KR102661178B1 - 락토바실러스 파라카세이 유래 세포외소포를 포함하는 안질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 락토바실러스 파라카세이 유래 세포외소포 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 자세하게는 산화 스트레스에 의한 세포 노화와 관련해서 발생하는 안질환 발생을 효과적으로 억제할 수 있는 락토바실러스 파라카세이 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 안질환 개선, 예방, 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

락토바실러스 파라카세이 유래 세포외소포를 포함하는 안질환 예방 또는 치료용 조성물{Composition for Prevention or Treatment of Ocular Diseases Comprising Extracellular Vesicles derived from Lactobacillus paracasei}

본 발명은 락토바실러스 파라카세이 유래 세포외소포 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 락토바실러스 파라카세이 유래 세포외소포를 유효성분으로 포함하는 안질환 예방 또는 치료용 조성물 등에 관한 것이다.

21세기에 들어서면서 과거 전염병으로 인식되던 급성 감염성 질환의 중요성은 감소된 반면, 인간과 공생 미생물과의 부조화에 의해 발생하는 면역기능 이상을 동반한 만성질환 및 우리 몸의 주요 장기에 발생하는 노화 관련 만성질환이 삶의 질 감소와 인간 수명을 결정하는 주요 질환으로 질병 패턴이 바뀌었다. 여러 가지 스트레스에 의한 면역기능 및 대사기능 이상을 특징으로 하는 21세기 난치성 만성질환으로서, 암, 심혈관질환, 만성폐질환, 대사질환, 및 신경-정신질환이 인간 수명과 삶의 질을 결정하는 주요 질환으로서 국민보건에 큰 문제가 되고 있다.

면역(immunity)은 생물학적, 화학적, 물리적, 정신적 스트레스에 대한 세포의 방어기작으로, 선천면역(innate immunity)과 후천면역(adaptive immunity)을 통해 일어나게 된다. 대사(metabolism)는 우리 몸에 필요한 에너지를 만들어서 세포의 기능을 수행할 여러 가지 물질을 만드는 것으로서 미토콘드리아에서 만들어진 ATP를 통해 소포체(endoplasmic reticulum, ER)에서 단백질과 지질이 만들어져 필요한 영역으로 물질을 공급한다. 세포는 생기는 순간부터 여러 가지 스트레스에 직면하게 되는데, 생물학적, 화학적, 물리적, 정신적 스트레스는 세포 내에서 소포체(ER) 스트레스를 유도하고, ER 스트레스가 지속되면 세포는 사멸하거나 암세포로 변하게 된다. 따라서 최근 문제가 되는 많은 난치성 질환은 반복적인 ER 스트레스에 의해 면역기능과 대사기능에 이상이 초래되어 발생한다는 사실이 최근에 밝혀지고 있다.

한편, 안구의 망막은 중추신경계에 속하는 기관으로, 성숙한 망막 세포는 뇌에 존재하는 대부분의 뉴런 세포와 마찬가지로 정상 상태에서는 분열하지 않는다. 따라서, 망막 세포의 기능이 저하되면 시각 기능에 이상이 나타나기 쉬우며 노화가 빠르게 진행되게 된다. 망막 세포의 기능이 저하되는 가장 큰 원인으로는 산화적 스트레스가 꼽히는데, 안구를 구성하는 망막, 시신경, 광수용체 세포, 수정체를 포함하는 조직은 일상생활에서 빛, 자외선과 같은 산화적 손상에 꾸준히 노출되기 때문이다. 이러한 산화적 손상에 의해 세포를 구성하는 DNA, 단백질, 지질에 변형이 나타나고 세포 사멸이 유도되면서 눈에 노화가 발생하고, 심각하게는 지도모양 위축증(geographic atrophy), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 백내장(cataract), 녹내장(glaucoma) 및 안구건조증(dry eye) 등과 같은 노화 관련 안질환이 발생하게 된다.

또한, 블루라이트(blue light), 자외선 등과 같은 환경적 스트레스에 대해 시각과 관련된 세포가 제대로 방어하지 못하면 눈에 염증이 발생하고, 반복적인 스트레스에 의해 만성 염증성 안질환이 발생하게 되며, 최근에는 이러한 만성 염증성 안질환을 치료 또는 예방하기 위하여 염증질환의 주요 매개체로 알려진 염증성 사이토카인인 TNF-α 억제제에 대한 관심이 증가되고 있다.

인체에 공생하는 미생물은 100조에 이르러 인간 세포보다 10배 많으며, 미생물의 유전자수는 인간 유전자수의 100배가 넘는 것으로 알려지고 있다. 미생물총(microbiota 혹은 microbiome)은 주어진 거주지에 존재하는 진정세균(bacteria), 고세균(archaea), 진핵생물(eukarya)을 포함한 미생물 군집(microbial community)을 말한다.

우리 몸에 공생하는 세균 및 주변 환경에 존재하는 세균은 다른 세포로의 유전자, 저분자화합물, 단백질 등의 정보를 교환하기 위하여 나노미터 크기의 소포(vesicle)를 분비한다. 점막은 200 나노미터(nm) 크기 이상의 입자는 통과할 수 없는 물리적인 방어막을 형성하여 점막에 공생하는 세균인 경우에는 점막을 통과하지 못하지만, 세균 유래 소포는 크기가 200 나노미터 크기 이하라서 비교적 자유롭게 점막을 통하여 상피세포를 통과하여 우리 몸에 흡수된다. 이와 같이, 세균 유래 소포는 세균에서 분비된 것이지만, 세균과 구성 성분, 체내 흡수율, 부작용 위험성 등이 서로 상이하며, 이로 인하여 세균 유래 소포를 사용하는 것은 살아있는 세균을 사용하는 것과는 전혀 상이하거나 현저한 효과를 나타낸다.

국소적으로 분비된 세균 유래 소포는 점막의 상피세포를 통해 흡수되어 국소 염증반응을 유도할 뿐만 아니라, 상피세포를 통과한 소포는 림프관을 통해 전신에 흡수되어 각 장기로 분포하고, 분포된 장기에서 면역 및 염증반응을 조절한다. 예를 들어, 대장균(Eshcherichia coli))과 같은 병원성 세균에서 유래하는 소포는 바이러스를 모사하는 병원성 나노 입자로서 국소적으로 대장염이나 식중독을 일으키고, 혈관으로 흡수된 경우에 혈관 내피세포 염증반응을 통해 전신적인 염증반응 및 혈액응고를 촉진시킨다. 반면, 유익한 세균에서 유래하는 소포는 병원성 소포에 의한 면역기능 및 대사기능 이상을 조절하여 질병을 조절할 수 있다.

젖산균(lactic acid bacteria) 또는 유산균(乳酸菌)은 물질대사에 의해 탄수화물을 젖산으로 분해시키는 세균의 총칭이다. 요구르트, 유산균음료, 김치 등의 식품을 발효시키며, 일부 젖산균은 창자 등의 소화기관(장내세균)이나 질 안에 존재하여 다른 병원미생물로부터 몸을 지키고, 항상성 유지를 돕는다고 알려져 있다. 이 중에서 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 세균은 아포(spore)를 형성하지 않는 통기성 유산균으로 인간의 위장관, 여성의 질에 공생하는 세균으로 병원성 세균으로부터 인간의 신체를 지키는 역할을 담당한다고 알려져 있다.

그러나 아직까지 락토바실러스 파라카세이 유래 소포를 활용하여 노화 또는 염증과 관련된 안질환의 치료에 응용한 사례는 보고된 바가 없다.

국내공개특허 10-2019-0105522호

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 발명한 것으로, 본 발명의 목적은 락토바실러스 파라카세이 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 락토바실러스 파라카세이 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 락토바실러스 파라카세이 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 락토바실러스 파라카세이 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환 예방 또는 개선용 흡입용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 락토바실러스 파라카세이 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환 치료 약물전달용 조성물을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 락토바실러스 파라카세이 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 락토바실러스 파라카세이 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 파라카세이 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 파라카세이 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환 예방 또는 개선용 흡입용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 파라카세이 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환 치료 약물전달용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 안질환은 노화 관련 안질환일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 안질환은 염증성 안질환일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 안질환은 레베르 선천 흑암시(LCA), 스타가르트병, 어셔 증후군, 맥락막 결여, 로드-콘 또는 콘-로드 디스트로피, 섬모병증, 미토콘드리아 장애, 진행성 망막 위축증, 퇴행성 망막 질환, 나이관련황반변성(age-related macular degeneration, AMD), 습성 AMD, 건성 AMD, 지도상 위축증, 가족형 또는 획득 황반병증, 망막 광수용체 질환, 망막 색소 상피계 질환, 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 낭포성 황반 부종, 망막박리, 외상성 망막 손상, 의원성 망막 손상, 황반 원공, 황반 모세관확장증, 신경절 세포 질환, 시신경 세포 질환, 녹내장(glaucoma), 백내장(cataract), 시신경병증, 허혈성 망막 질환, 미숙아 망막증, 망막 혈관 폐색, 가족형 마크로아뉴리즘, 망막 혈관 질환, 안혈관 질환, 녹내장으로 인한 망막신경세포 퇴화 및 허혈성 시신경병증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 염증성 안질환은 색소성 망막염(RP), 결막염(conjunctivitis), 공막염(scleritis), 각막염(keratitis), 홍채염(iritis), 포도막염(uveitis), 맥락망막염(chorioretinitis), 맥락염(choroiditis), 및 망막염(retinitis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 염증성 안질환은 IL-6에 의해 매개되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 안질환은 면역기능 또는 대사기능 이상이 초래되어 발생되는 안질환일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 안질환은 산화 스트레스에 의한 안질환일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 소포는 평균 직경이 10 내지 300 nm일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 소포는 락토바실러스 파라카세이에서 자연적으로 또는 인공적으로 분비되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 소포는 락토바실러스 파라카세이의 배양액 또는 락토바실러스 파라카세이를 첨가하여 배양한 식품에서 분리할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 파라카세이 유래 소포를 유효성분으로 하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 안질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 파라카세이 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 조성물의 안질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 파라카세이 유래 소포의 안질환 예방 또는 치료 약제 제조를 위한 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 파라카세이 유래 소포의 안질환 예방 또는 개선 식품 제조를 위한 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 파라카세이 유래 소포의 안질환 예방 또는 치료 의약외품 제조를 위한 용도를 제공한다.

본 발명에 따른 락토바실러스 파라카세이 유래 소포는 우리 몸에 흡수된 후, 뇌혈관 장벽(blood brain barrier, BBB)를 통과하여 중추신경계로 분포하고, 세포에 흡수된 후 난치성 염증질환의 주요 매개체인 IL-6의 분비를 효과적으로 억제하고, AMPK 신호를 활성화하여 대사기능을 증가시켜, 세포 노화 및 염증에 의한 안질환의 발생을 효율적으로 억제함을 확인하였다. 나아가, 산화 스트레스에 의한 안질환 토끼 모델에 상기 소포를 투여하였을 때, 산화 스트레스에 의한 망막 변성의 발생을 유의하게 억제함을 확인하였는 바, 본 발명에 따른 락토바실러스 파라카세이 유래 소포는 안질환의 개선, 예방, 또는 치료제로서 폭넓게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 균 유래 소포를 경구로 투여하여 체내 분포양상을 분석한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 균 유래 소포를 경구로 투여하여 중추신경계로의 분포양상을 분석한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 LPS에 의한 염증성 사이토카인 분비에 대한 락토바실러스 파라카제이 유래 소포의 억제 효과 및 락토바실러스 파라카제이 유래 소포에 열처리, 산처리, 또는 답즙처리 시의 소포의 치료 효과에 미치는 영향을 평가한 도면이다(MDH-001: Lactobacillus paracasei EV).
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 락토바실러스 파라카세이 유래 소포의 대사기능 장애에 대한 치료효능을 평가한 것으로, 대조 약물인 메트포민과 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 유래 소포를 세포에 처리하여 대사기능의 핵심 신호전달 경로인 AMPK 신호전달에 대한 효과를 평가한 것이다 (MDH-001: Lactobacillus paracasei EV).
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 균 유래 소포를 경구로 투여하여 안질환에 대한 효능을 확인하기 위한 동물 모델 실험 방법 및 평가 방법을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 균 유래 소포를 안질환에 대한 효능을 확인하기 위해 산화 스트레스에 의한 안질환 토끼 모델에 소포를 경구로 투여하여 대조군 대비 처리군의 망막변성 면적(retinal degenerated area)를 측정한 결과를 나타낸 도면이다. G1: 미처리 음성대조군, G2: 질환유발 양성대조군, G3: 저용량 소포 처리군, G4: 고용량 소포 처리군.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 균 유래 소포를 노화 관련 안질환에 대한 효능을 확인하기 위해 산화 스트레스에 의한 안질환 토끼 모델에 소포를 경구로 투여한 후, 안저카메라(TRC-50IX, TOPCON, Japan)로 안저를 촬영한 도면이다. G1: 미처리 음성대조군, G2: 질환유발 양성대조군, G3: 저용량 소포 처리군, G4: 고용량 소포 처리군.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 안질환에 대한 락토바실러스 파라카세이 유래 소포의 작용기전을 도식화한 것이다.

본 발명은 락토바실러스 파라카세이 유래 소포 및 이의 용도에 관한 것이다.

본 발명자들은 락토바실러스 파라카세이 유래 소포를 분리하여,

락토바실러스 파라카세이 유래 소포가 경구 투여 후 여러 장기에 잘 전달됨을 확인하였으며, 특히 혈관 뇌 장벽(BBB)을 통과하여 망막을 포함한 중추신경계로 이동 및 분포함을 확인하였다(실시예 2 참조).

또한, 본 발명자들은 LPS에 의한 염증반응에 대하여 락토바실러스 파라카세이 유래 세포외소포가 IL-6의 분비를 억제하였고, 이러한 억제 효과는 소포에 열처리, 산처리, 및 담즙처리에 의해서도 유지됨을 확인하였다(실시예 3 참조).

또한, 본 발명자들은 락토바실러스 파라카세이 유래 소포가 대사 장애 조절의 핵심 신호전달인자인 AMPK 신호를 활성화하여 자가포식을 유도함에 따라, 대사기능의 항상성을 증가시켜 대사 장애에 의한 안질환을 치료할 수 있음을 확인하였다(실시예 4 참조).

또한, 본 발명자들은 산화스트레스에 의한 황반변성 토끼 모델에 락토바실러스 파라카세이 유래 소포를 경구 투여한 결과, 망막 색소 상피세포층의 변성에 의한 황반변성이 유의하게 감소됨을 확인하였다(실시예 5 참조).

따라서, 본 발명은 락토바실러스 파라카세이 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환의 예방, 치료 또는 개선용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 약학적 조성물, 식품 조성물, 및 의약외품 조성물을 포함한다.

이하, 본 발명의 락토바실러스 파라카세이 유래 소포의 안질환 예방, 개선 또는 치료 용도에 대하여 상세히 설명한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “세포외 소포(Extracellular vesicle)” 또는 “소포(Vesicle)”란, 다양한 세균에서 분비되는 나노 크기의 막으로 된 구조물을 의미하며, 예를 들어, 내독소(lipopolysaccharide), 독성 단백질 및 세균 DNA와 RNA도 가지고 있는 대장균과 같은 그람음성균(gram-negative bacteria) 유래 소포 또는 외막 소포체(outer membrane vesicles, OMVs) 및 단백질과 핵산 외에도 세균의 세포벽 구성성분인 펩티도글리칸(peptidoglycan)과 리포테이코산(lipoteichoic acid)도 가지고 있는 마이크로코커스 세균과 같은 그람양성균(gram-positive bacteria) 유래 소포 등이 있다.

본 명세서에 있어서, 상기 소포는 락토바실러스 파라카세이로부터 자연적으로 분비되거나, 인공적으로 생산된 막으로 된 모든 구조물을 총칭한다.

상기 소포는 락토바실러스 파라카세이 배양과정에서 열처리, 고압처리 하거나, 상기 세균 배양액을 원심분리, 초고속 원심분리, 고압처리, 압출, 초음파분해, 세포 용해, 균질화, 냉동-해동, 전기천공, 기계적 분해, 화학물질 처리, 필터에 의한 여과, 겔 여과 크로마토그래피, 프리-플로우 전기영동, 및 모세관 전기영동으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 방법을 사용하여 분리할 수 있다. 또한, 불순물의 제거를 위한 세척, 수득된 소포의 농축 등의 과정을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 락토바실러스 파라카세이의 배양액 또는 발효식품에서 소포를 분리하는 방법은 소포를 포함한다면 특별히 제한되지 않는다. 예컨대 원심분리, 초고속 원심분리, 필터에 의한 여과, 겔 여과 크로마토그래피, 프리-플로우 전기영동, 또는 모세관 전기영동 등의 방법, 및 이들의 조합을 이용하여 소포를 분리할 수 있으며, 또한 불순물의 제거를 위한 세척, 수득된 소포의 농축 등의 과정을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 “안질환”이란 눈과 관련하여 발병하는 질환을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 “노화 관련 안질환(age-related ocular disease)”이란 나이가 들어감에 따른 생체 기능 퇴화에 기이한 안질환뿐만 아니라, 실제 연령대보다 생체 기능이 퇴화하여 노인에게서 주로 나타나는 질환의 증상과 유사한 증상을 나타내는 안질환을 모두 포함하는 개념으로, 본 발명에 있어서, 노화 관련 안질환은 AMPK에 의해 매개되는 안질환 또는 산화적 스트레스에 기이한 안질환을 포함할 수 있다. 상기 노화 관련 안질환은 예를 들어, 레베르 선천 흑암시(LCA), 스타가르트병, 어셔 증후군, 맥락막 결여, 로드-콘 또는 콘-로드 디스트로피, 섬모병증, 미토콘드리아 장애, 진행성 망막 위축증, 퇴행성 망막 질환, 황반변성(age-related macular degeneration, AMD), 습성 AMD, 건성 AMD, 지도상 위축증, 가족형 또는 획득 황반병증, 망막 광수용체 질환, 망막 색소 상피계 질환, 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 낭포성 황반 부종, 망막박리, 외상성 망막 손상, 의원성 망막 손상, 황반 원공, 황반 모세관확장증, 신경절 세포 질환, 시신경 세포 질환, 녹내장(glaucoma), 백내장(cataract), 시신경병증, 허혈성 망막 질환, 미숙아 망막증, 망막 혈관 폐색, 가족형 마크로아뉴리즘, 망막 혈관 질환, 안혈관 질환, 녹내장으로 인한 망막신경세포 퇴화 및 허혈성 시신경병증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어 “염증성 안질환(inflammatory ocular disease)”이란 염증성 원인 인자에 의해 눈에 염증이 발생하여 나타내는 안질환을 모두 포함하는 개념으로, 본 발명에 있어서, 염증성 안질환은 IL-6에 의해 매개되는 안질환 또는 산화적 스트레스에 기이한 안질환을 포함할 수 있다. 상기 염증성 안질환은 예를 들어, 색소성 망막염(RP), 결막염(conjunctivitis), 공막염(scleritis), 각막염(keratitis), 홍채염(iritis), 포도막염(uveitis), 맥락망막염(chorioretinitis), 맥락염(choroiditis), 및 망막염(retinitis) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 있어서, 상기 “망막 지도모양 위축증(retinal geographic atrophy)”은 노화로 인해 눈의 기능이 저하되고 혈류 공급이 원할하게 이뤄지지 않아 망막색소상피에 쌓이는 노폐물인 드루젠(drusen)이 석회화되면서 망막과 맥락막모세혈관이 위축되고, 위축된 부위가 지도모양으로 커져서 중심부위까지 퍼지게 되어 시력을 상실하게 되는 질환을 의미한다.

본 명세서에 있어서, “황반변성(Age-related macular degeneration, AMD)”이란 시력에 매우 중요한 역할을 하는 망막의 황반부에 나이가 들면서 여러 가지 변화가 동반되어 생기는 질병이다. 본 발명에서, 상기 노화 관련 황반변성은 건성(비삼출성) 또는 습성(삼출성)을 포함할 수 있다. “건성 AMD”는 망막에 드루젠이나 망막색소상피의 위축과 같은 병변이 생긴 경우를 말하며, AMD의 90% 가까이를 차지한다. 황반에 있는 시세포가 서서히 위축되어 시간이 지날수록 시력이 차차 떨어지며, 습성 형태로 발전할 수 있다. “습성 AMD”는 망막 밑에 맥락막 신생혈관이 자라서, 이 신생혈관 자체 또는 혈관으로부터의 출혈, 삼출 등에 의해 심한 시력 손상이 발생하기 쉬우며, 발병 후 수개월-수년 사이에 원반형 위축, 심한 출혈 등으로 실명을 초래할 수 있다.

본 명세서에 있어서, “당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy)”이란 당뇨병에서 나타나는 미세혈관 합병증의 하나로, 고혈당과 이에 동반되는 여러 생화학 적인 변화로 망막의 혈관 투과성 증가 허혈과 신생혈관 생성과 같은 모세혈관의 기능적 형태학적 변화에 의해 발생한다. 본 발명에서, 상기 당뇨병성 망막증은 비증식성 또는 증식성 망막병증을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. “비증식성 망막병증”은 망막의 작은 혈관들이 약해져서 혈청이 새거나 혈관이 막혀서 영양 공급이 중단되는 상태를 말한다. “증식성 망막병증”은 혈액순환이 나쁜 곳에 신생 혈관이 생김으로써 적절한 치료를 받지 않으면 신생 혈관에서 발생하는 출혈에 의해 5년 이내에 실명하게 되는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서, 상기 소포는 구형의 형태로, 평균 직경이 10 내지 300 nm, 10 내지 200 nm, 10 내지 190 nm, 10 내지 180 nm, 10 내지 170 nm, 10 내지 160 nm, 10 내지 150 nm, 10 내지 140 nm, 10 내지 130 nm, 10 내지 120 nm, 10 내지 110 nm, 10 내지 100 nm, 10 내지 90 nm, 10 내지 80 nm, 10 내지 70 nm, 10 내지 60 nm, 10 내지 50 nm, 20 내지 200 nm, 20 내지 180 nm, 20 내지 160 nm, 20 내지 140 nm, 20 내지 120 nm, 20 내지 100 nm, 또는 20 내지 80 nm 일 수 있으며, 바람직하게는, 20 내지 200 nm 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어 "유효성분으로 포함하는"이란 상기 락토바실러스 파라카세이 유래 소포의 효능 또는 활성을 달성하는데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다.

본 발명의 조성물 내의 상기 소포의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 또는 0.001 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC) 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜 4000, PEG 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9%염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩 톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO₃) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na₂S₂O₃), 아황산나트륨(Na₂SO₃), 질소가스(N₂), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16(Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈(Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입(AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈(N, Es), 웨코비(W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제(TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.

경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.

본 발명에서, 상기 안구투여는 결막낭 내 투여, 유리체 내 투여, 망막하 투여, 맥락막 상강 투여, 결막 하 투여 및 테논낭 하 투여로 이루어진 군으로부터 선택된 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다. 구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명에서 “예방”이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 파라카세이 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다.

상기 식품 조성물은 건강기능성 식품 조성물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 소포를 식품 첨가물로 사용할 경우, 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 소포는 원료에 대하여 15 중량% 이하, 또는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 0.01-0.20g, 또는 약 0.04-0.10g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01-0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 파라카세이 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 흡입용 조성물 형태로 제공될 수 있다.

흡입 투여제의 경우, 당업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있으며, 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물 및 락토오즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 파라카세이 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 의약외품 조성물 형태로 제공될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 “의약외품”은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것이다. 예를 들어 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 섬유ㆍ고무 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염병을 막기 위한 살균ㆍ살충제 등도 이에 포함된다.

본 발명에 있어서, 의약외품 조성물은 안과용 조성물의 제형으로 제형화하여 사용할 수 있고, 예컨대 안과용 액제, 점안제, 안연고, 주사액, 및 세안약(eyewash)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형으로 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 파라카세이 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환 치료 약물전달용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 “약물전달”이란 특정 장기, 조직, 세포 또는 세포소기관으로 약물을 전달하기 위하여 본 발명에 따른 조성물에 약물을 로딩하여 전달하는 모든 수단 또는 행위를 의미한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 락토바실러스 파라카세이 유래 소포의 분리

락토바실러스 파라카세이 유래 소포(extracellular vesicle; EV)를 분리하기 위하여, 여러 가지 락토바실러스 파라카세이를 자체 제작한 배지에 접종하고 37 ℃에서 200 rpm으로 흡광도(OD_600nm)가 1.0 내지 1.5가 될 때까지 배양한 후에, 배지에 재접종하여 배양하였다. 그리고 균체가 포함되어 있는 배양액을 회수하여 10,000 g로 4 ℃에서 20 분 동안 원심분리하여 균체를 제거된 상층액을 획득하였다. 획득된 상층액은 다시 0.22 μm의 필터를 이용하여 여과하였다. 여과한 상층액은 100 kDa Pellicon 2 Cassette 필터 멤브레인(Merck Millipore)과 MasterFlex pump system(Cole-Parmer)을 이용하여 50 mL 이하의 부피로 농축하였다. 농축시킨 상층액은 다시 0.22 μm의 필터를 이용하여 여과시켜, 락토바실러스 파라카세이 유래 소포를 분리하였다. 상층액에 포함되어 있는 단백질의 양은 Pierce BCA Protein Assay kit(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 측정하였다. 분리된 소포에 대하여 하기 실험들을 실시하였다.

실시예 2: 락토바실러스 파라카세이 유래 소포의 약동학적 특성 분석

락토바실러스 유래 소포의 경구 투여 시 약동학적 특성을 알아보기 위해, 형광 염색시약인 Cy7-NHS으로 염색한 소포를 마우스에 경구 투여하여 투여 직전부터 투여 후 72시간까지 몸과 각 장기에서 발현된 형광을 측정하였다.

도 1에서 나타난 바와 같이 형광 염색된 락토바실러스 파라카제이 유래 소포는 경구 투여 후 1시간이 지나자 위에서 형광시그널이 관찰되었으며, 3시간에는 위와 소장, 대장, 그리고 폐에 약간의 시그널 수치가 기록되었으며, 6시간에는 위, 소장, 대장, 폐 뿐만 아니라 뇌까지 시그널이 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 형광 시그널은 경구 투여 6시간에서 24시간 사이에 가장 강한 시그널을 나타내고 점차 줄어드는 경향을 보였고 48시간 이후로는 거의 사라졌다.

또한, 도 2에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 파라카제이 유래 소포를 경구 투여한 후, 중추신경계로 분포하는 양상을 평가하였을 때, 경구 투여 3시간 이후부터 중추신경계로 분포하였고, 6시간째에 피크를 보였으며, 48시간 후부터는 신호가 없어짐을 관찰하였다.

상기 결과로부터, 락토바실러스 파라카제이 유래 소포를 경구 투여하였을 때 점막을 통과하여 체내에 흡수되어 여러 장기에 분포함을 알 수 있고, 특히 혈관 뇌 장벽(BBB, brain biood barrier)을 통과하여 망막을 포함한 중추신경계로 이동하여 분포함을 알 수 있다.

실시예 3: LPS에 의한 염증반응의 발생에 락토바실러스 파라카세이 유래 소포의 항염증 효과 평가

락토바실러스 파라카세이 유래 소포의 항염 효과를 확인하기 위하여, 마우스 대식세포(RAW 264.7 세포)에 락토바실러스 파라카세이 유래 소포를 각 10μg/ml 및 100μg/ml 씩 전처리한 후, 염증 유도 물질인 LPS(Lipopolysaccharide)를 100ng/ml 처리한 후, 염증 관련 마커인 IL-6의 분비량을 측정하였다. 또한, 락토바실러스 파라카세이 유래 소포를 경구 투여가 가능한지를 평가하기 위하여, 상기 소포에 열처리, 산처리 및 담즙처리를 수행한 후 IL-6의 분비량을 측정하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 양성 대조군인 LPS 100ng/ml 처리 군과 대비하여, 락토바실러스 파라카세이 유래 소포가 IL-6의 분비량을 현저히 감소시키는 것을 확인하였다. 또한, 락토바실러스 파라카세이 유래 소포에 열처리, 산처리, 및 담즙처리 시에도 대식세포에서의 IL-6의 분비 억제 효과가 유지됨을 확인하였다.

이상의 결과는 락토바실러스 파라카세이 유래 소포가 열이나 산에도 안정적이고, 소포를 경구로 투여하였을 때에 항염증 효과가 유지될 수 있음을 알 수 있다.

실시예 4: 대사 장애 조절 핵심 신호전달인 AMPK 신호 활성화에 미치는 락토바실러스 파라카세이 유래 소포의 효과 평가

AMPK(AMP-activated protein kinase) 신호는 자가포식(autophagy) 등의 기전을 통해 에너지 고갈 시에 발생하는 대사 장애를 억제한다. 본 발명에서는 락토바실러스 파라카제이 유래 세포외소포(MDH-001-CM)를 세포에서 처리하여 AMPK 활성화에 미치는 영향을 평가하였다. 60 mm 세포배양 페트리디쉬에 세포를 2 x 10⁶ 개씩 분주한 DMEM 무혈청 배지를 넣어 2시간 동안 배양하였다. 이후, 락토바실러스 파라카세이 유래 소포를 0, 0.1, 1, 10 μg/mL의 농도로 1시간 동안 처리하였으며, 비교군인 인슐린(1 uM)과 메트포민(50 mM) 또한 1시간 동안 처리하였다. 세포 용해 어세이를 진행하기 위해 샘플을 처리한 페트리디쉬를 얼음 위에 올려놓고 상층액을 흡입(suction)한 다음, 차가운 PBS 버퍼를 5 mL씩 넣고 2번 세척하였다. 용해 버퍼(Lysis buffer) 1 mL에 protease/phosphatase 억제제 10 uL를 넣고 잘 섞어준 뒤, 각 디쉬에 세포 용해 버퍼 100 μL씩을 떨어트려 5분간 얼음에서 인큐베이션하였다. 스크래퍼로 세포를 떼어낸 뒤, 1.5 mL 마이크로튜브에 옮겨 볼텍싱 및 얼음에서의 인큐베이션 과정을 각 1분씩 20분간 반복하였다. 이후, 14,000 rpm, 10분, 4℃ 조건으로 원심분리하였으며, 용해된 샘플 상층액을 새로운 1.5 mL 마이크로튜브 2개에 각각 5 μL, 70 μL씩 옮겼다. 5 μL를 옮긴 마이크로튜브는 -20℃에 보관하고, 70 μL를 옮긴 마이크로튜브에는 5X 샘플 버퍼를 16.5 μL 넣은 뒤 100℃에서 5분 동안 끓였다. 끓여진 샘플은 -20℃에 보관하였다. BCA 정량 분석을 진행하기 위해 용해된 샘플 상층액 5 μL씩을 넣은 1.5 mL 마이크로튜브는 상온에 꺼내어두고, 멸균 증류수 20 μL를 넣어 볼텍싱 한 후 스핀다운 하였다. 소 혈청 알부민(BSA)을 멸균 증류수에 2 mg/mL 농도로 녹인 뒤에 1/2씩 희석하여 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.03125, 0 mg/mL 의 스톡을 제조하였다. 96 Well polystyrene 플레이트에 BSA 농도별로 25 μL씩 3개의 웰에 넣고, 용해된 샘플도 25 μL씩 한 개의 well에 넣어주었다. 8 mL의 BCA Protein Assay Reagent A와 160 μL의 BCA Protein Assay Reagent B를 섞어준 뒤, 200 μL씩 well에 넣어주었다. 37℃ 인큐베이터에서 30분간 반응시킨 뒤에 SpectraMax M3 microplate reader (Molecular Devices, USA)를 이용해 562 nm에서 흡광도를 측정하였다. 웨스턴 블롯을 위해 Tris-glycine SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 진행하는 과정에서 10% 겔을 제조하였으며, 각 샘플당 단백질 50 μg을 정량하여 로딩하였다. 니트로셀룰로스 막에 트랜스퍼한 뒤에는 5% skim milk로 차단하는 과정을 거쳐 AMPKα 항체는 1:400, phospho-AMPKα 항체는 1:400, β-actin 항체는 1:1,000 비율로 5% skim milk에 희석하여 막과 함께 밤새 섞어주었다. 1X PBST(0.05% tween-20이 들어있는 PBS) 용액으로 5분씩 세 번 씻어준 후, 항-rabbit IgG, HRP-linked 항체를 1:1,000 비율로 희석하여 1시간 동안 막과 섞어주었다. 1X PBST 용액으로 5분씩 세 번 씻어준 뒤, West-Q Chemiluminescent Substrate Kit의 solution A와 solution B를 1:1로 섞은 용액을 막에 충분히 뿌리고 Chemidoc 기기로 밴드를 확인하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 락토바실러스 파라카세이 유래 소포(MDH-001-CM)의 처리 농도에 의존적으로 인산화된 AMPK의 발현이 증가함을 확인하였다. 이는 락토바실러스 파라카세이 유래 소포가 용량 의존적으로 AMPK 신호를 활성화하여 자가포식을 유도하며, 대사기능 장애를 억제하여 세포의 항상성을 증가시킴을 알 수 있다.

실시예 5: 산화 스트레스(oxidative stress)에 의한 안질환 토끼모델에서 락토바실러스 파라카세이 유래 소포의 치료 효과 평가

산화 스트레스는 노화 관련 황반변성(AMD), 미숙아 망막병증, 망막 광 손상, 녹내장 및 백내장과 같은 무수히 많은 안질환에서 병리학적 관점에서 중요한 역할을 한다는 점은 알려져 있다(문헌 Beatty S., Koh H., Phil M., Henson D., and Boulton M., “The role of oxidative stress in the pathogenesis of age-related macular degeneration”, Surv. Ophthalmol., 45(2): 115-134(2000).. 참조)

이에, 산화 스트레스에 의한 안질환을 유발하기 위하여 토끼에 산화 스트레스에 의해 황반변성을 유발하는 물질인 SI(Sodium iodate)를 단회 정맥 투여하였다. 락토바실러스 파라카제이 유래 소포의 치료 효과를 평가하기 위해 락토바실러스 파라카제이 유래 소포(MDH-001) 0.25mg/kg 및 2.5mg/kg를 유발 3일 전부터 유발 후 7일째까지 매일 1회씩 경구 투여하였다. 평가 방법은 retinal degenerated area(변성된 망막의 면적)을 안저카메라(TRC-50IX, TOPCON, Japan)로 질환 유발 후 7일째 마지막 투여 날에 촬영하여 분석하였다 (도 5 참조).

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 저용량 소포(MDH-001) 처리군(G3)과 고용량 소포(MDH-001) 처리군(G4)에서 양성 대조군(G2) 대비 망막 색소 상피세포층(retinal pigment epithelium, RPE)의 변성된 면적이 통계적으로 유의하게 감소되었고, 이는 용량 의존적임을 확인하였다.

한편, 락토바실러스 파라카제이 유래 소포의 황반변성 치료 효과를 평가하기 위해, 토끼의 우측 안구에 산동제(미드리아실 1% 점안액)를 점안한 후, 동물을 마취하고, 안저카메라를 이용하여, 안저를 촬영한 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, 음성대조군(G1)은 황반변성이 거의 보이지 않고, 질환이 유발된 양성대조군(G2)에서는 황반변성이 확연히 발생됨을 알 수 있었다. 또한, 저용량 소포 처리군(G3)과 고용량 소포 처리군(G4)에서는 양성 대조군 대비 황반변성이 확연히 감소되어 있음을 알 수 있었으며 고용량 처리군에서 감소 효과가 더욱 뚜렷하게 나타났다.

상기 결과들을 통하여, 본 발명의 락토바실러스 파라카세이 유래 소포는 산화 스트레스에 의한 안질환의 발생을 효율적으로 억제함을 알 수 있었다. 특히 병원성 인자에 의한 염증성 매개체 분비를 억제할 뿐만 아니라 대사 스트레스에 대한 저항성을 AMPK 신호를 통해 증가시켜 세포 노화 관련 안질환의 병인을 효율적으로 조절할 수 있음을 확인하였다(도 8 참조).

따라서, 본 발명의 락토바실러스 파라카세이 유래 소포는 세포 노화 관련 및 염증성 안질환의 개선, 예방, 또는 치료용도로서 사용될 수 있을 것으로 기대된다 .

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (12)

1. 락토바실러스 파라카세이 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
   상기 조성물은 락토바실러스 파라카세이 균체가 제거된 것이고,
   상기 안질환은 노화 관련 안질환인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,
   상기 안질환은 레베르 선천 흑암시(LCA), 스타가르트병, 어셔 증후군, 맥락막 결여, 로드-콘 또는 콘-로드 디스트로피, 섬모병증, 미토콘드리아 장애, 진행성 망막 위축증, 퇴행성 망막 질환, 황반변성(age-related macular degeneration, AMD), 습성 AMD, 건성 AMD, 지도상 위축증, 가족형 또는 획득 황반병증, 망막 광수용체 질환, 망막 색소 상피계 질환, 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 낭포성 황반 부종, 망막박리, 외상성 망막 손상, 의원성 망막 손상, 황반 원공, 황반 모세관확장증, 신경절 세포 질환, 시신경 세포 질환, 녹내장(glaucoma), 백내장(cataract), 시신경병증, 허혈성 망막 질환, 미숙아 망막증, 망막 혈관 폐색, 가족형 마크로아뉴리즘, 망막 혈관 질환, 안혈관 질환, 녹내장으로 인한 망막신경세포 퇴화 및 허혈성 시신경병증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
5. 삭제
6. 제1항에 있어서,
   상기 소포는 평균 직경이 10 내지 300 nm인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
7. 제1항에 있어서,
   상기 소포는 락토바실러스 파라카세이에서 자연적으로 또는 인공적으로 분비되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
8. 제1항에 있어서,
   상기 소포는 락토바실러스 파라카세이의 배양액 또는 락토바실러스 파라카세이를 첨가하여 배양한 식품에서 분리한 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
9. 락토바실러스 파라카세이 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환 예방 또는 개선용 식품 조성물로서,
   상기 조성물은 락토바실러스 파라카세이 균체가 제거된 것이고,
   상기 안질환은 노화 관련 안질환인 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
   
10. 락토바실러스 파라카세이 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환 예방 또는 개선용 의약외품 조성물로서,
    상기 조성물은 락토바실러스 파라카세이 균체가 제거된 것이고,
    상기 안질환은 노화 관련 안질환인 것을 특징으로 하는, 의약외품 조성물.
    
11. 락토바실러스 파라카세이 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환 예방 또는 개선용 흡입용 조성물로서,
    상기 조성물은 락토바실러스 파라카세이 균체가 제거된 것이고,
    상기 안질환은 노화 관련 안질환인 것을 특징으로 하는, 흡입용 조성물.
    
    
12. 삭제