WO2022145656A1 - 마이크로코커스 루테우스 유래 세포외 소포를 포함하는 안질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

마이크로코커스 루테우스 유래 세포외 소포를 포함하는 안질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2022145656A1
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micrococcus luteus
vesicles
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derived
eye diseases
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김윤근
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주식회사 엠디헬스케어
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    • A61P27/02—Ophthalmic agents
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes

Definitions

  • the present invention relates to Micrococcus luteus-derived extracellular vesicles and uses thereof, and more particularly, to a composition for preventing or treating ophthalmic diseases comprising the Micrococcus luteus-derived extracellular vesicles as an active ingredient.
  • chronic diseases accompanied by immune function abnormalities caused by mismatch between humans and symbiotic microorganisms and aging related to major organs of the body
  • the disease pattern has changed as chronic disease is a major disease that reduces the quality of life and determines the longevity of human beings.
  • chronic disease intractable chronic disease characterized by abnormalities in immune and metabolic functions caused by various stresses, cancer, cardiovascular disease, chronic lung disease, metabolic disease, and neuro-psychiatric disease are the major factors that determine human lifespan and quality of life. As a disease, it has become a major problem in public health.
  • Aging refers to a decline in the function of body organs over time, and the accumulation of cellular damage over time is regarded as a common cause of aging. It was found that the NLRP3 inflammasome, which is activated in response to various damage-associated molecular patterns (DAMPs), which increases with age, is particularly closely related to aging. Therefore, the NLRP3 inflammasome has been a target for the prevention and treatment of aging-related diseases, and aging-related chronic diseases are characterized by chronic inflammation and apoptosis accompanied by abnormalities in immune and metabolic functions. It is reported to be able to suppress the disease.
  • DAMPs damage-associated molecular patterns
  • Immunity is a defense mechanism of cells against biological, chemical, physical, and mental stress, and occurs through innate immunity and adaptive immunity.
  • PAMP pathogen-associated molecular pattern
  • DAMP damage-associated molecular pattern
  • Metabolism is the process of making energy for our body and making various substances to perform cell functions. Proteins and lipids are made in the endoplasmic reticulum (ER) through ATP made in mitochondria, and the substances are supplied to the required area. . Cells face various stresses from the moment they are created. Biological, chemical, physical, and mental stress induce ER stress, mitochondrial dysfunction, and lysosomal damage within the cell, thereby activating the NLRP3 inflammasome. It induces apoptosis and causes various diseases.
  • ER endoplasmic reticulum
  • the retina of the eye is an organ belonging to the central nervous system, and mature retinal cells do not divide under normal conditions like most neuronal cells in the brain. Therefore, when the function of the retinal cells is reduced, abnormalities in the visual function are likely to appear, and aging proceeds rapidly. Oxidative stress is the biggest cause of the deterioration of retinal cell function.
  • the tissues including the retina, optic nerve, photoreceptor cells, and lens constituting the eyeball are constantly exposed to oxidative damage such as light and ultraviolet rays in daily life. because it is exposed.
  • Microbiota or microbiome refers to a microbial community, including bacteria, archaea, and eukaryotes, that exist in a given habitat.
  • Bacterial-derived vesicles secreted locally are absorbed through epithelial cells of the mucosa to induce a local inflammatory response, and vesicles that have passed through epithelial cells are absorbed throughout the body through lymphatic vessels and distributed to each organ. Regulates immune and inflammatory responses.
  • vesicles derived from pathogenic Gram-negative bacteria such as Escherichia coli are pathogenic nanoparticles mimicking viruses and cause colitis locally, and when absorbed into blood vessels, systemic vesicles through vascular endothelial cell inflammatory response It promotes inflammatory response and blood clotting, and is absorbed into muscle cells where insulin acts, leading to insulin resistance and diabetes.
  • vesicles derived from beneficial bacteria can control diseases by regulating abnormalities in immune and metabolic functions caused by pathogenic vesicles.
  • Micrococcus luteus is a gram-positive bacterium belonging to the genus Micrococcus, and is a bacterium widely distributed in nature such as water, dust, soil, and the like. This bacterium is known to produce riboflavin when grown in toxic organic pollutants such as pyridine and to absorb ultraviolet light through lutein pigment. In addition, this fungus is isolated from dairy products and beer, grows in a dry environment or a high salt environment, does not form spores, but is known to survive for a long time even at a refrigeration temperature such as a refrigerator.
  • the present inventors found that when micrococcus luteus-derived vesicles were treated in cells, the vesicles significantly inhibited secretion of inflammatory mediators by pathogenic nanoparticles as well as biological pathogenicity. It was confirmed that the immune function abnormality caused by the factor was effectively suppressed. In addition, it was confirmed that Micrococcus luteus-derived vesicles suppressed immune dysfunction by inhibiting the expression of NLRP3 protein, a pattern recognition receptor involved in the pathogenesis of various diseases, and increasing eNOS (endothelial NO synthase) signal. .
  • NLRP3 protein a pattern recognition receptor involved in the pathogenesis of various diseases
  • eNOS endothelial NO synthase
  • the present invention was completed.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of eye diseases, comprising vesicles derived from Micrococcus luteus as an active ingredient.
  • an object of the present invention is to provide a food composition for preventing or improving eye diseases, comprising vesicles derived from Micrococcus luteus as an active ingredient.
  • an object of the present invention is to provide a quasi-drug composition for preventing or improving eye diseases, comprising vesicles derived from Micrococcus luteus as an active ingredient.
  • an object of the present invention is to provide a composition for inhalation for preventing or improving eye diseases, comprising vesicles derived from Micrococcus luteus as an active ingredient.
  • an object of the present invention is to provide a composition for drug delivery for treating eye diseases, comprising vesicles derived from Micrococcus luteus as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating eye diseases, comprising micrococcus luteus -derived vesicles as an active ingredient.
  • the present invention provides a food composition for preventing or improving eye diseases, comprising vesicles derived from Micrococcus luteus as an active ingredient.
  • the present invention provides a quasi-drug composition for preventing or improving eye diseases, comprising vesicles derived from Micrococcus luteus as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for inhalation for preventing or improving eye diseases, comprising vesicles derived from Micrococcus luteus as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for drug delivery for treating eye diseases, comprising vesicles derived from Micrococcus luteus as an active ingredient.
  • the eye disease may be an eye disease mediated by NLRP3 inflammasome (NOD-like receptor pyrin domain-containing protein 3 inflammasome), but is not limited thereto.
  • NLRP3 inflammasome NOD-like receptor pyrin domain-containing protein 3 inflammasome
  • the eye disease may be an age-related eye disease, specifically, retinal geographic atrophy, diabetic retinopathy, cataract, glaucoma. And it may be one or more diseases selected from the group consisting of xerophthalmia, but is not limited thereto.
  • the eye disease may be an inflammatory eye disease, and specifically, the eye disease is conjunctivitis, scleritis, keratitis, ulceris, uveitis. ), chorioretinitis, choroiditis, and retinitis may be at least one disease selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the vesicle may have an average diameter of 10 to 200 nm, but is not limited thereto.
  • the vesicle may be naturally secreted or artificially produced in Micrococcus luteus , but is not limited thereto.
  • the composition may inhibit the activity of NLRP3 inflammasome (NOD-like receptor pyrin domain-containing protein 3 inflammasome), but is not limited thereto.
  • NLRP3 inflammasome NOD-like receptor pyrin domain-containing protein 3 inflammasome
  • the ocular disease is retinal geographic atrophy, diabetic retinopathy, cataract, glaucoma, dry eye disease (xerophthalmia), conjunctivitis ), scleritis, keratitis, ulceratitis, ulceris, uveitis, chorioretinitis, choroiditis, and retinitis may be one or more diseases selected from the group consisting of , but not limited thereto.
  • the present invention provides a method for preventing or treating eye diseases, comprising administering a composition comprising vesicles derived from Micrococcus luteus as an active ingredient to an individual in need thereof.
  • the present invention provides a preventive or therapeutic use of a composition comprising vesicles derived from Micrococcus luteus as an active ingredient.
  • the present invention provides a use for the preparation of a medicament for preventing or treating eye diseases of Micrococcus luteus -derived vesicles.
  • the present invention provides a method for delivering a drug for treating an eye disease, comprising administering to an individual in need thereof a composition comprising, as an active ingredient, a micrococcus luteus-derived vesicle carrying a target eye disease treatment drug. .
  • the present invention provides a use of a composition comprising vesicles derived from Micrococcus luteus as an active ingredient for the treatment of ophthalmic diseases.
  • the present invention provides the use of vesicles derived from Micrococcus luteus for the manufacture of a medicament for drug delivery for the treatment of eye diseases.
  • the present inventors confirmed that when micrococcus luteus-derived vesicles were orally administered, the vesicles pass through the blood brain barrier (BBB) and are delivered to the central nervous system.
  • BBB blood brain barrier
  • the vesicles were treated with epithelial cells and macrophages, the secretion of inflammatory mediators by biological causative factors was significantly suppressed, and when the cells were treated with the vesicles, NLRP3 protein expression by biological causative factors was inhibited. Confirmed.
  • 1 is a view showing the results of measuring the intensity of fluorescence in each organ by extracting each organ by time after oral administration of micrococcus luteus-derived vesicles to mice.
  • FIG. 2 is a view showing the distribution of vesicles in the brain by time after oral administration of micrococcus luteus-derived vesicles to mice.
  • FIG. 3 is a diagram showing an experimental protocol for evaluating the anti-inflammatory effect of Micrococcus luteus-derived vesicles (M. luteus EV) in epithelial cells.
  • FIG. 4A and 4B show Micrococcus luteus-derived vesicles (M. luteus EV) and a positive control drug dexamethasone (Dex) on epithelial cells to evaluate the anti-inflammatory effect of Micrococcus luteus-derived vesicles (M. luteus EV).
  • FIG. 4a is a diagram showing the IL-8 secretion inhibitory effect according to the concentration of Micrococcus luteus-derived vesicles
  • FIG. 4b is a comparison of the IL-8 secretion inhibitory effect with the positive control drug dexamethasone. It is a drawing (*P ⁇ 0.05, **P ⁇ 0.01, ***P ⁇ 0.001, n.s. means not significant, hereinafter the same).
  • FIG. 5 is a diagram showing an experimental protocol for evaluating the anti-inflammatory effect of Micrococcus luteus-derived vesicles (M. luteus EV) in macrophages.
  • Figures 6a and 6b show the results of processing Micrococcus luteus-derived vesicles (M. luteus EV) on macrophages in order to evaluate the anti-inflammatory effect of Micrococcus luteus-derived vesicles (M. luteus EV).
  • 6a is a diagram showing the secretion inhibitory effect of TNF- ⁇
  • Figure 6b is a diagram showing the IL-6 secretion inhibitory effect.
  • M. luteus EV Micrococcus luteus-derived vesicles
  • E. coli EV E. coli EV
  • Figure 8 shows the degree of activation of neutrophils by E. coli-derived vesicles (E. coli EV), which are pathogenic nanoparticles, by treating neutrophils isolated from peripheral blood with vesicles derived from Micrococcus luteus (M. luteus EV) and dexamethasone, a positive control drug.
  • E. coli EV E. coli-derived vesicles
  • M. luteus EV Micrococcus luteus
  • dexamethasone a positive control drug.
  • M. luteus EV Micrococcus luteus-derived vesicles
  • E. coli EV E. coli-derived vesicles
  • FIG. 10a and 10b show the effect of inhibiting inflammation by Micrococcus luteus-derived vesicles (M. luteus EV) in a mouse model of an inflammatory disease caused by E. coli-derived vesicles (E. coli EV), which are pathogenic nanoparticles. It is a view showing the result of confirming the number of macrophages and neutrophils in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of the mouse model, and FIG. 10b is a view confirming the infiltration of inflammatory cells in the lung tissue of the mouse model.
  • M. luteus EV Micrococcus luteus-derived vesicles
  • E. coli EV E. coli-derived vesicles
  • 11A to 11C show the effect of inhibiting secretion of inflammatory mediators by Micrococcus luteus-derived vesicles (M. luteus EV) in a mouse model of inflammatory disease caused by E. coli-derived vesicles (E. coli EV), which are pathogenic nanoparticles.
  • 11a is a result of measuring CXCL-1 secretion in bronchoalveolar lavage fluid (BALF)
  • FIG. 11b is a result of measuring TNF- ⁇ secretion in bronchoalveolar lavage fluid (BALF)
  • FIG. 11c is a result of measuring IL-1 ⁇ secretion is a diagram showing
  • FIG. 12a to 12c show the effect of micrococcus luteus-derived vesicles (M. luteus EV) on the secretion of immunomodulatory-related cytokines in a mouse model of inflammatory disease caused by pathogenic nanoparticles, E. coli-derived vesicles (E. coli EV).
  • FIG. 12a is a result of measuring IL-6 secretion
  • FIG. 12b is a result of measuring IL-17 secretion
  • FIG. 12c is a diagram showing a result of measuring IL-10 secretion.
  • M. luteus EV micrococcus luteus-derived vesicles
  • E. coli EV E. coli-derived vesicles
  • M. luteus EV Micrococcus luteus-derived vesicles
  • FIG. 15a to 15c show the anti-inflammatory effect of Micrococcus luteus-derived vesicles (M. luteus EV) in a mouse model of immune disease caused by proteins contaminated with LPS, and FIG. 15a is total inflammation in bronchoalveolar lavage fluid (BALF). It is a result of measuring the number of cells, FIG. 15b is a result of measuring the number of neutrophils in bronchoalveolar lavage fluid (BALF), and FIG. 15c is a view confirming inflammatory cell infiltration in lung tissue.
  • M. luteus EV Micrococcus luteus-derived vesicles
  • FIG. 16A and 16B show the effects of Micrococcus luteus-derived vesicles (M. luteus EV) on IL-1 ⁇ , an inflammatory mediator, and IL-17, an indicator of Th17 immune response, in a mouse model of an immune disease caused by a protein contaminated with LPS.
  • M. luteus EV Micrococcus luteus-derived vesicles
  • IL-17 an indicator of Th17 immune response
  • 17 is an immune function regulatory protein, NLRP3, from lung tissue isolated from a mouse model of an immune disease caused by a protein contaminated with LPS, in order to evaluate the mechanism of immune function regulation by Micrococcus luteus-derived vesicles (M. It is a diagram showing the results of confirming the expression pattern of T-bet, and ROR-rt.
  • FIG. 18a and 18b are micrococcus luteus-derived vesicles (M. luteus EV) in order to evaluate the molecular biological mechanism of NO production, epithelial cells are treated with micrococcus luteus-derived vesicles and a positive control drug dexamethasone.
  • E. coli-derived vesicles E. coli EV
  • FIG. 18a is the result of confirming the eNOS signaling activity
  • FIG. 18b is the result of confirming the iNOS signaling activity. It is a drawing.
  • FIG. 19 is a view showing an animal model test method and evaluation method for evaluating the effect of Micrococcus luteus-derived vesicles (M. luteus EV) on eye diseases.
  • M. luteus EV Micrococcus luteus-derived vesicles
  • FIG. 20 is a micrococcus luteus-derived vesicle-treated group compared to the control group by oral administration of vesicles to a rabbit model of eye disease caused by oxidative stress in order to evaluate the effect of Micrococcus luteus-derived vesicles (M. luteus EV) on ocular diseases.
  • FIG. 21 is a view of the fundus taken with a fundus camera (TRC-50IX, TOPCON, Japan) after oral administration of vesicles to a rabbit model of eye disease induced by oxidative stress.
  • a fundus camera TRC-50IX, TOPCON, Japan
  • M. luteus EV Micrococcus luteus-derived vesicles
  • the present invention relates to vesicles derived from Micrococcus luteus and uses thereof.
  • the present inventors confirmed that when micrococcus luteus-derived vesicles were orally administered to mice, the vesicles passed through the mucosa and were systemically absorbed and, in particular, were distributed in brain tissue.
  • the vesicles were treated in epithelial cells, the vesicles significantly inhibited the secretion of inflammatory mediators by pathogenic nanoparticles, which activated the vesicles through the eNOS (endothelial NO synthase) signal, whereas iNOS (inducible NO synthase) ) was confirmed to occur by suppressing the expression.
  • the present inventors confirmed that when micrococcus luteus-derived vesicles were orally administered to mice, the vesicles were distributed in brain tissue, thereby passing through the blood brain barrier (BBB) and delivering the vesicles to the central nervous system including the retina. was confirmed.
  • BBB blood brain barrier
  • the vesicles are treated in epithelial cells, the secretion of inflammatory mediators by biological causative factors is significantly inhibited, and when the vesicles are treated with macrophages and neutrophils, which are representative inflammatory cells, secretion of inflammatory mediators by biological causative factors and neutrophil activation were confirmed to be dose-dependently inhibited.
  • the eNOS endothelial NO synthase
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of ophthalmic diseases comprising micrococcus luteus-derived vesicles as an active ingredient.
  • the term "eye disease” refers to a disease that occurs in relation to the eye, and in the present invention, the eye disease may be an age-related eye disease or an inflammatory eye disease, and specifically, NLRP3 inflammasome (NOD It may be an eye disease mediated by -like receptor pyrin domain-containing protein 3 inflammasome) or an eye disease peculiar to oxidative stress, but is not limited thereto.
  • NLRP3 inflammasome NOD It may be an eye disease mediated by -like receptor pyrin domain-containing protein 3 inflammasome) or an eye disease peculiar to oxidative stress, but is not limited thereto.
  • age-related ocular disease is not only a strange eye disease due to deterioration of biological functions with aging, but also a disease mainly seen in the elderly due to deterioration of biological functions than the actual age.
  • the age-related eye diseases are, for example, retinal geographic atrophy, diabetic retinopathy (DR), glaucoma (glaucoma). , cataract, and xerophthalmia, but are not limited thereto.
  • the "retinal geographic atrophy” refers to the deterioration of the function of the eye due to aging and insufficient blood flow, so that drusen, a waste product accumulated in the retinal pigment epithelium, is calcified, and the retina and choroidal capillaries are damaged. Atrophy refers to a disease in which the atrophied area enlarges in a map shape and spreads to the center of the body, resulting in loss of vision.
  • the term "inflammatory ocular disease” is a concept that includes all eye diseases caused by inflammation of the eye by an inflammatory causative factor, and the inflammatory eye disease is, for example, conjunctivitis. ), scleritis, keratitis, ulceris, uveitis, chorioretinitis, choroiditis, and retinitis, and the like, but are not limited thereto. .
  • the "eye disease mediated by NLRP3 inflammasome (NOD-like receptor pyrin domain-containing protein 3 inflammasome)” refers to an eye disease caused by abnormally excessive activation of NLRP3 inflammasome.
  • the Micrococcus luteus-derived vesicle can inhibit the activity of NLRP3 inflammasome, it can be used as a composition for preventing, treating or improving eye diseases mediated by NLRP3 inflammasome, but is not limited thereto. does not
  • extracellular vesicle refers to a structure made of a nano-sized membrane secreted by various bacteria, for example, endotoxin (lipopolysaccharide) , vesicles or outer membrane vesicles (OMVs) from gram-negative bacteria such as Escherichia coli, which also contain toxic proteins and bacterial DNA and RNA, and peptidoglycan ( There are vesicles derived from gram-positive bacteria, such as bacteria of the genus Micrococcus, which also contain peptidoglycan and lipoteichoic acid.
  • endotoxin lipopolysaccharide
  • OMVs outer membrane vesicles
  • gram-negative bacteria such as Escherichia coli
  • peptidoglycan There are vesicles derived from gram-positive bacteria, such as bacteria of the genus Micrococcus, which also contain peptidoglycan and lipoteichoic acid.
  • the extracellular vesicle or vesicle may collectively refer to all membrane structures naturally secreted or artificially produced in Micrococcus luteus, and in the present invention, MDH-101, It can be variously expressed as MDH-101 EV, M. luteus EV, or MlEV.
  • the vesicles are heat-treated or high-pressure treated in the process of culturing Micrococcus luteus, or the bacterial culture medium is centrifuged, ultra-high-speed centrifugation, high-pressure treatment, extrusion, sonication, cell lysis, homogenization, freeze-thaw, electroporation, mechanical degradation , chemical treatment, filtration by filter, gel filtration chromatography, free-flow electrophoresis, and capillary electrophoresis. In addition, it may further include processes such as washing for removal of impurities, concentration of the obtained vesicles, and the like.
  • the vesicles separated by the method have a spherical shape, and have an average diameter of 10-200 nm, 10-190 nm, 10-180 nm, 10-170 nm, 10-160 nm, 10-150 nm, 10 to 140 nm, 10-130 nm, 10-120 nm, 10-110 nm, 10-100 nm, 10-90 nm, 10-80 nm, 10-70 nm, 10-60 nm, 10-50 nm, 20 to 200 nm, 20 to 180 nm, 20 to 160 nm, 20 to 140 nm, 20 to 120 nm, 20 to 100 nm, or 20 to 80 nm, preferably, 20 to 200 nm, It is not limited thereto.
  • the content of the vesicles in the composition of the present invention can be appropriately adjusted depending on the symptoms of the disease, the degree of progression of the symptoms, the condition of the patient, etc., for example, 0.0001 to 99.9% by weight, or 0.001 to 50% by weight based on the total weight of the composition.
  • the content ratio is a value based on the dry amount from which the solvent is removed.
  • the term “comprising as an active ingredient” means including an amount sufficient to achieve efficacy or activity of the Micrococcus luteus-derived vesicle.
  • pharmaceutical composition means one prepared for the purpose of preventing or treating eye diseases, and each can be formulated in various forms according to a conventional method and used.
  • oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, etc.
  • oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, etc.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is commonly used in formulation, and includes, but is not limited to, saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, cyclodextrin, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, liposome, and the like. It does not, and may further include other conventional additives, such as antioxidants and buffers, if necessary.
  • diluents, dispersants, surfactants, binders, lubricants and the like may be additionally added to form an injectable formulation such as an aqueous solution, suspension, emulsion, etc., pills, capsules, granules, or tablets.
  • suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations formulations can be preferably made according to each component using the method disclosed in Remington's literature.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited in dosage form, but may be formulated as injections, inhalants, external preparations for skin, eye drops, or oral ingestion.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include, as an active ingredient, a component useful for the prevention, improvement, or treatment of ophthalmic diseases in addition to the above vesicles, for example, an antioxidant, a steroid-based or non-steroidal anti-inflammatory drug.
  • a component useful for the prevention, improvement, or treatment of ophthalmic diseases in addition to the above vesicles for example, an antioxidant, a steroid-based or non-steroidal anti-inflammatory drug.
  • antioxidant ascorbic acid, sodium bisulfite, butylated hydroxytoluene, butylated hydroxyanisole, tocopherol, or a combination thereof may be used, but is not limited thereto.
  • the anti-inflammatory drug may include dexamethasone, fluorometholone, prednisolone, bromfenac, diclofenac, prubiprofen, ketorolac, or a salt thereof, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered to an individual by various routes. All modes of administration can be contemplated, for example, oral administration, subcutaneous injection, intraperitoneal administration, intravenous injection, intramuscular injection, paraspinal space (intrathecal) injection, sublingual administration, buccal administration, rectal insertion, vaginal It can be administered according to internal insertion, ocular administration, ear administration, nasal administration, inhalation, spraying through the mouth or nose, skin administration, transdermal administration, etc. Depending on the route and time, it may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the ocular administration may be one selected from the group consisting of intraconjunctival sac administration, intravitreal administration, subretinal administration, suprachoroidal administration, subconjunctival administration and subtenon's capsule administration, but is not limited thereto.
  • a pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level depends on the type, severity, drug activity, and drug of the patient. It can be determined according to factors including sensitivity, administration time, administration route and excretion rate, duration of treatment, concurrent drugs, and other factors well known in the medical field.
  • the composition according to the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or may be administered in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered single or multiple. In consideration of all of the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with a minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the effective amount of the pharmaceutical composition according to the present invention may vary depending on the age, sex, and weight of the patient, and generally 0.001 to 150 mg, preferably 0.01 to 100 mg per kg of body weight, is administered daily or every other day. Or it can be administered in divided doses 1 to 3 times a day. However, since it may increase or decrease depending on the route of administration, the severity of obesity, sex, weight, age, etc., the dosage is not intended to limit the scope of the present invention in any way.
  • prevention means any action that suppresses or delays the onset of eye diseases by administration of the composition according to the present invention.
  • treatment means any action in which symptoms for eye diseases are improved or beneficially changed by administration of the composition according to the present invention.
  • “improvement” refers to any action of reducing a parameter related to a desired disease or a condition to be treated, for example, the degree of symptom by administration of the composition according to the present invention.
  • the present invention provides a method for preventing or treating eye diseases, comprising administering the composition to an individual in need thereof.
  • the present invention provides the use of micrococcus luteus-derived vesicles for the prevention or treatment of ophthalmic diseases.
  • the present invention also provides the use of Micrococcus luteus-derived vesicles for the manufacture of a medicament for the treatment of age-related eye diseases.
  • “individual” means a subject in need of treatment for a disease, and more specifically, human or non-human primates, mice, rats, dogs, cats, horses, cattle, etc. It may be a mammal of, but is not limited thereto.
  • administration means providing a predetermined composition of the present invention to an individual by any suitable method.
  • the present invention provides a food composition for the prevention or improvement of eye diseases comprising micrococcus luteus-derived vesicles as an active ingredient.
  • the food composition may be a health functional food composition, but is not limited thereto.
  • the food composition according to the present invention may be used as an active ingredient added to food or used together with other food or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the mixing amount of the active ingredient may be appropriately determined depending on the purpose of its use (for prevention or improvement).
  • the composition of the present invention is added in an amount of 15% by weight or less, preferably 10% by weight or less, based on the raw material.
  • the amount may be less than or equal to the above range.
  • the food composition of the present invention is not particularly limited in other ingredients other than containing the active ingredient as an essential ingredient in the indicated ratio, and may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional ingredients like a conventional beverage.
  • natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; disaccharides such as maltose, sucrose and the like; and polysaccharides such as conventional sugars such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • natural flavoring agents tacmatin, stevia extract, for example rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.
  • synthetic flavoring agents sacharin, aspartame, etc.
  • the ratio of the natural carbohydrate may be appropriately determined by the selection of those skilled in the art.
  • the food composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents such as synthetic flavoring agents and natural flavoring agents, coloring agents and thickening agents (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and its salts, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated beverages, and the like. These components may be used independently or in combination. The proportion of these additives may also be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the present invention provides a quasi-drug composition for the prevention or improvement of eye diseases, comprising vesicles derived from Micrococcus luteus as an active ingredient.
  • quasi-drug used in the present invention refers to articles with a milder action than pharmaceuticals among articles used for the purpose of diagnosing, treating, improving, alleviating, treating or preventing diseases of humans or animals.
  • quasi-drugs are products that are not used for medicinal purposes. Textiles and rubber products used for the treatment or prevention of diseases in humans and animals, have a slight or no direct action on the human body, and devices or machines This includes non- and similar substances, as well as sterilizing and insecticides to prevent infectious diseases.
  • the quasi-drug composition can be formulated and used in the form of an ophthalmic composition, for example, one or more formulations selected from the group consisting of ophthalmic solutions, eye drops, eye ointments, injections, and eyewash.
  • an ophthalmic composition for example, one or more formulations selected from the group consisting of ophthalmic solutions, eye drops, eye ointments, injections, and eyewash.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the present invention may be provided in the form of a composition for inhalation comprising vesicles derived from Micrococcus luteus as an active ingredient.
  • a suitable propellant for example, dichlorofluoromethane, trichlorofluoromethane, dichlorotetrafluoroethane, carbon dioxide or other suitable gas. It can be conveniently delivered in the form of an aerosol spray from a pressurized pack or nebulizer. In the case of a pressurized aerosol, the dosage unit may be determined by providing a valve to deliver a metered amount.
  • a suitable powder base such as lactose or starch.
  • the present invention provides a composition for drug delivery for treating eye diseases, comprising vesicles derived from Micrococcus luteus as an active ingredient.
  • drug delivery refers to any means or action for loading and delivering a drug into the composition according to the present invention in order to deliver the drug to a specific organ, tissue, cell or organelle.
  • Micrococcus luteus After culturing the Micrococcus luteus strain, its vesicles were isolated and characterized. Micrococcus luteus was sub-cultured in MRS (de Man-Rogosa and Sharpe) medium until the absorbance (OD 600) became 1.0-1.5 in an aerobic chamber at 37°C. Thereafter, the medium supernatant containing the strain was recovered, centrifuged at 10,000 g, 4° C. for 20 minutes, the strain was removed, and filtered through a 0.22 ⁇ m filter.
  • MRS de Man-Rogosa and Sharpe
  • the filtered supernatant was concentrated to a volume of 50 ml through microfiltration using a MasterFlex pump system (Cole-Parmer, US) with a 100 kDa Pellicon 2 Cassette filter membrane (Merck Millipore, US). Then, the concentrated supernatant was filtered again with a 0.22 ⁇ m filter. Thereafter, the protein was quantified using the BCA assay, and the following experiments were performed on the obtained vesicles.
  • Example 2 Evaluation of pharmacokinetic properties of vesicles derived from Micrococcus luteus
  • Micrococcus luteus-derived vesicles stained with a fluorescent dye were orally administered to mice, and the fluorescence expressed in each organ was measured for up to 72 hours.
  • Example 3 Evaluation of the anti-inflammatory effect of Micrococcus luteus-derived vesicles in epithelial cells
  • E. coli-derived vesicles E. coli EV
  • the secretion amount of the inflammatory cytokine IL-8 was measured by ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay, R&D Systems).
  • A549 cells were pre-treated with Micrococcus luteus-derived vesicles at various concentrations (1, 10, 100 ⁇ g/mL) for 24 hours, and then treated with E. coli-derived vesicles at a concentration of 1 ng/mL for 24 hours.
  • IL secreted into the medium -8 was measured.
  • Micrococcus luteus-derived vesicles have superior anti-inflammatory efficacy compared to dexamethasone, a representative anti-inflammatory drug, and the anti-inflammatory effect of Micrococcus luteus-derived vesicles disappears during heat treatment. It can be seen that the action is mediated by proteins in the vesicles.
  • Example 4 Evaluation of the anti-inflammatory effect of Micrococcus luteus-derived vesicles in macrophages, which are inflammatory cells
  • E. coli-derived vesicles As shown in FIG. 5 , after pretreatment of micrococcus luteus-derived vesicles (M. luteus EV) into macrophages (RAW 264.7 cells), E. coli-derived vesicles (E. coli EV) that induce inflammation were treated to induce inflammatory cytokines.
  • the kinases TNF- ⁇ and IL-6 were measured by ELISA (R&D Systems) method. Specifically, after pretreatment of micrococcus luteus-derived vesicles at various concentrations (1 ⁇ g/mL, 10 ⁇ g/mL, and 100 ⁇ g/mL) for 24 hours, E. coli-derived vesicles were treated at a concentration of 1 ng/mL for 24 hours. Thus, TNF- ⁇ and IL-6 secreted into the medium were measured.
  • FIGS. 6a and 6b As a result, as shown in FIGS. 6a and 6b, when micrococcus luteus-derived vesicles were pretreated, the secretion of TNF- ⁇ ( FIG. 6a ) and IL-6 ( FIG. 6b ) by E. coli-derived vesicles was dose-dependently was confirmed to be inhibited.
  • the above result means that Micrococcus luteus-derived vesicles effectively inhibit the occurrence of inflammation caused by pathogenic biological causative factors (pathogenic bacteria or viruses).
  • Example 5 Evaluation of the neutrophil activation inhibitory effect of Micrococcus luteus-derived vesicles in neutrophils, which are inflammatory cells
  • neutrophil elastase a granular protein in neutrophils
  • ELISA ELISA
  • 10 mL of blood was collected in a tube containing ACD solution, and then the blood was carefully placed on 20 mL lymphoprep and centrifuged. After centrifugation, the red blood layer was collected, mixed with 12 mL of Dextran, and left at room temperature for 45 minutes.
  • E. coli EV E. coli-derived vesicles
  • M. luteus EV Micrococcus luteus-derived vesicles
  • the control drug dexamethasone did not inhibit NE secretion, which is an indicator of neutrophil activation, but Micrococcus luteus-derived vesicles dose-dependently inhibited NE secretion from neutrophils. From the above results, it can be seen that Micrococcus luteus-derived vesicles can effectively treat diseases caused by activation of neutrophils.
  • Example 6 Evaluation of the anti-inflammatory effect of micrococcus luteus-derived vesicles in a mouse model of inflammatory disease caused by pathogenic nanoparticles
  • E. coli-derived vesicles E. coli EV
  • 10 ng/ml of pathogenic nanoparticles E. coli-derived vesicles (E. coli EV)
  • 10 ng/ml or 100 ng/ml of Micrococcus luteus-derived vesicles were intranasally administered from 5 days before administration of the E. coli-derived vesicles to bronchoalveolar Anti-inflammatory effects were evaluated in lavage fluid (BALF) and lung tissue.
  • BALF lavage fluid
  • a syringe containing 1 mL of PBS was connected to the airway to collect bronchoalveolar lavage (BALF), and then, using Trypan blue (Abcam), total cells , macrophages and neutrophils were counted.
  • the cells were fixed by mounting a slide glass on Cytopro (ELItech), and then stained with Hematoxylin (DAKO) and Eosin (Sigma, USA), and then the number of neutrophils was measured. .
  • FIG. 10a it was confirmed that the number of macrophages and neutrophils was decreased in a dose-dependent manner in the bronchoalveolar lavage (BALF) of the group administered with Micrococcus luteus-derived vesicles.
  • FIG. 10b as a result of evaluating histological changes in the lungs using Hematoxylin & Eosin staining, it was confirmed that the infiltration of immune cells and inflammatory cells was significantly reduced in the lung tissue of the group administered with Micrococcus luteus-derived vesicles. did
  • FIGS. 11a to 11c as a result of evaluating the degree of secretion of inflammatory mediators in bronchoalveolar lavage fluid (BALF), inflammation-inducing cytokines CXCL-1 ( FIG. 11a ), TNF- ⁇ ( FIG. 11b ), and It was confirmed that the secretion of IL-1 ⁇ (Fig. 11c) was dose-dependently inhibited by Micrococcus luteus-derived vesicles.
  • BALF bronchoalveolar lavage fluid
  • Micrococcus luteus-derived vesicles can effectively suppress inflammatory diseases caused by pathogenic nanoparticles.
  • Example 7 Evaluation of the immunomodulatory effect of Micrococcus luteus-derived vesicles in a mouse model of inflammatory disease by pathogenic nanoparticles
  • FIGS. 12A and 12B the secretion of IL-6 (FIG. 12A) and IL-17 (FIG. 12B), cytokines related to the immune response that induces inflammation by E. coli-derived vesicles, is It was confirmed that the dose-dependent inhibition by the vesicles derived from Teus.
  • FIG. 12c the secretion of IL-10, a cytokine that suppresses immune function, was not inhibited by Micrococcus luteus-derived vesicles ( FIG. 12c ). From the above results, it can be seen that the anti-inflammatory effect of micrococcus luteus-derived vesicles occurs by suppressing the immune response by pathogenic nanoparticles.
  • Example 8 Evaluation of the therapeutic effect on immune dysfunction of Micrococcus luteus-derived vesicles in a mouse model of inflammatory disease caused by virus-mimicking pathogenic nanoparticles
  • Inflammatory reactions caused by immune dysfunction cause functional changes in organs and cause diseases.
  • Micrococcus luteus-derived vesicles By administering Micrococcus luteus-derived vesicles to the inflammatory disease mouse model of Example 6, functional changes in the lungs induced by inflammation were evaluated.
  • aerosol methacholine (Sigma, USA) was administered to each mouse at various concentrations (0 mg/mL, 6.25 mg/mL, 12.5 mg/mL, and 25 mg/mL), followed by flexiVent (SCIREQ, Canada).
  • AHR airway hyperresponsiveness
  • Example 9 Evaluation of the anti-inflammatory effect of Micrococcus luteus-derived vesicles in a mouse model of immune disease caused by proteins contaminated with LPS
  • LPS 10 ⁇ g and OVA protein (ovalbumin) 75 which are one of PAMP (pathogen-associated molecular patterns) derived from biological causative factors ⁇ g was administered to mice by inhalation to prepare a mouse model of immune disease caused by proteins contaminated with LPS. Thereafter, 50 ⁇ g of OVA and 100 ng of micrococcus luteus-derived vesicles were simultaneously intranasally administered for 3 weeks. As a control drug, 20 ⁇ g of dexamectasone (Dex) was administered intraperitoneally.
  • Dex dexamectasone
  • the group administered with Micrococcus luteus-derived vesicles was similar to the group administered with dexamethasone, the total number of inflammatory cells in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) ( FIG. 15A ) and the number of neutrophils (FIG. 15b) was confirmed to be significantly reduced.
  • BALF bronchoalveolar lavage fluid
  • FIG. 15b the number of neutrophils
  • Example 10 Identification of the immunological mechanism of action for the anti-inflammatory effect of Micrococcus luteus-derived vesicles in a mouse model of immune disease caused by proteins contaminated with LPS
  • FIGS. 16A and 16B the inflammatory cytokine IL-1 ⁇ ( FIG. 16A ) in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) and IL-17 (FIG. 16B), which is an indicator of the Th17 immune response by PAMP, showed that the concentration of It was confirmed that the vesicles were significantly reduced by Micrococcus luteus-derived vesicles. From the above results, it can be seen that Micrococcus luteus-derived vesicles can treat diseases induced by PAMP by effectively suppressing the Th17 immune response caused by LPS.
  • Example 11 Immune function regulation of Micrococcus luteus-derived vesicles in a mouse model of immune disease caused by proteins contaminated with LPS Confirmation of molecular and biological mechanism of action
  • NLRP3 protein present in the cytoplasm is known as a key signaling pathway in the pathogenesis of age-related eye diseases and inflammatory eye diseases.
  • t-bet and ROR- ⁇ t which are related to the development of an acquired immune response to an antigen, are known as key signaling substances involved in the differentiation into Th1 and Th17 immune cells against the antigen, respectively.
  • NLRP3 NOD-like receptor pyrin domain-containing protein 3
  • t-bet t -box protein expressed in T cells
  • ROR- ⁇ t tineic-acid-receptor-related orphan nuclear receptor gamma
  • NLRP3 expression was significantly increased compared to the negative control group, and in the lung tissue of the group administered with micrococcus luteus-derived vesicles, the group administered with dexamethasone Similarly, it was confirmed that the expression of NLRP3, t-bet and ROR- ⁇ t was significantly inhibited.
  • NLRP3 is a key pattern-recognition receptor (PRR) that is expressed in monocytes and macrophages during bacterial and viral infection and secretes IL-1 ⁇ .
  • PRR pattern-recognition receptor
  • t-bet and ROR- ⁇ t which are related to the development of an acquired immune response to an antigen, are key signaling substances involved in the differentiation into Th1 and Th17 immune cells against the antigen, respectively. From the above results, it can be seen that Micrococcus luteus-derived vesicles inhibit the differentiation and activation of Th1 and IL-17-secreting Th17 immune cells by suppressing the expression of t-bet and ROR- ⁇ t.
  • Example 12 Evaluation of the efficacy of Micrococcus luteus-derived vesicles in regulating cellular homeostasis against oxidative stress
  • A549 cells were treated with Micrococcus luteus-derived vesicles (M. luteus EV) by the method described in Example 3, Expression patterns of cell signaling proteins were evaluated.
  • M. luteus EV Micrococcus luteus-derived vesicles
  • Expression patterns of cell signaling proteins were evaluated.
  • cells were lysed using a lysis buffer and proteins were extracted, and proteins were quantified using a BCA protein assay kit (Thermo, USA). 50 ⁇ g of protein per sample was electrophoresed on 10% polyacrylamide gel, and the separated protein was transferred to a nitrocellulose membrane.
  • Example 13 Evaluation of the therapeutic effect of micrococcus luteus-derived vesicles in rabbit model of eye disease caused by oxidative stress
  • a substance that induces retinal degeneration by oxidative stress was administered intravenously to a rabbit model once. More specifically, as shown in FIG. 19 , in order to evaluate the therapeutic effect of Micrococcus luteus-derived vesicles, 0.025 mg/kg and 0.25 mg/kg of Micrococcus luteus-derived vesicles (M. luteus EV) induce eye disease. It was orally administered once daily from 3 days to 7 days after induction. For the evaluation method, the retinal degenerated area (area of the degenerated retina) was photographed and analyzed with a fundus camera (TRC-50IX, TOPCON, Japan) on the 7th day after disease induction on the last day of administration.
  • a fundus camera TRC-50IX, TOPCON, Japan
  • the area of the degenerated retina was statistically significantly reduced in the low-dose vesicle-treated group (G3) and the high-dose vesicle-treated group (G4) compared to the positive control (G2), which was dose-dependent. did
  • the positive control group (G2) compared to the negative control group (G1) it was found that the retinal degeneration was significantly increased, the low-dose vesicle treated group (G3) and the high-dose vesicle-treated group (G4) was the retina It was found that the denaturation was significantly reduced compared to the positive control.
  • the micrococcus luteus-derived vesicles of the present invention effectively inhibited the occurrence of ocular diseases related to aging or inflammation.
  • the Micrococcus luteus-derived vesicle suppresses the NLRP3 inflammasome signal induced by oxidative stress, mitochondrial dysfunction, and lysosomal damage to restore innate immunity and acquired immunity.
  • the eNOS signal induces low-concentration NO production to increase cellular homeostasis.
  • micrococcus luteus-derived vesicles when they are orally administered, they pass through the blood-brain barrier (BBB) and are distributed in the central nervous system, and as shown in FIG. As it was confirmed that it can inhibit and simultaneously increase cellular homeostasis, the micrococcus luteus-derived vesicles of the present invention can be used for improvement, prevention, or treatment of aging-related eye diseases and inflammatory eye diseases. It is expected.
  • BBB blood-brain barrier
  • Example 14 Evaluation of the effect of micrococcus bacteria-derived vesicles in an inflammatory disease mouse model by pathogenic nanoparticles
  • the present inventors confirmed that when micrococcus luteus-derived vesicles were orally administered, the vesicles pass through the blood brain barrier (BBB) and are delivered to the central nervous system.
  • BBB blood brain barrier
  • the vesicles were treated with epithelial cells and macrophages, the secretion of inflammatory mediators caused by biological factors was significantly suppressed, and when the cells were treated with the vesicles, NLRP3 protein expression by biological factors was inhibited. Confirmed.
  • the vesicle was administered to a rabbit model of eye disease caused by oxidative stress, it was confirmed that the occurrence of retinal degeneration caused by oxidative stress was significantly inhibited. It is expected to be usefully used as a composition for preventing, improving or treating eye diseases, as well as as a drug delivery agent for treating eye diseases.

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Abstract

본 발명은 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 안질환의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명자들은 상기 소포를 경구로 투여하였을 때 BBB(Blood-brain barrier)를 통과하여 망막을 포함한 중추신경계로 소포가 전달됨을 확인하였다. 또한, 상피세포 및 대식세포에 상기 소포를 처리하였을 때, 생물학적 원인 인자에 의한 염증성 매개체 분비를 현저히 억제할 뿐만 아니라 세포에 상기 소포를 처리하였을 때, 생물학적 원인 인자에 의한 NLRP3 단백질 발현을 억제함을 확인하였다. 나아가, 산화 스트레스에 의한 안질환 토끼 모델에 상기 소포를 투여하였을 때, 산화 스트레스에 의한 망막 변성의 발생을 유의하게 억제함을 확인하였는바, 본 발명에 따른 마이크로코커스 루테우스 유래 소포는 노화 관련 안질환 및 염증성 안질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 노화 관련 안질환 및 염증성 안질환의 예방, 증상 개선, 또는 치료하기 위한 의약품 또는 건강기능식품 등의 개발에도 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

Description

마이크로코커스 루테우스 유래 세포외 소포를 포함하는 안질환 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 마이크로코커스 루테우스 유래 세포외 소포 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 마이크로코커스 루테우스에서 유래하는 세포외 소포를 유효성분으로 포함하는 안질환의 예방 또는 치료용 조성물 등에 관한 것이다.
본 발명은 2020년 12월 28일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2020-0184337호 및 2021년 10월 18일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2021-0138713호에 기초한 우선권을 주장하며, 상기 출원들의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
21세기에 들어서면서 과거 전염병으로 인식되던 급성 감염성 질환의 중요성은 감소된 반면, 인간과 공생 미생물과의 부조화에 의해 발생하는 면역기능 이상을 동반한 만성질환 및 우리 몸의 주요 장기에 발생하는 노화 관련 만성질환이 삶의 질 감소와 인간 수명을 결정하는 주요 질환으로 질병 패턴이 바뀌었다. 여러 가지 스트레스에 의한 면역기능 및 대사기능 이상을 특징으로 하는 21세기 난치성 만성질환으로서, 암, 심혈관질환, 만성폐질환, 대사질환, 및 신경-정신질환이 인간 수명과 삶의 질을 결정하는 주요 질환으로서 국민보건에 큰 문제가 되고 있다.
노화는 시간이 흐르면서 신체 기관의 기능이 저하되는 것을 의미하는 것으로, 시간에 따른 세포 손상의 축적을 노화의 일반적인 원인으로 보고 있으며, 세포 외 ATP, 고혈당, 세라미드, 아밀로이드, 요산결정, 콜레스테롤 결정 등 나이가 들수록 증가하는 다양한 손상관련 분자패턴(damage-associated molecular pattern; DAMPs)에 응답하여 활성화되는 NLRP3 inflammasome은 특히 노화와 관련이 깊은 것으로 밝혀졌다. 따라서, NLRP3 inflammasome은 노화 관련 질환의 예방과 치료의 표적이 되었으며, 노화 관련 만성질환은 면역기능 및 대사기능 이상을 동반한 만성 염증 및 세포사멸을 특징으로 하므로, NLRP3 inflammasome 관련 염증을 억제하면 노화 관련 질환을 억제할 수 있는 것으로 보고되고 있다.
면역(immunity)은 생물학적, 화학적, 물리적, 정신적 스트레스에 대한 세포의 방어기작으로, 선천면역(innate immunity)과 후천면역(adaptive immunity)을 통해 일어나게 된다. 최근 염증질환의 병인과 관련해서 생물학적 원인 인자에서 유래하는 pathogen-associated molecular pattern(PAMP) 및 세포 손상에 의해 생기는 danger signal인 damage-associated molecular pattern(DAMP)이 유형 인식 수용체(pattern recognition receptor)인 NLRP(Nucleotide-binding oligomerization domain)에 의해 인지되고, 이 중에서 NLRP3는 NLRP3 inflammasome을 형성하여 여러 가지 난치성 질환을 일으킨다는 사실이 주목받고 있다.
대사(metabolism)는 우리 몸에 필요한 에너지를 만들어 세포의 기능을 수행할 여러 가지 물질을 만드는 것으로 미토콘드리아에서 만들어진 ATP를 통해 소포체(endoplasmic reticulum, ER)에서 단백질과 지질이 만들어져 필요한 영역으로 물질을 공급한다. 세포는 생기는 순간부터 여러 가지 스트레스에 직면하게 되는데, 생물학적, 화학적, 물리적, 정신적 스트레스는 세포 내에서 소포체(ER) 스트레스, 미토콘드리아 기능 이상, 리소좀 손상(lysosomal damage) 등을 유도하여 NLRP3 inflammasome을 활성화하여 세포 사멸을 유도하여 여러 가지 질병을 일으키게 된다.
한편, 안구의 망막은 중추신경계에 속하는 기관으로, 성숙한 망막 세포는 뇌에 존재하는 대부분의 뉴런 세포와 마찬가지로 정상 상태에서는 분열하지 않는다. 따라서, 망막 세포의 기능이 저하되면 시각 기능에 이상이 나타나기 쉬우며 노화가 빠르게 진행되게 된다. 망막 세포의 기능이 저하되는 가장 큰 원인으로는 산화적 스트레스가 꼽히는데, 안구를 구성하는 망막, 시신경, 광수용체 세포, 수정체를 포함하는 조직은 일상생활에서 빛, 자외선과 같은 산화적 손상에 꾸준히 노출되기 때문이다. 이러한 산화적 손상에 의해 세포를 구성하는 DNA, 단백질, 지질에 변형이 나타나고 세포 사멸이 유도되면서 눈에 노화가 발생하고, 심각하게는 망막 지도모양 위축증(retinal geographic atrophy), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 백내장(cataract), 녹내장(glaucoma) 및 안구건조증(xerophthalmia) 등과 같은 노화 관련 안질환이 발생하게 된다.
또한, 블루라이트(blue light), 자외선 등과 같은 환경적 스트레스에 대해 시각과 관련된 세포가 제대로 방어하지 못하면 눈에 염증이 발생하고, 반복적인 스트레스에 의해 만성 염증성 안질환이 발생하게 되며, 최근에는 이러한 만성 염증성 안질환을 치료 또는 예방하기 위하여 염증질환의 주요 매개체로 알려진 염증성 사이토카인인 TNF-α 억제제에 대한 관심이 증가되고 있다.
인체에 공생하는 미생물은 100조에 이르러 인간 세포보다 10배 많으며, 미생물의 유전자수는 인간 유전자수의 100배가 넘는 것으로 알려지고 있다. 미생물총(microbiota 혹은 microbiome)은 주어진 거주지에 존재하는 진정세균(bacteria), 고세균(archaea), 진핵생물(eukarya)을 포함한 미생물 군집(microbial community)을 말한다.
우리 몸에 공생하는 세균 및 주변 환경에 존재하는 세균은 다른 세포로의 유전자, 저분자화합물, 단백질 등의 정보를 교환하기 위하여 나노미터 크기의 소포(vesicle)를 분비한다. 점막은 200 나노미터(nm) 크기 이상의 입자는 통과할 수 없는 물리적인 방어막을 형성하여 점막에 공생하는 세균인 경우에는 점막을 통과하지 못하지만, 세균 유래 소포는 크기가 200 나노미터 크기 이하라서 비교적 자유롭게 점막을 통하여 상피세포를 통과하여 우리 몸에 흡수된다. 이와 같이, 세균 유래 소포는 세균에서 분비된 것이지만, 세균과 구성 성분, 체내 흡수율, 부작용 위험성 등이 서로 상이하며, 이로 인하여 세균 유래 소포를 사용하는 것은 살아있는 세균을 사용하는 것과는 전혀 상이하거나 현저한 효과를 나타낸다.
국소적으로 분비된 세균 유래 소포는 점막의 상피세포를 통해 흡수되어 국소 염증반응을 유도할 뿐만 아니라, 상피세포를 통과한 소포는 림프관을 통해 전신에 흡수되어 각 장기로 분포하고, 분포된 장기에서 면역 및 염증반응을 조절한다. 예를 들어, 대장균(Eshcherichia coli)와 같은 병원성 그람음성세균에서 유래하는 소포는 바이러스를 모사하는 병원성 나노 입자로서 국소적으로 대장염을 일으키고, 혈관으로 흡수된 경우에 혈관 내피세포 염증반응을 통해 전신적인 염증반응 및 혈액응고를 촉진시키고, 또한 인슐린이 작용하는 근육세포 등에 흡수되어 인슐린저항성과 당뇨병을 유발한다. 반면, 유익한 세균에서 유래하는 소포는 병원성 소포에 의한 면역기능 및 대사기능 이상을 조절하여 질병을 조절할 수 있다.
마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)는 마이크로코커스 속에 속하는 그람양성세균으로, 물, 먼지, 토양 등과 같은 자연에 널리 분포하는 세균이다. 이 균은 피리딘과 같은 독성 유기오염물질에서 자랄 때 리보플라빈을 생성하고, 루테인 색소를 통해 자외선을 흡수하는 것으로 알려져 있다. 또한, 이 균은 유제품 및 맥주에서도 분리되고, 건조한 환경이나 고염 환경에서도 자라고, 포자(spore)를 형성하지는 않지만, 냉장고와 같은 냉장온도에서도 장기간 생존하는 것으로 알려져 있다.
그러나, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 이용하여 안질환 치료에 응용한 사례는 보고된 바가 없다.
본 발명자들은 상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여 예의 연구한 결과, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 세포에 처리하였을 때, 상기 소포가 병원성 나노 입자에 의한 염증성 매개체 분비를 현저히 억제할 뿐만 아니라 생물학적 병원성 인자에 의한 면역기능 이상을 효율적으로 억제하는 것을 확인하였다. 또한, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포는 여러 질병의 병인과 관련된 유형 인식 수용체(pattern recognition receptor)인 NLRP3 단백질 발현을 억제하고, eNOS(endothelial NO synthase) 신호를 증가시켜 면역기능 이상을 억제함을 확인하였다. 또한, 상기 소포를 경구 투여하였을 때 상기 소포가 혈관-뇌 장벽(blood brain barrier, BBB)을 통과하여 중추신경계로 전달됨을 확인하였다. 나아가, 산화 스트레스에 의한 안질환 토끼 모델에 상기 소포를 처리하였을 때, 망막 변성(retinal degeneration)이 용량 의존적으로 억제됨을 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 안질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환 예방 또는 개선용 흡입용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환 치료 약물전달용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환 예방 또는 개선용 흡입용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환 치료 약물전달용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 안질환은 NLRP3 inflammasome(NOD-like receptor pyrin domain-containing protein 3 inflammasome)에 의해 매개되는 안질환일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 안질환은 노화 관련 안질환일 수 있으며, 구체적으로, 망막 지도모양 위축증(retinal geographic atrophy), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 백내장(cataract), 녹내장(glaucoma) 및 안구건조증(xerophthalmia)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 안질환은 염증성 안질환일 수 있으며, 구체적으로, 상기 안질환은 결막염(conjunctivitis), 공막염(scleritis), 각막염(keratitis), 홍채염(iritis), 포도막염(uveitis), 맥락망막염(chorioretinitis), 맥락염(choroiditis), 및 망막염(retinitis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 소포는 평균 직경이 10 내지 200 nm일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 소포는 마이크로코커스 루테우스 (Micrococcus luteus)에서 자연적으로 분비 또는 인공적으로 생산될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 NLRP3 inflammasome(NOD-like receptor pyrin domain-containing protein 3 inflammasome)의 활성을 억제할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 안질환은 망막 지도모양 위축증(retinal geographic atrophy), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 백내장(cataract), 녹내장(glaucoma), 안구건조증(xerophthalmia), 결막염(conjunctivitis), 공막염(scleritis), 각막염(keratitis), 홍채염(iritis), 포도막염(uveitis), 맥락망막염(chorioretinitis), 맥락염(choroiditis), 및 망막염(retinitis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스 (Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 안질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스 (Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 조성물의 안질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스 (Micrococcus luteus) 유래 소포의 안질환 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 목적하는 안질환 치료 약물을 담지한 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 안질환 치료 약물 전달 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스 (Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 조성물의 안질환 치료 약물 전달 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스 (Micrococcus luteus) 유래 소포의 안질환 치료 약물 전달용 약제의 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 발명자들은 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 경구 투여하였을 때 상기 소포가 혈관-뇌 장벽(blood brain barrier, BBB)을 통과하여 중추신경계로 전달됨을 확인하였다. 또한, 상피세포 및 대식세포에 상기 소포를 처리하였을 때, 생물학적 원인 인자에 의한 염증성 매개체 분비를 현저히 억제할 뿐만 아니라 세포에 상기 소포를 처리하였을 때, 생물학적 원인 인자에 의한 NLRP3 단백질 발현을 억제함을 확인하였다. 나아가, 산화 스트레스에 의한 안질환 토끼 모델에 상기 소포를 투여하였을 때, 산화 스트레스에 의한 망막 변성(retinal degeneration) 발생을 유의하게 억제함을 확인하였는바, 본 발명에 따른 마이크로코커스 루테우스 유래 소포는 안질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물뿐만 아니라 안질환 치료 약물전달체로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 마우스에 경구 투여한 후, 시간별로 각 장기를 적출하여 각 장기에서 형광의 세기를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 마우스에 경구 투여한 후, 시간별로 소포가 뇌에 분포하고 있는 양상을 나타낸 도면이다.
도 3은 상피세포에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)의 항염증 효과를 평가하기 위한 실험 프로토콜을 나타낸 도면이다.
도 4a 및 도 4b는 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)의 항염증 효과를 평가하기 위해 상피세포에 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)와 양성 대조 약물 덱사메타손(Dexamethasone; Dex)을 처리한 결과를 나타낸 것으로, 도 4a는 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 농도에 따른 IL-8 분비 억제 효과를 나타낸 도면이고, 도 4b는 양성 대조 약물 덱사메타손과 IL-8 분비 억제 효과를 비교한 도면이다 (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, n.s.는 유의하지 않음을 의미함, 이하 동일).
도 5는 대식세포에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)의 항염증 효과를 평가하기 위한 실험 프로토콜을 나타낸 도면이다.
도 6a 및 도 6b은 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)의 항염증 효과를 평가하기 위해 대식세포에 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)를 처리한 결과를 나타낸 것으로, 도 6a는 TNF-α의 분비 억제 효과를 나타낸 도면이고, 도 6b는 IL-6 분비 억제 효과를 나타낸 도면이다.
도 7은 말초혈액에서 분리한 호중구에 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)와 양성 대조 약물 덱사메타손을 처리하여 생물학적 원인 인자인 대장균 유래 소포(E. coli EV)에 의한 호중구 활성화 정도를 평가하기 위한 실험 프로토콜을 나타낸 도면이다.
도 8은 말초혈액에서 분리한 호중구에 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)와 양성 대조 약물인 덱사메타손을 처리하여 병원성 나노 입자인 대장균 유래 소포(E. coli EV)에 의한 호중구의 활성화 정도를 NE(neutrophil elastase) 분비로 평가한 결과를 도면이다.
도 9는 병원성 나노 입자인 대장균 유래 소포(E. coli EV)에 의한 염증질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)에 의한 염증질환 발생 억제 효과 및 작용기전을 확인하기 위한 실험 프로토콜을 나타낸 도면이다.
도 10a 및 도 10b는 병원성 나노 입자인 대장균 유래 소포(E. coli EV)에 의한 염증질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)에 의한 염증 억제 효과를 나타낸 것으로, 도 10a는 마우스 모델의 기관지폐포 세척액(BALF) 내 대식세포와 호중구 수를 확인한 결과를 나타낸 도면이고, 도 10b는 마우스 모델의 폐 조직에서 염증세포 침윤을 확인한 도면이다.
도 11a 내지 도 11c는 병원성 나노 입자인 대장균 유래 소포(E. coli EV)에 의한 염증질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)에 의한 염증성 매개체 분비 억제 효과를 나타낸 것으로, 도 11a는 기관지폐포 세척액(BALF) 내 CXCL-1 분비를 측정한 결과이고, 도 11b는 기관지폐포 세척액(BALF) 내 TNF-α 분비를 측정한 결과이며, 도 11c는 IL-1β 분비를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12a 내지 도 12c는 병원성 나노 입자인 대장균 유래 소포(E. coli EV)에 의한 염증질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)가 면역조절 관련 사이토카인의 분비에 미치는 효과를 나타낸 것으로, 도 12a는 IL-6 분비를 측정한 결과이고, 도 12b는 IL-17 분비를 측정한 결과이며, 도 12c는 IL-10 분비를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 13은 병원성 나노 입자인 대장균 유래 소포(E. coli EV)에 의한 염증질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)가 기도과민성의 발생에 미치는 효과를 나타낸 도면이다.
도 14는 LPS에 오염된 단백질에 의한 면역질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포 (M. luteus EV)의 염증질환 치료 효과를 평가하기 위한 실험 프로토콜을 나타낸 도면이다.
도 15a 내지 도 15c는 LPS에 오염된 단백질에 의한 면역질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)의 염증 억제 효과를 나타낸 것으로, 도 15a는 기관지폐포 세척액(BALF) 내 총 염증세포 수를 측정한 결과이고, 도 15b는 기관지폐포 세척액(BALF) 내 호중구 수를 측정한 결과이며, 도 15c는 폐 조직에서 염증세포 침윤을 확인한 도면이다.
도 16a 및 도 16b는 LPS에 오염된 단백질에 의한 면역질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)가 염증성 매개체인 IL-1β 및 Th17 면역반응 지표인 IL-17에 미치는 영향을 확인한 것으로, 도 16a는 IL-1β 농도를 측정한 결과이고, 도 16b는 Th17 면역반응 지표인 IL-17 농도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 17은 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)에 의한 면역기능 조절 기전을 평가하기 위하여, LPS에 오염된 단백질에 의한 면역질환 마우스 모델에서 분리한 폐 조직에서 면역기능 조절 단백질인 NLRP3, T-bet, 및 ROR-rt의 발현 양상을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 18a 및 도 18b는 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)에 의한 NO 생성 분자생물학적 기전을 평가하기 위하여, 상피세포에 마이크로코커스 루테우스 유래 소포와 양성 대조 약물인 덱사메타손(Dexamethasone)을 처리하여 바이러스 모사 나노 입자인 대장균 유래 소포(E. coli EV)에 의한 eNOS 신호 활성 및 iNOS 신호 활성을 확인한 것으로, 도 18a는 eNOS 신호 활성을 확인한 결과이고, 도 18b는 iNOS 신호 활성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 19는 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)의 안질환에 대한 효과를 평가하기 위한 동물 모델 실험 방법 및 평가 방법에 관해 나타낸 도면이다.
도 20은 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)의 안질환에 대한 효과를 평가하기 위해 산화 스트레스에 의한 안질환 토끼 모델에 소포를 경구 투여하여 대조군 대비 마이크로코커스 루테우스 유래 소포 처리군의 망막변성 면적(retinal degenerated area)를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 21은 산화 스트레스에 의한 안질환 토끼 모델에 소포를 경구 투여한 후, 안저카메라(TRC-50IX, TOPCON, Japan)로 안저를 촬영한 도면이다.
도 22는 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)의 안질환에 대한 작용기작을 도식화한 도면이다.
본 발명은 마이크로코커스 루테우스 유래 소포 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명자들은 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 마우스에 경구 투여하였을 때 소포가 점막을 통과하여 전신적으로 흡수되고, 특히 뇌 조직에 분포함을 확인하였다. 또한, 상피세포에 상기 소포를 처리하였을 때, 상기 소포가 병원성 나노 입자에 의한 염증성 매개체 분비를 현저히 억제하였고, 이는 상기 소포가 eNOS(endothelial NO synthase) 신호를 통해 활성화하는 반면, iNOS(inducible NO synthase) 발현을 억제하여 일어남을 확인하였다. 또한, 대표적인 염증세포인 대식세포와 호중구에 상기 소포를 처리하였을 때, 병원성 나노 입자에 의한 염증성 매개체 분비와 호중구의 활성화를 용량 의존적으로 억제할 뿐만 아니라 병원성 나노 입자에 의한 염증질환 마우스 모델에 상기 소포를 투여하였을 때, 병원성 나노 입자에 의한 염증의 발생을 유의하게 억제함을 확인하였다. 또한, LPS에 오염된 단백질에 의한 면역질환 마우스 모델에 상기 소포를 투여하였을 때, PAMP(pathogen-associated molecular pattern)에 의한 염증의 발생을 유의하게 억제하고, 이는 면역기능 이상을 조절하는 것을 통해 나타냄을 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명에 따른 마이크로코커스 루테우스 유래 소포가 노화 관련 안질환 및 염증성 안질환에 대한 예방, 개선 또는 치료용 조성물 등으로 유용하게 이용할 수 있음을 확인하였다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명자들은 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 마우스에 경구 투여하였을 때 상기 소포가 뇌 조직에 분포하는 것을 확인함으로써 혈관-뇌 장벽(blood brain barrier, BBB)를 통과하여 망막을 포함한 중추신경계로 소포가 전달됨을 확인하였다. 또한, 상피세포에 상기 소포를 처리하였을 때, 생물학적 원인 인자에 의한 염증성 매개체 분비를 현저히 억제할 뿐만 아니라 대표적인 염증세포인 대식세포와 호중구에 상기 소포를 처리하였을 때, 생물학적 원인 인자에 의한 염증성 매개체 분비와 호중구의 활성화를 용량 의존적으로 억제함을 확인하였다. 나아가, 생물학적 원인 인자에 의해 발현되는 조직 내 NLRP3 단백질이 상기 소포를 투여하였을 때 현저히 억제될 뿐만 아니라 생물학적 원인 인자에 의해 억제되는 eNOS(endothelial NO synthase) 신호가 상기 소포를 투여하였을 때 유의하게 회복되는 것을 확인하였다. 또한, 산화 스트레스에 의한 안질환 토끼 모델에 상기 소포를 투여하였을 때, 상기 소포가 망막 변성의 발생을 용량 의존적으로 유의하게 억제함을 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 안질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "안질환"이란 눈과 관련하여 발병하는 질환을 의미하는 것으로, 본 발명에서 있어서, 안질환이란 노화 관련 안질환 또는 염증성 안질환일 수 있으며, 구체적으로, NLRP3 inflammasome(NOD-like receptor pyrin domain-containing protein 3 inflammasome)에 의해 매개되는 안질환 또는 산화적 스트레스에 기이한 안질환일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어 "노화 관련 안질환(age-related ocular disease)"이란 나이가 들어 감에 따른 생체 기능 퇴화에 기이한 안질환뿐만 아니라, 실제 연령대보다 생체 기능이 퇴화하여 노인에게서 주로 나타나는 질환의 증상과 유사한 증상을 나타내는 안질환을 모두 포함하는 개념으로, 상기 노화 관련 안질환은 예를 들어, 망막 지도모양 위축증(retinal geographic atrophy), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy, DR), 녹내장(glaucoma), 백내장(cataract) 및 안구건조증(xerophthalmia) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 "망막 지도모양 위축증(retinal geographic atrophy)"이란 노화로 인해 눈의 기능이 저하되고 혈류 공급이 원할하게 이뤄지지 않아 망막색소상피에 쌓이는 노폐물인 드루젠(drusen)이 석회화되면서 망막과 맥락막모세혈관이 위축되고, 위축된 부위가 지도모양으로 커져서 중심부위까지 퍼지게 되어 시력을 상실하게 되는 질환을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "염증성 안질환(inflammatory ocular disease)"이란 염증성 원인인자에 의해 눈에 염증이 발생하여 나타나는 안질환을 모두 포함하는 개념으로, 상기 염증성 안질환은 예를 들어, 결막염(conjunctivitis), 공막염(scleritis), 각막염(keratitis), 홍채염(iritis), 포도막염(uveitis), 맥락망막염(chorioretinitis), 맥락염(choroiditis), 및 망막염(retinitis) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 "NLRP3 inflammasome(NOD-like receptor pyrin domain-containing protein 3 inflammasome)에 의해 매개되는 안질환"이란 NLRP3 inflammasome이 비정상적으로 과도하게 활성화되어 발생되는 안질환을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 마이크로코커스 루테우스 유래 소포는 NLRP3 inflammasome의 활성을 억제할 수 있으므로, 이를 통하여 NLRP3 inflammasome에 의해 매개되는 안질환에 대한 예방, 치료 또는 개선용 조성물로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어, "세포외 소포(Extracellular vesicle)" 또는 "소포(Vesicle)"란, 다양한 세균에서 분비되는 나노 크기의 막으로 된 구조물을 의미하며, 예를 들어, 내독소(lipopolysaccharide), 독성 단백질 및 세균 DNA와 RNA도 가지고 있는 대장균과 같은 그람음성균(gram-negative bacteria) 유래 소포 또는 외막 소포체(outer membrane vesicles, OMVs) 및 단백질과 핵산 외에도 세균의 세포벽 구성성분인 펩티도글리칸(peptidoglycan)과 리포테이코산(lipoteichoic acid)도 가지고 있는 마이크로코커스 속 세균과 같은 그람양성균(gram-positive bacteria) 유래 소포 등이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포외 소포 또는 소포는 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)에서 자연적으로 분비되거나 또는 인공적으로 생산된 막으로 된 모든 구조물을 총칭할 수 있으며, 본 발명에 있어서, MDH-101, MDH-101 EV, M. luteus EV 또는 MlEV로 다양하게 표시될 수 있다.
상기 소포는 마이크로코커스 루테우스 세균 배양과정에서 열처리, 고압처리 하거나, 상기 세균 배양액을 원심분리, 초고속 원심분리, 고압처리, 압출, 초음파분해, 세포 용해, 균질화, 냉동-해동, 전기천공, 기계적 분해, 화학물질 처리, 필터에 의한 여과, 겔 여과 크로마토그래피, 프리-플로우 전기영동, 및 모세관 전기영동으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 방법을 사용하여 분리할 수 있다. 또한, 불순물의 제거를 위한 세척, 수득된 소포의 농축 등의 과정을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 방법에 의하여 분리된 소포는 구형의 형태로, 평균 직경이 10 내지 200 nm, 10 내지 190 nm, 10 내지 180 nm, 10 내지 170 nm, 10 내지 160 nm, 10 내지 150 nm, 10 내지 140 nm, 10 내지 130 nm, 10 내지 120 nm, 10 내지 110 nm, 10 내지 100 nm, 10 내지 90 nm, 10 내지 80 nm, 10 내지 70 nm, 10 내지 60 nm, 10 내지 50 nm, 20 내지 200 nm, 20 내지 180 nm, 20 내지 160 nm, 20 내지 140 nm, 20 내지 120 nm, 20 내지 100 nm, 또는 20 내지 80 nm 일 수 있으며, 바람직하게는, 20 내지 200 nm 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물 내의 상기 소포의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 또는 0.001 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "유효성분으로 포함하는"이란 상기 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 소포의 효능 또는 활성을 달성하는데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명에서 "약학적 조성물"은 안질환의 예방 또는 치료를 목적으로 제조된 것을 의미하며, 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨데, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화활 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제, 점안제 또는 경구 섭취제 등으로 제제화할 수 있다.
나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 유효성분으로서 상기 소포 이외에 안질환의 예방, 개선, 또는 치료에 유용한 성분, 예를 들어 항산화제, 스테로이드계 또는 비스테로이드계 소염성 약물 등을 포함할 수 있다.
상기 항산화제로는 아스코르브산, 중아황산 나트륨, 부틸화 히드록시톨루엔, 부틸화 히드록시아니솔, 토코페롤 또는 이들의 조합이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 소염성 약물로는 덱사메타손, 플루오로메톨론, 프레드니솔론, 브롬페낙, 디클로페낙, 프루비프로펜, 케토로락, 또는 그의 염을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명에서 상기 안구 투여는 결막낭 내 투여, 유리체 내 투여, 망막하 투여, 맥락막 상강 투여, 결막 하 투여 및 테논낭 하 투여로 이루어진 군으로부터 선택된 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, 약학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에서 "예방"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 안질환의 발생을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 "치료"란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 안질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 "개선"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터 또는 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 안질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 안질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 노화 관련 안질환 치료용 약제 제조를 위한 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 용도를 제공한다.
본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
또한, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 안질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 식품 조성물은 건강기능성 식품 조성물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카 라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물, 예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 안질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것이다. 예를 들어 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 섬유ㆍ고무 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염병을 막기 위한 살균ㆍ살충제 등도 이에 포함된다.
본 발명에 있어서, 의약외품 조성물은 안과용 조성물의 제형으로 제형화하여 사용할 수 있고, 예컨대 안과용 액제, 점안제, 안연고, 주사액, 및 세안약(eyewash)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형으로 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 흡입용 조성물 형태로 제공될 수 있다.
흡입 투여제의 경우, 당업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있으며, 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물 및 락토오즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.
또한, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환 치료 약물전달용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "약물전달"이란 특정 장기, 조직, 세포 또는 세포소기관으로 약물을 전달하기 위하여 본 발명에 따른 조성물에 약물을 로딩하여 전달하는 모든 수단 또는 행위를 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 마이크로코커스 루테우스 배양액에서 소포 분리
마이크로코커스 루테우스 균주를 배양한 후 이의 소포를 분리하여 특성을 분석하였다. 마이크로코커스 루테우스를 37℃ 호기성 챔버에서 흡광도(OD 600)가 1.0~1.5가 될 때까지 MRS(de Man-Rogosa and Sharpe) 배지에서 배양한 후 sub-culture 하였다. 이후 균주가 포함되어 있는 배지 상등액을 회수하여 10,000 g, 4 ℃에서 20분 동안 원심분리하고 균주를 제거하고, 0.22μm 필터에 여과하였다. 여과한 상등액을 100 kDa Pellicon 2 Cassette 필터 멤브레인(Merck Millipore, US)으로 MasterFlex pump system(Cole-Parmer, US)를 이용하여 microfiltration을 통해 50 ㎖ 부피로 농축하였다. 이후 농축시킨 상등액을 다시 한 번 0.22 μm 필터로 여과하였다. 이후 BCA assay를 이용해 단백질을 정량하였고, 얻어진 소포에 대하여 하기 실험들을 실시하였다.
실시예 2. 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 약동학적 특성 평가
마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 약동학적 특성을 알아보기 위해, 형광 염색시약으로 염색한 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 마우스 경구로 투여하여 72시간까지 각 장기에서 발현된 형광을 측정하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, 형광 염색된 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 시간에 따른 장기 분포를 이미지로 확인하였을 때, 상기 소포가 여러 장기에 분포하고 있는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 뇌에서 발현되는 마이크로코커스 루테우스 유래 세포외 소포의 형광 세기를 그래프로 나타냈을 때, 도 2에 나타난 바와 같이, 뇌에서 상기 소포는 경구 투여 1시간 후부터 시그널이 나타나 24시간까지 지속되었으며, 이후 형광 시그널이 사라지는 양상을 나타내는 것을 확인하였다. 상기 결과로부터, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 경구 투여하였을 때 점막을 통과하여 체내에 흡수되어 여러 장기에 분포함을 알 수 있으며, 특히 혈관-뇌 장벽(blood brain barrier, BBB)를 통과하여 망막을 포함한 중추신경계로 이동하여 분포함을 알 수 있다.
실시예 3. 상피세포에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 항염증 효과 평가
도 3에 나타난 바와 같이, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)와 양성 대조 약물인 덱사메타손(Dexamethasone)을 상피세포(A549 세포)에 전처리한 후, 염증을 유도하는 대장균 유래 소포(E. coli EV)를 처리하여 염증성 사이토카인 IL-8의 분비량을 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay, R&D Systems)로 측정하였다. 구체적으로, A549 세포에 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 다양한 농도 (1, 10, 100 ㎍/mL)로 24시간 전처리한 후 대장균 유래 소포를 1 ng/mL 농도로 24시간 처리하여 배지로 분비된 IL-8을 측정하였다.
그 결과, 도 4a에 나타난 바와 같이, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포에 의해 IL-8의 분비가 용량 의존적으로 억제됨을 확인하였다. 또한, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 대조 약물인 덱사메타손과 비교하였을 때, IL-8 분비 억제 효과가 더욱 탁월하였고, 상기 소포에 열처리를 하여 투여하였을 때에는 IL-8 분비 억제 효과가 없어짐을 확인하였다. 상기 결과로부터, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포가 대표적인 항염증 약물인 덱사메타손에 비해 항염증 효능이 더 우수함을 알 수 있으며, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포에 의한 항염증 효능이 열처리 시 없어지는 것을 통해 항염증 작용이 소포 내 단백질에 의해 매개됨을 알 수 있다.
실시예 4. 염증세포인 대식세포에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 항염증 효과 평가
도 5에 나타난 바와 같이, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)를 대식세포(RAW 264.7 세포)에 전처리한 후, 염증을 유발하는 대장균 유래 소포(E. coli EV)를 처리하여 염증성 사이토카인 TNF-α 및 IL-6을 ELISA (R&D Systems) 방법으로 측정하였다. 구체적으로, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 다양한 농도 (1 ㎍/mL, 10 ㎍/mL, 및 100 ㎍/mL)로 24시간동안 전처리한 후, 대장균 유래 소포를 1 ng/mL 농도로 24시간 처리하여 배지로 분비된 TNF-α와 IL-6를 측정하였다.
그 결과, 도 6a 및 도 6b에 나타난 바와 같이, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 전처리한 경우에 대장균 유래 소포에 의한 TNF-α (도 6a) 및 IL-6 (도 6b)의 분비가 용량 의존적으로 억제됨을 확인하였다. 상기 결과는, 병원성 생물학적 원인 인자(병원성 세균 또는 바이러스)에 의한 염증의 발생을 마이크로코커스 루테우스 유래 소포가 효율적으로 억제함을 의미한다.
실시예 5. 염증세포인 호중구에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 호중구 활성화 억제 효과 평가
도 7에 나타난 바와 같이, lymphoprep을 이용해 사람 혈액을 분리하여 호중구를 추출한 후, 호중구의 활성화를 평가하기 위하여 호중구 내 과립 단백질인 NE(neutrophil elastase)를 ELISA (R&D Systems)로 측정하였다. 구체적으로, 혈액 10 mL을 ACD solution을 포함하는 tube에 모아준 뒤, 20 mL lymphoprep 위에 혈액을 조심히 넣고 원심분리를 진행하였다. 원심분리 후 red blood layer를 모아 12 mL의 Dextran과 섞어주고 상온에 45 분간 방치하였다. 층 분리 후 상층액에 1X HBSS를 40 mL 넣고 한번 더 원심분리를 진행한 후, autoclaved millipore water로 적혈구를 제거해 주고 neutrophil isolation kit (MACS)를 이용해 호중구를 분리하였다. 분리한 호중구를 RPMI1640 배지를 이용해 배양하고 대장균 유래 소포(E coli EV)와 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)를 24시간 동안 동시 처리한 후, 배지에서 NE를 측정하였다. 양성 대조 약물로는 덱사메타손(Dex)을 처리하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 대조 약물인 덱사메타손은 호중구 활성화 지표인 NE 분비를 억제하지 못하였지만, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포는 용량 의존적으로 호중구에서 NE 분비를 억제하였다. 상기 결과로부터, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포는 호중구가 활성화되어 일어나는 질환을 효율적으로 치료할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 6. 병원성 나노 입자에 의한 염증질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 항염증 효과 평가
도 9에 나타난 바와 같이, 병원성 나노 입자인 대장균 유래 소포(E. coli EV) 10 ng/ml를 비강으로 투여하여 염증질환 마우스 모델을 제작하였다. 상기 모델에 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 면역기능 조절 효과룰 평가하기 위하여 상기 대장균 유래 소포를 투여하기 5일전부터 마이크로코커스 루테우스 유래 소포 10 ng/ml 또는 100 ng/ml을 비강으로 투여하여 기관지폐포 세척액(BALF) 및 폐 조직에서 항염증 효과를 평가하였다. 구체적으로, 기관지폐포 세척액(BALF)에서의 항염증 효과를 평가하기 위하여, PBS 1 mL이 담긴 주사기를 기도에 연결하여 기관지폐포 세척액(BALF)을 채취한 후 Trypan blue(Abcam)을 사용하여 총 세포, 대식세포 및 호중구 수를 측정하였다. 또한, 폐 조직에서 항염증 효과를 평가하기 위하여, Cytopro(ELItech)에 슬라이드 글라스를 장착하여 세포를 고정시킨 후 Hematoxylin (DAKO) 및 Eosin (Sigma, USA)을 사용하여 염색한 뒤 호중구 수를 측정하였다.
그 결과, 도 10a에 나타낸 바와 같이, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 투여한 그룹의 기관지폐포 세척액(BALF)에서 용량 의존적으로 대식세포와 호중구 수가 감소된 것을 확인하였다. 또한, 도 10b에 나타난 바와 같이, Hematoxylin&Eosin 염색법을 이용하여 폐의 조직학적 변화를 평가한 결과, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 투여한 그룹의 페 조직에서 면역세포와 염증세포 침윤이 현저히 감소된 것을 확인하였다.
나아가, 도 11a 내지 도 11c에 나타난 바와 같이, 기관지폐포 세척액(BALF)에서 염증성 매개체 분비 정도를 평가한 결과, 염증 유도 사이토카인인 CXCL-1(도 11a), TNF-α(도 11b), 및 IL-1β(도 11c)의 분비가 마이크로코커스 루테우스 유래 소포에 의해 용량 의존적으로 억제됨을 확인하였다.
상기 결과로부터, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포가 병원성 나노 입자에 의해 발생하는 염증질환을 효율적으로 억제할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 7. 병원성 나노 입자에 의한 염증질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 면역 조절 효과 평가
실시예 6의 염증질환 마우스 모델에 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 투여하여 면역기능 조절 효과를 평가하였다.
그 결과, 도 12a 및 도 12b에 나타낸 바와 같이, 대장균 유래 소포에 의한 염증을 유발하는 면역반응과 관련된 사이토카인인 IL-6(도 12a) 및 IL-17(도 12b)의 분비가 마이크로코커스 루테우스 유래 소포에 의해 용량 의존적으로 억제됨을 확인하였다.
한편, 도 12c에 나타낸 바와 같이, 면역기능을 억제하는 사이토카인 IL-10의 분비는 마이크로코커스 루테우스 유래 소포에 의해 억제되지 않았다 (도 12c). 상기의 결과로부터, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포에 의한 항염증 효과가 병원성 나노 입자에 의한 면역반응을 억제함으로써 일어남을 알 수 있다.
실시예 8. 바이러스 모사 병원성 나노 입자에 의한 염증질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 면역기능 이상에 대한 치료 효과 평가
면역기능 이상에 의해 발생하는 염증반응은 장기의 기능적인 변화를 초래하여 질환을 일으키게 된다. 실시예 6의 염증질환 마우스 모델에 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 투여하여 염증에 의해 유도되는 폐의 기능적인 변화를 평가하였다. 구체적으로, 각 마우스에 다양한 농도(0 mg/mL, 6.25 mg/mL, 12.5 mg/mL 및 25 mg/mL)로 에어로졸 메타콜린(Sigma, USA)을 투여한 후 flexiVent(SCIREQ, Canada)를 사용하여 흡입된 메타콜린에 대한 최고 기도반응을 측정함으로써 메타콜린에 의한 기도과민성(Airway hyperresponsiveness, AHR)을 측정하여 기능적인 변화를 평가하였다.
그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 투여한 그룹에서 메타콜린에 의해 유도된 기도저항성이 용량 의존적으로 개선된 것을 확인하였다. 상기의 결과로부터, 병원성 나노 입자에 의해 유도되는 질환의 병인에서 염증과 관련된 면역기능의 변화가 마이크로코커스 루테우스 유래 소포에 의해 효율적으로 치료될 수 있음을 알 수 있다.
실시예 9. LPS에 오염된 단백질에 의한 면역질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 항염증 효과 평가
도 14에 나타낸 바와 같이, LPS에 오염된 단백질에 의한 면역질환 마우스 모델을 제작하기 위하여, 생물학적 원인 인자에서 유래한 PAMP(pathogen-associated molecular pattern) 중의 하나인 LPS 10 μg 및 OVA 단백질(ovalbumin) 75 μg 를 마우스에 흡입 투여하여 LPS에 오염된 단백질에 의한 면역질환 마우스 모델을 제작하였다. 이후, 3주간 OVA 50 μg와 마이크로코커스 루테우스 유래 소포 100ng을 동시에 비강으로 투여하였다. 대조 약물로는 덱사멕타손 (Dex) 20 μg을 복강으로 투여하였다.
그 결과, 도 15a 및 도 15b에 나타낸 바와 같이, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 투여한 그룹은 덱사메타손을 투여한 그룹과 유사하게 기관지폐포 세척액(BALF) 내 총 염증세포 수(도 15a) 및 호중구 수(도 15b)가 유의하게 감소한 것을 확인하였다.
또한, 도 15c에 나타낸 바와 같이, Hematoxylin&Eosin 염색법을 이용하여 폐의 조직학적 변화를 평가한 결과, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 투여한 그룹은 덱사메타손을 투여한 그룹과 유사하게 폐 조직에서 염증세포 침윤이 현저히 억제된 것을 확인하였다 (도 15c). 상기 결과로부터, PAMP에 의해 유도되는 면역질환을 마이크로코커스 루테우스 유래 소포가 효율적으로 치료할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 10. LPS에 오염된 단백질에 의한 면역질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 항염증 효과에 대한 면역학적 작용기전 확인
실시예 9의 마우스 모델을 이용하여 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 항염증 효과에 대한 면역학적 작용기전을 확인하기 위하여, 기관지폐포 세척액(BALF) 내 IL-1β와 IL-17을 ELISA(R&D Systems)를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 16a 및 도 16b에 나타낸 바와 같이, 기관지폐포 세척액(BALF) 내 염증성 사이토카인 IL-1β(도 16a) 및 PAMP에 의한 Th17 면역반응의 지표인 IL-17(도 16b)의 농도가 마이크로코커스 루테우스 유래 소포에 의해 유의하게 감소한 것을 확인하였다. 상기의 결과로부터, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포가 LPS에 의한 Th17 면역반응을 효율적으로 억제함으로써 PAMP에 의해 유도되는 질환을 치료할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 11. LPS에 오염된 단백질에 의한 면역질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 면역기능 조절 분자생물학적 작용기전 확인
여러 가지 스트레스에 대한 선천면역 반응은 질병의 병인에 매우 중요하다고 알려져 있다. 특히, 세포질에 존재하는 NLRP3 단백질은 노화 관련 안질환 및 염증성 안질환의 병인에 핵심적인 신호전달 경로로 알려지고 있다. 또한, 항원에 대한 후천면역 반응 발생과 관련있는 t-bet과 ROR-γt는 각각 항원에 대한 Th1 및 Th17 면역세포로의 분화에 관련된 핵심적인 신호전달 물질로 알려져 있다.
마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 면역기능 조절에 대한 분자생물학적 작용기전을 평가하기 위하여, 실시예 9의 마우스 모델의 폐 조직에서 NLRP3(NOD-like receptor pyrin domain-containing protein 3), t-bet (t-box protein expressed in T cells), ROR-γt (retineic-acid-receptor-related orphan nuclear receptor gamma) 발현을 western blotting으로 확인하였다. 구체적으로, 각 단백질의 발현양을 측정하기 위해 단백질 50 μg을 사용하였으며, 덱사메타손 (Dexamethasone; Dex) 또는 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 투여한 마우스 그룹의 폐 조직에서 단백질의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이, LPS에 오염된 단백질을 투여한 그룹에서는 음성 대조군에 비해 NLRP3 발현이 현저히 증가되었고, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 투여한 그룹의 폐 조직에서는 덱사메타손을 투여한 그룹과 유사하게 NLRP3, t-bet 및 ROR-γt의 발현이 현저히 억제됨을 확인하였다.
NLRP3는 세균 및 바이러스 감염 시 단핵구와 대식세포에서 발현되어 IL-1β를 분비하는 핵심적인 pattern-recognition receptor (PRR)이다. 상기 결과로부터, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포가 NLRP3 발현을 억제하여 선천면역 기능을 조절함을 알 수 있다. 또한, 항원에 대한 후천면역 반응 발생과 관련있는 t-bet과 ROR-γt는 각각 항원에 대한 Th1 및 Th17 면역세포로의 분화에 관련된 핵심적인 신호전달 물질이다. 상기 결과로부터 마이크로코커스 루테우스 유래 소포는 t-bet과 ROR-γt 발현을 억제함으로써 Th1 및 IL-17을 분비하는 Th17 면역세포로의 분화 및 활성화를 억제함을 알 수 있다.
이는 LPS와 같은 PAMP에 의해 유도되는 면역기능 이상이 상기 마이크로코커스 루테우스 유래 소포에 의해 효율적으로 억제됨을 의미한다.
실시예 12. 산화 스트레스에 대한 세포의 항상성 조절에 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 효능 평가
세포가 여러 가지 스트레스에 반복적으로 노출 시 세포 내에서는 산화 스트레스(oxidative stress)에 의해 세포 노화가 발생하고, 세포 기능에 이상이 초래되며, 또한 세포 사멸이 초래되어 노화에 따른 퇴행성 질환이 발생한다. 특히, eNOS 신호를 통해 생성되는 저농도의 NO(nitric oxide)는 산화 스트레스의 주범인 활성 산소(reactive oxygen species, ROS) 작용을 길항하여 세포의 항상성을 유지하는 핵심적인 역할을 담당한다. 반면, iNOS 신호를 통해 생성되는 고농도의 NO는 오히려 세포에 과도한 스트레스를 초래하여 면역기능과 대사기능 이상을 초래하여 질병 발생을 촉진한다.
산화 스트레스에 대한 세포의 항상성에 미치는 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 효과를 평가하기 위하여, 실시예 3에 기술된 방법으로 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)를 A549 세포에 처리한 후, 세포 신호전달 단백질의 발현 양상을 평가하였다. 신호전달 단백질 발현을 평가하기 위한 구체적인 방법으로, lysis buffer를 이용해 세포를 용해시키고 단백질을 추출하였으며, BCA protein assay kit(Thermo, USA)를 사용하여 단백질을 정량하였다. 샘플 당 50 μg의 단백질을 10% polyacrylamide gel에서 전기영동 하였으며, 분리된 단백질은 nitrocellulose membrane에 transfer하였다. skim milk를 첨가한 tris-buffered saline(0.05% tween 20) (TBST)로 실온에서 30분간 blocking 한 후, p-ERK, ERK, p-p38, p38, p-JNK, JNK, p-p65, p65, iNOS, p- eNOS, eNOS, 및 β-actin에 특이적인 1차 항체를 1/1,000으로 희석하여 4°C에서 24시간 동안 반응시켰다. 이후, 10분씩 3회 PBST(0.05% tween-20이 들어있는 phosphate buffer saline)로 세척하고, 1/5,000으로 희석한 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 10분씩 5회 PBST로 세척 후 ECL select reagent를 이용해 band를 확인하였다.
그 결과, 도 18a에 나타난 바와 같이, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 처리하였을 때, ERK 및 eNOS의 인산화가 덱사메타손(Dex) 및 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M luteus EV)에 의해 증가하였다. 또한, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포에 의한 eNOS 신호는 상기 마이크로코커스 루테우스 유래 소포에 열처리를 하였을 때 억제되었다. 상기 결과로부터, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포는 eNOS 신호를 활성화하여 세포 내에서 저농도의 NO을 유도하여 세포의 항상성을 증가시키며, 이러한 eNOS 신호를 통한 저농도의 NO 생성 및 산화 스트레스 억제 효과는 열에 취약한 소포 내 단백질에 의해 매개됨을 알 수 있다.
한편, 도 18b에 나타난 바와 같이, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 처리하였을 때, JNK, p65, p38의 인산화 및 iNOS의 발현이 억제되었다. 또한, iNOS의 발현은 마이크로코커스 루테우스 유래 소포에 열처리하여 막단백질 기능을 억제하였을 때도 상기 소포의 억제효과가 유지되는 것으로 나타났다. 상기 결과로부터, iNOS 신호를 통한 고농도 NO 생성과 이로 인한 염증은 상기 소포에 존재하는 단백질 이외의 성분에 의해 매개됨을 알 수 있다.
실시예 13. 산화 스트레스(oxidative stress)에 의한 안질환 토끼모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 치료 효과 평가
안질환을 유발하기 위하여 산화 스트레스에 의해 망막의 변성을 유발하는 물질인 SI(Sodium iodate)를 토끼 모델에 단회 정맥 투여하였다. 보다 자세하게는, 도 19에 나타낸 바와 같이,마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 치료 효과를 평가하기 위해, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV) 0.025mg/kg 및 0.25mg/kg를 안질환 유발 3일 전부터 유발 후 7일째까지 매일 1회씩 경구 투여하였다. 평가 방법은 retinal degenerated area(변성된 망막의 면적)을 안저카메라(TRC-50IX, TOPCON, Japan)로 질환 유발 후 7일째 마지막 투여 날에 촬영하여 분석하였다.
그 결과, 도 20에 나타난 바와 같이, 저용량 소포 처리군(G3)과 고용량 소포 처리군(G4)에서 양성 대조군(G2) 대비 변성된 망막의 면적이 통계적으로 유의하게 감소되었고, 이는 용량 의존적임을 확인하였다.
한편, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 안질환 치료 효과를 평가하기 위해, 토끼의 우측 안구에 산동제(미드리아실 1% 점안액)를 점안한 후, 동물을 마취하고, 안저카메라를 이용하여, 안저를 촬영한 결과를 도 21에 나타내었다.
도 21에 나타낸 바와 같이, 양성 대조군(G2)은 음성 대조군(G1)에 비해 망막의 변성이 현저히 증가되어 있음을 알 수 있었고, 저용량 소포 처리군(G3) 및 고용량 소포 처리군(G4)은 망막의 변성이 양성 대조군에 비해 현저히 감소되어 있음을 알 수 있었다.
상기 결과로부터, 본 발명의 마이크로코커스 루테우스 유래 소포는 노화 또는 염증과 관련하여 발생하는 안질환의 발생을 효율적으로 억제함을 알 수 있었다. 특히, 상기 마이크로코커스 루테우스 유래 소포는 산화 스트레스, 미토콘드리아 기능 이상, 리소좀 손상 등에 의해 유도되는 NLRP3 inflammasome 신호를 억제하여 선천면역과 후천면역 기능을 회복시킴을 알 수 있다. 또한, eNOS 신호를 통해 저농도 NO 생성을 유도하여 세포의 항상성을 증가시킨다는 사실을 알 수 있다. 특히, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 경구 투여하였을 때 BBB(Blood-brain barrier)를 통과하여 중추신경계에 분포하여, 도 22에 나타낸 바와 같이, 시각과 관련된 신경세포의 면역기능 이상에 의한 세포 사멸을 억제함과 동시에 세포의 항상성을 효율적으로 증가시킬 수 있음을 확인하였는바, 본 발명의 마이크로코커스 루테우스 유래 소포는 노화 관련 안질환 및 염증성 안질환의 개선, 예방, 또는 치료 용도로서 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
실시예 14. 병원성 나노 입자에 의한 염증질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 속 세균 유래 소포의 효과 평가
상기 실시예 6과 같이 병원성 나노 입자에 의한 염증질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 속 세균 유래 소포의 효과를 확인한 결과, 마이크로코커스 속 세균 유래 소포를 투여한 그룹에서 용량 의존적으로 천식, 폐렴 등의 호흡기질환; 간염, 간경변, 간암 등의 간질환; 사구체신염, 당뇨병성 신증 등의 신장질환; 및/또는 알츠하이머병, 파킨슨병, 루게릭병 등의 뇌질환 등의 난치성 질환에 치료 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명자들은 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 경구 투여하였을 때 상기 소포가 혈관-뇌 장벽(blood brain barrier, BBB)을 통과하여 중추신경계로 전달됨을 확인하였다. 또한, 상피세포 및 대식세포에 상기 소포를 처리하였을 때, 생물학적 원인 인자에 의한 염증성 매개체 분비를 현저히 억제할 뿐만 아니라 세포에 상기 소포를 처리하였을 때, 생물학적 원인 인자에 의한 NLRP3 단백질 발현을 억제함을 확인하였다. 나아가, 산화 스트레스에 의한 안질환 토끼 모델에 상기 소포를 투여하였을 때, 산화 스트레스에 의한 망막 변성(retinal degeneration) 발생을 유의하게 억제함을 확인하였는바, 본 발명에 따른 마이크로코커스 루테우스 유래 소포는 안질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물뿐만 아니라 안질환 치료 약물전달체로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (22)

  1. 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 안질환은 NLRP3 inflammasome(NOD-like receptor pyrin domain-containing protein 3 inflammasome)에 의해 매개되는 안질환인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 안질환은 노화 관련 안질환인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 안질환은 망막 지도모양 위축증(retinal geographic atrophy), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 백내장(cataract), 녹내장(glaucoma) 및 안구건조증(xerophthalmia)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 안질환은 염증성 안질환인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 안질환은 결막염(conjunctivitis), 공막염(scleritis), 각막염(keratitis), 홍채염(iritis), 포도막염(uveitis), 맥락망막염(chorioretinitis), 맥락염(choroiditis), 및 망막염(retinitis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 소포는 평균 직경이 10 내지 200 nm인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 소포는 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)에서 자연적으로 분비 또는 인공적으로 생산되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 NLRP3 inflammasome(NOD-like receptor pyrin domain-containing protein 3 inflammasome)의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  10. 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 안질환은 망막 지도모양 위축증(retinal geographic atrophy), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 백내장(cataract), 녹내장(glaucoma), 안구건조증(xerophthalmia), 결막염(conjunctivitis), 공막염(scleritis), 각막염(keratitis), 홍채염(iritis), 포도막염(uveitis), 맥락망막염(chorioretinitis), 맥락염(choroiditis), 및 망막염(retinitis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환인 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
  12. 마이크로코커스 루테우스 (Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 안질환은 망막 지도모양 위축증(retinal geographic atrophy), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 백내장(cataract), 녹내장(glaucoma), 안구건조증(xerophthalmia), 결막염(conjunctivitis), 공막염(scleritis), 각막염(keratitis), 홍채염(iritis), 포도막염(uveitis), 맥락망막염(chorioretinitis), 맥락염(choroiditis), 및 망막염(retinitis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환인 것을 특징으로 하는, 의약외품 조성물.
  14. 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환 예방 또는 개선용 흡입용 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 안질환은 망막 지도모양 위축증(retinal geographic atrophy), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 백내장(cataract), 녹내장(glaucoma), 안구건조증(xerophthalmia), 결막염(conjunctivitis), 공막염(scleritis), 각막염(keratitis), 홍채염(iritis), 포도막염(uveitis), 맥락망막염(chorioretinitis), 맥락염(choroiditis), 및 망막염(retinitis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환인 것을 특징으로 하는, 흡입용 조성물.
  16. 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환 치료 약물전달용 조성물.
  17. 마이크로코커스 루테우스 (Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 안질환의 예방 또는 치료 방법.
  18. 마이크로코커스 루테우스 (Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 조성물의 안질환의 예방 또는 치료 용도.
  19. 마이크로코커스 루테우스 (Micrococcus luteus) 유래 소포의 안질환 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 용도.
  20. 목적하는 안질환 치료 약물을 담지한 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 안질환 치료 약물 전달 방법.
  21. 마이크로코커스 루테우스 (Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 조성물의 안질환 치료 약물 전달 용도.
  22. 마이크로코커스 루테우스 (Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 조성물의 안질환 치료 약물 전달용 약제의 제조를 위한 용도.
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