CN105753761A - 一种从芜菁根中高效提取药效活性成分的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从芜菁根中高效提取药效活性成分的工艺，其采用吡咯烷盐作为提取剂、非离子型表面活性剂(脂肪醇聚氧乙烯醚)作为提取助剂，并采用微波辅助提取和高效逆流色谱相结合的提取分离模式，充分发挥了微波特有的破坏植物组织、电磁加热以及微波定型除杂等功能，有效地增加了目标物的溶出率，并具有高效、快速、样品无污染、可大量制备分离等优点，并大幅提高了提取收率，具有广泛的工业化应用前景和市场前景。
Description
技术领域
本发明属于从天然植物中提取药物有效活性成分的技术领域。更具体地，本发明涉及一种从芜菁中高效提取4-(甲酰基-5-羟甲基-1-氢-吡咯-1-基)丁酸的工艺，属于药效活性成分的天然植物提取领域。
背景技术
4-(2-甲酰基-5-羟甲基-1-氢-吡咯-1-基)丁酸是一种重要的药物活性成分，其具有保护肝脏和增加外周血流量等诸多生物活性，已被广泛应用于医药、制剂等相关领域，其结构如下所示：
现有技术中已存在多种提取4-(2-甲酰基-5-羟甲基-1-氢-吡咯-1-基)丁酸的报道，其主要针对不同的植物来源进行提取工艺的优化。例如：
戚中杰等(“猫爪草中吡咯丁酸的含量测定研究”,中国药学杂志,2012,47(2),101-103)首次公开了一种从猫爪草中分离制备4-(2-甲酰基-5-羟甲基-1-氢-吡咯-1-基)丁酸的提取工艺，并通过HPLC测定了猫爪草中吡咯丁酸的含量。
SalwaF.Farag等(“NewisoflavoneglycosidesfromIrisspuriaL.(Calizona)cultivatedinEgypt”,J.Nat.Med.,2009,63,91-95)报道了一种从拟鸢尾中采用甲醇萃取后再分离各种天然活性组分的方法，其成功分离出4-(2-甲酰基-5-羟甲基-1-氢-吡咯-1-基)丁酸，但仅能够从3kg拟鸢尾植物提取源中分离得到6.3mg该上述成分。
SangShengmin等(“AntifungalConstituentsfromSeedsofAlliumfistulosumL.”,J.Agric.Food.Chem.,2002,50,6318-6321)报道了一种从葱属植物中经乙醇、石油醚连续萃取，后经色谱分离得到4-(2-甲酰基-5-羟甲基-1-氢-吡咯-1-基)丁酸的工艺方法，其采用30kg植物提取源分离得到了32mg该上述成分，其收率仅为1.07%。
ChinYoung-Won等(“HepatoprotectivePyrroleDerivativesofLyciumchineseFruits”,Bioorganic&MedicinalChemistryLetters,2003,13,79-81)公开了一种从枸杞中提取分离吡咯衍生物的方法，其通过甲醇超声萃取，过滤、萃取物置于水中并用正己烷、乙酸乙酯分离，分离得到的粗品用反相柱硅胶柱、硅胶柱、葡聚糖凝胶柱和HPLC分离纯化得到三种不同的吡咯衍生物，其中4-(2-甲酰基-5-羟甲基-1-氢-吡咯-1-基)丁酸的分离收率为0.18mg/kg。
CN103073479A的专利申请中公开了一种从植物芜菁中提取、分离、纯化吡咯衍生物[4-(2-甲酰基-5-羟甲基-1-氢-吡咯-1-基)丁酸]的工艺，其首次在植物芜菁中发现并提取了较高含量的该天然活性成分，并且从500g芜菁块根中提取得到了约250mg的有效成分。
但如上所述，尽管已存在多种从不同植物源中提取4-(2-甲酰基-5-羟甲基-1-氢-吡咯-1-基)丁酸的方法，然而却存在普遍存在着提取率低下、原料利用率低的问题。同时，依据现有技术可知芜菁是一种含该成分较为丰富的植物源，因此如何实现从芜菁中高效提取4-(2-甲酰基-5-羟甲基-1-氢-吡咯-1-基)丁酸的工艺来提高物料的利用率则成为研究领域的一个亟待解决的问题。
本发明人针对现有技术的缺陷，旨在开发一种适用于吡咯衍生物的高效、快速提取工艺，从而提高物料的利用率和有效活性成分的得率、增加企业收益，充分满足现有医药、化工领域对该组分的大量需求，实现吡咯衍生物的规模化提取和生产应用。
发明内容
针对现有技术存在的诸多缺陷，本发明人经过大量的深入的研究，在付出了充分的创造性劳动后，开发了一种从芜菁中提取植物有效成分的工艺方法。
具体而言，本发明提供了一种从芜菁根中提取药效成分的方法，所述方法包括如下步骤：
A、备料
取芜菁根，水洗、自然晾干后，脱水至干燥，再粉碎、研磨后过筛，得到芜菁根粉末。
B、提取
取芜菁根粉末置于微波提取釜中，向釜中加入盐酸水溶液润湿粉末，并搅拌均匀，然后进行微波辐射预处理；预处理结束后，再向其中加入提取剂，混合均匀后，再加入助剂，于室温下直接微波提取，然后过滤分离得提取液；经真空浓缩后，冷冻干燥，将所得干燥提取物置于微波釜中进行微波后处理，即得到粗品。
C、分离
高速逆流色谱固定相和流动相的制备步骤：按照比例将石油醚、乙腈和水混合并振荡均匀，静置分层，上层作为固定相，下层作为流动相，两相各进行超声脱气处理20-30min，其中石油醚、乙腈和水的体积比为2-3:4-7:1，优选2.5:5:1。
高速逆流色谱分离的具体步骤：首先将固定相泵入高速逆流色谱的色谱柱中，使其充满整个色谱柱，然后开启高速逆流色谱，调整主机转速，将流动相泵入色谱柱中，待两相达到动态平衡后，取步骤B所得的粗品溶解在体积比为1:1的固定相和流动相的混合溶剂中，得到样品溶液，将样品溶液通过进样阀进样，进样完毕后继续泵入流动相，用HPLC检测出峰位置，分步收集分离物，合并目标物，经浓缩脱溶、冻干得到纯品。
在本发明的所述方法中，所述步骤A中的芜菁根粉末的粒度为50-100目，优选70-90目。
在本发明的所述方法中，所述步骤A中的“脱水至干燥”的处理可采用任何的常规处理手段，例如将洗干净后的芜菁根自然放置至干燥，或者为了加快处理过程，将其切成小块，于干燥器中烘干脱水至干燥。
其中，所述“干燥”的含义是指本领域中的公知含义，例如当将芜菁根干燥至在随后的研磨处理中，能够处理研磨成干燥粉末并进行顺利过筛，便可认为达到了上述定义中的“干燥”。例如，当芜菁根中的水分质量含量小于5%，例如小于4%、小于3%、小于2%或小于1%均可认为达到干燥状态。
在本发明的所述方法中，所述步骤B中的盐酸水溶液的pH为3-5，非限定性地，pH可为3、3.5、4、4.5或5。
其中，所述盐酸水溶液的用量并没有特别的限定，只要其能够将芜菁根粉末润湿即可，例如盐酸水溶液与芜菁根粉末的质量比可为1:3-9，非限定性地例如可为1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8或1:9。
在本发明的所述方法中，所述步骤B中的提取剂为1-丁基-1-甲基吡咯烷四氟硼酸盐、1-丁基-1-甲基吡咯烷氯化盐、1-丁基-1-甲基吡咯烷溴化盐、1-丁基-1-甲基吡咯烷硝酸盐或1-丁基-1-甲基吡咯烷六氟磷酸盐中的任意一种，更优选1-丁基-1-甲基吡咯烷氯化盐、1-丁基-1-甲基吡咯烷溴化盐中的任意一种。本发明人创造性地采用吡咯烷盐替代常规的有机溶剂，实现了目标成分的有效提取，其避免了有机溶剂对环境的污染，符合当前绿色化工的要求，同时兼具提取率高地优点，具备规模化推广的潜力。
在本发明的所述方法中，步骤B中的芜菁根粉末与所述提取剂的重量比为1:8-15，非限定性地可为1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14或1:15。在本发明提取剂用量的最优选择应兼顾目标物的提取率和提取的成本，在大量探究实验的基础上得到芜菁根粉末与提取剂重量比更优选1:10-12。
在本发明的所述方法中，所述步骤B中的助剂为非离子表面活性剂，优选为脂肪醇聚氧乙烯醚，更优选为月桂醇聚氧乙烯(7)醚、十四醇聚氧乙烯(6)醚、十六醇聚氧乙烯(8)醚中的任意一种；所述步骤B中提取助剂的重量为提取剂重量的1-10%，优选2-8%，更优选4-6%。本发明人发现通过使用非离子表面活性剂作为提取助剂，可促使提取中形成合适的分子空穴，增强了目标分子的溶出效果，从而进一步提高了目标成分的提取率和物料利用率。
在本发明的所述方法中，所述步骤B中的微波预处理条件为：微波功率为200-250W，优选220W，处理时间为5-10min，优选为7min。本发明人采用微波预处理的方式可促进植物纤维素、木质素等的腐败和细胞破壁，有利于提取目标组分的溢出而增强提取的效果。
在本发明的所述方法中，所述步骤B中的微波提取条件为：微波功率为300-400W，优选350W，提取时间为15-30min。
在本发明的所述方法中，所述步骤B中的微波后处理条件为：微波功率为500-600W，优选550W，提取时间为30-90秒，优选为45-60秒。本发明采用微波处理提取物的后处理模式，通过电磁波促进提取物中的杂质的结构变化而易于跟目标物分离，从而有助于后续粗品的分离和纯化。
在本发明的所述方法中，所述步骤C中，粗品与固定相和流动相组成的混合溶剂的质量体积比为3-12mg/ml(即每1ml混合溶剂溶解3-12mg粗品)，非限定性地例如可为3mg/ml、5mg/ml、7mg/ml、9mg/ml、10mg/ml或12mg/ml。
其中，为了得到需要量的纯品，可连续多次进行该分离纯化步骤。
在本发明的所述方法中，所述步骤C中，所述主机的转速为800-1000rpm，优选850-950rpm，更优选900rpm；所述流动相流速为1-3mL/min，优选1.5mL/min。
在本发明的所述方法中，所得最终产物的纯度可通过HPLC进行检测，所述HPLC检测可采用现有技术中的常规方法。
与现有技术相比，本发明带来的有益效果是：
1、本发明最大程度的利用了微波辅助提取工艺，发挥微波特有的破坏植物组织、电磁加热提取以及微波定型除杂等功能，有效地增加了目标物的溶出率、缩短了提取时间。
2、本发明首次筛选出合适固定相和流动相以采用高效逆流色谱法实现了4-(甲酰基-5-羟甲基-1-氢-吡咯-1-基)丁酸的分离纯化，具有高效、快速、样品无污染、可大量制备分离等优点。
3、本发明筛选出合适的吡咯烷盐用作常规溶剂的替代品，改善了常规提取效率低下的弊端，同时具有绿色环保的优势。
4、本发明采用非离子型表面活性剂作为提取助剂，有效发挥了其独特的增溶性能，与提取剂协同作用，加速了提取进程。
本发明人通过大量的创造性劳动，开发了一种从芜菁根中高效、快速提取植物有效成分的方法，实现了4-(甲酰基-5-羟甲基-1-氢-吡咯-1-基)丁酸的高效提取分离，大幅提高了物料的利用率，具有绿色环保、适宜大规模生产的优点，具有广阔的市场前景和工业应用价值。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明，但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。
实施例1
A、备料
取芜菁根，水洗、自然晾干后，脱水干燥至水分质量含量小于1%，再粉碎、研磨后过80目筛，得到芜菁根粉末。
B、提取
取0.1kg芜菁根粉末置于工业微波提取釜中，向釜中加入pH=4的盐酸水溶液润湿粉末(盐酸水溶液与芜菁根粉末的质量比为1:9)并搅拌均匀，然后进行微波辐射预处理7min，微波功率220W；预处理结束后，再向其中加入1kg提取剂，提取剂种类见下表1，混合均匀后，再加入50g助剂月桂醇聚氧乙烯(7)醚，于室温下直接微波提取20min，微波功率为350W，然后过滤分离得提取液；经真空浓缩后，冷冻干燥，将干燥所得提取物置于微波釜中继续后处理45秒，微波功率为550W，得到粗品。
C、分离
高速逆流色谱固定相和流动相的制备步骤：按照比例将石油醚、乙腈和水混合并振荡均匀，静置分层，上层作为固定相，下层作为流动相，两相各进行超声脱气处理25min，其中石油醚、乙腈和水的体积比为2.5:5:1。
高速逆流色谱分离的具体步骤：首先将固定相泵入高速逆流色谱的色谱柱中，使其充满整个色谱柱，然后开启高速逆流色谱，调整主机转速为900rpm，以1.5mL/min的流速将流动相泵入色谱柱中，待两相达到动态平衡后，取400mg粗品溶解在50ml体积比为1:1的固定相和流动相的混合溶剂中，得到样品溶液，将样品溶液通过进样阀进样，进样完毕后继续泵入流动相，用HPLC检测出峰位置，分步收集分离物，合并目标物，经浓缩脱溶、冻干得到纯品4-(2-甲酰基-5-羟甲基-1-氢-吡咯-1-基)丁酸。
采用MS法、HNMR法以及薄层色谱法测定直接分析鉴定提取产品，采用HPLC法分析产品纯度。
当总共处理步骤A中的500g干燥芜菁根粉末和步骤B中使用不同的提取剂时，最终所得目标物总量及纯度的结果如下表1所示：
表1
| 提取剂 | 目标物总量/mg | 目标物纯度(HPLC) |
| 1-丁基-1-甲基吡咯烷四氟硼酸盐 | 449.6 | 99.4% |
| 1-丁基-1-甲基吡咯烷氯化盐 | 461.2 | 99.6% |
| 1-丁基-1-甲基吡咯烷溴化盐 | 460.5 | 99.7% |
| 1-丁基-1-甲基吡咯烷硝酸盐 | 431.4 | 99.5% |
| 1-丁基-1-甲基吡咯烷六氟磷酸盐 | 395.8 | 99.3% |
| 三丁基铵氯化盐 | 283.9 | 98.2% |
| N-丁基吡啶溴化盐 | 295.7 | 98.1% |
| 甲醇 | 325.4 | 97.3% |
| 乙酸乙酯 | 337.8 | 98.4% |
由表1的结果可见，通过本发明的整体工艺可以显著提高目标物的提取率，同时纯度也有一定程度的提高，即使是采用有机溶剂为提取剂时也可取得较高的产品得率，而本发明人在此基础上筛选出吡咯烷盐作为更合适的提取剂相对其它盐(如季铵盐、吡啶盐等)大幅提高了产品收率，取得了意想不到的技术效果。
实施例2
A、备料
取芜菁根，水洗、自然晾干后，脱水干燥至水分质量含量小于2%，再粉碎、研磨后过70目筛，得到芜菁根粉末。
B、提取
取0.1kg芜菁根粉末置于工业微波提取釜中，向釜中加入pH=3的盐酸水溶液润湿粉末(盐酸水溶液与芜菁根粉末的质量比为1:8)并搅拌均匀，然后进行微波辐射预处理7min，微波功率220W；预处理结束后，再向其中加入1kg提取剂1-丁基-1-甲基吡咯烷氯化盐，混合均匀后，再加入60g助剂，助剂种类见下表2，于室温下直接微波提取15min，微波功率为350W，然后过滤分离得提取液；经真空浓缩后，冷冻干燥，将干燥所得提取物置于微波釜中继续后处理60秒，微波功率为550W，得到粗品。
C、分离
高速逆流色谱固定相和流动相的制备步骤：按照比例将石油醚、乙腈和水混合并振荡均匀，静置分层，上层作为固定相，下层作为流动相，两相各进行超声脱气处理25min，其中石油醚、乙腈和水的体积比为2.5:5:1。
高速逆流色谱分离的具体步骤：首先将固定相泵入高速逆流色谱的色谱柱中，使其充满整个色谱柱，然后开启高速逆流色谱，调整主机转速为900rpm，以1.5mL/min的流速将流动相泵入色谱柱中，待两相达到动态平衡后，取250mg粗品溶解在50ml体积比为1:1的固定相和流动相的混合溶剂中，得到样品溶液，将样品溶液通过进样阀进样，进样完毕后继续泵入流动相，用HPLC检测出峰位置，分步收集分离物，合并目标物，经浓缩脱溶、冻干得到纯品4-(2-甲酰基-5-羟甲基-1-氢-吡咯-1-基)丁酸。
采用MS法、HNMR法以及薄层色谱法测定直接分析鉴定提取产品，采用HPLC法分析产品纯度。
当总共处理步骤A中的500g干燥芜菁根粉末和步骤B中使用不同的提取助剂时，最终所得目标物总量及纯度的结果如下表2所示：
表2
| 助剂种类 | 目标物总量/mg | 目标物纯度(HPLC) |
| 月桂醇聚氧乙烯(7)醚 | 461.8 | 99.6% |
| 十四醇聚氧乙烯(6)醚 | 443.7 | 99.4% |
| 十六醇聚氧乙烯(8)醚 | 448.6 | 99.2% |
| 聚乙二醇400 | 325.9 | 99.1% |
| β-环糊精 | 367.9 | 98.4% |
| 18-冠-6 | 374.2 | 98.6% |
| -- | 275.7 | 98.2% |
“--”表示未加入提取助剂
由表2的结果可知，脂肪醇聚氧乙烯醚作为提取助剂能够发挥与提取剂的协同作用，从而有益改善提取收率，而传统的助剂如β-环糊精、18-冠-6、聚乙二醇400等均不能达到与其相同的技术效果。此外，本发明人尝试在无外加助剂时提取则表现出较低的提取率。由此可见，提取助剂的种类选择能够直接影响目标物的提取效果。
实施例3
A、备料
取芜菁根，水洗、自然晾干后，脱水干燥至水分质量含量小于1%，再粉碎、研磨后过90目筛，得到芜菁根粉末。
B、提取
取0.1kg芜菁根粉末置于工业微波提取釜中，向釜中加入pH=5的盐酸水溶液润湿粉末(盐酸水溶液与芜菁根粉末的质量比为1:7)并搅拌均匀，然后进行微波辐射预处理7min，微波功率220W；预处理结束后，再向其中加入提取剂1-丁基-1-甲基吡咯烷氯化盐，提取剂用量见下表3，混合均匀后，再加入45g助剂月桂醇聚氧乙烯(7)醚，于室温下直接微波提取20min，微波功率为350W，然后过滤分离得提取液；经真空浓缩后，冷冻干燥，将干燥所得提取物置于微波釜中继续后处理50秒，微波功率为550W，得到粗品。
C、分离
高速逆流色谱固定相和流动相的制备步骤：按照比例将石油醚、乙腈和水混合并振荡均匀，静置分层，上层作为固定相，下层作为流动相，两相各进行超声脱气处理20min，其中石油醚、乙腈和水的体积比为2.5:5:1。
高速逆流色谱分离的具体步骤：首先将固定相泵入高速逆流色谱的色谱柱中，使其充满整个色谱柱，然后开启高速逆流色谱，调整主机转速为900rpm，以1.5mL/min的流速将流动相泵入色谱柱中，待两相达到动态平衡后，取300mg粗品溶解在50ml体积比为1:1的固定相和流动相的混合溶剂中，得到样品溶液，将样品溶液通过进样阀进样，进样完毕后继续泵入流动相，用HPLC检测出峰位置，分步收集分离物，合并目标物，经浓缩脱溶、冻干得到纯品4-(2-甲酰基-5-羟甲基-1-氢-吡咯-1-基)丁酸。
采用MS法、HNMR法以及薄层色谱法测定直接分析鉴定提取产品，采用HPLC法分析产品纯度。
当总共处理步骤A中的500g干燥芜菁根粉末和步骤B中使用不同提取剂用量时的结果如下表3所示：
表3
| 提取剂用量(g) | 目标物总量/mg | 目标物纯度(HPLC) |
| 600 | 298.6 | 99.2% |
| 700 | 345.7 | 99.5% |
| 800 | 385.9 | 99.4% |
| 900 | 422.5 | 99.7% |
| 1000 | 462.4 | 99.6% |
| 1100 | 463.8 | 99.4% |
| 1200 | 462.7 | 99.5% |
| 1400 | 459.1 | 99.2% |
| 1500 | 446.5 | 99.3% |
实施例4
A、备料
取芜菁根，水洗、自然晾干后，脱水干燥至水分质量含量小于2%，再粉碎、研磨后过80目筛，得到芜菁根粉末。
B、提取
取0.1kg芜菁根粉末置于工业微波提取釜中，向釜中加入pH=4的盐酸水溶液润湿粉末(盐酸水溶液与芜菁根粉末的质量比为1:8)并搅拌均匀，然后进行微波辐射预处理7min，微波功率220W；预处理结束后，再向其中加入1kg提取剂1-丁基-1-甲基吡咯烷氯化盐，混合均匀后，再加入助剂月桂醇聚氧乙烯(7)醚，助剂用量见下表4，于室温下直接微波提取15min，微波功率为350W，然后过滤分离得提取液；经真空浓缩后，冷冻干燥，将干燥所得提取物置于微波釜中继续后处理60秒，微波功率为550W，得到粗品。
C、分离
高速逆流色谱固定相和流动相的制备步骤：按照比例将石油醚、乙腈和水混合并振荡均匀，静置分层，上层作为固定相，下层作为流动相，两相各进行超声脱气处理30min，其中石油醚、乙腈和水的体积比为2.5:5:1。
高速逆流色谱分离的具体步骤：首先将固定相泵入高速逆流色谱的色谱柱中，使其充满整个色谱柱，然后开启高速逆流色谱，调整主机转速为900rpm，以1.5mL/min的流速将流动相泵入色谱柱中，待两相达到动态平衡后，取500mg粗品溶解在50ml体积比为1:1的固定相和流动相的混合溶剂中，得到样品溶液，将样品溶液通过进样阀进样，进样完毕后继续泵入流动相，用HPLC检测出峰位置，分步收集分离物，合并目标物，经浓缩脱溶、冻干得到纯品4-(2-甲酰基-5-羟甲基-1-氢-吡咯-1-基)丁酸。
采用MS法、HNMR法以及薄层色谱法测定直接分析鉴定提取产品，采用HPLC法分析产品纯度。
当总共处理步骤A中的500g干燥芜菁根粉末和步骤B中使用不同提取助剂用量时的结果如下表4所示：
表4
| 提取助剂用量(g) | 目标物总量/mg | 目标物纯度(HPLC) |
| 30 | 394.7 | 99.3% |
| 40 | 426.3 | 99.7% |
| 50 | 463.1 | 99.6% |
| 60 | 460.7 | 98.8% |
| 70 | 453.7 | 99.1% |
| 80 | 422.6 | 98.9% |
表3和表4的结果显示，提取剂和提取助剂的用量均应控制在合适的范围，用量过少会致使提取收率的降低，用量过多会引起生产成本的增加，并且提取剂或助剂的用量并非愈大愈好。由表中可知用量过大可能会产生相反的效果，这可能是由于合适的提取剂/助剂的配比才能够保证复合溶剂分子空穴的大小合适，从而增容目标物而增加目标物的溶出率(即提取率)。
实施例5
1、除省略实施例1中的微波预处理步骤外，以实施例1的相同方式进行了实验探究，实验结果如下表5所示：
表5
| 提取剂 | 目标物总量/mg | 目标物纯度(HPLC) |
| 1-丁基-1-甲基吡咯烷四氟硼酸盐 | 416.6 | 99.4% |
| 1-丁基-1-甲基吡咯烷氯化盐 | 418.4 | 99.6% |
| 1-丁基-1-甲基吡咯烷溴化盐 | 420.5 | 99.7% |
| 1-丁基-1-甲基吡咯烷硝酸盐 | 409.8 | 99.5% |
2、除省略实施例1中的微波后处理步骤外，而以实施例1的相同方式进行了实验探究，实验结果如下表6所示：
表6
| 提取剂 | 目标物总量/mg | 目标物纯度(HPLC) |
| 1-丁基-1-甲基吡咯烷四氟硼酸盐 | 447.4 | 98.2% |
| 1-丁基-1-甲基吡咯烷氯化盐 | 457.6 | 98.4% |
| 1-丁基-1-甲基吡咯烷溴化盐 | 458.9 | 98.1% |
| 1-丁基-1-甲基吡咯烷硝酸盐 | 428.3 | 98.5% |
由上述结果表明，微波预处理工艺能有效破坏植物纤维组织和细胞组织，加速植物有效成分的溢出或溶出，在一定程度上增加了目标物的提取率。
而微波后处理步骤可通过电磁促使微量杂质组分变性而实现其易于与产品分离的目的，从而为制备高纯度的目标物提供了可行的渠道，可以在一定程度上提高最终产物的纯度。而当省略该步骤时，不但稍微降低了产物总量，而且在纯度上也有所降低，证明了该步骤能够提高产物总量和纯度。
本发明人通过前后两次微波步骤的创造性引入不仅能够更加完善整个提取工艺流程，而且产生了十分有益的效果。
3、考察微波提取的功率
A、备料
取芜菁根，水洗、自然晾干后，脱水干燥至水分质量含量小于1%，再粉碎、研磨后过70目筛，得到芜菁根粉末。
B、提取
取0.1kg芜菁根粉末置于工业微波提取釜中，向釜中加入pH=4的盐酸水溶液润湿粉末(盐酸水溶液与芜菁根粉末的质量比为1:9)并搅拌均匀，然后进行微波辐射预处理7min，微波功率220W；预处理结束后，再向其中加入1kg提取剂1-丁基-1-甲基吡咯烷氯化盐，混合均匀后，再加入50g月桂醇聚氧乙烯(7)醚，于室温下直接微波提取20min，微波功率见下表7，然后过滤分离得提取液；经真空浓缩后，冷冻干燥，将干燥所得提取物置于微波釜中继续后处理45秒，微波功率为550W，得到粗品。
C、分离
高速逆流色谱固定相和流动相的制备步骤：按照比例将石油醚、乙腈和水混合并振荡均匀，静置分层，上层作为固定相，下层作为流动相，两相各进行超声脱气处理25min，其中石油醚、乙腈和水的体积比为2.5:5:1。
高速逆流色谱分离的具体步骤：首先将固定相泵入高速逆流色谱的色谱柱中，使其充满整个色谱柱，然后开启高速逆流色谱，调整主机转速为900rpm，以1.5mL/min的流速将流动相泵入色谱柱中，待两相达到动态平衡后，取250mg粗品溶解在50ml体积比为1:1的固定相和流动相的混合溶剂中，得到样品溶液，将样品溶液通过进样阀进样，进样完毕后继续泵入流动相，用HPLC检测出峰位置，分步收集分离物，合并目标物，经浓缩脱溶、冻干得到纯品4-(2-甲酰基-5-羟甲基-1-氢-吡咯-1-基)丁酸。
采用MS法、HNMR法以及薄层色谱法测定直接分析鉴定提取产品，采用HPLC法分析产品纯度。
当总共处理步骤A中的500g干燥芜菁根粉末和使用不同的微波提取功率时，实验结果如下表7所示：
表7
| 微波功率(W) | 目标物总量/mg | 目标物纯度(HPLC) |
| 200 | 319.8 | 92.8% |
| 300 | 421.7 | 99.2% |
| 320 | 435.4 | 99.5% |
| 340 | 451.3 | 99.7% |
| 350 | 462.5 | 99.6% |
| 380 | 458.4 | 99.8% |
| 400 | 455.7 | 97.3% |
| 500 | 406.3 | 90.7% |
由上述的结果可知，提取时的微波功率优选在300-400W的范围内，功率过低电磁波不能提供足够的能量，会导致提取收率的降低；功率过高可能会导致细胞组织破坏后引起杂质增多或增加能源消耗。
在本发明的实施例1-5中，对所得产品经高分辨质谱和核磁共振氢谱，发现与现有技术中的记载一致，并通过与纯品的谱图对比而进行了结构的再次确定(得到了高纯度的4-(2-甲酰基-5-羟甲基-1-氢-吡咯-1-基)丁酸)，所得产品的核磁共振图谱和质谱如下：
1HNMR(CD3OD,600MHz)δ:9.41(1H,s),6.95(1H,d,J=4.2Hz),6.23(1H,d,J=4.2Hz),4.55(2H,s),4.31(3H,m),2.18(3H,t,J=7.2Hz),1.91(3H,dt,J=7.2Hz)。
MSm/z：210.08(M+1,100)。
综上所述，本发明提供了一种从芜菁根中高效提取药效成分的工艺，创造性地首次采用微波辅助提取和高效逆流色谱分离相结合的手段，充分发挥了微波特有的破坏植物组织、电磁加热以及微波定型除杂等功能，有效地增加了目标物的溶出率，并具有高效、快速、样品无污染、可大量制备分离等优点。同时，寻找出一种替代常规有机溶剂的提取剂，同时采用非离子型表面活性剂(脂肪醇聚氧乙烯醚)作为提取助剂，从而协同增效而大幅提高了提取收率。本发明任何的工艺参数选择和提取手段辅助配合获得了明显高于现有技术中的提取率和较短的提取时间等技术效果，具有广泛的工业化应用前景和市场前景。
应当理解，这些实施例的用途仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外，也应理解，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型，所有的这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种从芜菁根中提取药效成分的方法，所述方法包括如下步骤：
A、备料
取芜菁根，水洗、自然晾干后，脱水至干燥，再粉碎、研磨后过筛，得到芜菁根粉末；
B、提取
取芜菁根粉末置于微波提取釜中，向釜中加入盐酸水溶液润湿粉末，并搅拌均匀，然后进行微波辐射预处理；预处理结束后，再向其中加入提取剂，混合均匀后，再加入助剂，于室温下直接微波提取，然后过滤分离得提取液；经真空浓缩后，冷冻干燥，将所得干燥提取物置于微波釜中进行微波后处理，即得到粗品；
C、分离
高速逆流色谱固定相和流动相的制备步骤：按照比例将石油醚、乙腈和水混合并振荡均匀，静置分层，上层作为固定相，下层作为流动相，两相各进行超声脱气处理20-30min，其中石油醚、乙腈和水的体积比为2-3:4-7:1，优选2.5:5:1；
高速逆流色谱分离的具体步骤：首先将固定相泵入高速逆流色谱的色谱柱中，使其充满整个色谱柱，然后开启高速逆流色谱，调整主机转速，将流动相泵入色谱柱中，待两相达到动态平衡后，取步骤B所得的粗品溶解在体积比为1:1的固定相和流动相的混合溶剂中，得到样品溶液，将样品溶液通过进样阀进样，进样完毕后继续泵入流动相，用HPLC检测出峰位置，分步收集分离物，合并目标物，经浓缩脱溶、冻干得到纯品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤A中的芜菁根粉末的粒度为50-100目，优选70-90目。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤B中的芜菁根粉末与所述提取剂的重量比为1:8-15，优选1:10-12。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤B中的提取剂为1-丁基-1-甲基吡咯烷四氟硼酸盐、1-丁基-1-甲基吡咯烷氯化盐、1-丁基-1-甲基吡咯烷溴化盐、1-丁基-1-甲基吡咯烷硝酸盐或1-丁基-1-甲基吡咯烷六氟磷酸盐中的任意一种。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤B中的助剂为非离子表面活性剂，优选为脂肪醇聚氧乙烯醚；提取助剂的重量为提取剂重量的1-10%，优选为2-8%。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤B中的盐酸水溶液的pH为3-5；盐酸水溶液与芜菁根粉末的质量比为1:3-9。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤B中的微波预处理条件为：微波功率为200-250W，优选220W，处理时间为5-10min，优选为7min。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤B中的微波提取条件为：微波功率为300-400W，优选350W，提取时间为15-30min。
9.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤B中的微波后处理条件为：微波功率为500-600W，优选550W，提取时间为30-90秒，优选为45-60秒。
10.根据权利要求1-10任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤C中，粗品与固定相和流动相组成的混合溶剂的质量体积比为3-12mg/ml。
Priority Applications (1)
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| CN114470026B (zh) * | 2021-12-08 | 2024-02-02 | 湖南尔康制药股份有限公司 | 一种蔓菁膏的炮制方法 |
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