CN116710070A - 包含源自藤黄微球菌的胞外囊泡的用于预防或治疗眼病的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于预防、缓解或治疗眼病的组合物，该组合物包括源自藤黄微球菌的囊泡作为活性成分。发明人证实，当囊泡口服时，囊泡通过血脑屏障(BBB)被递送到包括视网膜在内的中枢神经系统。此外证实，当上皮细胞和巨噬细胞用囊泡处理时，不仅大大抑制了生物致病因子对炎症介质的分泌，而且还抑制了生物致病因子的NLRP3蛋白表达。此外证实，当对具有由氧化应激引起的眼病的兔子模型施用囊泡时，由氧化应激引起的视网膜变性得到显著抑制，因此，根据本发明的源自藤黄微球菌的囊泡不仅能够用于预防、缓解或治疗年龄相关性眼病和炎症性眼病的组合物，而且还能够有效地用于开发预防、缓解或治疗年龄相关性眼病和炎症性眼病的药物或保健功能食品。

Description

包含源自藤黄微球菌的胞外囊泡的用于预防或治疗眼病的组 合物

技术领域

本发明涉及源自藤黄微球菌的胞外囊泡及其用途，更特别是涉及一种用于预防或治疗眼病的组合物，该组合物包含源自藤黄微球菌的胞外囊泡作为活性成分。

本申请要求分别于2020年12月28日和2021年10月18日在韩国知识产权局提交的韩国专利申请号10-2020-0184337和10-2021-0138713的优先权和利益，这些申请的说明书和附图中公开的所有内容均并入本申请。

背景技术

进入21世纪以来，过去被公认为流行性疾病的急性传染病已不再重要，而伴随人类与共生微生物之间的不和谐而导致的免疫功能紊乱的慢性病以及发生在人体主要器官的老年性慢性病，作为决定生活质量和人类寿命的主要疾病，已经改变了疾病模式。作为以各种压力引起的免疫和代谢功能异常为特征的21世纪难治性慢性病，癌症、心血管疾病、慢性肺部疾病、代谢性疾病和神经精神疾病是决定人类寿命和生活质量并成为公共卫生一大问题的主要疾病。

老化是指人体器官功能随着时间的推移而退化，而细胞损伤随着时间的积累被认为是老化的常见致因。据揭示，在应对随着年龄增长而增加的各种损伤相关分子模式(DAMP)(如细胞外ATP、高血糖、神经酰胺、淀粉样物质、尿酸结晶、胆固醇结晶等)时激活的NLRP3炎症小体与老化的关系尤为深刻。因此，NLRP3炎症小体已成为预防和治疗年龄相关性疾病的靶标，并且由于年龄相关性慢性疾病可能以伴随免疫和代谢功能的异常和细胞死亡的慢性炎症为特征，有报道称，通过抑制NLRP3炎症小体相关的炎症能够抑制与老化有关的疾病。

免疫是一种针对生物、化学、物理和精神压力的细胞防御机制，并通过先天免疫和适应性免疫发生。最近，关于炎症性疾病的病因，源自生物致病因子的病原体相关分子模式(PAMP)和作为由细胞损伤产生的危险信号的损伤相关分子模式(DAMP)被作为模式识别受体的核苷酸结合寡聚结构域(NLRP)识别，其中，NLRP3形成NLRP3炎症小体并引起各种难治性疾病的事实引起了人们的关注。

新陈代谢是为了制造身体生产执行细胞功能的各种材料所需的能量，并将由线粒体产生的ATP在内质网(ER)中产生的蛋白质和脂类提供给对其需要的区域。从细胞产生的那一刻起，细胞就面临着各种压力，并且生物、化学、物理和心理压力诱发细胞中的ER压力、线粒体功能障碍和溶酶体损伤，并激活NLRP3炎症小体以诱发细胞死亡，从而导致各种疾病。

同时，眼睛的视网膜是一种属于中枢神经系统的器官，成熟的视网膜细胞在正常情况下不会像大脑中存在的大多数神经元细胞那样进行分裂。因此，当视网膜细胞的功能下降时，很容易出现视觉功能的异常，并且老化迅速进展。视网膜细胞功能恶化的最大致因是氧化应激，这是因为构成眼睛的组织，包括视网膜、视神经、感光细胞和晶状体，在日常生活中不断暴露于氧化应激，如光和紫外线。由于这种氧化应激，随着构成细胞的DNA、蛋白质和脂质的改变的发生和细胞死亡的诱发，眼部老化发生，严重的是，发生年龄相关性眼病，如视网膜地图状萎缩、糖尿病视网膜病变、白内障、青光眼、干眼症等。

此外，当与视力有关的细胞不能正确抵御环境应激，如蓝光和紫外线时，眼睛的炎症就会发生，并由于反复应激而发生慢性炎症性眼病。最近，为了治疗或预防这些慢性炎症性眼病，人们对已知为炎症性疾病主要介质的炎症细胞因子TNF-α的抑制剂越来越感兴趣。

已知在人体内共存的微生物数量达到100万亿，是人体细胞数量的约10倍，而微生物的基因数量是人类基因数量的100倍。微生物群或微生物组是指存在于特定栖息地的微生物群落，包括细菌、古细菌和真核生物。

共存于我们体内的细菌和存在于周围环境中的细菌分泌出纳米级的囊泡，与其他细胞交换诸如基因、低分子化合物和蛋白质之类的信息。粘膜形成具有200纳米(nm)或更大尺寸的颗粒不能通过的物理防御膜，使得共存于粘膜中的细菌不能通过粘膜，但细菌源性囊泡具有200纳米或更小的尺寸，因此相对自由地经由粘膜通过上皮细胞而被我们的身体吸收。如上所述，虽然细菌源性囊泡是从细菌中分泌出来的，但它们在其成分、在体内的吸收率和副作用的风险方面都与细菌不同，因此，使用细菌源性囊泡与使用活细胞完全不同，或具有显著效果。

局部分泌的细菌源性囊泡通过粘膜的上皮细胞吸收以诱发局部炎症反应，而已通过上皮细胞的囊泡则通过淋巴管被全身吸收而分布到各自的器官，并调节分布器官的免疫和炎症反应。例如，源自致病性革兰氏阴性细菌[如大肠杆菌(E.coli)]的胞外囊泡是模仿病毒的致病性纳米颗粒，在局部引起结肠炎，并且当吸收到血管后，通过血管内皮炎症反应促进全身炎症反应和血液凝固，并被吸收到胰岛素作用的肌细胞中，从而引起胰岛素抵抗和糖尿病。另一方面，源自有益细菌的囊泡可通过调节致病性囊泡引起的免疫和代谢功能的异常来控制疾病。

藤黄微球菌是指属于微球菌属的革兰氏阳性细菌，广泛分布在自然界(如水、灰尘和土壤)中。已知这些细菌在有毒的有机污染物(如吡啶)中生长时可产生核黄素，并通过叶黄素色素吸收紫外线。已知这些细菌还从乳制品和啤酒中分离出来，在干燥环境或高盐环境中生长，并在冷藏温度下(例如在冰箱中)长期存活，但是不会形成孢子。

然而，目前还没有关于使用藤黄微球菌源性囊泡治疗眼病的应用案例的报道。

发明内容

[技术问题]

发明人为解决常规问题进行了认真研究，证实用源自藤黄微球菌的囊泡处理细胞时，囊泡不仅能显著抑制致病性纳米颗粒对炎症介质的分泌，还能有效抑制生物致病因子的异常免疫功能。此外证实，源自藤黄微球菌的囊泡抑制了作为与各种疾病原因有关的模式识别受体的NLRP3蛋白的表达，并且通过增加内皮NO合成酶(eNOS)信号传导抑制了异常的免疫功能。此外证实，当口服时，囊泡通过血脑屏障(BBB)被递送到中枢神经系统。此外，当用囊泡治疗具有由氧化应激引起的眼病的兔子模型时，证实视网膜变性以剂量依赖的方式受到抑制。因此，本发明得以完成。

因此，本发明的一个目的是提供一种用于预防或治疗眼病的药物组合物，其包括源自藤黄微球菌的囊泡作为活性成分。

此外，本发明的另一个目的是提供一种用于预防或缓解眼病的食品组合物，其包括源自藤黄微球菌的囊泡作为活性成分。

此外，本发明的另一个目的是提供一种用于预防或缓解眼病的准药物组合物，其包括源自藤黄微球菌的囊泡作为活性成分。

此外，本发明的另一个目的是提供一种用于预防或缓解眼病的吸入剂组合物，其包括源自藤黄微球菌的囊泡作为活性成分。

此外，本发明的另一个目的是提供一种用于递送治疗眼病的药物的组合物，其包括源自藤黄微球菌的囊泡作为活性成分。

然而，本发明要实现的技术问题并不限于上述问题，其他未提及的问题可由本领域技术人员从以下描述中清楚地了解。

[技术方案]

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了一种用于预防或治疗眼病的药物组合物，其包括源自藤黄微球菌的囊泡作为活性成分。

此外，本发明提供了一种用于预防或缓解眼病的食品组合物，其包括源自藤黄微球菌的囊泡作为活性成分。

此外，本发明提供了一种用于预防或缓解眼病的准药物组合物，其包括源自藤黄微球菌的囊泡作为活性成分。

此外，本发明提供了一种用于预防或缓解眼病的吸入剂组合物，其包括源自藤黄微球菌的囊泡作为活性成分。

此外，本发明提供了一种用于递送治疗眼病的药物的组合物，其包括源自藤黄微球菌的囊泡作为活性成分。

作为本发明一示例性实施方案，眼病可以是由NOD样受体含吡啶结构域的蛋白3(NLRP3)炎症小体介导的眼病，但本发明不限于此。

作为本发明另一示例性实施方案，眼病可以是年龄相关性眼病，具体而言，该眼病可以是选自由视网膜地图状萎缩、糖尿病视网膜病变、白内障、青光眼和干眼症组成的群组的一种或多种疾病，但本发明不限于此。

作为本发明另一示例性实施方案，眼病可以是炎症性眼病，具体而言，眼病可以是选自由结膜炎、巩膜炎、角膜炎、虹膜炎、葡萄膜炎、脉络膜视网膜炎、脉络膜炎和视网膜炎组成的群组的一种或多种疾病，但本发明不限于此。

作为本发明另一示例性实施方案，囊泡可以具有10至200nm的平均直径，但本发明不限于此。

作为本发明另一示例性实施方案，囊泡可以由藤黄微球菌自然分泌或者人工产生，但本发明不限于此。

作为本发明另一示例性实施方案，该组合物可抑制NOD样受体含吡啶结构域的蛋白3(NLRP3)炎症小体的活性，但本发明不限于此。

作为本发明另一示例性实施方案，眼病可以是选自由视网膜地图状萎缩、糖尿病视网膜病变、白内障、青光眼、干眼症、结膜炎、巩膜炎、角膜炎、虹膜炎、葡萄膜炎、脉络膜视网膜炎、脉络膜炎和视网膜炎组成的群组的一种或多种疾病，但本发明不限于此。

此外，本发明提供了一种用于预防或治疗眼病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用包含源自藤黄微球菌的囊泡作为活性成分的组合物。

此外，本发明提供了包含源自藤黄微球菌的囊泡作为活性成分的用于预防或治疗眼病的组合物的用途。

此外，本发明提供了源自藤黄微球菌的囊泡用于制备预防或治疗眼病的药物的用途。

此外，本发明提供了一种递送治疗眼病的药物的方法，该方法包括向有需要的受试者施用含有治疗眼病的药物的组合物，该组合物包含源自藤黄微球菌的囊泡作为活性成分。

此外，本发明提供了用于递送治疗眼病的药物的组合物的用途，该组合物包含源自藤黄微球菌的囊泡作为活性成分。

此外，本发明提供了源自藤黄微球菌的囊泡用于制备递送治疗眼病的药物的用途。

[有益效果]

发明人证实，当源自藤黄微球菌的囊泡口服时，囊泡通过血脑屏障(BBB)被递送到中枢神经系统。此外证实，当上皮细胞和巨噬细胞用囊泡处理时，不仅大大抑制了生物致病因子的炎症介质的分泌，而且还抑制了生物致病因子的NLRP3蛋白表达。此外证实，当对具有由氧化应激引起的眼病的兔子模型施用囊泡时，由氧化应激引起的视网膜变性得到显著抑制。因此，预期根据本发明源自藤黄微球菌的囊泡不仅能有效地用于预防、缓解或治疗眼病的组合物，而且还能有效地用于治疗眼病的药物递送系统。

附图说明

图1显示了在小鼠口服藤黄微球菌源性囊泡后，通过移除器官随时间推移测量每个器官的荧光强度的结果。

图2显示了小鼠口服藤黄微球菌源性囊泡后，随着时间的推移囊泡在大脑中的分布模式。

图3显示了用于评价藤黄微球菌源性囊泡(M.luteus EV)在上皮细胞中的抗炎作用的实验方案。

图4a和图4b是用藤黄微球菌源性囊泡(M.luteus EV)和阳性对照药物地塞米松(Dex)处理上皮细胞以评价藤黄微球菌源性囊泡(M.luteus EV)的抗炎效果的结果：图4a显示了根据藤黄微球菌源性囊泡的浓度抑制IL-8分泌的效果；并且图4b显示了与阳性对照药物地塞米松的IL-8分泌抑制效果的比较(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，在下文中n.s.表示不显著)。

图5显示了用于评价藤黄微球菌源性囊泡(M.luteus EV)在巨噬细胞中的抗炎效果的实验方案。

图6a和图6b是用藤黄微球菌源性囊泡(M.luteus EV)处理巨噬细胞以评价藤黄微球菌源性囊泡(M.luteus EV)的抗炎效果的结果：图6a显示了对TNF-α分泌的抑制效果；并且图6b显示了对IL-6分泌的抑制效果。

图7是通过用藤黄微球菌源性囊泡(M.luteus EV)或阳性对照药物地塞米松处理从外周血中分离的中性粒细胞来评价作为生物致病因子的大肠杆菌源性囊泡(E.coli EV)对中性粒细胞激活程度的实验方案。

图8是在用藤黄微球菌源性囊泡(M.luteus EV)和阳性对照药物地塞米松处理从外周血中分离的中性粒细胞时，通过中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)的分泌来评价作为致病性纳米颗粒的大肠杆菌源性囊泡(E.coli EV)对中性粒细胞激活程度的结果。

图9是用于确认小鼠模型中由藤黄微球菌源性囊泡(M.luteus EV)引起的炎症性疾病抑制作用及其作用机制的实验方案，该小鼠模型具有由作为致病性纳米颗粒的大肠杆菌源性囊泡(E.coli EV)引起的炎症性疾病。

图10a和图10b显示了在具有由作为致病性纳米颗粒的大肠杆菌源性囊泡(E.coliEV)引起的炎症性疾病的小鼠模型中，藤黄微球菌源性囊泡(M.luteus EV)的炎症抑制效果：图10a显示了确认小鼠模型的支气管肺泡灌洗液(BALF)中巨噬细胞和中性粒细胞数量的结果；并且图10b显示了小鼠模型的肺组织中的炎症细胞浸润。

图11a至图11c显示了小鼠模型中藤黄微球菌源性囊泡(M.luteus EV)对炎症介质分泌的抑制效果，该小鼠模型具有由作为致病性纳米颗粒的大肠杆菌源性囊泡(E.coliEV)引起的炎症性疾病：图11a是测量支气管肺泡灌洗液(BALF)中CXCL-1分泌的结果；图11b是测量支气管肺泡灌洗液(BALF)中TNF-α分泌的结果；并且图11c是测量IL-1β分泌的结果。

图12a至图12c显示了小鼠模型中藤黄微球菌源性囊泡(M.luteus EV)对免疫调节相关细胞因子的分泌的影响，该小鼠模型具有由作为致病性纳米颗粒的大肠杆菌源性囊泡(E.coli EV)引起的炎症性疾病：图12a是通过测量IL-6的分泌得到的结果；图12b是通过测量IL-17的分泌得到的结果；并且图12c是通过测量IL-10的分泌得到的结果。

图13显示了小鼠模型中藤黄微球菌源性囊泡(M.luteus EV)对气道高反应性的影响，该小鼠模型具有由作为致病性纳米颗粒的大肠杆菌源性囊泡(E.coli EV)引起的炎症性疾病。

图14显示了用于评价藤黄微球菌源性囊泡(M.luteus EV)治疗具有由LPS污染的蛋白质引起的免疫疾病的小鼠模型中的炎症性疾病的效果的实验方案。

图15a至图15c显示了藤黄微球菌源性囊泡(M.luteus EV)在具有由LPS污染的蛋白质引起的免疫疾病的小鼠模型中的炎症抑制效果：图15a是通过测量支气管肺泡灌洗液(BALF)中的炎症细胞总数量得到的结果；图15b是测量支气管肺泡灌洗液(BALF)中的中性粒细胞数量的结果；并且图15c显示肺组织中炎症细胞的浸润。

图16a和图16b显示了藤黄微球菌源性囊泡(M.luteus EV)对具有由LPS污染的蛋白质引起的免疫疾病的小鼠模型中的IL-1β和IL-17(即Th17免疫反应指标)的影响：图16a是通过测量IL-1β浓度得到的结果；并且图16b是通过测量IL-17浓度(即Th17免疫反应指标)得到的结果。

图17是确认免疫功能调节蛋白，如NLRP3、T-bet和ROR-rt在从具有由LPS污染的蛋白质引起的免疫疾病的小鼠模型中分离的肺组织中的表达模式的结果，以评价藤黄微球菌源性囊泡(M.luteus EV)的免疫功能调节机制。

图18a和图18b显示了作为病毒模仿纳米颗粒的大肠杆菌源性囊泡(E.coli EV)的eNOS信号传导活性和iNOS信号传导活性，其通过用藤黄微球菌源性囊泡和阳性对照药物地塞米松处理上皮细胞进行，以评价藤黄微球菌源性囊泡(M.luteus EV)产生NO的分子生物学机制：图18a显示了确认eNOS信号传导活性的结果；并且图18b显示了确认iNOS信号传导活性的结果。

图19显示了一种动物模型实验方法及其用于评价藤黄微球菌源性囊泡(M.luteusEV)对眼病的影响的评价方法。

图20显示了通过测量经藤黄微球菌源性囊泡处理的组与对照相比的视网膜变性面积而得到的结果，其通过使具有氧化应激引起的眼病的兔子模型中口服藤黄微球菌源性囊泡(M.luteus EV)来进行以评价囊泡对眼病的影响。

图21是通过使具有氧化应激引起的眼病的兔子模型口服囊泡后，用眼底照相机(日本TOPCON的TRC-50IX)拍摄真菌得到的一组照片。

图22是示出藤黄微球菌源性囊泡(M.luteus EV)对眼病的作用机制的图。

具体实施方式

本发明涉及源自藤黄微球菌的囊泡及其用途。

发明人证实，当小鼠口服时，源自藤黄微球菌的囊泡通过粘膜被吸收到整个身体，特别是分布在脑组织中。此外，他们证实，当上皮细胞用囊泡处理时，它们显著抑制致病性纳米颗粒对炎症介质的分泌，并被内皮NO合成酶(eNOS)信号传导激活，这是通过抑制诱导性NO合成酶(iNOS)表达而发生的。此外，证实当代表性炎症细胞，如巨噬细胞和中性粒细胞，用囊泡处理时，它们能够以剂量依赖的方式抑制由致病性纳米颗粒和中性粒细胞激活引起的炎症介质的分泌，并且当具有由致病性纳米颗粒引起的炎症疾病的小鼠模型被施用囊泡时，由致病性纳米颗粒引起的炎症得到显著抑制。此外证实，当用囊泡治疗具有由LPS污染的蛋白质引起的免疫疾病的小鼠模型时，由病原体相关分子模式(PAMP)引起的炎症得到显著抑制，从而调节异常的免疫功能。基于此，根据本发明的源自藤黄微球菌的囊泡能够有效地用于预防、改善或治疗与年龄相关的眼病和炎症性眼病的组合物。

下面，将详细描述本发明。

发明人证实，当小鼠口服源自藤黄微球菌的囊泡时，囊泡分布在脑组织中，囊泡通过血脑屏障(BBB)被递送到包括视网膜在内的中枢神经系统。此外证实，当上皮细胞用囊泡处理时，生物致病因子的炎症介质的分泌得到显著抑制，并且当代表性炎症细胞(如巨噬细胞和中性粒细胞)用囊泡处理时，生物致病因子的炎症介质的分泌和中性粒细胞激活以与剂量无关的方式得到抑制。进一步证实，当施用囊泡时，由生物致病因子在组织中NLRP3蛋白的表达得到显著抑制，并且当施用囊泡时，由生物致病因子抑制的内皮NO合酶(eNOS)信号传导得以明显恢复。此外证实，当对患有氧化应激引起的眼病的兔子模型施用囊泡时，囊泡以剂量依赖的方式显著抑制了视网膜变性。基于上述结果，本发明得以完成。

因此，本发明提供了一种用于预防或治疗眼病的药物组合物，其包括源自藤黄微球菌的囊泡作为活性成分。

本文所用的术语“眼病”是指与眼睛有关的疾病，并且在本发明中，眼病可以是年龄相关性或炎症性的眼病，特别是由NOD样受体含吡啶结构域的蛋白3(NLRP3)炎症小体介导的眼病或由氧化应激引起的眼病，但本发明不限于此。

本文使用的术语“年龄相关性眼病”是这样一个概念，其不仅包含由随老化而生物功能退化引起的眼病，而且还包含表现出与因生物功能退化的速度比实际年龄要快而主要发生在老年人中的疾病症状相似的症状的眼病。年龄相关性眼病可以包含例如视网膜地图状萎缩、糖尿病视网膜病变(DR)、青光眼、白内障、干眼症等，但本发明不限于此。

本文所用的“视网膜地图状萎缩”是这样一种疾病，其中由于老化和血液供应不良的眼部功能疾病导致视网膜和脉络膜毛细血管因玻璃疣钙化而萎缩，玻璃疣是视网膜色素上皮细胞中积聚的废物，并且萎缩区域扩大为地图形状并扩散到中心区域，从而导致视力丧失。

本文所用的术语“炎症性眼病”是包括由炎症性致病因子引起的眼部炎症引起的所有眼病的概念，并且炎症性眼病可以包含例如结膜炎、巩膜炎、角膜炎、虹膜炎、葡萄膜炎、脉络膜视网膜炎、脉络膜炎、视网膜炎等，但本发明不限于此。

术语“由NOD样受体含吡啶结构域的蛋白3(NLRP3)炎症小体介导的眼病”是指由NLRP3炎症小体的异常过度激活而发生的眼病。

在本发明中，由于源自藤黄微球菌的囊泡能够抑制NLRP3炎症小体的活性，因此它们能够用于预防、治疗或缓解由NLRP3炎症小体介导的眼病的组合物，但本发明不限于此。

如本文所用，术语“胞外囊泡”或“囊泡”是指由各种细菌分泌的纳米级膜形成的结构，并且包括例如源自革兰氏阴性菌(如大肠杆菌)的囊泡，其具有内毒素(脂多糖)、有毒蛋白质以及细菌DNA和RNA两者；或源自革兰氏阳性菌(如微球属细菌)的囊泡，其具有外膜囊泡(OMV)、蛋白质和核酸以及细菌细胞壁的成分，例如肽聚糖和脂磷壁酸。

在本发明中，胞外囊泡或囊泡涵盖从藤黄微球菌自然分泌或由人工生产的膜形成的所有结构，并且在本发明中，胞外囊泡或囊泡可由MDH-101、MDH-101EV、M.luteus EV或MlEV表示。

囊泡可以通过在藤黄微球菌培养期间的热处理或高压灭菌，或使用选自由以下组成的组的针对细胞培养物的一种或多种方法来分离：离心、超速离心、高压灭菌、挤出、超声处理、细胞裂解、均质化、冻融、电穿孔、机械降解、化学处理、用过滤器过滤、凝胶过滤色谱法、预流动电泳和毛细管电泳。此外，为了分离，可以进一步对获得的囊泡进行洗涤以去除杂质并浓缩。

在本发明中，通过该方法分离的囊泡为球体形式，并且其平均直径可为10至200nm，10至190nm，10至180nm，10至170nm，10至160nm，10至150nm，10至140nm，10至130nm，10至120nm，10至110nm，10至100nm，10至90nm，10至80nm，10至70nm，10至60nm，10至50nm，20至200nm，20至180nm，20至160nm，20至140nm，20至120nm，20至100nm,或者20至80nm，优选20至200nm，但平均直径不限于此。

本发明的组合物中囊泡的量可根据疾病的症状、症状的进展程度、患者的病症等进行适当调整，并且范围可以为，例如，相对于组合物的总重量，0.0001wt％至99.9wt％或0.001wt％至50wt％，但本发明不限于此。量比率是基于除去溶剂的干燥产物的量的值。

本文所用的术语“包括……作为活性成分”是指包括足以实现源自藤黄微球菌的囊泡的功效或活性的量。

本发明中的“药物组合物”是为预防或治疗眼病而制备的，可分别按照常规方法配制成各种形式。例如，根据本发明的药物组合物可用于口服制剂，如粉末、颗粒、片剂、胶囊、混悬液、乳剂或糖浆、准药物、栓剂或灭菌注射液。

根据本发明的药物组合物可包含药学上可接受的载体。药学上可接受的载体一般用于制剂，并且包含盐水、蒸馏水、林格氏溶液、缓冲盐水、环糊精、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇、脂质体等，但本发明不限于此。如果需要，该药学组合物可进一步包含其他常规添加剂，包含抗氧化剂、缓冲剂等。此外，通过额外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂或润滑剂，该药物组合物可配制成注射剂形式，如水溶液、乳剂或混悬液、药丸、胶囊、颗粒或片剂。合适的药学上可接受的载体及其制剂可根据每种成分使用Remington'sPharmaceutical Science中披露的方法进行配制。本发明的药物组合物在剂型上不受限制，因此可以配制成注射剂、吸入剂、外用的皮肤制剂、滴眼剂或口服制剂。

此外，除了囊泡之外，本发明的药物组合物可以包含有效预防、缓解或治疗眼病的成分作为活性成分，例如抗氧化剂，或类固醇或非类固醇抗炎药。

作为抗氧化剂，可以使用抗坏血酸、亚硫酸氢钠、丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚、生育酚或其组合，但本发明不限于此。

作为抗炎药，可以使用地塞米松、氟美松、泼尼松龙、溴芬酸、双氯芬酸、氟比洛芬、酮咯酸或其盐，但本发明不限于此。

本发明的药物组合物可经由各种途径施用于个体。可预测所有给药方法，并且该药物组合物可经由例如以下方式给药：口服给药、皮下注射、腹膜内给药、静脉内注射、肌肉注射、鞘内(脊髓周围空间)注射、舌下给药、经由口腔粘膜给药、直肠内插入、阴道内插入、眼内给药、耳内给药、鼻内给药、吸入、经由口或鼻喷雾、透皮给药、经皮给药等，并且药物组合物的剂量可根据患者的情况和体重、疾病的严重程度、药物类型、施用途径和时间而变化并且可由本领域普通技术人员适当选择。

在本发明中，眼部给药可以是选自由结膜内给药、玻璃体内给药、视网膜下给药、脉络膜上给药、结膜下给药和腱下给药组成的群组的一种，但本发明不限于此。

本发明的药物组合物以药学有效量施用。本文所用的“药学有效量”是指以适用于医学治疗的合理获益/风险比足以治疗疾病的量，有效剂量水平可根据患者的疾病类型、严重程度、药物活性、对药物的敏感性、施用时间、施用途径和排泄率、治疗周期和同时使用的药物，以及医学领域熟知的其他因素来确定。本发明的组合物可以单独或与其他治疗剂组合的形式施用，并且可以与常规治疗剂依次或同时施用，或者以单剂量或多剂量施用。考虑到所有上述因素，重要的是以最小剂量而无副作用地获得最大效果，并且此剂量可由本领域普通技术人员容易地确定。

根据本发明的药物组合物根据作为活性成分的药物的类型，连同各种相关因素(例如所治疗的疾病、给药途径、患者的年龄、性别和体重，以及疾病的严重程度)来确定。具体地，根据本发明的组合物的有效量可根据患者的年龄、性别和体重而变化，并且一般地，每天或每隔一天给药，也可每天一次到三次给药，0.001至150mg组合物/kg体重，优选地0.01至100mg组合物/kg体重。然而，由于有效量可根据给药途径、肥胖的严重程度、性别、体重、年龄等增加或减少，因此剂量不旨在以任何方式限制本发明的范围。

本文所用的术语“预防”是指通过施用根据本发明的组合物来抑制或延缓眼病发生的所有动作。

本文所用的术语“治疗”是指通过施用根据本发明的组合物改善或有益地改变眼病症状的所有动作。

本文所用的术语“缓解”是指通过施用根据本发明的组合物，减少与所需疾病相关的参数或与待治疗的病症相关的参数(例如症状程度)所涉及的所有动作。

此外，本发明提供了一种用于预防或治疗眼病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用该组合物。

此外，本发明提供了源自藤黄微球菌的囊泡用于预防或治疗眼病的用途。

此外，本发明提供了源自藤黄微球菌的囊泡用于制备治疗年龄相关性眼病的药物的用途。

在本发明中，“受试者”是指需要治疗疾病的受试者，更具体地，是指哺乳动物，例如人或非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马和牛，但本发明不限于此。

在本发明中，“施用”是指通过使用任意合适的方法向受试者提供本发明的预定组合物。

此外，本发明提供了一种用于预防或缓解眼病的食品组合物，其包括源自藤黄微球菌的囊泡作为活性成分。

该食品组合物可以是健康功能食品组合物，但不限于此。

根据本发明的食品组合物可通过将活性成分原样添加到食品中使用，或可与其他食品或食品成分一起使用，但可根据典型的方法适当使用。活性成分的混合量可根据其使用目的(预防或减轻)适当地确定。一般地，当制备食品或饮料时，本发明的组合物的添加量为基于原料计15wt％或更少，优选地10wt％或更少。然而，就为了健康和卫生目的或为了健康控制目的而长期摄入而言，该量可少于上述范围。

本发明的食品组合物除了按指定比例含有活性成分作为基本成分外，对成分没有限制，可以像传统饮料一样含有各种调味剂或天然碳水化合物。上述天然碳水化合物的示例包含常规糖类，例如单糖，如葡萄糖、果糖等；二糖，如麦芽糖、蔗糖等；以及多糖，如糊精、环糊精等，以及糖醇，如木糖醇、山梨醇、赤藓糖醇等。作为甜味剂，可以有利地使用天然甜味剂[索马甜、甜叶菊提取物(如甜叶菊苷A、甘草甜素等)]和合成甜味剂(糖精、阿斯巴甜等)。天然碳水化合物的比例可以通过本领域普通技术人员的选择来适当地确定。

除上述添加剂外，本发明的食品组合物可含有各种营养素、维生素、矿物质(电解质)；调味剂，包含合成和天然调味剂；着色剂、填料(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精或用于碳酸饮料的碳酸剂。此类成分可以独立或组合使用。这些添加剂的比例也可由本领域的普通技术人员适当选择。

此外，本发明提供了一种用于预防或缓解眼病的准药物组合物，其包括源自藤黄微球菌的囊泡作为活性成分。

本文所用的术语“准药物”是指在用于诊断、治愈、改善、减轻、治疗或预防人类或动物疾病的产品中表现出比药物更温和的作用的产品。例如，根据药事法(PharmaceuticalAffairs Act)，准药物不包括用作药物的产品，而包括用于治疗或预防人类·动物疾病的纺织·橡胶产品、对人体作用较弱或不直接作用于人体的产品，并且不是仪器或机器或类似物，以及用于预防传染病的消毒剂和杀虫剂。

在本发明中，准药物组合物可以配制成眼科组合物，例如，选自由眼用液体、滴眼剂、眼药膏、注射液和洗眼液组成的群组的一种或多种，但本发明是不限于此。

此外，本发明可以以吸入剂组合物的形式提供，该吸入剂组合物包括源自藤黄微球菌的囊泡作为活性成分。

在吸入制剂的情况下，该化合物可以根据本领域已知的方法配制，并且可以通过使用合适的推进剂以气雾剂喷雾的形式从加压包或喷雾器方便地递送，所述推进剂为例如二氯氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可通过设置用于输送计量的阀来确定。例如，用于吸入器或吹入器中的明胶胶囊和药筒可被配制成包含化合物和合适的粉末基质(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。

此外，本发明提供了一种用于递送治疗眼病的药物的组合物，其包括源自藤黄微球菌的囊泡作为活性成分。

本文所用的术语“药物递送”意指将药物装载和递送至根据本发明的组合物以便将药物递送至特定器官、组织、细胞或细胞器的任何手段或作用。

[发明方式]

在下文中，将提出有助于理解本发明的优选实施例。然而，提供以下实施例仅是为了更容易理解本发明，并且本发明的内容不受以下实施例的限制。

实施例

实施例1.从藤黄微球菌培养液中分离囊泡

培养藤黄微球菌菌株后，对其囊泡进行了分离、分析和定性。藤黄微球菌在德曼-罗戈萨和夏普(MRS)培养基中培养，直到吸光度(OD 600)在37℃有氧室中变为1.0至1.5，然后进行传代培养。随后，回收含有菌株的培养基上清液，在10,000g和4℃下离心20分钟，取出菌株，然后通过0.22-μm过滤器进行过滤。使用100kDa Pellicon 2Cassette滤膜(美国Merck Millipore)和MasterFlex泵系统(美国Cole-Parmer)通过微滤将过滤后的上清液浓缩至50mL的体积。然后，使用0.22μm过滤器再次过滤经浓缩的上清液。随后，用BCA检测法对蛋白质进行定量，并对得到的囊泡进行以下实验。

实施例2.源自藤黄微球菌的囊泡的药代动力学特征评价

为了研究源自藤黄微球菌的囊泡在口服期间的药代动力学特征，通过使小鼠口服用荧光染色试剂染色的源自藤黄微球菌的囊泡，测量从施用前即刻到施用后72小时在身体和各器官中表达的荧光。

如图1所示，当用图像确认源自藤黄微球菌的荧光染色囊泡随时间的长期分布时，能够证实囊泡分布在几个器官中。

此外，当把源自藤黄微球菌的胞外囊泡在大脑中表达的荧光强度绘制成图(如图2所示)时，能够证实在口服后1小时大脑中显示有囊泡的信号，一直持续到24小时，然后荧光信号消失。从该结果可见，当口服时，源自藤黄微球菌的囊泡通过粘膜被吸收到体内，并分布在各个器官中，特别是，它们通过BBB迁移到包括视网膜在内的中枢神经系统并进行分布。

实施例3.源自藤黄微球菌的囊泡在上皮细胞中的抗炎效果评价

如图3所示，上皮细胞(A549细胞)用源自藤黄微球菌的囊泡(M.luteus EV)和阳性对照药物地塞米松进行预处理，并且用诱导炎症的源自大肠杆菌的囊泡(E.coli EV)处理后，用酶联免疫吸附试验(ELISA，R&D Systems)测量炎症细胞因子(如IL-8)的分泌水平。具体而言，A549细胞用不同浓度(1、10和100μg/mL)的源自藤黄微球菌的囊泡预处理24小时，然后用浓度为1ng/mL的源自大肠杆菌的囊泡处理24小时，接着测量分泌到培养基中的IL-8。

结果，如图4a所示，证实IL-8的分泌被源自藤黄微球菌的囊泡以剂量依赖的方式抑制。此外，如图4b所示，证实了与对照药物地塞米松相比，IL-8的分泌抑制效果更优异，并且当胞外囊泡在热处理后进行施用时，IL-8的分泌抑制效果则消失了。从上述结果可见，与代表性抗炎药地塞米松相比，源自藤黄微球菌的囊泡具有更优异的抗炎效果，源自藤黄微球菌的囊泡经热处理后介导的抗炎效果消失，这表示抗炎作用是由胞外囊泡中的蛋白质介导的。

实施例4.源自藤黄微球菌的囊泡在巨噬细胞等炎症细胞中的抗炎效果评价

如图5所示，巨噬细胞(RAW 264.7细胞)用源自藤黄微球菌的囊泡(M.luteus EV)进行预处理，然后用诱导炎症的源自大肠杆菌的囊泡(E.coli EV)进行处理，随后通过ELISA(R&D Systems)测量炎症细胞因子(如TNF-α和IL-6)的水平。具体而言，在用不同浓度(1μg/mL、10μg/mL和100μg/mL)的源自藤黄微球菌的囊泡预处理24小时，并用1ng/mL的源自大肠杆菌的囊泡处理24小时后，测量分泌到培养基中的TNF-α和IL-6。

结果，如图6a和图6b所示，证实了当对源自藤黄微球菌的囊泡进行预处理时，源自大肠杆菌的囊泡对TNF-α(图6a)和IL-6(图6b)的分泌以剂量依赖的方式被抑制。这一结果表明，由致病性生物致病因子(致病性细菌或病毒)引起的炎症被源自藤黄微球菌的囊泡有效地抑制。

实施例5.源自藤黄微球菌的囊泡对中性粒细胞等炎症细胞的激活抑制效果评价

如图7所示，用Lymphoprep分离人血以提取中性粒细胞，为了评价中性粒细胞激活，通过ELISA(R&D Systems)测量中性粒细胞中的颗粒蛋白，如中性粒细胞弹性蛋白(NE)。具体而言，在含有ACD溶液的管中收集10mL血液，将血液小心地加入20mL的Lymphoprep中并进行离心。离心后，收集红血层并与12mL葡聚糖混合，然后在室温下静置45分钟。层分离后，向上清液中加入40mL1X HBSS并再次离心，并用高压灭菌的Millipore水去除红细胞，然后用中性粒细胞分离试剂盒(MACS)分离中性粒细胞。使用RPMI1640培养基来培养分离出的中性粒细胞，并用源自大肠杆菌的囊泡(Ecoli EV)和源自藤黄微球菌的囊泡(M.luteus EV)两者处理24小时，接着测量培养基中的NE。处理地塞米松(Dex)作为阳性对照药物。

结果，如图8所示，对照药物地塞米松没有抑制NE的分泌，而NE是中性粒细胞激活指标，但源自藤黄微球菌的囊泡以剂量依赖的方式抑制了中性粒细胞中NE的分泌。从上述结果可见，源自藤黄微球菌的囊泡能够有效地治疗由中性粒细胞激活引发的疾病。

实施例6.源自藤黄微球菌的囊泡在具有由致病性纳米颗粒引起的炎症性疾病的 小鼠模型中的抗炎效果评价

如图9所示，通过鼻内施用10ng/ml的致病性纳米颗粒，如源自大肠杆菌的囊泡(E.coli EV)，制备具有炎症性疾病的小鼠模型。为了评价该模型中源自藤黄微球菌的囊泡的免疫功能调节效果，在施用源自大肠杆菌的囊泡前5天，通过鼻内施用10ng/ml或100ng/ml的源自藤黄微球菌的囊泡，评价支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织中的抗炎效果。具体而言，为了评价支气管肺泡灌洗液(BALF)中的抗炎效果，将装有1mL PBS的注射器与气道相连以收集支气管肺泡灌洗液(BALF)，并使用Trypan蓝(Abcam)测量总细胞、巨噬细胞和中性粒细胞的数量。此外，为了评价肺组织中的抗炎效果，将载玻片安装在Cytopro(ELItech)上以固定细胞，并且用苏木精(DAKO)和曙红(美国Sigma)染色后测量中性粒细胞数量。

结果，如图10a所示，在施用源自藤黄微球菌的囊泡的组的支气管肺泡灌洗液(BALF)中，证实巨噬细胞和中性粒细胞的数量以剂量依赖的方式减少。此外，如图10b所示，作为使用苏木精和曙红染色评价肺部组织学变化的结果，证实在施用源自藤黄微球菌的囊泡的组的肺部组织中，免疫细胞和炎症细胞的浸润显著减少。

此外，如图11a至图11c所示，对支气管肺泡灌洗液(BALF)中炎症介质分泌程度的评价显示，炎症诱导细胞因子，如CXCL-1(图11a)、TNF-α(图11b)和IL-1β(图11c)的分泌，被源自藤黄微球菌的囊泡以剂量依赖的方式抑制了。

从上述结果可见，源自藤黄微球菌的囊泡能够有效地抑制由致病性纳米颗粒引起的炎症性疾病。

实施例7.源自藤黄微球菌的囊泡在具有由致病性纳米颗粒引起的炎症性疾病的 小鼠模型中的免疫调节效果评价

通过向实施例6的具有炎症性疾病的小鼠模型中施用源自藤黄微球菌的囊泡来评价免疫调节效果。

结果，如图12a和图12b所示，证实与源自大肠杆菌的囊泡的引起免疫反应的炎症相关的细胞因子如IL-6(图12a)和IL-17(图12b)的分泌被源自藤黄微球菌的囊泡以剂量依赖的方式所抑制。

另一方面，如图12c所示，抑制免疫功能的细胞因子IL-10的分泌没有被源自藤黄微球菌的囊泡所抑制(图12c)。从上述结果可见，由源自藤黄微球菌的囊泡引起的抗炎效果是通过抑制致病性纳米颗粒的免疫反应而表现出来的。

实施例8.源自藤黄微球菌的囊泡在具有由病毒模仿致病性纳米颗粒引起的炎症 性疾病的小鼠模型中对异常免疫功能的治疗效果评价

异常免疫功能引起的炎症反应导致器官的功能变化，从而引起疾病。通过向实施例6的具有炎症性疾病的小鼠模型中施用源自藤黄微球菌的囊泡，评价了由炎症诱发的肺部功能变化。具体而言，通过向每只小鼠施用不同浓度(0mg/mL，6.25mg/mL，12.5mg/mL和25mg/mL)的气溶胶醋甲胆碱(美国Sigma)并通过测量使用flexiVent(加拿大SCIREQ)吸入的醋甲胆碱的最大气道反应性而测量气道高反应性(AHR)，评价所述功能变化。

结果，如图13所示，证实了在施用源自藤黄微球菌的囊泡的组中，由醋甲胆碱诱导的气道高反应性(AHR)以剂量依赖的方式得到改善。从上述结果可见，在致病性纳米颗粒诱发的疾病原因中与炎症有关的免疫功能变化能够被源自藤黄微球菌的囊泡有效地治疗。

实施例9.源自藤黄微球菌的囊泡在具有由LPS污染的蛋白质引起的免疫疾病的小 鼠模型中的抗炎效果评价

如图14所示，为了制备具有由LPS污染的蛋白质引起的免疫疾病的小鼠模型，使小鼠吸入10μg的LPS[源自生物致病因子的病原体相关分子模式(PAMP)之一]和75μg的卵清蛋白(OVA)蛋白质，从而制备具有由LPS污染的蛋白质引起的免疫疾病的小鼠模型。之后，将50μg的OVA和100ng的源自藤黄微球菌的囊泡两者鼻内施用3周。腹腔注射20μg的地塞米松(Dex)作为对照药物。

结果，如图15a和图15b所示，与施用地塞米松的组相似，在施用源自藤黄微球菌的囊泡的组中，证实支气管肺泡灌洗液(BALF)中的炎症细胞总数(图15a)和中性粒细胞数量(图15b)显著减少。

此外，如图15c所示，作为使用苏木精和曙红染色评价肺部的组织学变化的结果，与施用地塞米松的组相似，在施用源自藤黄微球菌的囊泡的组中，证实炎症细胞在肺组织中的浸润得到显著抑制(图15c)。从该结果可见，由PAMP诱导的免疫疾病能够被源自藤黄微球菌的囊泡有效地治疗。

实施例10.有关源自藤黄微球菌的囊泡在具有由LPS污染的蛋白质引起的免疫疾 病的小鼠模型中的抗炎效果的免疫学作用机制的证实

为了证实有关源自藤黄微球菌的囊泡的抗炎效果的免疫学作用机制，使用实施例9的小鼠模型，利用ELISA(R&D Systems)测定支气管肺泡灌洗液(BALF)中的IL-1β和IL-17。

结果，如图16a和图16b所示，证实支气管肺泡灌洗液(BALF)中的炎症细胞因子如IL-1β(图16a)和PAMP的Th17免疫反应的指标如IL-17(图16b)的浓度被源自藤黄微球菌的囊泡显著降低。从上述结果可见，源自藤黄微球菌的囊泡能够通过有效抑制LPS的Th17免疫反应来治疗PAMP诱发的疾病。

实施例11.源自藤黄微球菌的囊泡在具有由LPS污染的蛋白质引起的免疫疾病的 小鼠模型中对免疫功能调节的分子生物学作用机制的证实

已知对各种应激的先天免疫反应在疾病的发病机制中非常重要。特别是，存在于细胞质中的NLRP3蛋白被认为是年龄相关性眼病和炎症性眼病发病的关键信号传导通路。此外，与抗原获得性免疫反应的进展有关的t-bet和ROR-γt分别被认为是与针对抗原的Th1和Th17免疫细胞的分化有关的关键信号传导物质。

为了评价源自藤黄微球菌的囊泡的调节免疫功能的分子生物作用机制，通过西方印迹法确认了实施例9的小鼠模型的肺组织中NOD样受体含吡啶结构域的蛋白3(NLRP3)、T细胞中表达的t-box蛋白(t-bet)和视黄酸-受体相关的孤核受体γ(ROR-γt)的表达。具体而言，为了测量每种蛋白质的表达水平，使用50μg的蛋白质，并且在施用地塞米松(Dex)或源自藤黄微球菌的囊泡的小鼠组的肺部组织中证实有蛋白质的表达。

结果，如图17所示，证实与阴性对照相比，在施用被LPS污染的蛋白质的组中，NLRP3表达显著增加，而在施用源自藤黄微球菌的囊泡的组的肺组织中，与施用地塞米松的组类似，NLRP3、t-bet和ROR-γt的表达显著受到抑制。

NLRP3是在细菌和病毒感染中通过表达单核细胞和巨噬细胞分泌IL-1β的关键的模式识别受体(PRR)。从上述结果可见，源自藤黄微球菌的囊泡抑制了NLRP3的表达以调节先天免疫功能。此外，与抗原获得性免疫反应的进展有关的t-bet和ROR-γt分别是与针对抗原的Th1和Th17免疫细胞的分化有关的关键信号传导物质。从上述结果可见，源自藤黄微球菌的囊泡通过抑制t-bet和ROR-γt的表达来抑制向分泌Th1和IL-17的Th17免疫细胞的分化及其激活。

这意味着由PAMP(如LPS)诱导的异常免疫功能被源自藤黄微球菌的囊泡有效地抑制了。

实施例12.源自藤黄微球菌的囊泡对氧化应激下细胞平衡调节的功效评价

当细胞反复暴露于各种类型的压力时，由于细胞中的氧化应激而发生细胞老化，细胞功能发生异常，并引起细胞死亡，从而导致老化引起的退行性疾病。特别是，通过eNOS信号传导产生的低浓度一氧化氮(NO)通过拮抗作为氧化应激主要原因的活性氧(ROS)的作用，在维持细胞平衡方面起着关键作用。另一方面，通过iNOS信号传导产生的高浓度NO反而会对细胞造成过度的压力，引起免疫和代谢功能的异常，从而促进疾病的发生。

为了评价源自藤黄微球菌的囊泡对氧化应激的细胞平衡的影响，通过实施例3中公开的方法用源自藤黄微球菌的囊泡(M.luteus EV)处理A549细胞，然后评价细胞信号传导的表达模式。作为评价信号传导蛋白表达的具体方法，使用裂解缓冲液裂解细胞以提取蛋白，接着使用BCA蛋白测定试剂盒(美国Thermo)对蛋白进行定量。每个样品50μg的蛋白质在10％聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，并且将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜。在室温下用添加了脱脂牛奶的Tris-缓冲盐水(0.05％吐温0；TBST)阻断30分钟后，将p-ERK、ERK、p-p38、p38、p-JNK、JNK、p-p65、p65、iNOS、p-eNOS、eNOS和β-actin的特异性初级抗体的1/1,000稀释物在4℃反应24小时。随后，将所得产物用PBST(含0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲盐水)洗涤三次达10分钟，并且使二抗的1/5,000稀释物在室温下反应1小时。用PBST洗涤5次达10分钟后，用ECL选择试剂检测条带。

结果，如图18a所示，当源自藤黄微球菌的囊泡被处理时，ERK和eNOS磷酸化被地塞米松(Dex)和源自藤黄微球菌的囊泡(M luteus EV)增加。此外，对源自藤黄微球菌的囊泡的热处理抑制了源自藤黄微球菌的囊泡的eNOS信号传导。上述结果可以说明，源自藤黄微球菌的囊泡激活eNOS信号传导，以诱导细胞内低浓度的NO并增加细胞稳态，而通过eNOS信号传导产生低浓度NO和抑制氧化应激的作用是由囊泡中的热敏蛋白介导的。

另一方面，如图18b所示，当源自藤黄微球菌的囊泡进行处理时，JNK、p65和p38磷酸化和iNOS表达得到抑制。此外，iNOS的表达表明，即使在通过对源自藤黄微球菌的囊泡的热处理抑制膜蛋白功能时，囊泡的抑制效果也得以保持。上述结果可以表明，通过iNOS信号传导产生高浓度的NO及由此引起的炎症是由囊泡中蛋白质以外的成分介导的。

实施例13：源自藤黄微球菌的囊泡在具有由氧化应激引起的眼病的兔子模型中的 治疗效果评价

为了诱发眼病，对兔子静脉注射一次碘酸钠(SI)，其是一种通过氧化应激诱发视网膜变性的物质。更具体而言，如图19所示，为了评价源自藤黄微球菌的囊泡的治疗效果，在诱导前3天至诱导后7天，每天口服0.025mg/kg和0.25mg/kg的源自藤黄微球菌的囊泡(Mluteus EV)。为了评价，在最后施用日，即诱导疾病后的第7天，用眼底照相机(日本TOPCON的TRC-50IX)拍摄视网膜退化区，并进行分析。

结果，如图20所示，在低剂量囊泡处理组(G3)和高剂量囊泡处理组(G4)中，与阳性对照(G2)相比，视网膜的退化区在统计学上显著减少，从而证实了剂量依赖性。

同时，为了评价源自藤黄微球菌的囊泡在治疗眼病方面的效果，在向兔子右眼中灌注催泪剂(Midriacil 1％滴眼剂)后，对该动物进行麻醉，然后用眼底照相机对其眼底进行拍照。结果显示在图21中。

如图21所示，可见，在阳性对照(G2)中，与阴性对照(G1)相比，视网膜变性显著增加，而在低剂量囊泡处理组(G3)和高剂量囊泡处理组(G4)中，与阳性对照相比，视网膜变性显著减少。

上述结果可以表明，本发明的源自藤黄微球菌的囊泡有效地抑制了因老化或炎症而发生的眼病。特别是可见，源自藤黄微球菌的囊泡通过抑制由氧化应激、线粒体功能异常和溶酶体损伤诱发的NLRP3炎症小体信号传导来恢复先天免疫和获得性免疫功能。此外可见，eNOS信号传导诱导低浓度NO产生以增加细胞稳态。特别是，当源自藤黄微球菌的囊泡口服时，它们通过血脑屏障(BBB)散布在中枢神经系统中，这证实：如图22所示，视觉相关神经细胞的异常免疫功能导致的细胞死亡得到抑制，并且细胞稳态得到有效提高。因此，预期本发明的源自藤黄微球菌的囊泡可用于缓解、预防或治疗年龄相关性眼病和炎症性眼病。

实施例14.源自藤黄微球菌的囊泡在具有由致病性纳米颗粒引起的炎症性疾病的 小鼠模型中的效果评价

作为证实源自微球菌属细菌的囊泡在具有由致病性纳米颗粒引起的炎症性疾病的小鼠模型中的效果的结果，在对源自微球菌属细菌的囊泡进行处理的组中，可以证实胞外囊泡以剂量依赖的方式对治疗难治性疾病是有效的，所述疾病例如呼吸系统疾病，如哮喘和肺炎；肝脏疾病，如肝炎、肝硬化和肝癌；肾脏疾病，如肾小球肾炎和糖尿病肾病；和/或脑部疾病，如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和卢伽雷氏病。

提供本发明的上述描述是出于说明的目的，并且本发明所属领域的普通技术人员将理解，在不改变本发明的技术精神或实质特征的情况下，可以容易地将本发明修改为其他特定形式。因此，应当理解，上述实施例仅在所有方面进行了说明，而不是限制性的。

工业适用性

发明人证实，当源自藤黄微球菌的囊泡口服时，胞外囊泡通过血脑屏障(BBB)被递送到中枢神经系统。此外证实，当上皮细胞和巨噬细胞用胞外囊泡处理时，不仅大大抑制了生物致病因子的炎症介质的分泌，而且还抑制了生物致病因子的NLRP3蛋白表达。此外证实，当胞外囊泡被施用于具有由氧化应激引起的眼病的兔子模型时，由氧化应激引起的视网膜变性得到显著抑制。因此，预期根据本发明的源自藤黄微球菌的囊泡不仅能够有效地用于预防、缓解或治疗眼病的组合物，而且还能够用于治疗眼病的药物递送系统。

Claims (22)

1.一种用于预防或治疗眼病的药物组合物，其包括源自藤黄微球菌的囊泡作为活性成分。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述眼病是由NOD样受体含吡啶结构域的蛋白3(NLRP3)炎症小体介导的眼病。

3.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述眼病是年龄相关性眼病。

4.如权利要求3所述的药物组合物，其中所述眼病是选自由视网膜地图状萎缩、糖尿病视网膜病变、白内障、青光眼和干眼症组成的群组的一种或多种疾病。

5.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述眼病是炎症性眼病。

6.如权利要求5所述的药物组合物，其中所述眼病是选自由结膜炎、巩膜炎、角膜炎、虹膜炎、葡萄膜炎、脉络膜视网膜炎、脉络膜炎和视网膜炎组成的群组的一种或多种疾病。

7.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述囊泡具有10至200nm的平均直径。

8.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述囊泡由藤黄微球菌自然分泌或人工产生。

9.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述组合物抑制NOD样受体含吡啶结构域的蛋白3(NLRP3)炎症小体的活性。

10.一种用于预防或缓解眼病的食品组合物，其包括源自藤黄微球菌的囊泡作为活性成分。

11.如权利要求10所述的食品组合物，其中所述眼病是选自由视网膜地图状萎缩、糖尿病视网膜病变、白内障、青光眼、干眼症、结膜炎、巩膜炎、角膜炎、虹膜炎、葡萄膜炎、脉络膜视网膜炎、脉络膜炎和视网膜炎组成的群组的一种或多种疾病。

12.一种用于预防或缓解眼病的准药物组合物，其包括源自藤黄微球菌的囊泡作为活性成分。

13.如权利要求12所述的准药物组合物，其中所述眼病是选自由视网膜地图状萎缩、糖尿病视网膜病变、白内障、青光眼、干眼症、结膜炎、巩膜炎、角膜炎、虹膜炎、葡萄膜炎、脉络膜视网膜炎、脉络膜炎和视网膜炎组成的群组的一种或多种疾病。

14.一种用于预防或缓解眼病的吸入剂组合物，其包括源自藤黄微球菌的囊泡作为活性成分。

15.如权利要求14所述的吸入剂组合物，其中所述眼病是选自由视网膜地图状萎缩、糖尿病视网膜病变、白内障、青光眼、干眼症、结膜炎、巩膜炎、角膜炎、虹膜炎、葡萄膜炎、脉络膜视网膜炎、脉络膜炎和视网膜炎组成的群组的一种或多种疾病。

16.一种用于递送治疗眼病的药物的组合物，所述组合物包括源自藤黄微球菌的囊泡作为活性成分。

17.一种预防或治疗眼病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用包含源自藤黄微球菌的囊泡作为活性成分的组合物。

18.包括源自藤黄微球菌的囊泡作为活性成分的组合物用于预防或治疗眼病的用途。

19.源自藤黄微球菌的囊泡用于制备预防或治疗眼病的药物的用途。

20.一种递送治疗眼病的药物的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用含有治疗眼病靶向药物的组合物，所述组合物包含源自藤黄微球菌的囊泡作为活性成分。

21.用于递送治疗眼病的药物的组合物的用途，所述组合物包含源自藤黄微球菌的囊泡作为活性成分。

22.包含源自藤黄微球菌的囊泡作为活性成分的组合物用于制备递送治疗眼病的药物的用途。