WO2001049308A1 - Nouvelles compositions de renforcement de l'immunité - Google Patents

Description

明 細 書 新規免疫増強組成物 技術分野

本発明は、 新規の免疫増強組成物に関する。 本発明の免疫増強組成物は、 医薬 品として投与することができるだけでなく、 種々の形態、 例えば、 機能性食品や 健康食品 （飲料を含む） 、 又は飼料として飲食物の形で与えることも可能である 更には、 口中に一時的に含むものの、 そのほとんどを口中より吐き出す形態、 例 えば、 歯磨剤、 洗口剤、 チューインガム、 又はうがい剤の形で与えることも、 あ るいは、 鼻から吸引させる吸入剤の形で与えることも可能である。 背景技術

キノコには種々の生理活性物質が含まれていることが知られており、 例えば、 特公昭 5 7 - 1 2 3 0号公報及び特許第 2 7 6 7 5 2 1号明細書には、 マツタケ に含有される各種の抗腫瘍性物質が開示されている。 前記特公昭 5 7 - 1 2 3 0 号公報には、 マッタケ菌糸体の液体培養物を熱水又は希アル力リ溶液で抽出して 得られる抽出液から分離精製されたエミタニン一 5— A、 エミタニン一 5— B、 エミタニン一 5— C、 及びエミタニン一 5—りに、 サルコ一マ 1 8 0細胞の増殖 阻止作用があることが開示されている。 また、 前記特許第 2 7 6 7 5 2 1号明細 書には、 マツタケ子実体の水抽出物から分離精製された分子量 2 0〜2 1万のタ ンパク質 （サブュニッ 卜の分子量 = 1 0〜 1 1万） が抗腫瘍活性を有することが 開示されている。

本発明者は、 市販されている種々の食用キノコについて、 その熱水抽出液の 種々の生理活性を比較検討したところ、 マツタケを含む多くの食用キノコにおい てサルコ一マ 1 8 0細胞の増殖抑制活性が認められたのに対して、 免疫増強活性 に関しては、 マツタケだけが非常に高い活性を示すことを新たに見出した。 また、 マツタケ熱水抽出液だけでなく、 マツタケのアルカリ溶液抽出液、 あるいは、 マ ッタケ熱水抽出液又はマッタケアルカリ溶液抽出液の陰ィォン交換樹脂吸着画分 も、 免疫増強活性を示すことを新たに見出した。 このようなマツタケ熱水抽出液 又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 あるいは、 マツタケ熱水抽出液又はマツタケ アルカリ溶液抽出液の陰ィ才ン交換樹脂吸着画分の免疫増強活性は、 これまで全 く知られておらず、 本発明はこうした知見によるものである。 発明の開示

従って、 本発明は、 マツタケ （T r i c h o l o m a m a t s u t a k e ) 熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分に関す る。

また、 本発明は、 マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 ある いは、 マツタケ熱水抽出液又はマッタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂 吸着画分と、 薬剤学的に許容することのできる担体とを含有する、 免疫増強組成 物、 キラー活性誘導 （好ましくは腸管リンパ球のキラー活性誘導） 組成物、 腫瘍 増殖抑制組成物、 インタ一ロイキン 1 2誘導組成物、 T G F—/?活性抑制組成物、 及び活性酸素捕捉組成物に関する。

また、 本発明は、 マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 ある し、は、 マッタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰ィ才ン交換樹脂 吸着画分を、 それ単独で、 あるいは、 所望により 1又はそれ以上の食品成分と共 に含有する、 免疫増強機能性食品、 キラー活性誘導 （好ましくは腸管リンパ球の キラー活性誘導） 機能性食品、 腫瘍増殖抑制機能性食品、 インタ—ロイキン 1 2 誘導機能性食品、 T G F—/?活性抑制機能性食品、 及び活性酸素捕捉機能性食品 に関する。

また、 本発明は、 マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 ある いは、 マッタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰ィォン交換樹脂 吸着画分を、 免疫増強が必要な対象に、 有効量で投与することを含む、 免疫を増 強する方法に関する。

また、 本発明は、 マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 ある いは、 マッタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂 吸着画分を、 キラー活性誘導 （好ましくは腸管リンパ球のキラー活性誘導） が必 要な対象に、 有効量で投与することを含む、 キラ一活性 （好ましくは腸管リンパ 球のキラ一活性） を誘導する方法に関する。

また、 本発明は、 マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 ある いは、 マッタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂 吸着画分を、 腫瘍増殖抑制が必要な対象に、 有効量で投与することを含む、 腫瘍 増殖を抑制する方法に関する。

また、 本発明は、 マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 ある し、は、 マッタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰ィ才ン交換樹脂 吸着画分を、 インタ一ロイキン 1 2誘導が必要な対象に、 有効量で投与すること を含む、 インターロイキン 1 2を誘導する方法に関する。

また、 本発明は、 マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 ある いは、 マッタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰ィ才ン交換樹脂 吸着画分を、 T G F— /5活性抑制が必要な対象に、 有効量で投与することを含む、 T G F— 5活性を抑制する方法に関する。

また、 本発明は、 マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 ある いは、 マツタケ熱水抽出液又はマッタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂 吸着画分を、 活性酸素捕捉が必要な対象に、 有効量で投与することを含む、 活性 酸素を捕捉する方法に関する。

また、 本発明は、 マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 ある いは、 マッタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰ィ才ン交換樹脂 吸着画分の、 免疫増強組成物又は免疫増強機能性食品を製造するための使用に関 する。

また、 本発明は、 マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 ある いは、 マッタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰ィ才ン交換樹脂 吸着画分の、 キラー活性誘導 （好ましくは腸管リンパ球のキラー活性誘導） 組成 物又はキラー活性誘導 （好ましくは腸管リンパ球のキラー活性誘導） 機能性食品 を製造するための使用に関する。

また、 本発明は、 マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 ある いは、 マッタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰ィ才ン交換樹脂 吸着画分の、 腫瘍増殖抑制組成物又は腫瘍増殖抑制機能性食品を製造するための 使用に関する。

また、 本発明は、 マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 ある いは、 マツタケ熱水抽出液又はマッタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂 吸着画分の、 インタ一ロイキン 1 2誘導組成物又はインターロイキン 1 2誘導機 能性食品を製造するための使用に関する。

また、 本発明は、 マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 ある いは、 マッタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰ィ才ン交換樹脂 吸着画分の、 T G F— ?活性抑制組成物又は T G F— /5活性抑制機能性食品を製 造するための使用に関する。

更に、 本発明は、 マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 ある いは、 マッタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂 吸着画分の、 活性酸素捕捉組成物又は活性酸素捕捉機能性食品を製造するための 使用に関する。

図面の簡単な説明

図 1 は、 吸着画分 D 2の¹ H—次元 N M R測定により得られたスぺクトルであ る。

図 2は、 吸着画分 D 2の^{1 3} C—次元 N M R測定により得られたスぺクトルであ る。

図 3は、 吸着画分 D 2の円偏光二色性分析により得られた C Dスぺク トルであ る。 発明を実施するための最良の形態

以下、 本発明を詳細に説明する。

マツタケ （T r i c h o l o m a m a t s u t a k e ) から熱水抽出し、 陰 ィ才ン交換樹脂吸着させて得ることのできる本発明の新規画分は、 熱水抽出工程 を経由するにもかかわらず、 優れた免疫増強活性を示す。 また、 マツタケ熱水抽 出液も優れた免疫増強活性を示す。 更に、 マツタケのアルカリ溶液抽出液も優れ た免疫増強活性を示し、 前記アルカリ溶液抽出液を、 陰イオン交換樹脂吸着させ て得ることのできる本発明の新規画分も優れた免疫増強活性を示す。

従って、 本発明による免疫増強組成物は、 （1 ) マツタケ熱水抽出液、 （2 ) マツタケのアルカリ溶液抽出液、 （3 ) マツタケ熱水抽出液の陰イオン交換樹脂 吸着画分、 あるいは、 （4 ) マツタケのアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂 吸着画分を、 有効成分として含有し、 更に、 薬剤学的又は獣医学的に許容するこ とのできる通常の担体を含有する。

本発明の免疫増強組成物における有効成分である、 マッタケ熱水抽出液の陰ィ オン交換樹脂吸着画分は、 これに限定されるものではないが、 例えば、 マツタケ を熱水で抽出し （以下、 熱水抽出工程と称する） 、 得られた抽出液を陰イオン交 換樹脂に吸着させた後 （以下、 陰イオン交換樹脂吸着工程と称する） 、 適当な溶 離液により吸着画分を溶出する （以下、 溶出工程と称する） ことにより、 得るこ とができる。

熱水抽出工程に用いる前記マツタケとしては、 例えば、 天然のマツタケの子実 体若しくは菌糸体、 又は培養により得られるマツタケの菌糸体若しくは培養物

( B r o t h ) を挙げることができる。 培養に用いる前記マツタケとしては、 例 えば、 呉羽化学工業株式会社生物医学研究所で樹立及び維持しているマツタケ C M 6 2 7 - 1株を挙げることができる。

前記マツタケとして子実体又は菌糸体を用いる場合には、 抽出効率が向上する ように、 破砕物又は粉体の状態に加工することが好ましい。

熱水抽出工程に用いる熱水の温度は、 6 0〜〗 0 0 °Cであることが好ましく、 8 0〜9 8 °Cであることがより好ましい。 また、 抽出の際には、 抽出効率が向上 するように、 撹拌又は振盪しながら実施することが好ましい。 抽出時間は、 例え ば、 マツタケの状態 （すなわち、 子実体、 菌糸体、 又は培養物のいずれの状態で あるか、 あるいは、 破砕物又は粉体の状態に加工した場合にはその加工状態） 、 熱水の温度、 又は撹拌若しくは振盪の有無若しくは条件に応じて、 適宜決定する ことができるが、 通常、 1〜 6時間であり、 2〜 3時間であることが好ましい。 熱水抽出工程で得られた抽出液は、 不溶物が混在する状態で、 そのまま、 次の 陰イオン交換樹脂吸着工程に用いることもできるが、 不溶物を除去してから、 あ るいは、 不溶物を除去し、 更に、 抽出液中の低分子画分を除去してから、 次の陰 イオン交換樹脂吸着工程に用いることが好ましい。 例えば、 不溶物が混在する熱 水抽出液を遠心分離することにより不溶物を除去し、 得られる上清のみを、 次の 陰イオン交換樹脂吸着工程に用いることができる。 あるいは、 不溶物が混在する 熱水抽出液を遠心分離して得られる前記上清を透析し、 低分子画分 （好ましくは 分子量 3 5 0 0以下の画分） を除去してから、 次の陰イオン交換樹脂吸着工程に 用いることができる。

陰イオン交換樹脂吸着工程に用いることのできる陰イオン交換樹脂としては、 公知の陰イオン交換樹脂を用いることができ、 例えば、 ジェチルアミノエチル

(D E A E) セル口一ス又は 卜リエチルアンモニ才ェチル （T E A E) セル口一 スを挙げることができる。

溶出工程に用いる溶離液は、 陰イオン交換樹脂吸着工程に用いる陰イオン交換 樹脂の種類に応じて適宜決定することができ、 例えば、 塩化ナトリウム水溶液な どを挙げることができる。

溶出工程により溶出される画分は、 そのまま、 本発明の免疫増強組成物の有効 成分として用いることができるが、 通常、 溶離液に由来する塩を含有するので、 それを除去するために、 更に透析を実施することが好ましい。

本発明の免疫増強組成物における有効成分であるマツタケ熱水抽出液の陰ィ才 ン交換樹脂吸着画分は、 これに限定されるものではないが、 例えば、 以下に示す 理化学的性質を有する。 なお、 以下に示す各数値は、 マツタケ熱水抽出液の陰ィ オン交換樹脂吸着画分の一態様である、 後述の実施例 2で調製した吸着画分 D 2 の理化学的性質であり、 後述する実施例における 「吸着画分 D 2の理化学的性質 の検討」 に記載の各測定方法に基づく数値である。

( 1 ) 糖質含量： グルコース換算値として 1 3%である。

(2) タンパク質含量：アルブミン換算値として 8 6%である。

(3) 糖組成： マンノース 4 7. 7 g/mg、 ガラク卜一ス 3 2. 4 3 gZ m g、 グルコ一ス 2 5. 0 9 μ g/m g , ァラビノース 1 2, 0 9 g/m g、 リボース 8. 3 0 gノ m α、 キシロース 3. 7 5 〃 gノ m g、 及びラムノース 0. A μ g

gである。

(4) アミノ酸組成：ァスパラギン酸及びァスパラギン 1 4. 1 2 mo l %、 ト レオニン 6. 3 9 m o l %、 セリン 7. 6 4 m o I %、 グルタミン酸及びグルタ ミン 1 3Z8 3 m o l %、 グリシン 1 4. 0 3 m o l %、 ァラニン 7. 7 7 m o

1 %、 バリン 5. 3 6 m 0 \ %, 1 Z2—シスチン 0. 8 7 m o l %、 メチォ二 ン 1 . 1 1 m o l %、 イソロイシン 3. 7 0 m o l %、 ロイシン 5. 2 0 m o | %、 チロシン 1 . 5 1 m o l %、 フエ二ルァラニン 2. 2 8 m o I %、 リシン 4. 0 5 m o I %、 ヒスチジン 1 . 6 7 m o I %、 アルギニン 2. 5 2 m o I %、 及びプロリン 7. 9 3 m o 1 %である。

(5) 分子量分布：約 4. 5万〜〗 0 0万の間に幅広く分布する。 その中でピー クトップが 5つ存在し、 それぞれの推定分子量は、 約 4. 5万、 約 1 2万、 約 1 6万、 約 3 8万、 及び 1 0 0万以上である。

(6) 等電点：等電点電気泳動法により、 3本のピークが検出される。 メインバ ンドは 4. 8付近 （4. 5〜5. 2) であり、 その他のバンドは、 7. 6付近

(7. 3 5 -8. 0) 及び 9. 2付近 （8. 6 5〜9. 3) である。

(7) 紫外分光分析： 2 4 0〜2 6 0 n mにピークが見出された [測定条件は、 後述の 「吸着画分 D 2の理化学的性質の検討」 （7) を参照のこと] 。

(8) ¹ H—次元 N MR分析：図 1 に示すスペク トル [測定条件は、 後述の 「吸 着画分 D 2の理化学的性質の検討」 （8) ( i ) を参照のこと] を示す。

(9) ^{1 3}C—次元 NMR分析：図 2に示すスペク トル [測定条件は、 後述の 「吸 着画分 D 2の理化学的性質の検討」 （8 ) (i i) を参照のこと] を示す。

( 1 0) 円偏光二色性分析：図 3に示すスぺク トル [測定条件は、 後述の 「吸着 画分 D 2の理化学的性質の検討」 （9) を参照のこと] を示す。 C h e nらの方 法 [B i o c h e m i s t r y, 1 1， 4 1 2 0 - 4 1 3 1 ( 1 9 7 2) ] に従 つて 2次構造を解析したところ、 へリックス 1 ，％、 ^シート 1 8%、 及び不 規則構造 6 5%である。

本発明の免疫増強組成物における有効成分である、 マツタケのアルカリ溶液抽 出液の陰イオン交換樹脂吸着画分は、 これに限定されるものではないが、 先に説 明した、 マッタケ熱水抽出液の陰ィォン交換樹脂吸着画分の製造方法に準じた方 法により得ることができる。 すなわち、 熱水の代わりにアルカリ溶液を用いるこ と以外は、 マッタケ熱水抽出液の陰ィ才ン交換樹脂吸着画分の前記製造方法と同 様の方法により、 調製することができる。 例えば、 マツタケをアルカリ溶液で抽 出し （以下、 アルカリ溶液抽出工程と称する） 、 得られた抽出液を陰イオン交換 樹脂に吸着させた後 （すなわち、 陰イオン交換樹脂吸着工程） 、 適当な溶離液に より吸着画分を溶出する （すなわち、 溶出工程） ことにより、 得ることができる アル力リ溶液抽出工程に用いるアル力リ溶液としては、 これに限定されるもの ではないが、 例えば、 アルカリ金属 （例えば、 ナトリウム又はカリウム） の水酸 化物、 特には水酸化ナトリウムの水溶液を用いることができる。 前記アルカリ溶 液の p Hは、 8〜 1 3であることが好ましく、 9〜 1 2であることがより好まし し、。 アルカリ溶液抽出工程は、 0〜2 0 °Cで実施することが好ましく、 0〜 1 5 °Cで実施することがより好ましい。 アルカリ抽出工程で得られた抽出液は、 中 和処理を実施してから次の陰ィ才ン交換樹脂吸着工程に用し、ることができる。 本発明の免疫増強組成物は、 有効成分としてのマツタケ熱水抽出液又はマッタ ケアルカリ溶液抽出液、 あるいは、 マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶 液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分を、 薬剤学的又は獣医学的に許容すること のできる通常の担体と共に、 動物、 好ましくは哺乳動物 （特にはヒ ト） に投与す ることができる。

本発明の有効成分である、 マツタケ熱水抽出液又はマッタケアルカリ溶液抽出 液、 あるいは、 マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン 交換樹脂吸着画分は、 免疫増強活性、 例えば、 キラー活性 （好ましくは腸管リン パ球のキラー活性） の誘導活性、 腫瘍増殖抑制活性、 サイ トカイン （特にはイン ターロイキン 1 2 ) 誘導活性、 T G F— ;？活性抑制活性、 又は活性酸素捕捉活性 を有する。

従って、 本発明の有効成分である、 マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ 溶液抽出液、 あるいは、 マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の 陰イオン交換樹脂吸着画分は、 それ単独で、 あるいは、 好ましくは薬剤学的又は 獣医学的に許容することのできる通常の担体と共に、 免疫増強が必要な対象、 例 えば、 キラ一活性 （好ましくは腸管リンパ球のキラー活性） の誘導が必要な対象、 腫瘍増殖抑制が必要な対象、 サイ 卜力イン （特にはインタ一ロイキン 1 2 ) 誘導 が必要な対象、 T G F— ?活性抑制が必要な対象、 又は活性酸素捕捉が必要な対 象に、 有効量で投与することができる。

また、 本発明の有効成分である、 マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶 液抽出液、 あるいは、 マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰 イオン交換樹脂吸着画分は、 免疫増強組成物又は免疫増強機能性食品、 例えば、 キラー活性誘導 （好ましくは腸管リンパ球のキラー活性誘導） 組成物若しくはキ ラー活性誘導 （好ましくは腸管リンパ球のキラー活性誘導） 機能性食品、 腫瘍増 殖抑制組成物若しくは腫瘍増殖抑制機能性食品、 インターロイキン 1 2誘導組成 物若しくはインターロイキン 1 2誘導機能性食品、 T G F—/?活性抑制組成物若 しくは T G F— /?活性抑制機能性食品、 又は活性酸素捕捉組成物若しくは活性酸 素捕捉機能性食品を製造するために使用することができる。

本発明による免疫増強組成物の投与剤型としては、 特に限定がなく、 例えば、 散剤、 細粒剤、 顆粒剤、 錠剤、 カプセル剤、 懸濁液、 ェマルジヨン剤、 シロップ 剤、 エキス剤、 若しくは丸剤等の経口剤、 又は注射剤、 外用液剤、 軟膏剤、 坐剤、 局所投与のクリーム、 若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げることができる。 これらの経口剤は、 例えば、 ゼラチン、 アルギン酸ナトリウム、 澱粉、 コ一ン スターチ、 白糖、 乳糖、 ぶどう糖、 マンニッ 卜、 カルボキシメチルセルロース、 デキス卜リン、 ポリビニルピロリ ドン、 結晶セルロース、 大豆レシチン、 ショ糖、 脂肪酸エステル、 タルク、 ステアリン酸マグネシウム、 ポリエチレングリコ一ル、 ケィ酸マグネシウム、 無水ケィ酸、 又は合成ケィ酸アルミニウムなどの賦形剤、 結合剤、 崩壊剤、 界面活性剤、 滑沢剤、 流動性促進剤、 希釈剤、 保存剤、 着色剤、 香料、 矯味剤、 安定化剤、 保湿剤、 防腐剤、 又は酸化防止剤等を用いて、 常法に 従って製造することができる。

非経口投与方法としては、 注射 （皮下、 静脈内等） 、 又は直腸投与等が例示さ れる。 これらのなかで、 注射剤が最も好適に用いられる。

例えば、 注射剤の調製においては、 有効成分としての前記画分の他に、 例えば、 生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、 植物油若しくは脂肪酸エステル 等の非水溶性溶剤、 ブドウ糖若しくは塩化ナ卜リゥム等の等張化剤、 溶解補助剤、 安定化剤、 防腐剤、 懸濁化剤、 又は乳化剤などを任意に用いることができる。 また、 本発明による免疫増強組成物は、 徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製 剤の手法を用いて投与してもよい。 例えば、 本発明による免疫増強組成物をェチ レンビニル酢酸ポリマーのペレツ 卜に取り込ませて、 このペレツ トを治療又は予 防すべき組織中に外科的に移植することができる。

本発明による免疫増強組成物は、 これに限定されるものではないが、 マツタケ 熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 あるいは、 マツタケ熱水抽出液又 はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分を、 0 . 0 1 〜9 9 重量％、 好ましくは 0 . 1 〜8◦重量％の量で含有することができる。

本発明による免疫増強組成物を用いる場合の投与量は、 病気の種類、 患者の年 齢、 性別、 体重、 症状の程度、 又は投与方法などに応じて適宜決定することがで き、 経口的に又は非経口的に投与することが可能である。

また、 形態も医薬品に限定されるものではなく、 種々の形態、 例えば、 機能性 食品や健康食品 （飲料を含む） 、 又は飼料として飲食物の形で与えることも可能 である。 更には、 口中に一時的に含むものの、 そのほとんどを口中より吐き出す 形態、 例えば、 歯磨剤、 洗口剤、 チューインガム、 又はうがい剤の形で与えるこ とも、 あるいは、 鼻から吸引させる吸入剤の形で与えることも可能である。 例え ば、 マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 あるいは、 マツタケ 熱水抽出液又はマッタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分を、 添 加剤 （例えば、 食品添加剤） として、 所望の食品 （飲料を含む） 、 飼料、 歯磨剤、 洗口剤、 チューインガム、 又はうがい剤等に添加することができる。 実施例

以下、 実施例によって本発明を具体的に説明するが、 これらは本発明の範囲を 限定するものではない。

実施例 1 ：キノコ熱水抽出液の生物活性試験

( 1 ) キノコ熱水抽出液の調製

市販の岩手県産マツタケ子実体 2 5 0 gを凍結乾燥して水分を除去した後、 粉 砕して粉末 3 5 gを得た。 1 リッ トル容量のビーカーに、 前記粉末の一部 （2 0 g) と純水 8 0 0 m Lと を加え、 スターラー撹拌下、 9 3〜9 8°Cのウォーターバス中で 3時間抽出した c 抽出終了後、 室温まで)令却し、 遠心分離 （ 1 2 0 0 0 r p m， 2 0分間） により、 上清を得た。

上清を得た後の沈殿部には、 純水 5 0 O m Lを加え、 前記と同様の処理を行な つた。 この操作を計 3回行ない、 各操作で得られた上清と、 先に得られた上清と を一緒にした後、 分子量 3 5 0 0分画の透析膜 （S p e c t r a ZP o r 3 M e m b r a n e ,- S p e c t r u m, 米国） に入れ、 水道水の流水中で 2日間透 析した。 透析膜内液を口一タリーエバポレーターを用いて濃縮した後、 凍結乾燥 を行ない、 粉末 1 . 1 2 gを得た。

更に、 市販食用キノコ 1 3種類につき、 前記と同様の処理を行ない、 それぞれ、 粉末を得た。 キノコの種類と収率 （対乾燥菌体質量％) を表 1 に示す。

±

N 0. キノコの種類 収率

1 まつたけ 5. 6

2 しいたけ 6. 0

3 えのきたけ 5. 5

4 ひらたけ 5. 3

5 まいたけ 4. 9

6 なめこ 7. 0

7 エリンギ 5. 8

8 いわたけ 4. 6

9 きくらげ 4. 8

1 0 ァガリクス 7. 3

1 1 ぶなしめじ 6. 9

1 2 しろまいたけ 5. 1

1 3 マッシュル一厶 6. 3

1 ポルチーニ 5. 5 (2) キノコ熱水抽出液の生物活性検定

前項 ) で粉体として得られた食用キノコ抽出液を、 マウスに経口投与し、 腸管リンパ球のキラー活性誘導に及ぼす影響を検討した。 すなわち、 腫瘍細胞を 盲腸壁に移植したマウスから、 腸間膜リンパ節細胞を取り出し、 試験管内で前記 腫瘍細胞で再刺激した時のキラー活性を測定することにより、 生物活性を検定し た。 用いた腫瘍細胞は、 マウス白血病細胞 P 8 1 5及び B 7/P 8 1 5細胞であ り、 これらは九州大学生体防御医学研究所原田守博士から供与された細胞株を、 1 0%牛胎児血清 （5 6°Cで 3 0分間の熱処理済み） 添加 R PM I 1 6 4 0培地 中で、 呉羽化学工業株式会社生物医学研究所で継代維持している。 動物は日本 S L Cから購入した雌性 D BAZ2マウスであり、 予備飼育した後、 8週齢で実験 に用いた。

予め、 ペン卜バルビタール （大日本製薬） 5 0 m gZk gを腹腔内投与して麻 酔状態にしたマウスを固定し、 その腹部をはさみとピンセッ 卜とで開き、 盲腸部 を取り出し、 1 8 Gの歯科用注射針 （旗印本木注射針） を装着した 1 m L容注 射筒を用いて、 B 7ZP 8 1 5細胞 （1 X 1 0⁶個 5 0 μ L) を盲腸壁下に移 植し、 解剖用ホッチキスを用いて腹部を閉じた。 麻酔からさめたマウスを飼育ケ —ジに入れ、 通常の飼育環境下で飼育した。 そして、 腫瘍細胞移植翌日から、 経 口投与用ゾンデを用いて、 各サンプル 5 0 0 m gZk gZ日を連日 1 0日間経口 投与した （ 1群当たり 5〜 1 0匹） 。

最終投与の翌日にマウスを屠殺し、 腸間膜リンパ節を無菌的に取り出し、 ハン クス平衡塩類溶液 （H a n k s B a l a n c e d S a l t S o l u t i o n) を入れた無菌シャ一レに移した。 はさみとピンセッ トとでリンパ節をほぐし た後、 メッシュを通してリンパ球の単細胞液を調製した。 1 0%牛胎児血清 （5 6 °Cで 3 0分間の熱処理済み） 添加 R P M I 1 6 4 0培地で細胞を 3回洗浄した 後、 1 0%牛胎児血清 （5 6°Cで 3 0分間の熱処理済み） 、 5 X 1 0— ⁵m o I / Lの 2—メルカプトエタノール、 2 0 mm o I ZLの 4一 （2—ヒ ドロキシェチ ル） 一 1—ピペラジンエタンスルホン酸、 及び 3 0 ； gZm Lゲンタマイシンを それぞれ添加した R P M I 1 6 4 0培地で、 細胞濃度を 5 X 1 0⁶個 Zm Lに調 整し、 エフェクター細胞として用いた。 一方、 刺激細胞は、 以下の手順で調製した。 すなわち、 P 8 1 5細胞又は B 7 /? 8 1 5細胞を 1 0%牛胎児血清 （56°Cで 3 0分間の熱処理済み） 添加 R P M I 1 64 0培地中に 5X 1 0⁶個/ m Lになるように懸濁し、 マイ 卜マイシン C (シグマ） を 5 0 >u gZmLになるように加え、 5 %炭酸ガス培養器中で 3 0 分間反応させた後、 1 0%牛胎児血清 （5 6°Cで 3 0分間の熱処理済み） 添加 R PM I 1 6 4 0培地で細胞を 3回洗浄し、 細胞濃度を 1 X 1 0⁵個 Lに調整 した。

混合リンパ球 ·腫瘍細胞反応 （M i x e d L y m p h o c y t e T u mo r c e l l R e a c t i o n) は、 以下の条件で検討した。

すなわち、 9 6ゥエルの細胞培養用平底マイクロプレート （F a I c o n 3 072 ; B e c t o n D i c k i n s o n L a b w a r e , 米国) に、 suae! エフ 1クタ一細胞及び Z又は刺激細胞を 0. I m Lずつ加え、 5%炭酸ガス培養 器中で 3日間培養し、 細胞をフィルタ一上に回収した。 なお、 エフェクター細胞 及び刺激細胞の両方を加える場合には、 両者の細胞数比を 1 2. 5 (ェフエクタ 一細胞数 刺激細胞数） とした。 本測定系においては、 前記エフェクター細胞が、 混合リンパ球 ·腫瘍細胞反応における 「リンパ球」 として機能し、 前記刺激細胞 が 「腫瘍細胞」 として機能する。 培養終了の 2 4時間前に、 プレー卜の各ゥエル に³ H—チミジン （アマ一シャムジャパン） 3 7 k B qを加えた。 回収した細胞 を 5%卜リクロロ酢酸で充分に洗浄した後、 乾燥し、 液体用バイアルに入れ、 液 体シンチレ一ターを加え、 液体シンチレーシヨンカウンターで、 放射能活性を測 定した。

スティ ミュレ一シヨン · 1 ンテックス (S t i m u I a t i o n I n d e x ； S. I . ) は、 式：

[S. I . ] = (Bm i x— B s) / (B e— B s)

[式中、 Bm i xは、 エフェクター細胞及び刺激細胞混合培養群の放射能活性 (単位 =B q) であり、 B sは、 刺激細胞単独培養群の放射能活性 （単位 =B q) であり、 B eは、 エフ Iクタ一細胞単独培養群の放射能活性 （単位 =B q) である]

により算出した。 一方、 リンパ球 ·腫瘍細 ½の混合培養による細胞傷害活性誘導反応 （L y mp h o c y t e T umo r c e l l M i x e d c u l t u r e— i n d u c e d C y t o t o x i c i t y) は、 以下の条件で検討した。

すなわち、 24ゥエルの細胞培養用マイクロプレー卜 （C u I t u r e C I a s t a r ) (C o s t a r 3 524 ； C o r n i n g I n c. , 米国) に. 前記エフェクター細胞及び刺激細胞 （エフェクター細胞数 Z刺激細胞数 = 1 2. 5) を 1. O m Lずつ加え、 3 7°Cの 5%炭酸ガス培養器中で 3日間培養した。 培養終了後、 細胞を回収し、 1 0%牛胎児血清 （5 6°Cで 3 0分間の熱処理済 み） 添加 R PM I 1 64 0培地で 3回洗浄した。 顕微鏡を用いて、 細胞懸濁液中 のエフ Iクタ一細胞数のみを計数し、 エフヱクタ一細胞数を 2. 5X 1 0⁶個 Z m Lに調整した。

—方、 別に用意した P 8 1 5細胞をクロム酸ナトリウム （アマ一シャムジャパ ン） と 3 7°Cで 20分間反応させた。 未結合の放射性物質を 1 0%牛胎児血清 ( 5 6 °Cで 3 0分間の熱処理済み） 添加 R P M I 1 64 0培地で 3回洗浄するこ とにより除去し、 放射性クロム標識腫瘍細胞を 5X 1 0⁴ZmLに調整した。

前記エフ Iクタ一細胞又はその 2倍希釈系列と放射性ク口厶標識腫瘍細胞とを 試験管に 0. 1 m Lずつ加え、 3 7 °Cの 5%炭酸ガス培養器中で 4時間反応させ た。 反応終了後、 1 0%牛胎児血清 （5 6°Cで 3 0分間の熱処理済み） 添加 R P M l 1 64 0培地をそれぞれの試験管に 1. 5 m Lずつ加え、 ミキサーでよく混 合した後、 遠心分離 （1 2 00 r pm， 5分間， 4°C) して上清を分離し、 放射 能活性をガンマカウンタ一を用いて測定した。

特異的傷害率 [S p e c i f i c L y s i s ； S. L. (単位 =%) ] は 式：

[S. L. {%) ] = ( (B-B f ) / (Bm a X -B f ) ！ X 1 00

[式中、 Bは実験群上清の放射能活性 （単位 =B q) であり、 B f は自然遊離群 上清の放射能活性 （単位 = B q ) であり、 B m a Xは最大遊離群の放射能活性

(単位 =B q) である]

により算出した。 なお、 自然遊離群とは、 放射性クロム標識腫瘍細胞単独培養群 を意味し、 最大遊離群とは、 卜リ 卜ン （T r i t o n) 処置放射性クロム標識腫 瘍細胞群を意味する。

前項 （ 1 ) で調製したサンプルの混合リンパ球 ·腫瘍細胞反応、 あるいは、 リ ンパ球 ·腫瘍細胞の混合培養による細胞傷害活性誘導反応に及ぼす影響を測定し た結果 （エフ Iクタ一細胞数ノ腫瘍細胞数が 1 2. 5の時の値） を表 2に示す。 マツタケ子実体由来のサンプルで有意の増強がみられた。 なお、 コントロール群 には純水 0. 2 m Lを経口投与した。 表 2において、 *はコントロール群に対し て p < 0. 0 5で有意差のあることを示す。

i.

リンパ球 ·腫瘍細胞混合 混合リンパ球 ·腫瘍細胞 培養による細胞傷害活性 反応に及ぼす影響 誘導反応

N o. サンプル由来 (コントロ-ル群に する％) (コント口-ル群に対する％)

1 まつたけ 1 3 2 * 1 7 5 *

2 しいたけ 1 1 8 9 2

3 えのきたけ 1 1 2 1 0 3

4 ひらたけ 1 1 1 1 0 3

5 まいたけ 1 0 8 1 1 8

6 なめこ 1 0 7 1 0 3

7 ェリンギ 1 2 0 1 1 2

8 いわたけ 1 0 1 1 2 0

9 きくらげ 1 0 9 1 0 3

1 0 ァガリクス 1 0 6 1 1 3

1 1 ぶなしめじ 1 0 8 1 0 6

1 2 しろまいたけ 1 1 0 1 1

1 3 マッシユリレ一厶 1 0 2 9 7

1 4 ポルチ一二 1 1 6 1 0 3 実施例 2 ：マツタケ熱水抽出液及びその陰イオン交換樹脂吸着画分の調製

呉羽化学工業株式会社生物医学研究所で樹立及び維持しているマツタケ CM 6 27— 1株菌糸体を滅菌済み培地 （3%グルコース， 0. 3%酵母エキス， p H 6. 0) 1 00 m Lの入った 5 0 0 m L容三角フラスコ 1 0本に接種し、 2 2°C で 2 5 0 r p mの振燙培養機で 4週間培養を行なった。 得られた培養物をホモゲ ナイザーにかけた後、 スタ一ラ一撹拌下、 9 3〜98°Cのゥ才一タ一バス中で 3 時間抽出した。 抽出終了後、 室温まで冷却し、 遠心分離 （ 1 2 000 r pm， 2 0分間， 4°C) により、 上清を得た。

沈殿部には純水 5 0 O mLを加え、 前記と同様の処理を行なった。 この操作を 計 3回行ない、 全ての上清を合わせて、 透析膜 （S p e c t r aZP o r 3 em b r a n e， 分子量 35 0 0分画） に入れ、 水道水の流水中で 3日間透析し た。 透析膜内液を口一タリ一エバポレーターで濃縮した後、 凍結乾燥を行ない、 粉末 （画分 D) 3. 9 gを得た。

次に、 前記粉末 （画分 D) を 5 0mmo l ZL トリス塩酸緩衝液 （ p H 7. 0) に溶解し、 予め前記緩衝液で平衡化させておいたジェチルアミノエチル （D E A E) セルロースカラム （口径 =2 cm, 高さ =20 c m) にアプライし、 次 いで、 前記緩衝液 1 0 Om Lを流し、 非吸着画分 D 1 (以下、 単に 「D 1画分」 と称することがある） を得た。 次いで、 前記緩衝液に 1 mo I ZL塩化ナ卜リウ 厶を加えた溶液 2 0 Om Lを調製し、 前記カラムにかけ、 吸着物を溶出し、 吸着 画分 D 2 (以下、 単に 「D 2画分」 と称することがある） を得た。 得られた非吸 着画分及び吸着画分溶液をそれぞれ、 透析膜 （S p e c t r a/P o r 3 Me m b r a n e, 分子量 3 5 00分画） に入れ、 純水中で 3日間透析した。 透析膜 内液を口一タリ一エバポレーターで濃縮した後、 凍結乾燥を行ない、 非吸着画分 D 1粉末 1. 9 g及び吸着画分 D 2粉末 1. 5 gを得た。

前記 「キノコ熱水抽出液の生物活性試験」 （2) と同様の方法によりそれぞれ の画分の免疫活性を調べたところ、 表 3に示すように、 吸着画分 D 2に活性が確 認された。 なお、 表 3において、 *はコントロール群に対して p< 0. 0 1 で有 意差のあることを示し、 * *はコントロール群に対して p< 0. 0 5で有意差の あることを示す。 また、 画分 Dは、 D E A Eセルロースカラムにかける前の画分 を意味する。 表 3

リンパ球♦腫瘍細胞の 混合リンパ球 ·腫瘍 混合培養による細胞傷害 細胞反応 活性誘導反応

荬験 No. サンプル/投与量 (コント口-ル群に対する％) (コント口-ル群に対する％)

D / 2 Q XW Q/ i Q 1 5 8 * 1 5 3 * D l Z25 0mgZk g 1 0 3 1 09

D 2/^/2 5 0mg 'k g 1 6 2 * 1 7 1 * D 2/2. 5 m g/ k g 1 06 1 1 0

Ό 2/ 2 m q/ Q 1 34 * * 1 3 *

D 2Z2 5 0m aZk a 1 5 1 * 1 6 7 * 吸着画分 D 2の理化学的性質の検討

D 2画分の理化学的性質を検討した。 測定方法及びその結果を以下に示す。

( 1 ) 糖質の定量

フエノール硫酸法を用いる比色により定量した。 D 2画分の糖質含量は、 グル コース換算値として 1 3%であった。

(2) タンパク質の定量

銅フォリン法を用いる比色により定量した。 D 2画分のタンパク質含量は、 ァ ルブミン換算値として 8 6%であった。

(3) 糖質の組成分析

封入管に D 2画分 1. 0 m gと 2 mo I ZL トリフル才ロ酢酸 0. 2m Lとを 入れ、 1 00°Cで 6時間加水分解した後、 エバポレーターで減圧乾固し、 残渣を 得た。 残渣を純水 5 0 0 Lに溶解し、 純水で 2倍又は 1 0倍希釈した。 この溶 液 5 0 しに内部標準物質ヘプ卜一ス 500 n gを添力 Gし、 カラム T S K-g e

I S u g a r AXG L C— 9 A 1 5 c mX 4. 6 mm I D (東ソ一） と検 出器分光光度計 R F- 5 3 5 (島津製作所） とを装着した高速液体クロマ卜装置

L C-9 A (島津製作所） にアプライした。 カラム温度は 7 0°Cであり、 移動相 及びその流速は 0. 5Mホウ酸カリウム緩衝液 （p H 8. 7) 及び 0. 4 mLZ 分であった。 ポス卜カラム標 i哉の条件は、 反応試薬として 1 %アルギニン Z3% ホウ酸を用い、 流速は 0. 5 m LZ分であり、 反応温度は 1 5 (TCであり、 検出 波長は E X 3 20 nm及びEM 4 3 0 n mである。

糖組成は、 多い方から順に、 マンノース 4 7. 7 yu gZmg、 ガラク卜ース 3 2. 4 3 gノ m g、 グルコース 2 5. 09 gZm g、 ァラビノース 1 2. 0 9 gZmg、 リボース 8. 3 0 g/mg、 キシロース 3. 7 5〃 g/mg、 及びラムノース 0. 4 4 9 9でぁった。

(4) アミノ酸組成分析

封入管に D 2画分 1. 0 m gと 6 m 0 I し塩酸 0. 1 m Lとを入れ、 1 1 0°Cで 2 2時間加水分解した後、 エバポレーターで減圧乾固し、 残渣を得た。 残 渣を純水 1. O m Lに溶解し、 その 5 0 Lをアミノ酸分析に用いた。 装置は日 立 L— 8 5 0 0型アミノ酸分析計 （日立製作所） であり、 ニンヒドリン発色によ り定量した。

アミノ酸組成は、 ァスパラギン酸及びァスパラギン 1 4. 1 2 mo 1 %、 トレ 才ニン 6. 3 9 mo l %、 セリン 7. 64 m o I %、 グルタミン酸及びグルタミ ン 1 3Z8 3 mo l %、 グリシン 1 4. 0 3 mo l %、 ァラニン 7. 7 7 m o

1 %、 バリン 5. 3 6 m 0 \ %. 1 /2—シスチン 0. 8 7 mo l %、 メチォ二 ン 1. 1 1 mo l %、 イソロイシン 3. 7 0 mo l %、 ロイシン 5. 20 m o

| %、 チロシン 1. 5 1 mo l %、 フエ二ルァラニン 2. 2 8 m o I %、 リシン 4. 05 mo l %、 ヒスチジン 1. 6 7 mo l %、 アルギニン 2. 5 2 mo I %、 及びプロリン 7. 9 3 mo 1 %であった。

(5) 分子量分布の測定

02画分1. Omgを純水 1. O m Lに溶解した後、 0. 22 のフィルタ —で濾過し、 濾液を得た。 この濾液を、 カラム A s a h i p a k G S— 6 20

5 0 c mX7. 6 mm I D (旭化成） 、 示差屈折計検出器 R I D— 6 A (島津 製作所） 、 及び紫外部検出器 S P D— 6 A (島津製作所） を装着した高速液体ク ロマ卜装置 L C— 9 A (島津製作所） にアプライした。 カラム温度は室温であり、 移動相及びその流速は純水及び 0. 5 m LZ分であった。

分子量分布は、 約 4. 5万〜 1 0 0万の間に幅広く分布した。 その中でピーク トップが 5つ見いだされ、 それぞれの推定分子量は、 約 4. 5万、 約 1 2万、 約 1 6万、 約 3 8万、 及び 1 00万以上であった。

(6) 等電点分析

D 2画分 1 90 gを純水 2 0〃 Lに溶解した後、 その半量に 4 0 % (体積 体積） 程度のサッカロースを加え、 電気泳動を実施した。 電気泳動の条件は以下 のとおりである。

ゲル： I E F— PAG Em i n i (4%， p H 3〜 1 0 ;テフコ社）

泳動用緩衝液： （陰極） 0. 04 mo I ZL水酸化ナトリウム溶液、 （陽極） 0.

0 1 m o I Z Lリン酸溶液

泳動条件： 1 0 0 Vで 3 0分間泳動を行ない、 続いて、 3 0 0 Vで 2 0分間泳動 を行ない、 更に、 5 00 Vで 4 0分間泳動を行なった。

P Iマ一カー：各バンドが 1. 3 5 g (フアルマシア）

3本のブロードなピークが検出された。 メインバンドは 4. 8付近 （4. 5〜 5. 2) で、 その他に 7. 6付近 （7. 3 5〜 8. 0) と 9. 2付近 （ 8. 6 5 〜9. 3) にバンドがあった。

(7) 紫外分光分析 （UV)

純水に溶解し、 0. 5 m 1 0 m L濃度で測定した。 装置として、 2500 P C (島津製作所） を使用した。 24 0〜2 6 0 n mにピークが見出された。

(8) 核磁気共鳴分析 （NMR)

測定条件は以下のとおりである。

( i ) ¹ H—次元 NM R測定

測定装置としては、 U N I TY I NOVA— 5 00型 （V a r i a n社） を 使用した。 溶媒として D化塩酸グァニジゥム D₂0溶液を使用した。 濃度は 4 m 0 I ZLであり、 内部標準として D S Sを用い、 温度は 2 3°Cで測定を実施した。 得られたスぺクトルを図 1 に示す。 糖の 1位のプロ トンに特徴的な 4. 5 p p m〜5. O p pm付近に、 ガラクトース又はグルコ一スの o 1位と考えられるピ —クが観測された。 また、 5. 0〜5. 2 p p m付近に、 ガラク卜ース又はグル コースの^ 1位と考えられるピ一クが観測された。

(ii) ¹³ C—次元 NMR測定 観測周波数は 1 5 0. 8MH zで測定した。 濃度は 2 0. 3 m g / 0. 7 5 m Lであり、 内部標準は重メタノール （3%重水溶液， S = 4 9 p p m) であり、 温度は 4 5 °Cであり、 デカップリングは¹ H完全デカップリングである条件で測 定を実施した。

結果を図 2に示す。 1 0 3〜1 0 4 p p m付近のブロードなピークは、 ガラク ト一ス又はグルコースの 1位の炭素で、 型でグルコシド結合したものと考えら れる。 1 0 2. 9 6 p p m及び 1 0 2. 5 1 p p mの各ピークは、 それぞれマン ノースの 1位と/? 1位でクルコシド結合したものと考えられる。 9 9. 1 7 p p mのピークは、 ガラクト一ス又はグルコースのな 1位で、 やはりグルコシド結 合したものと考えられる。

1位以外については、 6 0〜8 0 p p mのピークの化学シフ卜を解析した。 各 単糖の化学シフ トを比較すると、 ガラクト一ス又はグルコースの^ 2位の炭素、 あるいは、 マンノースの 2位 （な， ) の炭素が変化していると考えられた。 ま た、 ガラクト一ス又はグルコースの 型の炭素については、 化学シフトが単糖と 比較して変化しているものが見当たらないので、 6位が変化し、 マンノースの 4 位のシグナル （6 7. 8 p p m) と重なっていると推定した （このピークの強度 が大きいことから推測した） 。 以上のことから、 1位以外で結合に関与している と推定される糖の位置は、 ガラクト一ス又はグルコースの 2位 （ ?型） と 6位

( 型） 、 あるいは、 マンノースの 2位 （ひ 、 型） である。 但し、 ピークが全 般的にブロードで、 SZNも悪いため、 解析の精度は高くない。

( 1 0) 円偏光二色性分析 （C D)

測定条件は以下のとおりである。

測定装置として J A S C O J— 5 0 O Aを使用し、 溶媒として水を使用した。 タンパク質濃度は 0. 1 2 5 m gZm Lであり、 波長範囲は 2 0 0〜2 5 0 n m であり、 セル長は 1 mmであり、 温度は室温 （2 4で） であり、 積算回数は 8回 である条件で測定を実施した。

得られた C Dスペク トルを図 3に示す。 C D値 （縦軸） は、 平均残基楕円率 [ ] で示した。 [ ] の単位は d e g · c m² · d e c i m o I— ¹となる。

[ Θ に換算する際の平均残基分子量は 1 0 3. 4 5を用いた （アミノ酸分析か ら求めた） 。 2次構造の解析は、 C h e nらの方法に従って算出したところ、 a ヘリックス 1 7%、 ?シ一卜 1 8%、 及び不規則構造 6 5%であった。

吸着画分 D 2の生物活性評価例

(1 ) 吸着画分 D 2のサルコ一マ 1 8 0腫瘍増殖抑制活性

動物としては、 日本クレア （株） から購入した雌性 I C Rマウスを用い、 腫瘍 としては、 呉羽化学工業株式会社生物医学研究所で雌性 I C Rマウスの腹腔内で 継代維持しているサルコ一マ 1 80細胞を用いた。 すなわち、 5週齢の雌性 I C Rマウスの腋窩部皮下に、 サルコ一マ 1 80細胞を 1 0⁶個移植した （1群= 1 0匹） 。 移植後翌日から、 前記実施例 2で得られた吸着画分 D 2の所定量 （1. 0 m g/k g, l OmgZk g， 又は 5 0m gZk g) を隔日に 1 0回、 腹腔内 投与し、 移植後 25日目にマウスを屠殺して腫瘍結節を摘出し、 重量を測定した c 対照としては生理食塩水投与群を設けた。

増殖抑制率 （単位 =%) は、 式：

[増殖抑制率 （％) ] = { (Wc-W) /Wcl X I 0 0

[式中、 Wはサンプル処置群の平均結節重量 （単位 =g) であり、 Wcは生理食 塩水処置群の平均結節重量 （単位 =g) である]

により算出した。

結果を表 4に示す。 なお、 *はコン トロール群に対して p < 0. 05で有意差 のあることを示す。 表 4から明らかなように、 D 2画分投与により有意の増殖抑 制がみられた。

N 0. '又 増殖抑制率％

1 D 2画分 Z 1. 0 m g/k g 6 5%*

2 02画分 1 0 |19/1< 9 7 6%*

3 D 2画分ノ 5 0 m αノ k α 4 6%

( 2 ) 吸着画分 D 2のサイ トカイン誘導活性

8週齢の雌性 DBAZ2マウスを屠殺後脱血し、 腸間膜リンパ節を無菌的に取 り出し、 ハンクス平衡塩類溶液を入れた無菌シャーレに移した。 はさみとピンセ ッ 卜とでリンパ節をほぐした 、 メッシュを通してリンパ球の単細胞液を調製し た。 1 0%牛胎児血清 （5 6 Cで 3 0分間の熱処理済み） 添加 R PM I 1 6 4 0 培地で細胞を 3回洗浄した後、 細胞数を 2 X 1 0⁶個 m Lに調整した。 前記実 施例 2で得られた吸着画分 D 2を培地に溶解し、 フィルターで除菌し、 サンプル 溶液 2 5 0 gノ m Lを調製した。 9 6ゥエルの細胞培養用平底マイクロプレー 卜 (F a l c o n 3 0 7 2 ; B e c t o n D i c k i n s o n L a bwa r e， 米国） に、 前記細胞及びサンプルを 0. I m Lずつ加え、 3 7°Cの 5 %炭 酸ガス培養器中で 1 8時間培養した後、 遠心分離により、 上清を分離した。 そし て、 培養上清中の総 （ t o t a l ) インターロイキン 1 2含量を、 市販測定キッ 卜 （ I n t e r t e s t 1 2 X ; G e n z y m e社， 米国） を用いて測定した _c 結果を表 5に示す。 表 5から明らかなように、 D 2画分には、 インタ一ロイキン

1 2誘導活性が認められた。 総インタ一ロイキン 1 2含量

N Q . サンプル ( p aZm L)

1 培地コン トロール 0 (検出限界以下）

2 D 2画分 （1 25 " aZm L)

( 3 ) 吸着画分 D 2の免疫抑制物質 T G F— ?結合活性

タンパク質吸着の少ないポリプロピレンチューブ （マルチシリコナイズチュー ブ， S a f e S e a l M i c r o c e n t r i f u g e T u b e ; フナコ シ） 中で、 ヒ卜遺伝子組み替え卜ランスフ才一ミング増殖因子 ， [T r a n s f o r m i n g G r ow t h F a c t o r— β (以下、 Τ G F—/^) ； フ ナコシ] 標品を 2%アルブミン含有リン酸緩衝液 （p H 7. 2) に溶解し、 1 0 0 n gZm L溶液に調整した。 一方、 前記実施例 2で得られた吸着画分 D 2を 2%アルブミン含有リン酸緩衝液に溶解させ、 2 m gZm L濃度に調整した。 前 記 TG F— ?，溶液と D 2画分溶液とを 0. 5 m Lずつ、 タンパク質吸着の少な いチューブに入れ、 2 2°Cで 3時間反応させた。 反応終了後、 反応液中の T G F - β ,含量を、 市販の測定キッ ト （Q u a n t i k i n e H u m a n T G F β、 E L I S A K i t ; フナコシ） を用いて測定した。

結合率 （単位 =%) は、 式：

[結合率 （％) ] = { (T c-T) XT c! X 1 0 0

[式中、 Tは D 2画分添加群の T G F— / ^実測値 （単位 =n gZm L) であり、 T cは 2 %アルブミン含有リン酸緩衝液添加群の T G F _ ^，実測値 （単位 = n g/m L) である]

により算出した。

結果を表 6に示す。 D 2画分添加群では、 D 2画分と T G F ?，との結合が認 められた。

表 6

N o. サンプル 結合率％

1 2%アルブミン含有リン酸緩衝液添加 （対照） 0

2 D 2画分 （ 1 m aZm L) _2 1 _

( 4 ) 吸着画分 D 2の活性酸素捕捉活性

3. 0 m o I /Lヒポキサンチン溶液 1 0 0 0 ; ^し、 2 UZm Lキサンチンォ キシダ一ゼ （ベ一リンガーマンハイム） 溶液 5 し 8 m g/m L— D 2画分 5 0 0 / し、 及び R PM I 1 6 4 0培地 4 9 5 Lを試験管に入れた後、 2 7 0〃 m o I ZLの 2—メチルー 6—フエ二ルー 3， 7—ジヒ ドロイミダゾ一 [ 1， 2 -a] ピラジン一 3—オン （C L A— p h e n y I ；東京化成） 溶液 1 2 0〃 L を添加した。 続いて、 反応槽を 3 7 °Cに保ったケミルミネッセンスメータ一 （ァ ロカ） に入れ、 3 0分間反応させ、 発生するケミルミネッセンス量を経時的に測 定した。

捕捉活性 （単位 =%) は、 式：

[捕捉活性 （％) ] = { (C c -C) /C c\ X I 0 0

[式中、 Cは D 2画分添加群のケミルミネッセンス量であり、 C cはリン酸緩衝 液添加群 （対照群） のケミルミネッセンス量である]

により算出した。 結果を表 7に示す。 表 7から明らかなように、 D 2画分に活性 酸素捕捉活性が認められた。 N o サンプル 捕ネ 舌性％

1 リン酸緩衝液 （ p H 7. 2 ) 0

2 D 2画分 （ 1 m aZm L) 9 6

( 5 ) 吸着画分 D 2の抗腫瘍活性

呉羽化学工業株式会社生物医学研究所において 5 0 m L容の細胞培養用フラス コ （3 0 1 4 ; B e c t o n— D i c k i n s o n社） 中で継代維持しているス イスアルビノ 3 T 3株及び S V 4 0形質転換 3 T 3細胞株 [大日本製薬株式会社 ラボラトリ一プロダクツ部 （大阪） より入手] を、 0. 1 2 5%卜リブシン溶液 (シグマ社） で数分間処理することによりフラスコ器壁から遊離させた。 洗浄後、 1 0%ゥシ胎児血清 （5 6°Cで 3 0分間処理したもの） 含有 DM EM (D u I b e c c o s Mo d i f i c a t i o n o f E a g l e s M e d i u m) 培地に懸濁し、 2 X 1 0³個 Zm Lに調整した後、 0. 1 m Lずつ、 9 6ゥ エルの細胞培養用平底マイクロテス 卜プレー卜 （3 0 7 2 ; B e c t o n— D i c k i n s o n社） の各ゥエルに分注した。

3 7での 5 %炭酸ガス培養容器内で 2 4時間培養した後、 前記実施例 2で得ら れた吸着画分 D 2の所定量又は培地 0. 1 m Lを加え、 更に 2 4時間培養した。 なお、 培養終了 6時間前に、 ³ H—チミジン （Am e r s h a m I n t e r n a t i o n a l p i c) ] _M C \ ウエルを添加した。 培養終了後、 細胞を濾 紙上に回収し、 5%三塩化酢酸で充分に洗浄した後、 乾燥させ、 細胞に取り込ま れた放射能を液体シンチレーシヨンカウンターで測定した。 吸着画分 D 2の 5 0 %阻止濃度 （L D ₅。） は、 S V 4 0形質転換 3 T 3細胞株で約 5 0 g L であり、 スイスアルビノ 3 T 3株で約 4 0 μ gノ m Lであった。 また、 MT T法 により L D _{5 Q}を測定したところ、 ³H—チミジン法により得られた前記結果とほ ぼ同様の結果が得られた。

実施例 3 ：マツタケアルカリ溶液抽出液及びその陰イオン交換樹脂吸着画分の調 製

前記実施例 2と同様の方法で調製したマツタケ CM 6 2 7— 1株菌糸体培養物 を、 ホモゲナイザーにかけた後、 全体の濃度が 0. 1 mo になるまで水酸 化ナトリウム溶液を添加した。 スターラ一撹拌下、 2 2°Cで 1時間抽出した。 抽 出終了後、 遠心分離 （ 1 2000 r pm， 20分間， 4で） により、 上清を得た。 沈澱部に 0. 3 mo I 1_水酸化ナトリウム溶液を加え、 前記と同様の処理を 行ない、 上清を得た。 更に、 沈澱部に 0. 5 mo I 1_水酸化ナトリウム溶液を 加え、 前記と同様の処理を行ない、 上清を得た。 全ての上清を合わせて、 前記上 清に 1 m o I ZL塩酸を加え、 p Hを 7. 0に調整した後、 透析膜 （ S p e c t r a/P o r 3 Memb r a n e, 分子量 3 5 00分画） に入れ、 水道水の流 水中で 3日間透析した。 透析膜内液を口一タリ一エバポレーターで濃縮した後、 凍結乾燥を行ない、 粉末 （以下、 画分 Aと称する） 4. 3 gを得た。

次に、 前記粉末 （画分 A) を 5 0 mmo l ZL 卜リス塩酸緩衝液 （p H 7. 0) に溶解し、 予め前記緩衝液で平衡化させておいたジェチルアミノエチル （D E A E) セル口一スカラム （口径 =2 c m, 高さ =20 c m) にアプライし、 次 いで、 前記緩衝液 1 0 0 m Lを流し、 非吸着画分 A 1 (以下、 単に 「A 1画分」 と称することがある） を得た。 次いで、 前記緩衝液に 1 mo 1 1_塩化ナトリウ 厶を加えた溶液 20 Om Lを調製し、 前記カラムにかけ、 吸着物を溶出し、 吸着 画分 A 2 (以下、 単に 「A 2画分」 と称することがある） を得た。 得られた非吸 着画分及び吸着画分溶液をそれぞれ、 透析膜 （S p e c t r aZP o r S Me mb r a n e, 分子量 3 5 0 0分画） に入れ、 純水中で 3日間透析した。 透析膜 内液を口一タリ一エバポレーターで濃縮した後、 凍結乾燥を行ない、 非吸着画分 A 1粉末及び吸着画分 A 2粉末を得た。

画分 Aの生物活性評価例

前記 「キノコ熱水抽出液の生物活性試験」 （ 2 ) と同様の方法により T細胞増 強活性を評価したところ、 画分 A投与群 （投与量 =2 5 O mgZk g) の活性は、 混合リンパ球 '腫瘍細胞反応において 1 3 0% (コントロール群に対する％) で あり、 リンパ球 ·腫瘍細胞混合培養による細胞傷害活性誘導反応において 1 3 1 % (コン トロール群に対する％) であった。

また、 前記 「吸着画分 D 2の生物活性評価例」 （2) と同様の方法によりサイ 卜力イン誘導活性を評価したところ、 培地コントロール群の総インタ一ロイキン 1 2含量が検出限界以下であつたのに対して、 画分 A添加群の総インターロイキ ン 1 2含量は 6 9 p g Zm Lであった。

更に、 前記 「吸着画分 D 2の生物活性評価例」 （ 3 ) と同様の方法により T G F— ?結合活性を評価したところ、 画分 Aの結合活性は 2 6 %であった。 産業上の利用可能性

本発明の免疫増強組成物によれば、 免疫能を増強することができる。 以上、 本発明を特定の態様に沿って説明したが、 当業者に自明の変形や改良は 本発明の範囲に含まれる。

Claims

請 求 の 範 囲

1 . マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸 着画分。

2 . マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 あるいは、 マツタケ 熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分と、 薬 剤学的に許容することのできる担体とを含有する、 免疫増強組成物。

3 . マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 あるいは、 マツタケ 熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰ィォン交換樹脂吸着画分を、 そ れ単独で、 あるいは、 所望により 1又はそれ以上の食品成分と共に含有する、 免 疫増強機能性食品。

4 . マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 あるいは、 マツタケ 熱水抽出液又はマツタケアル力リ溶液抽出液の陰ィ才ン交換樹脂吸着画分を、 免 疫増強が必要な対象に、 有効量で投与することを含む、 免疫を増強する方法。

5 . マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 あるいは、 マツタケ 熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰ィォン交換樹脂吸着画分の、 免 疫増強組成物又は免疫増強機能性食品を製造するための使用。

6 . マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 あるいは、 マツタケ 熱水抽出液又はマッタケアルカリ溶液抽出液の陰ィ才ン交換樹脂吸着画分と、 薬 剤学的に許容することのできる担体とを含有する、 キラ一活性誘導組成物。

7 . マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 あるいは、 マツタケ 熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰ィ才ン交換樹脂吸着画分を、 そ れ単独で、 あるいは、 所望により 1又はそれ以上の食品成分と共に含有する、 キ ラー活性誘導機能性食品。

8 . マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 あるいは、 マツタケ 熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰ィ才ン交換樹脂吸着画分を、 キ ラー活性誘導が必要な対象に、 有効量で投与することを含む、 キラ一活性を誘導 する方法。

9 . マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 あるいは、 マツタケ 熱水抽出液又はマッタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分の、 キ ラ一活性誘導組成物又はキラー活性誘導機能性食品を製造するための使用。

1 0 . マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 あるいは、 マッタ ケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰ィォン交換樹脂吸着画分と、 薬剤学的に許容することのできる担体とを含有する、 腫瘍増殖抑制組成物。

1 1 . マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 あるいは、 マッタ ケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰ィ才ン交換樹脂吸着画分を、 それ単独で、 あるいは、 所望により 〗又はそれ以上の食品成分と共に含有する、 腫瘍増殖抑制機能性食品。

1 2 . マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 あるいは、 マッタ ケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰ィォン交換樹脂吸着画分を、 腫瘍増殖抑制が必要な対象に、 有効量で投与することを含む、 腫瘍増殖を抑制す る h 。

1 3 . マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 あるいは、 マッタ ケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分の、 腫瘍増殖抑制組成物又は腫瘍増殖抑制機能性食品を製造するための使用。

1 4 . マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 あるいは、 マッタ ケ熱水抽出液又はマッタケアルカリ溶液抽出液の陰ィォン交換樹脂吸着画分と、 薬剤学的に許容することのできる担体とを含有する、 インタ一ロイキン 1 2誘導 組成物。

1 5 . マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 あるいは、 マッタ ケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分を、 それ単独で、 あるいは、 所望により 1又はそれ以上の食品成分と共に含有する、 インタ一ロイキン 1 2誘導機能性食品。

1 6 . マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 あるいは、 マッタ ケ熱水抽出液又はマッタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分を、 インターロイキン 1 2誘導が必要な対象に、 有効量で投与することを含む、 イン タ一ロイキン 1 2を誘導する方法。

1 7 . マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 あるいは、 マッタ ケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分の、 インターロイキン 1 2誘導組成物又はインタ一ロイキン 1 2誘導機能性食品を製 造するための使用。

1 8 . マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 あるいは、 マッタ ケ熱水抽出液又はマッタケアルカリ溶液抽出液の陰ィ才ン交換樹脂吸着画分と、 薬剤学的に許容することのできる担体とを含有する、 T G F— 活性抑制組成物 _c

1 9 . マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 あるいは、 マッタ ケ熱水抽出液又はマッタケアルカリ溶液抽出液の陰ィォン交換樹脂吸着画分を、 それ単独で、 あるいは、 所望により 1又はそれ以上の食品成分と共に含有する、 T G F一/?活性抑制機能性食品。

2 0 . マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 あるいは、 マッタ ケ熱水抽出液又はマッタケアルカリ溶液抽出液の陰ィ才ン交換樹脂吸着画分を、 T G F—^活性抑制が必要な対象に、 有効量で投与することを含む、 T G F—/? 活性を抑制する方法。

2 1 . マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 あるいは、 マッタ ケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰ィ才ン交換樹脂吸着画分の、 T G F—/?活性抑制組成物又は T G F—^活性抑制機能性食品を製造するための 使用。

2 2 . マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 あるいは、 マッタ ケ熱水抽出液又はマツタケアル力リ溶液抽出液の陰ィォン交換樹脂吸着画分と、 薬剤学的に許容することのできる担体とを含有する、 活性酸素捕捉組成物。

2 3 . マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 あるいは、 マッタ ケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰ィ才ン交換樹脂吸着画分を、 それ単独で、 あるいは、 所望により 1又はそれ以上の食品成分と共に含有する、 活性酸素捕捉機能性食品。

2 4 . マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 あるいは、 マッタ ケ熱水抽出液又はマッタケアルカリ溶液抽出液の陰ィォン交換樹脂吸着画分を、 活性酸素捕捉が必要な対象に、 有効量で投与することを含む、 活性酸素を捕捉す る方法。

2 5 . マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、 あるいは、 マッタ ケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰ィ才ン交換樹脂吸着画分の、 活性酸素捕捉組成物又は活性酸素捕捉機能性食品を製造するための使用。