미한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 이의 입체 이성질체를 제공한다:

[화학식 1]

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상기 화합물은 화학식 2로 표시되는 페니실리놀라이드(Penicillinolide) A 균주로부터 분리된 것을 특징으로 한다:

[화학식 2]

.

상기 화합물은 페니실리움 속(Penicillium sp.) 균주로부터 분리되는 것이 바람직하고, 수탁번호 KCTC 18284P로 기탁된 페니실리움 속 SF-5292 균주로부터 분리되는 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 해양 무척추동물 시료로부터 균주를 분리하고, 상기 분리된 페니실리움 속 SF-5292 균주로부터 화합물을 분리하여 구조를 분석하여 페니실리놀라이드 A로 명명한 후 이의 구조를 분석하였다(도 1 내지 도 2 참조).

본 발명은 상기 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물을 모두 포함한다.

본 발명의 화학식 2의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 화학식 1의 화합물을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다.

동량의 화학식 2의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고, 이어서 이 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물2 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

또한, 본 발명은

1) 페니실리움 속 균주를 배양하는 단계;

2) 상기 1) 단계에서 얻어진 균주 배양물을 메틸에틸케톤(Methylethylketone)으로 추출하는 단계; 및

3) 상기 2) 단계에서 얻어진 메틸에틸케톤 추출물을 컬럼 크로마토그래피로 분리하는 단계를 포함하는 본 발명의 페니실리놀라이드 A 화합물의 분리 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)은 페니실리움 속 균주를 배양하는 단계로서, 균주 배양은 통상의 미생물이 사용할 수 있는 영양원을 함유하는 배지에서 배양하는 것이 바람직하다. 영양원으로는 종래 곰팡이의 배양에 이용되고 있는 공지의 영양원을 사용할 수 있다. 예를 들어, 탄소원으로는 글루코오스, 물엿, 덱스트린, 전분, 당밀, 동물유, 식물유 등을 사용할 수 있으며, 질소원으로는 밀기울, 대두박, 소맥, 맥아, 면실박, 어박, 콘스팁리커, 육즙, 효모 추출물, 황산암모늄, 질산소다, 요소 등을 사용할 수 있고, 필요에 따라, 식염, 칼륨, 마그네슘, 코발트, 염소, 인산, 황산 및 기타 이온생성을 촉진하는 무기염류를 첨가하면 매우 효과적이다. 배양방법으로는 호기적 조건에서는 진탕 배양 또는 정치배양이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 1)의 페니실리움 속 균주는 수탁번호 KCTC 18284P로 기탁된 페니실리움 속 SF-5292 균주인 것이 바람직하다.

배양온도는 상기의 각 조건들에서 배양할 경우 조건에 따라 약간씩 상이하나, 보통 20 ~ 37℃에서 배양하는 것이 바람직하고, 23 ~ 30℃에서 배양하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)는 상기 단계 1)에서 얻어진 균주 배양물을 메틸에틸케톤으로 추출하는 단계로서, 본 발명의 페니실리놀라이드 A 화합물은 균주의 배양액뿐만 아니라 균사체 부분에도 존재할 수 있다. 따라서, 균주의 배양액 및 균사체에 메틸에틸케톤과 같은 유기용매를 가하여 배양액 및 균사체로부터 유효성분을 추출한 후 수득된 추출액을 감압증발 방법으로 농축하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 3)은 본 발명의 페니실리놀라이드 A 화합물을 분리하는 단계로, 상기 단계 2)에서 얻은 메틸에틸케톤 농축액을 메탄올 : 디클로로메탄 혼합용매를 이용하여 플래쉬 컬럼 크로마토그래피를 실시한 후, 고속액체크로마토그래피로 정제하여 분리할 수 있다.

또한, 본 발명은 수탁번호 KCTC 18284P로 기탁된 페니실리움 속 균주를 제공한다.

본 발명자들은 해양 무척추동물로부터 균주를 분리한 후, 상기 균주의 28S rRNA 염기서열 분석 결과, 상기 균주는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 페니실리움 속으로 동정하였다. 본 발명에서는 상기 균주를 페니실리움 속(Penicillium sp.) SF-5292라고 명명하고, 이를 2014년 4월 25일자로 한국생명공학연구원(KRIBB)내 유전자은행(KCTC)에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 18284P).

또한, 본 발명은 본 발명의 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 이의 입체 이성질체를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 화합물은 해양 무척추동물 시료로부터 균주를 분리하는 것이 바람직하고, 페니실리움 속 균주로부터 분리된 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 페니실리움 속 균주는 수탁번호 KCTC 18284P로 기탁된 페니실리움 속 SF-5292 균주인 것을 특징으로 한다.

상기 화합물은 IL-1β, TNF-α, IL-6, NO 및 PGE₂의 생성을 억제하는 것을 특징으로 한다.

본 명세서에서 염증은 일반적인 염증질환을 포함하는 개념이며, 상기 염증성 질환은 피부염, 알레르기, 전신성 홍반성 낭창, 망막염, 위염, 간염, 장염, 췌장염, 신장염 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

더욱 구체적으로, 상기 염증성 질환은 피부염, 알레르기, 전신성 홍반성 낭창, 망막염과 같은 안과 질환, 류마티스 관절염, 루푸스, 다발성 경화증과 같은 각종 만성 염증 질환, 패혈증, 장기이식의 거부반응과 같은 각종 급성 염증 질환, 기관지염, 위염이나 장염과 같은 염증성 장질환, 간염, 췌장염, 신장염 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 화합물 페니실리놀라이드 A의 항염 효과를 확인한 결과, 염증 관련 물질로 알려진 IL-1β, TNF-α, IL-6, NO(일산화질소, nitric oxide) 및 PGE₂(프로스타글란딘 2, prostaglandin E2)의 생성을 농도 의존적으로 억제하고(도 3 참조), PGE₂ 생산을 유도하는 COX-2(cyclooxygenase 2)와 NO 생산을 유도하는 iNOS(inducible nitric oxide synthase)의 발현량을 확인한 결과, 페니실리놀라이드 A를 첨가한 경우에는 농도 의존적으로 iNOS와 COX-2 단백질 발현이 감소하는 것을 확인하였으며(도 4 참조), 염증 유도 단백질의 발현 억제 물질로 알려진 NF-κB(p65)의 핵으로 이동(nuclear translocation)을 억제하는 물질인 IκB-α의 인산화 및 분해 억제 여부를 확인한 결과, 페니실리놀라이드 A를 처리한 경우 농도의존적으로 IκB-α의 발현이 증가함으로써 LPS에 의해 유도된 IκB-α의 분해가 억제되고, 농도의존적으로 p-IκB-α의 발현이 감소함으로써 LPS에 의해 유도된 IκB-α의 활성화를 억제함이 확인되었고, 농도의존적으로 p65의 발현이 감소함으로써 LPS에 의해 유도된 NF-κB의 핵 내로의 이동이 억제되는 것이 확인되었으며, 농도의존적으로 NF-κB의 DNA 결합 정도가 감소되는 것을 확인하였다(도 5 참조).

또한, 염증 관련 효소로 알려진 헤마틴 산화효소-1(Heme Oxygenase-1, HO-1)의 발현 및 활성을 측정한 결과, 페니실리놀라이드 A를 처리한 경우 농도 의존적으로 HO-1의 활성이 증가하고, 농도 의존적으로 HO-1의 생성량이 증가하였으며, 이러한 HO-1의 생성량이 페니실리놀라이드 A 처리 시간이 경과함에 따라 증가됨을 확인하였다(도 6 참조).

따라서, 본 발명의 해양 진균에서 분리한 페니실리놀라이드 A는 염증과 관련된 사이토카인인 IL-1β, TNF-α, IL-6, NO 및 PGE₂의 생성 및 활성화를 효과적으로 억제하고, 염증을 직접적으로 유도할 수 있는 NO의 분비를 효과적으로 억제하며, 염증 유도 단백질의 발현 억제 물질의 핵 내로의 이동을 억제하고, 산화적 스트레스로 인한 손상으로부터의 세포보호효과를 나타내는 효소로 알려진 HO-1의 발현 및 활성을 증가시키며, 천연물로부터 분리된 것으로 부작용이 문제될 가능성이 낮음으로써 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있음을 확인하였다.

상기 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 이의 입체 이성질체는 조성물 내에 단독으로 사용될 수 있으며, 그 외 약리학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 희석제 또는 부성분을 추가로 포함할 수 있다. 보다 상세하게는, 상기 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 이의 입체 이성질체를 포함하는 조성물이 약제로 사용되거나, 의약 또는 약학적 용도로 사용되는 경우, 상기 유효성분은 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합하거나 희석제로 희석하여 사용될 수 있다.

이 경우 상기 조성물 내 유효성분의 함량은 0.001 중량 % 내지 99.9 중량 %, 0.1 중량 % 내지 99 중량 % 또는 1 중량 % 내지 50 중량 % 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 조성물의 사용태양 및 사용방법에 따라 상기 화합물의 함량은 바람직한 함량으로 적절히 조절하여 사용될 수 있다.

상기 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이트, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀 및 생리식염수로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용가능하다. 또한, 상기 약학 조성물은 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, pH 조절제, 영양제, 비타민, 전해질, 알긴산 및 그의 염, 펙트산 및 그의 염, 보호성 콜로라이드, 글리세린, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 성분들은 상기 유효성분인 펄첼라민 G, 약학적으로 허용되는 이의 염 및 이들의 조합으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.

상기 조성물이 약제로 사용하는 경우 투여방법은 경구 또는 비경구 모두 가능하며, 예로는 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다.

또한, 상기 조성물의 제형은 사용방법에 따라 달라질 수 있으며, 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화 될 수 있다. 일반적으로는, 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제(tablets), 알약, 연질 또는 경질 캅셀제(capsules), 환제(pills), 산제(powders) 및 과립제(granules) 등이 포함되고, 이러한 제제는 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제(sustesions), 내용액제, 유제(emulsions) 및 시럽제(syrups) 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구투여를 위한 형태는 크림(cream), 로션제(lotions), 연고제(onitments), 경고제(plasters), 액제(liquids and solutions), 에어로솔제(aerosols), 유동엑스제(fruidextracts), 엘릭서(elixir), 침제(infusions), 향낭(sachet), 패취제(patch) 또는 주사제(injections) 등의 형태일 수 있다.

더 나아가, 본 발명의 조성물은 당해 기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 제형화될 수 있다.

상기 조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별, 환자의 중증도, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 병용되는 약물을 고려하여 결정할 수 있으며, 예로 1일 유효성분을 기준으로 하였을 때 0.1 mg/kg(체중) 내지 500 mg/kg(체중), 0.1 mg/kg(체중) 내지 400 mg/kg(체중) 또는 1 mg/kg(체중) 내지 300 mg/kg(체중)으로 투여할 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 본 발명의 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 이의 입체 이성질체를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.

상기 화합물은 해양 무척추동물 시료로부터 균주를 분리하는 것이 바람직하고, 페니실리움 속 균주로부터 분리되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 페니실리움 속 균주는 수탁번호 KCTC 18284P로 기탁된 페니실리움 속 SF-5292 균주인 것을 특징으로 한다.

상기 화합물은 IL-1β, TNF-α, IL-6, NO 및 PGE₂의 생성을 억제하는 것을 특징으로 한다.

본 명세서에서 염증은 일반적인 염증질환을 포함하는 개념이며, 상기 염증성 질환은 피부염, 알레르기, 전신성 홍반성 낭창, 망막염, 위염, 간염, 장염, 췌장염, 신장염 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

더욱 구체적으로, 상기 염증성 질환은 피부염, 알레르기, 전신성 홍반성 낭창, 망막염과 같은 안과 질환, 류마티스 관절염, 루푸스, 다발성 경화증과 같은 각종 만성 염증 질환, 패혈증, 장기이식의 거부반응과 같은 각종 급성 염증 질환, 기관지염, 위염이나 장염과 같은 염증성 장질환, 간염, 췌장염, 신장염 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 해양 진균에서 분리한 페니실리놀라이드 A는 염증과 관련된 사이토카인인 IL-1β, TNF-α, IL-6, NO 및 PGE₂의 생성 및 활성화를 효과적으로 억제하고, 염증을 직접적으로 유도할 수 있는 NO의 분비를 효과적으로 억제하며, 염증 유도 단백질의 발현 억제 물질의 핵 내로의 이동을 억제하고, 산화적 스트레스로 인한 손상으로부터의 세포보호효과를 나타내는 효소로 알려진 HO-1의 발현 및 활성을 증가시키며, 천연물로부터 분리된 것으로 부작용이 문제될 가능성이 낮음으로써 염증성 질환 예방 및 개선용 건강 기능 식품의 유효성분으로 사용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 화합물이 상기와 같은 염증성 질환 예방 및 개선을 위해 이용되기 위해서는, 식품학 또는 약제학적 분야에서 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있으며 그 자체 또는 식품학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 경구로 섭취할 수 있는 어떤 식품 형태로도 제조될 수 있다. 바람직하게는 음료, 환, 과립, 정제 또는 캅셀 형태이다.

본 발명의 건강 기능 식품은, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되고 식품학적으로 허용되는 성분을 더 포함할 수 있다. 예컨대, 음료수로 제조되는 경우에는 본 발명의 화합물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙 등에서 하나 이상의 성분을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명에 따른 건강 기능 식품의 유효성분으로 포함될 수 있는 양은 염증성 질환 예방 및 개선을 원하는 사람의 연령, 성별, 체중, 상태, 질병의 증상에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인기준 1일 0.01 g 내지 10.0 g 정도로 포함되는 것이 좋으며, 이러한 함량을 갖는 건강 기능 식품을 섭취함으로써 염증성 질환 예방 및 개선 효과를 얻을 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 이의 입체 이성질체를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 화합물은 해양 무척추동물 시료로부터 균주를 분리하는 것이 바람직하고, 페니실리움 속 균주로부터 분리되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 페니실리움 속 균주는 수탁번호 KCTC 18284P로 기탁된 페니실리움 속 SF-5292 균주인 것을 특징으로 한다.

상기 화합물은 IL-1β, TNF-α, IL-6, NO 및 PGE₂의 생성을 억제하는 것을 특징으로 한다.

본 명세서에서 염증은 일반적인 염증질환을 포함하는 개념이며, 상기 염증성 질환은 피부염, 알레르기, 전신성 홍반성 낭창, 망막염, 위염, 간염, 장염, 췌장염, 신장염 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

더욱 구체적으로, 상기 염증성 질환은 피부염, 알레르기, 전신성 홍반성 낭창, 망막염과 같은 안과 질환, 류마티스 관절염, 루푸스, 다발성 경화증과 같은 각종 만성 염증 질환, 패혈증, 장기이식의 거부반응과 같은 각종 급성 염증 질환, 기관지염, 위염이나 장염과 같은 염증성 장질환, 간염, 췌장염, 신장염 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 해양 진균에서 분리한 페니실리놀라이드 A는 염증과 관련된 사이토카인인 IL-1β, TNF-α, IL-6, NO 및 PGE₂의 생성 및 활성화를 효과적으로 억제하고, 염증을 직접적으로 유도할 수 있는 NO의 분비를 효과적으로 억제하며, 염증 유도 단백질의 발현 억제 물질의 핵 내로의 이동을 억제하고, 산화적 스트레스로 인한 손상으로부터의 세포보호효과를 나타내는 효소로 알려진 HO-1의 발현 및 활성을 증가시키며, 천연물로부터 분리된 것으로 부작용이 문제될 가능성이 낮음으로써 염증성 질환 예방 및 개선용 화장료 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있음을 확인하였다.

상기 화장료 조성물은, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물은 본 발명의 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 이의 입체 이성질체에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.

본 발명의 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 이의 입체 이성질체를 함유하는 화장료 조성물에 있어서, 통상적으로 함유되는 화장료 조성물에 본 발명의 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 이의 입체 이성질체이 0.005 중량% 내지 50 중량%의 양으로 첨가될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 아스퍼질러스 속( Aspergillus sp .) SF -5044 균주의 분리

본 균주는 2009년 2월 제주도해변의 해양 무척추동물로부터 분리하였다. 채집한 시료는 채집 즉시 멸균된 플라스틱 백에 넣어, 실험에 사용하기까지 냉동보관하였다. 실험을 위한 시료는 멸균된 해수를 이용하여 10배 희석하였고, 상기 희석액 1 ml를 3% NaCl이 함유된 포테이토 덱스트로스 아가(potato dextrose agar) 배지에 도말하여 25℃에서 14일간 배양하여 나타난 집락을 수차례의 분리과정을 통하여 순수분리하였으며 최종 순수분리된 균주를 -70℃에 보관하였다.

< 실시예 2> 균주의 동정 및 명명

본 균주의 rRNA 서열 분석을 수행하여 28S rRNA 서열을 확인하여 다음과 같이 나타났다.

TTTTTTCTCCTCCCCCCCCCCCCGAAATATCATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCCCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAGAGCTCAAATTTGAAAGCTGGCTCCTTCGGGGTCCGCATTGTAATTTGTAGAGGATGCTTCGGGAGCGGTCCCCATCTAAGTGCCCTGGAACGGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTATGGGATGGGGTGTCCGCGCCCGTGTGAAGCTCCTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAATGGGTGGTAAATTTCATCTAAAGCTAAATATTGGCCGGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTTAAAAAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCTTGCGACCAGACTCGCTCGCGGGGTTCAGCCGGCATTCGTGCCGGTGTATTTCCCCGCGGGCGGGCCAGCGTCGGTTTGGGCGGTCGGTCAAAGGCCCTCGGAAGGTAACGCCCCTAGGGGCGTCTTATAGCCGAGGGTGCAATGCGACCTGCCTAGACCGAGGAACGCGCTTCGGCTCGGACGCTGGCATAATGGTCGTAAGCGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTCTAACATCTACGCGAGTGTTCGGGTGTCAAACCCGTGCGCGAAGTGAAAGCGAACGGAGGTGGGAACCCTTACGGGTGCACCATCGACCGATCCTGAAGTCTTCGGATGGATTTGAGTAAGAGCGTAGCTGTTGGGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCCTGAATAGGGCGAAGCCAGAGGAAACTCTGGTGGAGGCTCGTAGCGGTTCTGACGTGCAAATCGATCGTCGAATTTGGGTATAGGGGCGAAAGACTAATCGAACCATCTAGC(서열번호 : 1)

본 균주의 28S rRNA sequence 분석을 통하여 얻어진 염기서열의 GenBank 검색 결과, Penicillium expansum(JN938952)과 99.89%의 상동성을 보였다. 이에 본 균주를 페니실리움 속으로 동정하였고, 이를 페니실리움 속(Penicillium sp.) SF-5292로 명명하였고, 이를 2014년 4월 25일자로 한국생명공학연구원(KRIBB) 내 유전자은행(KCTC)에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 18284P).

< 실시예 3> 페니실리움 속( Penicillium sp .) SF -5292 균주의 배양

본 균주를 배양하기 위하여, 통상적으로 미생물이 이용하는 영양원과 염화나트륨을 함유하는 배지를 준비하였다. 균주의 조배지 및 생산배지로서 0.4%(w/v) 포테이토 스타치, 2%(w/v) 덱스트로스, 3%(w/v) 염화나트륨, 1.5%(w/v) 아가가 함유된 포테이토 덱스트로스 아가 배지를 사용하였다.

상기 종배지 20 ml이 담긴 100 ml 용량의 삼각플라스크를 121℃에서 20분간 멸균한 후, 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) SF-5044 균주의 사면배양 시험관으로부터 백금이 접종하여 4일간 진탕배양하여 종배양을 수행하였다. 생산배지 20 ml로 만든 평판배지 110개에 각각 종배양액 2 ml을 접종하여 25℃에서 10일간 정치배양 하였다.

< 실시예 4> 페니실리움 속( Penicillium sp .) SF -5292 균주로부터 화합물의 분리 및 정제

상기 <실시예 3>에서 배양한 페니실리움 속(Penicillium sp.) SF-5292 균주의 배양물을 2 L의 메틸에틸케톤(Methylethylketone)으로 추출하고, 수득된 추출액을 감압건조기를 이용하여 감압증발 방법으로 농축하여 2 g의 추출물을 얻었다. 이 농축액을 오디에스 알피 18에 흡착시켜 오디에스 알피 18 플래쉬 컬럼크로마토그래피(ODS RP-18 flash column chromatography)를 실시하였으며, 이때 메탄올/물(2:8-10/0, v/v)을 혼합용매로 하여 단계적으로 메탄올 농도를 증가시키면서 용출하였다. 이때 80% 메탄올에서 용출된 분획을 메탄올/디클로메탄(0%-20%, v/v)을 혼합용매로 하여 실리카겔 프레쉬 컬럼크로마토그래피를 실시하였다. 또한, 메탄올/디클로로메탄(1:19, v/v) 혼합용매로 용출한 분획을 감압농축한 후, 고속액체크로마토그래피(칼럼: Agilent semiprep-C18)를 이용하여 용매로는 0.1% 포름산(formic acid)이 함유된 40%~100% 메탄올 농도구배, 용출 유속 5 ml/min 조건으로 용출하여 210 nm의 UV 흡수 피크로 화학식 2로 표시된 화합물(13.4 mg, t _R = 31.0분)을 분리하였다.

< 실시예 5> 페니실리움 속 SF5292 균주로부터 화합물의 구조 분석

상기 <실시예 4>에서 분리한 화학식 2를 ESI 질량분석기(Electrospray Ionization mass spectrometer)를 사용하여 분자량 및 분자식을 결정하였다. 또한, 핵자기공명(NMR) 분석을 통하여 ¹H NMR, ¹³C NMR, COSY(Correlation Spectroscopy), HMQC(1H-Detected heteronuclear Multiple-Quantum Coherence), HMBC(Heteronuclear Multiple-Bond Coherence), DEPT(Distortionless Enhancement by Polarization), NOESY(Nuclear Overhauser effect spectroscopy) 스펙트럼을 얻고, 화합물들의 분자구조를 결정한 결과, 화학식 2는 하기 화학식과 같은 곰팡이 유래의 10원환의 대형 락톤을 포함하는 신규한 화합물로 동정하였다. 이에 상기 화학식 2를 페니실리놀라이드(penicillinolide)로 명명하였다(도 1 내지 도 2).

[화학식 2]

페니실리놀라이드 A(Penicillinolide A)(화학식 2): 흰색 고체; [α]_D +50 (c 0.38, MeOH); FT-IR νmax 3393, 2956, 2932, 2859, 1717, 1440, 1350, 1250, 1128, 1100, 1043, 963, 925 cm1 ; ¹H, ¹³C NMR 데이타는 하기 표 1에 나타내었음; HRESIMS m/z 295.1517 [M+Na]⁺ (calcd for calcd for C₁₄H₂₄O₅Na, 295.1521 ).

화학식 2의 NMR 데이터(pyridine-d ₅ 중 측정)

Position	δC	δH, mult.(J in Hz)	Key NOESY	HMBC(H→C#)
1	172.9	-	-	-
2	28.9	3.11, m 2.56, m	-	1, 3, 4
3	28.6	2.65, m 2.00, m	-	1, 2, 4, 5
4	65.2	5.00, m	H-7	-
5	46.2	3.12, dd (18.1, 11.0) 2.93, dd (18.1, 4.8)	-	3, 4, 6
6	211.0	-	-	-
7	75.2	4.57, dd (7.7, 3.7)	H-4, H-9	8, 9
8	39.3	2.58, m 2.41, m	-	6, 7, 9, 10
9	73.1	5.27, m	H-7	1, 7
10	34.3	1.81, m 1.70, m	-	8, 9, 11, 12
11	25.8	1.27, m	-	10, 12, 13
12	31.8	1.23-1.09, m	-	-
13	22.7	1.21-1.11, m	-	-
14	14.1	0.76, t (6.6)	-	12, 13

< 실시예 6> 페니실리놀라이드 A의 염증 관련 물질 생성 저해 효과 확인

페니실리놀라이드 A의 항염 효과를 확인하기 위하여 염증 관련 물질로 알려진 IL-1β, TNF-α, IL-6, NO 및 PGE₂의 생성 억제 여부를 다음과 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 쥐 유래 대식세포에 펄첼라민 G(Pulchellamin G)와 페니실리놀라이드 A(화학식 2)를 20 및 40 μM씩 처리하고, 12시간 동안 배양한 후, LPS(bacterial lipopoly-saccharide) 1 μg/ml를 처리하고 18시간 동안 더 배양하여, 염증 반응을 유도하였다. 배양 후, 13,000 X g 및 4 ℃의 조건에서 2분 동안 원심분리한 후, 상등액을 수집하였다.

TNF-α 및 IL-1β의 분비량 측정은 상업적으로 판매되는 측정 키트(R&D Systems, USA)를 이용하여 제조사에서 제공한 실험방법(protocol)에 따라 수행하였다. 각각의 대조군과 실험군의 상등액을 각각 마우스 유래 TNF-α 또는 IL-1β에 대한 항체가 코팅된 96 웰 플레이트에 첨가한 후, 2차 항체(enzyme-linked polyclonal antibody specific for mouse TNF-α or IL-1β)를 첨가하고 2시간 동안 반응시킨 다음, 미부착된 2차 항체를 제거하기 위하여 세척을 하였다. 이후, 기질용액을 첨가하고, 450 nm에서 형광세기를 측정하는 방법으로 TNF-α 또는 IL-1β의 함량을 측정하였다.

NO의 분비량 측정은 Griess reagent system(Promega, USA)를 이용하여 Promega에서 제공한 실험방법(protocol)에 따라 수행하였다. 각각의 대조군과 실험군의 상등액 100 μl와 동량의 Griess reagent(5%(v/v) 인산(phosphoric acid) 용액에 0.1%(w/v) N-(1-naphathyl)- ethylene diamine를 녹인 용액 및 1%(w/v) sulfanil amide를 녹인 용액)를 혼합한 후, 상온(15℃ 내지 20℃)에서 10분간 반응시켰다. 이후, ELISA 플레이트 리더기(ELISA plate reader)를 이용하여 525 nm에서 흡광도를 측정하였다.

PGE₂의 분비량 측정은 상업적으로 판매되는 PGE₂ 측정 키트(R&D Systems, USA)를 이용하여 제조사에서 제공한 실험방법(protocol)에 따라 수행하였다. 각각의 대조군과 실험군의 상등액을 PGE₂에 대한 항체가 코팅된 96 웰 플레이트에 첨가한 후, 2차 항체(enzyme-linked polyclonal antibody specific for PGE₂)를 첨가하고 20시간 동안 반응시킨 다음, 미부착된 2차 항체를 제거하기 위하여 세척을 하였다. 이후, 기질용액을 첨가하고, 450 nm에서 형광세기를 측정하는 방법으로 PGE₂의 함량을 측정하였다.

그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이, 염증 관련 물질로 알려진 IL-1β, TNF-α, IL-6, NO 및 PGE₂는 LPS를 첨가하지 않은 대조군에서는 생성량이 낮은 반면, LPS 시료를 첨가하여 염증을 유도한 경우에는 모두 현저하게 상승되었으며, 페니실리놀라이드 A를 첨가한 경우에는 농도 의존적으로 생성량이 감소되는 것을 확인하였다(도 3).

< 실시예 7> 페니실리놀라이드 A의 항염 효과 유도 효소 발현 변화 확인

<7-1> 세포질 분획( cytosolic fraction ), 및 핵 및 세포질 분획( Nuclear and cytoplasmic extract )의 제조

세포독성이 없어 안전한 것으로 확인된 페니실리놀라이드 A의 항염 효과를 유도하는 효소의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 쥐 유래 대식세포를 이용하여, PGE₂(프로스타글란딘 2, prostaglandin E2) 생산을 유도하는 COX-2(cyclooxygenase 2)와 NO(일산화질소, nitric oxide) 생산을 유도하는 iNOS(inducible nitric oxide synthase)의 발현량을 세포의 세포기질(cytosol), 핵(nuclear) 및 세포질(cytoplasm)분획에서 웨스턴 블롯 분석법(Western blot analysis)을 통해 측정하였다.

구체적으로, 쥐 유래 대식세포를 10% heat-inactivated FBS(fetal bovine serum) 및 penicillin G(100 IU/ml, Gibco co, USA)와 streptomycin(100 μg/ml, Gibco co, USA)을 함유한 DMEM 배지에 분주하고, 5% CO₂배양기(Sanyo, MCO175)를 이용하여, 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양된 배양액(1 × 10⁶ cells/ml)을 1 ml씩 96 웰 플레이트에 분리한 후, 펄첼라민 G를 농도별로 5, 10, 20 및 40 μM씩 처리하고, 추가로 5% CO₂ 배양기에서 12시간 동안 더 배양하였다. 배양 후 염증 반응을 유도하기 위하여, LPS를 1 μg/ml으로 처리하고 18시간 동안 더 배양하였다. 배양된 대식세포를 수집한 후, 2,000 rpm 및 4℃의 조건에서 2분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 상등액을 제거하고 남은 펠렛(pellet)은 단백질 분해 억제제(protease inhibitor cocktail I, EMD Boisciences, USA) 및 1 mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)가 포함된 PER-Mammalian 단백질 추출 완충액(PER-Mammalian Protein Extraction buffer, Pierce Biotechnology, USA)을 첨가한 후, 균질화 시켰다. 상기 단백질 분해 억제제 및 PMSF가 포함된 PER-Mammalian 단백질 추출 완충액은 20 mM TrisHCl buffer(pH7.4)에 단백질 분해 억제제 및 PMSF(0.1 mM PMSF, 5 mg/ml aprotinin, 5 mg/ml pepstatinA 및 1 mg/ml chymostatin)를 첨가하는 방법으로 제조하였다. 그 후, 세포질 분획(cytosolic fraction)은 상기 균질화된 세포 액을 15,000 X g 및 4℃의 조건에서 10분 동안 원심분리하여 제조하였다.

또한, 핵 및 세포질 분획의 제조를 위해서 NE-PER 핵 및 세포질 분획 시약(NE-PER Nuclear and cytoplasmic extraction reagents, Pierce Biotechnology, USA)을 사용하였는데, LPS를 처리하고 18시간 동안 더 배양한 배양액(1 × 10⁶ cells/ml) 3 ml를 60 mm 디쉬(dish)에 분리한 후, 세포를 수집하고, PBS(phosphate-buffered saline)로 세척하였다. 세척한 후, RIPA 완충액(radioimmunoprecipitation assay buffer, RIPA buffer, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 50 Mm TrisHCl [pH7.4], 50 mM glycerophosphate, 20 mM NaF, 20 mM ethylene glycol tetraacetic acid[EGTA], 1 mM dithiothreitol[DTT], 1 mM Na₃VO₄,및 protease inhibitors)을 처리하고, 4℃에서 15분간 교반하여 세포를 용해(lysis)시켰다. 이후, 15,000 X g 및 4℃의 조건에서 15분 동안 원심분리한 후, 상등액을 수득하는 방법으로 제조하였다.

제조한 세포질 분획, 및 핵 및 세포질 분획은 실험에 사용되기 전까지 -70℃에서 보관하였다.

<7-2> 항염 효과 유도 효소 발현 변화 확인

상기 실시예 <7-1>의 방법으로 얻은 세포질 분획으로부터 iNOS 및 COX-2의 발현 여부를 측정하기위한 웨스턴 블롯 분석법은 단백질 분해 억제제 및 PMSF가 포함된 PER-Mammalian 단백질 추출 완충액을 이용하여 수득한 세포질 분획 내에 포함된 단백질 함량을 Lowry 단백질 측정 키트(Lowry protein assay kit, P5626, Sigma Chemical Co., USA)를 이용하여 정량하였다. 상기 정량한 바에 따라 동일한 함량으로 분리한 단백질 용액을 12% SDS-PAGE로 분리하여, ECL 나이트로셀룰로스 멤브레인(Hybond enhanced chemiluminescence nitrocellulose membrane, Bio-Rad, USA)에 이동(transfer)시켰다. 상기 단백질을 이동시킨 ECL 나이트로셀룰로스 멤브레인은 5% skimed milk를 이용하여 블로킹한 다음 세척하고, 항체 반응은 각각 COX-2 및 iNOS에 대한 1차 항체(primary antibody, SantaCruz Biotechnology, USA)를 첨가하여 4℃에서 24시간 반응시킨 후, 세척한 다음 상기 세척한 멤브레인에 2차 항체(secondary antibody, HRP conjugated anti-rabbit antibody(horseradish peroxidase conjugated anti-rabbit antibody))를 첨가하고, 1시간 동안 반응시킨 후 세척하고, 항체에 의한 신호를 ECL 검출 시스템(ECL detection, Amersham Pharmacia Biotech, USA)을 이용하여 제공된 방법(protocol)에 따라 각각의 단백질 발현량을 확인하였다.

그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이, 염증과 관련이 없는 β-actin의 경우 모든 실험군에서 발현의 변화가 없었으나, 염증과 관련된 iNOS와 COX-2 단백질 발현량의 경우 LPS 및 시료 첨가 여부에 따라 그 발현량이 변화하였다. 즉, LPS를 첨가하지 않은 대조군에서는 iNOS와 COX-2 단백질들이 발현되지 않았으나, LPS를 첨가한 경우에는 iNOS와 COX-2 단백질의 발현이 급격히 증가하는 것으로 확인되었다. 또한, 본 발명의 페니실리놀라이드 A를 첨가한 경우에는 농도 의존적으로 iNOS와 COX-2 단백질 발현이 감소하는 것이 확인되었고, LPS만 처리한 대조군과 비교하면 iNOS의 경우 20 μM을 처리한 실험군부터 유의하게 감소하는 것이 확인되었으며, COX-2의 경우에도 20 μM을 처리한 실험군부터 유의하게 감소하는 것이 확인되었다(도 4).

상기 결과로부터, 본 발명의 페니실리놀라이드 A의 첨가는 iNOS와 COX-2 단백질의 발현량을 감소시키고, 결과적으로 iNOS 및 COX-2의 발현을 억제하여, 염증성 사이토카인을 저해함으로써, 항염효과가 있는 것으로 확인되었다.

< 실시예 8> 페니실리놀라이드 A의 염증 관련 단백질의 생성 및 활성화 억제 효과 확인

염증 유도 단백질의 발현 억제 물질로 알려진 NF-κB(p65)의 핵으로 이동(nuclear translocation)을 억제하는 물질인 IκB-α의 인산화 및 분해 억제 여부를 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 실시예 <7-1>과 동일한 방법으로 세포질 분획, 및 핵 및 세포질 분획을 수집하여, 세포질 분획에서 IκB-α 및 인산화된 IκB-α(phosphorylated IκB-α, p-IκB-α)의 함량과 핵 및 세포질 분획에서 p65의 함량을 각각에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석법으로 측정하였다.

또한, 수집된 핵 및 세포질 분획에서 NF-κB의 DNA에 대한 결합 정도(binding activity)의 측정은 TransAM 키트(TransAM kit, Active Motif, USA)를 이용하여 제조사에서 제공한 실험방법(protocol)에 따라 수행하였다.

그 결과 도 5A에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 LPS를 처리한 군에서 IκB-α의 발현이 현저히 감소하는 것이 확인되어, LPS에 의한 염증 유도는 IκB-α의 감소 즉, IκB-α의 분해를 유도하는 것이 확인되었고, 페니실리놀라이드 A를 처리한 경우, 농도의존적으로 IκB-α의 발현이 증가하여, 상기 페니실리놀라이드 A의 처리에 의해 LPS에 의해 유도된 IκB-α의 분해가 억제되는 것이 확인되었다. 또한, 아무런 처리를 하지 않은 군에 비해 LPS를 처리한 처리군에서 p-IκB-α의 발현이 증가한 것이 확인되어, LPS에 의한 염증 유도는 p-IκB-α의 증가 즉, IκB-α의 인산화 즉, 활성화를 유도하는 것이 확인되었다. 한편, 페니실리놀라이드 A를 처리한 경우, 농도의존적으로 p-IκB-α의 발현을 감소시켜, 페니실리놀라이드 A의 처리에 의해 LPS에 의해 유도된 IκB-α의 활성화가 억제되는 것이 확인되었다(도 5A).

또한, 도 5B에 나타낸 바와 같이, 아무런 처리를 하지 않은 군에 비해 LPS를 처리한 군의 핵 분획에서 p65 즉, NF-κB의 발현이 증가한 것이 확인되어, LPS에 의한 염증 유도는 p65의 증가 즉, NF-κB의 핵 내로의 이동을 유도하는 것이 확인되었다. 한편, 페니실리놀라이드 A를 처리한 경우, 농도의존적으로 p65의 발현이 감소하여, 상기 페니실리놀라이드 A의 처리에 의해 LPS에 의해 유도된 NF-κB의 핵 내로의 이동이 억제되는 것이 확인되었다(도 5B).

또한, 도 5C에 나타낸 바와 같이, 아무런 처리를 하지 않은 군에 비해 LPS를 처리한 군에서 NF-κB의 DNA 결합 정도(DNA binding activity)가 약 4배 가까이 증가한 반면, 페니실리놀라이드 A를 처리한 경우, 농도의존적으로 NF-κB의 DNA 결합 정도가 감소되고, 10 μM을 처리한 실험군부터 유의적으로 DNA 결합 정도가 감소되었으며, 10 μM을 처리한 실험군에서는 약 50% 정도로 감소되었다(도 5C).

상기 결과로부터, 페니실리놀라이드 A는 세포 내에서 IκB-α의 분해를 억제하고, p-IκB-α의 생성 즉, IκB-α의 활성화를 억제하며, NF-κB의 핵 내로의 이동을 억제하고, NF-κB의 DNA 결합 정도(DNA binding activity)를 약화시켜, LPS 처리에 의해 유도된 염증을 억제하는 효과 즉, 항염 효과가 우수한 것으로 확인되었다.

< 실시예 9> 본 발명의 페니실리놀라이드 A의 염증 관련 효소의 생성 및 활성화 억제 효과 확인

염증 관련 효소로 알려진 헤마틴 산화효소-1(Heme Oxygenase-1, HO-1)의 발현 및 활성을 측정하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 실시예 <7-1>과 동일한 방법으로 세포질 분획, 및 핵 및 세포질 분획을 수집하여, 세포질 분획에서 HO-1의 mRNA 함량, HO-1 생성량 및 HO-1의 활성을 측정하였고, 페니실리놀라이드 A를 40 μM로 처리하였을 때, 시간에 따라 HO-1의 발현량을 측정하였다. 양성대조군으로 HO-1의 발현을 촉진하는 코발트 프로토포르피린(Cobalt protophorphyrin, CoPP)를 20 μM 함량으로 처리하였다. HO-1의 활성(Assay for HO activity)은 수집된 세포로부터 수득한 마이크로좀(microsome)에 NADPH와 담록소 환원효소(biliverdin reductase)로서 쥐 간 세포질 액상 매질(rat liver cytosol) 및 헤민(hemin)이 포함된 반응용액(reaction mixture)을 첨가하였다. 상기 반응은 암조건 및 37℃의 온도조건에서 1시간 동안 수행하였고, 1 ml의 클로로포름(chloroform)을 처리하여 종결시켰다. 추출한 빌리루빈(bilirubin) 값을 464 nm 및 530 nm에서의 흡광도를 측정하여 그 차이로 확인하였다.

그 결과 도 6A에 나타낸 바와 같이, 양성대조군인 CoPP를 처리한 경우, 아무런 처리를 하지 않은 대조군에 비하여 현저하게 HO-1의 활성이 증가된 것이 확인되었고, 페니실리놀라이드 A를 처리한 경우, 농도 의존적으로 HO-1의 활성이 증가하여, 40 μΜ를 처리한 경우에는 양성대조군인 CoPP를 처리한 경우와 같이 유의한 것으로 확인되었다(도 6A).

또한, 상기 HO-1의 생성 여부와 관련해서는 실시예 <7-2>와 같은 방법으로 HO-1에 대한 웨스턴 블롯 분석법으로 수행하였으며, 페니실리놀라이드 A 처리 농도 및 처리 시간에 따른 HO-1 단백질 생성 여부를 확인하였다.

그 결과 도 6B에 나타낸 바와 같이, 페니실리놀라이드 A를 처리한 경우, 농도 의존적으로 HO-1의 생성량이 증가하여, 40 μΜ를 처리한 경우에는 양성대조군인 CoPP를 처리한 경우와 같이 유의한 것으로 확인되었다(도 6B).

또한, 생성량이 가장 많은 것으로 확인된 40 μΜ를 처리한 경우, 처리시간에 따른 HO-1의 생성량을 확인한 결과, 도 6C에 나타낸 바와 같이, 페니실리놀라이드 A를 처리한 후 6시간이 경과한 다음부터 HO-1가 생성되는 것이 확인되었고, 18시간이 경과된 시점에서 명확하게 증가된 밴드가 확인되어, HO-1의 생성량이 페니실리놀라이드 A 처리에 따른 시간이 경과함에 따라 증가됨이 확인되었다(도 6C).

상기에서 보는 바와 같이, 본 발명을 통해 페니실리움 속(Penicillium sp.) SF-5292 균주를 이용하여 본 발명의 신규 페니실리놀라이드(penicillinolide) A 화합물을 대량 생산할 수 있으며, 본 발명의 페니실리놀라이드 A 화합물을 이용하여 항염증용 조성물을 개발하는데 사용될 수 있다.

한국생명공학연구원 KCTC18284P 20140425

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Composition for the prevention and treatment of inflammatory diseases comprising the penicillinolide A isolated from marine fungi <130> 2014P-04-069 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 915 <212> RNA <213> Penicillium sp. SF-5292 <400> 1 ttttttctcc tccccccccc cccgaaatat cataagcgga ggaaaagaaa ccaacaggga 60 ttgccccagt aacggcgagt gaagcggcaa gagctcaaat ttgaaagctg gctccttcgg 120 ggtccgcatt gtaatttgta gaggatgctt cgggagcggt ccccatctaa gtgccctgga 180 acgggacgtc atagagggtg agaatcccgt atgggatggg gtgtccgcgc ccgtgtgaag 240 ctccttcgac gagtcgagtt gtttgggaat gcagctctaa atgggtggta aatttcatct 300 aaagctaaat attggccgga gaccgatagc gcacaagtag agtgatcgaa agatgaaaag 360 cactttgaaa agagagttaa aaagcacgtg aaattgttga aagggaagcg cttgcgacca 420 gactcgctcg cggggttcag ccggcattcg tgccggtgta tttccccgcg ggcgggccag 480 cgtcggtttg ggcggtcggt caaaggccct cggaaggtaa cgcccctagg ggcgtcttat 540 agccgagggt gcaatgcgac ctgcctagac cgaggaacgc gcttcggctc ggacgctggc 600 ataatggtcg taagcgaccc gtcttgaaac acggaccaag gagtctaaca tctacgcgag 660 tgttcgggtg tcaaacccgt gcgcgaagtg aaagcgaacg gaggtgggaa cccttacggg 720 tgcaccatcg accgatcctg aagtcttcgg atggatttga gtaagagcgt agctgttggg 780 acccgaaaga tggtgaacta tgcctgaata gggcgaagcc agaggaaact ctggtggagg 840 ctcgtagcgg ttctgacgtg caaatcgatc gtcgaatttg ggtatagggg cgaaagacta 900 atcgaaccat ctagc 915

Claims (5)

1. 하기 화학식 2로 표시되는 페니실리놀라이드(Penicillinolide) A 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 이의 입체 이성질체:
   [화학식 2]
   

   

   .
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 균주는 수탁번호 KCTC 18284P로 기탁된 페니실리움 속 SF-5292 균주인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 이의 입체 이성질체.
   
3. 1) 페니실리움 속 균주를 배양하는 단계;
   2) 상기 1) 단계에서 얻어진 균주 배양물을 메틸에틸케톤(Methylethylketone)으로 추출하는 단계; 및,
   3) 상기 2) 단계에서 얻어진 메틸에틸케톤 추출물을 컬럼 크로마토그래피로 분리하는 단계를 포함하는 페니실리놀라이드 A 화합물의 분리 방법.
   
4. 제 1항의 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 이의 입체 이성질체를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
   
5. 제 4항에 있어서, 상기 염증성 질환은 피부염, 알레르기, 전신성 홍반성 낭창, 망막염, 위염, 간염, 장염, 췌장염, 신장염 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
   
   

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