JP2001516570A - ビフィドゲニックペプチド類 - Google Patents

ビフィドゲニックペプチド類

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ヴォルフ ゲオルグ フォースマン
ハンス−ディーター ツァクスト
コメリア リエッケ
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ヴォルフ ゲオルグ フォースマン
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Abstract

(57)【要約】 −牛乳またはヒトの乳にプロテアーゼを加え、次いで２時間インキュベーションし、−遠心分離して乳脂肪を除去し、−強酸を用いてｐＨ２．０に酸性化し、−沈殿したタンパク質を除去し、−少なくとも１回の逆相ＨＰＬＣを適用し、−１回の陽イオン交換ＨＰＬＣを適用し、−フラクションを回収し、−活性試験を行うために、透析又は逆相ＨＰＬＣにより、これらのフラクションを２５ｍＭ未満の塩濃度に調整し、−ビフィドバクテリウム ビフィドム（Bifidobacterium bifidum）及び大腸菌（E.coli）を上記フラクションの存在下で培養し、かつ下記の条件を満たすフラクションを選択し、 【数1】 (式中、BWは、200μg/mlの濃度で前記ペプチド類が存在する50%エリカーブロス(Elliker broth)中でビフィドバクテリウム ビフィドム（Bifidobacterium bifidum）を16時間インキュベートしたときに得られた細菌数を表し、B0は、活性成分なしのコントロールインキュベーションにおいて得られた細菌数を表し、Ewは、200μg/mlの濃度で前記ペプチド類が存在する3g/lトリプシンソイブロス(triptic soy broth)中で大腸菌（E. coli）を16時間インキュベートしたときに得られた細菌数を表し、E0は、活性成分なしのコントロールインキュベーションにおいて得られた細菌数を表す。）−このフラクションに含まれたペプチドを単離することにより得られ得るペプチド類、及び、ビフィドゲニック性を有する、アミド化、アセチル化、硫酸塩化、燐酸塩化、グリコシル化、酸化誘導体類又はそのフラグメント類、及び化学結合によるペプチド類、フラグメント類又は誘導体類の組み合わせにより得られるペプチド類。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、ビフィドゲニック ペプチド類(Bifidogenic Peptides)、それらの
製造方法及び前記ビフィドゲニック ペプチド類の使用に関する。
【０００２】 牛乳は、幼児の健康を促進することが知られている。このことは、90%以上ビ フィドバクテリウム ビフィドム（Bifidobacterium bifidum）からなる腸内細 菌叢(Intestinal flora)の形成に対する牛乳の影響にしばしば帰属する。
【０００３】 本発明の目的は、腸内細菌叢に対してプラスの影響を有するペプチド類を提供
することであった。
【０００４】 この目的は、請求項1の特徴を有するペプチド類によって達成される。本発明 によるペプチド類は、 −牛乳またはヒトの乳にプロテアーゼを加え、次いで２時間インキュベーショ
ンし、 −遠心分離して乳脂肪を除去し、 −強酸を用いてｐＨ２．０に酸性化し、 −沈殿したタンパク質を除去し、 −少なくとも１回の逆相ＨＰＬＣを適用し、 −１回の陽イオン交換ＨＰＬＣを適用し、 −フラクションを回収し、 −活性試験を行うために、透析又は逆相ＨＰＬＣにより、これらのフラクショ
ンを２５ｍＭ未満の塩濃度に調整し、 −ビフィドバクテリウム ビフィドム（Bifidobacterium bifidum）及び大腸 菌（E.coli）を上記フラクションの存在下で培養し、かつ下記の条件を満たすフ
ラクションを選択し、
【数２】 (式中、BWは、200μg/mlの濃度で前記ペプチド類が存在する50%エリカーブロ ス(Elliker broth)中でビフィドバクテリウム ビフィドム（Bifidobacterium b
ifidum）を16時間インキュベートしたときに得られた細菌数を表し、 B0は、活性成分なしのコントロールインキュベーションにおいて得られた細菌
数を表し、 EWは、200μg/mlの濃度で前記ペプチド類が存在する3g/lトリプシンソイブロ ス(triptic soy broth)中で大腸菌（E. coli）を16時間インキュベートしたとき
に得られた細菌数を表し、 E0は、活性成分なしのコントロールインキュベーションにおいて得られた細菌
数を表す。） −このフラクションに含まれたペプチドを単離することにより得られ得るペプ
チド類、及び、ビフィドゲニック性を有する、アミド化、アセチル化、硫酸塩化
、燐酸塩化、グリコシル化、酸化誘導体類又はそのフラクション類である。
【０００５】 本発明のペプチド類は、天然の幼児の腸内細菌叢では、生じないか、または非
常に少量である細菌に対する抗菌効果を有し、ビフィドバクテリアのような所望
の細菌の成長を、他の細菌の成長よりもビフィドバクテリアの成長を促進するこ
と、または望ましくないバクテリアを選択的に阻害することにより、促進する。
成長に関する利点をビフィドバクテリアに与えるこの性質は「ビフィドゲニック
」と呼ばれる。 好ましくは、以下のアミノ酸配列を有するペプチド類、並びに、ビフィドゲニ
ック性を有する、アミド化、アセチル化、硫酸塩化、燐酸塩化、グリコシル化、
酸化誘導体類又はそのフラグメント類が用いられる。
【０００６】
【化２】
【０００７】 式中、R1、R3は独立にNH2、アミノ酸又は100までのアミノ酸を含むペプチドを
表し、 R2、R4は独立にCOOH、CONH2、アミノ酸又は100までのアミノ酸を含むペプチド
を表す。
【０００８】 好ましくは、R1、R2、R3及びR4は50までの長さの、より好ましくは20までの長
さの、最も好ましくは10までの長さのアミノ酸を有する。
【０００９】 本発明のペプチド類は、牛乳又はヒトの乳から単離及び精製されることで得る
ことができる。あるいは、それらは、遺伝子工学的に調製された生物中で発現さ
れるものでも、または化学ペプチド合成により調製されるものでもよい。
【００１０】 本発明の別の態様は、ビフィドゲニック バクテリアをコードする核酸類及び
ビフィドゲニック ペプチド類に対する抗体類に関する。
【００１１】 本発明のペプチド類及び／又は核酸類は、医薬的に許容可能な賦形剤と共に薬
剤に含めることができる。この場合、これらガレン式（galenic）配合物及び投 与形態は、ペプチド類がそれらの作用部位に分解せずに到達できるように選択さ
れる。
【００１２】 好ましくは、本発明のペプチド類は、体重1kg当たり0.1〜100mgの量で用いら れる。核酸類の有効量は、例えば、体重1kg当たり0.01 mg〜100mgである。好ま しくは、この量は、ペプチド類及び核酸類について、体重1kg当たり1 〜10mgの 範囲である。
【００１３】 本発明のペプチド類は、栄養物と共に食品に含めることもできる。
【００１４】 さらに、本発明のペプチド類及び／又はこのペプチド類に対する抗体類は他の
補助剤と共に検査薬に含めることもできる。
【００１５】 本発明のペプチド類及び核酸類は、伝染病、炎症、微生物誘発腫瘍（microbia
lly induced tumors）、微生物起因退行性疾病（microbially caused degenerat
ive diseases）、下痢、疝痛、口腔内逸脱（deviation in the oral）、腸内及 び膣内細菌叢、カリエスのような誤った微生物移植（misplaced microbial colo
nization）により引き起こされた疾病の治療のために適している。前記の誤った
微生物移植は、例えば、細菌、菌類、酵母、原生生物、ウイルス、マイコプラズ
マ（mycoplasmas）、糸状虫（filariae）及び／又はマラリア原虫（plasmodiums
）により引き起こされることがある。
【００１６】 本発明のペプチド類は、発酵剤に関する食料調製における補助剤としても適当
である。
【００１７】 特に、２つ以上のペプチドが好ましくは共同で使用され、又は本発明の２つ以
上のペプチド配列を有するペプチドが使用される。微生物耐性が起こるとき、個
々の物質の、又は本発明のペプチド類の個々の配列を有する物質の異なる範囲の
活性が、配列の適当な組み合わせにより、又は個々の物質の組み合わせにより、
望ましくない微生物の最適阻害を達成させる。
【００１８】 以下の実施例は、本発明をさらに説明しようとするものである。
【実施例】
実施例１ 乳の処理 塩酸によりｐHが3.5に調整された後のヒトの乳に、ペプシン（タンパク１ｇ当
たり20mg）を添加した。酵素反応は、37℃で2時間インキュベートされ、そして ５分間沸騰させて停止された。これは、その後遠心分離され（４℃において２０
分、60,000g）、乳脂肪分がすくい取られた。結果として得られた溶液は、0.1％
のTFAが添加され、そして、再度遠心分離が行われて、沈殿した高分子量タンパ ク質を分離除去した。
【００１９】 乳からのビフィドゲニック（bifidogenic）ペプチドのHPLC精製 乳からのビフィドゲニックペプチド類の精製のために、種々のHPLC分離方法が
、最適分離効果により、可能な限り高い純度の調製を達成するため、及び不活性
な望ましくない成分を分離除去するために組み合わせられなければならない。各
分離ステップの後に形成されたそれぞれの試料は、２つの試験系、即ち大腸菌を
ターゲットとした成長試験と組み合わせたビフィドバクテリアの成長試験におい
て試験されなければならない（実施例３及び４参照）。精製のためには、カチオ
ン交換HPLC分離とともに、少なくとも１回の逆相クロマトグラフィーステップ（
好ましくは２回の逆相クロマトグラフィーステップ）を組み合わせることが必要
である。生物試験（biotest）において、それぞれの試料は、可能な限り最善の スクリーニング結果を得るために、塩分欠乏条件において使用されなければなら
ない。
【００２０】 第一分離ステップは、パルコシル（parcosil）C18カラム（1×12.5cm、100Å 、バイオテック・ハイデルベルグ（biotek Heidelberg）、ドイツ）を用いて行 われた。 バッファーA：0.1％TFA バッファーB：0.1％TFA含有アセトニトリル グラジエント：４５分間でBを0から60％に 流速：2ml/min 280nmにおいて検出（図１参照）
【００２１】 同様のカラムを用い、より穏やかにグラジエントを上昇させたフラクション２
３の再クロマトグラフィー（rechromatography）（図を参照）： バッファーA:0.1％TFA バッファーB：0.1％TFA含有アセトニトリル グラジエント：５分間でBを0から20％に ４５分間でBを20から50％に 214nmにおいて検出（図２参照）
【００２２】 分離中の選択性を変えるために、同じカラムを用いるが、他の溶離液を用いる
前述の分離からのフラクション１６の再クロマトグラフィー： バッファーA:0.1％TFA バッファーB：0.1％TFA含有メタノール グラジエント：５分間でBを0から40％に ４５分間でBを40から70％に 214nmにおいて検出（図３参照）
【００２３】 カチオン交換HPLCによる活性フラクション２１の再クロマトグラフィー： カラム：パルコシル・ペプカット（Parcosil Pepkat）、４×５０mm、３００ Å、５μm、バイオテック・ハイデルベルグ バッファーA：10mM燐酸塩バッファー、ｐH４．５ バッファーB：１Mの塩化ナトリウムを添加したバッファーA 流速：０．７５ml/min グラジエント：５分間でBを０から１５％に ３５分間でBを１５％から５０％に ２１４nmにおいて検出（図４参照）
【００２４】 得られたそれぞれのフラクションは、抗菌性及びビフィドゲニック活性の試験
へ進められる以前に運転される短期（ｂｒｉｅｆ）逆相ＨＰＬＣにおいて別々に
脱塩された。
【００２５】 以下のペプチド類は、質量分析計及びアミノ酸配列決定により同定された。
【００２６】 純粋なビフィドゲニック成分が含有されたフラクション９：
【化３】 (カゼイン K-63-117)； ビフィドゲニック成分が含有されたフラクション１０
【化４】 (好中球ラクトフェリン（neutrophile lactoferrin）-20-67)； 及びフラクション１１は、それが酸化生成物（好ましくは１つのメチオニンが
酸化された）であることを示す＋16の付加物質量（adduct mass）を有するビフ ィドゲニック成分を含有する。 ペプチド類及び酸化生成物の両者は、ビフィドゲニック活性を示す。
【００２７】 実施例２ 大腸菌における成長調節活性の証明 ＨＰＬＣからのフラクションは、大腸菌Ｋ１２とともに使用された。この試験
は、以下のように、3g/lのトリプシンソイブロス（シグマ）中で行われた。 各分析のために、大腸菌Ｋ１２の培地は、トリプシンソイブロス（シグマ、ダ
イセンホフェン（Deisenhofen）、ドイツ、注文番号Ｔ８９０７）（Difco Manua
l,10th ed.,p.1027）中に新たに接種された。これらの細菌のインキュベーショ ンは、１６時間３７℃の好気性条件下で常に行われた。試験されるべきペプチド
類は、９６−ウェル細胞培地プレートにおいて、3g/lのトリプシンソイブロス20
0μlから成る試験溶液に与えられ、かつ希釈された細菌懸濁液２０μlとともに 接種された。その接種物の500nmにおいて測定された吸光度は0.05であった。ペ プチド類の影響下の細菌の成長もまた、16時間後にELISA読み取り機において光 度計で測定され、かつ顕微鏡により手作業で測定された。
【００２８】 実施例３ ビフィドバクテリウム ビフィドムにおける成長調節活性の証明 各分析のために、ビフィドバクテリウム ビフィドム ATCC 29521の培地は、 エリカーブロス（ディフコ（Difco）、デトロイト、米国）（トリプトン２０ｇ 、酵母抽出物５ｇ、ゼラチン２．５ｇ、デキストロース５ｇ、ラクトース５ｇ、
サッカロース５ｇ、塩化ナトリウム４ｇ、酢酸ナトリウム１．５ｇ、アスコルビ
ン酸０．５ｇ）中に新たに接種された。これらの細菌のインキュベーションは、
１６〜１８時間、３７℃の嫌気性条件下で常に行われた。試験されるべきペプチ
ド類は、９６−ウェル細胞培地プレートにおいて５０％のエリカーブロス200μl
から成る試験溶液に与えられ、かつ希釈された細菌懸濁液２０μlとともに接種 された。その接種物の550nmにおいて測定された吸収光度は0.05であった。ペプ チド類の影響下の細菌の成長もまた、16時間後にELISA読み取り機において、光 度計で測定され、かつ顕微鏡により手作業で測定された。N-アセチルグルコサミ
ンは、プラスの対照（positive control）として役立った。N-アセチルグルコサ
ミンに反応するビフィダス（bifidus）培地のみが、この試験のために使用され 得る。数継代後、ビフィドバクテリアはこの性質を失う。この場合、それらはも
はやこの成長試験のために使用され得ない。
【００２９】 実施例４
【数３】 であるそれらのフラクションは、ビフィドゲニックであると同定された。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例１の逆相クロマトグラフィーステップにおける第一分離ステッ
プのクロマトグラム。
【図２】 実施例１の逆相クロマトグラフィーステップにおけるフラクション２
３の再クロマトグラム。
【図３】 実施例１の逆相クロマトグラフィーステップにおけるフラクション１
６の再クロマトグラム。
【図４】 実施例１の逆相クロマトグラフィーステップにおけるフラクション２
１のカチオン交換HPLCによる再クロマトグラム。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年３月１５日（２０００．３．１５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【数1】 (式中、BWは、200μg/mlの濃度で前記ペプチド類が存在する50%エリカーブロ ス(Elliker broth)中でビフィドバクテリウム ビフィドム（Bifidobacterium b
ifidum）を16時間インキュベートしたときに得られた細菌数を表し、 B0は、活性成分なしのコントロールインキュベーションにおいて得られた細菌
数を表し、 EWは、200μg/mlの濃度で前記ペプチド類が存在する3g/lトリプシンソイブロ ス(triptic soy broth)中で大腸菌（E. coli）を16時間インキュベートしたとき
に得られた細菌数を表し、 E0は、活性成分なしのコントロールインキュベーションにおいて得られた細菌
数を表す。） −このフラクションに含まれたペプチドを単離することにより得られ得るペプ
チド類の、 及び、ビフィドゲニック性を有する、アミド化、アセチル化、硫酸塩化、燐酸
塩化、グリコシル化、酸化誘導体類又はそのフラグメント類の、及び化学結合に
よるペプチド類、フラグメント類又は誘導体類の組み合わせにより得られるペプ
チド類の使用。
【化１】 式中、R1、R3は独立にNH2、アミノ酸又は100までのアミノ酸を含むペプチドを
表し、 R2、R4は独立にCOOH、CONH2、アミノ酸又は100までのアミノ酸を含むペプチド
を表す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/06 Ａ６１Ｐ 19/00 1/12 29/00 19/00 31/04 29/00 31/10 31/04 31/12 31/10 33/02 31/12 33/06 33/02 35/00 33/06 Ｃ０７Ｋ 7/00 35/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ０７Ｋ 7/00 Ａ６１Ｋ 37/02 37/18 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ，ＵＳ 【要約の続き】 ョンにおいて得られた細菌数を表し、Ewは、200μg/ml の濃度で前記ペプチド類が存在する3g/lトリプシンソイ ブロス(triptic soy broth)中で大腸菌（E. coli）を16 時間インキュベートしたときに得られた細菌数を表し、 E0は、活性成分なしのコントロールインキュベーション において得られた細菌数を表す。）−このフラクション に含まれたペプチドを単離することにより得られ得るペ プチド類、及び、ビフィドゲニック性を有する、アミド 化、アセチル化、硫酸塩化、燐酸塩化、グリコシル化、 酸化誘導体類又はそのフラグメント類、及び化学結合に よるペプチド類、フラグメント類又は誘導体類の組み合 わせにより得られるペプチド類。

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 −牛乳またはヒトの乳にプロテアーゼを加え、次いで２時間イ
    ンキュベーションし、 −遠心分離して乳脂肪を除去し、 −強酸を用いてｐＨ２．０に酸性化し、 −沈殿したタンパク質を除去し、 −少なくとも１回の逆相ＨＰＬＣを適用し、 −１回の陽イオン交換ＨＰＬＣを適用し、 −フラクションを回収し、 −活性試験を行うために、透析又は逆相ＨＰＬＣにより、これらのフラクショ
    ンを２５ｍＭ未満の塩濃度に調整し、 −ビフィドバクテリウム ビフィドム（Bifidobacterium bifidum）及び大腸 菌（E.coli）を上記フラクションの存在下で培養し、かつ下記の条件を満たすフ
    ラクションを選択し、 【数1】 (式中、BWは、200μg/mlの濃度で前記ペプチド類が存在する50%エリカーブ ロス(Elliker broth)中でビフィドバクテリウム ビフィドム（Bifidobacterium
    bifidum）を16時間インキュベートしたときに得られた細菌数を表し、 B0は、活性成分なしのコントロールインキュベーションにおいて得られた細菌
    数を表し、 EWは、200μg/mlの濃度で前記ペプチド類が存在する3g/lトリプシンソイブロ ス(triptic soy broth)中で大腸菌（E. coli）を16時間インキュベートしたとき
    に得られた細菌数を表し、 E0は、活性成分なしのコントロールインキュベーションにおいて得られた細菌
    数を表す。） −このフラクションに含まれたペプチドを単離することにより得られ得るペプ
    チド類、 及び、ビフィドゲニック性を有する、アミド化、アセチル化、硫酸塩化、燐酸
    塩化、グリコシル化、酸化誘導体類又はそのフラグメント類、及び化学結合によ
    るペプチド類、フラグメント類又は誘導体類の組み合わせにより得られるペプチ
    ド類。
  2. 【請求項２】 以下のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のペプチド類並び
    に、ビフィドゲニック活性を有する、アミド化、アセチル化、硫酸塩化、燐酸塩
    化、グリコシル化、酸化誘導体類又はそのフラグメント類。 【化１】 式中、R1、R3は独立にNH2、アミノ酸又は100までのアミノ酸を含むペプチドを
    表し、 R2、R4は独立にCOOH、CONH2、アミノ酸又は100までのアミノ酸を含むペプチド
    を表す。
  3. 【請求項３】 牛乳又はヒトの乳からの単離及び精製、遺伝子工学的に調製さ
    れた生物中での発現、または化学合成による請求項１及び／又は２に記載のペプ
    チド類の調製方法。
  4. 【請求項４】 請求項１及び／又は２に記載のペプチド類をコードする核酸類
    。
  5. 【請求項５】 請求項１及び／又は２に記載のペプチド類に対する抗体類。
  6. 【請求項６】 医薬的に許容可能な賦形剤とともに請求項１及び／若しくは２
    に記載の少なくとも１つのペプチド類並びに／又は請求項３に記載の少なくとも
    １つの核酸類を含む薬剤。
  7. 【請求項７】 栄養物とともに請求項１及び／又は２に記載のペプチド類を含
    有する食料品。
  8. 【請求項８】 その他の補助剤とともに請求項１及び／若しくは２に記載のペ
    プチド類並びに／又は請求項５に記載の抗体類を含有する検査薬。
  9. 【請求項９】 例えば、細菌、菌類、酵母、原生生物、ウイルス、マイコプラ
    ズマ、糸状虫、マラリア原虫による、伝染病、炎症、微生物誘発腫瘍、微生物起
    因退行性疾病、下痢、疝痛、口腔内逸脱、腸内及び膣内細菌叢、カリエスのよう
    な、誤った微生物移植により引き起こされる疾病の治療のために、請求項１及び
    ／若しくは２に記載のペプチド類並びに／又は請求項３に記載の核酸類の使用。
  10. 【請求項１０】 食料品の調製のための請求項１又は２に記載のペプチド類の
    使用。
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