CN104910172B - 五种二苯乙烯三聚体的制备方法及其应用 - Google Patents

五种二苯乙烯三聚体的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

五种二苯乙烯三聚体的制备方法及其应用，以体外α‑葡萄糖苷酶抑制活性为导向，指导中药香附子的分离纯化过程，该制备方法包括：药材超声提取、硅胶柱层析分离、大孔树脂柱层析分离、凝胶柱层析分离、反相制备HPLC分离。经HR‑MS和NMR鉴定，该五种二苯乙烯三聚体为：(±)‑(E)‑cyperusphenol A、(E)‑mesocyperusphenol A、cyperusphenol C、cyperusphenol B、cyperusphenol D。另外，本发明首次公开了五种二苯乙烯三聚体化合物对α‑葡萄糖苷酶的抑制作用，以及其作为制备α‑葡萄糖苷酶抑制剂药物的应用。经药理实验证明，该五种二苯乙烯三聚体化合物均具有很强的体外α‑葡萄糖苷酶抑制活性，其活性较阳性对照药（阿卡波糖）强1000倍，较已知的二苯乙烯二聚体（scirpusin A和scirpusin B）强5‑10倍。

Description

五种二苯乙烯三聚体的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及化合物领域，尤其涉及五种二苯乙烯三聚体的制备方法及其作为制备α-葡萄糖苷酶抑制剂药物的应用。
背景技术
α-葡萄糖苷酶抑制剂（AGHI）是二十世纪八十年代出现的一类新的抗糖尿病药物，它能通过抑制小肠上皮绒毛膜上的α-葡萄糖苷酶的作用来延缓碳水化合物的消化，进而有效推迟糖尿病人餐后血糖升高的时间及进程，降低糖尿病风险。目前，以阿卡波糖，伏格列波糖为代表的AGHI已成为治疗Ⅱ型糖尿病的一线药物，也可作为治疗Ⅰ型糖尿病的辅助药物。然而，由于这些人工合成的AGHI具有的一些较为明显的副作用（N.Engl.J.Med.,2007,356,1499-1501.），如肝脏疾病，肠胃气胀，腹部痉挛等，因此，人们在过去的二十年中一直试图从动植物和食品中去寻找毒副作用较小的天然AGHI。
可以预见的是，随着老龄化社会的到来，我国的糖尿病发病率越来越高，并且我国以及东南亚地区饮食习惯以碳水化合物为主，因此，开发高效、低毒的AGHI具有巨大的经济效益和社会效益。我国中药资源丰富，许多药材均已被长期的临床实践证明具有较好的降糖作用，将这些具有确切降糖疗效的中药材进行深入系统的活性成分筛选研究，开发出新的高效、低毒的AGHI的可能性将会比传统的“盲筛”要大得多。
基于上述分析，我们对临床常用的31种具有降糖作用的中药材进行了体外α-葡萄糖苷酶（AGH）抑制活性初筛，结果表明，槐米、甘草、僵蚕、香附子等药材醇提物对AGH具有很高的抑制活性，尤以香附子活性为最强，因此我们对香附子的AGHI进行了深入的研究。
香附子为莎草科植物莎草（Cyperus rotundus L.）的干燥根茎，辛、微苦、微甘，平；归肝、脾、三焦经；具有行气解郁、调经止痛的功效，为中医临床的常用中药。药理研究表明，香附子具有抗炎、降血糖、抗血小板、保护神经系统、抗过敏反应等作用。Raut NA等发现（Fitoterapia,2006,77,585-588.）香附子水醇提取物能有效降低四氧嘧啶诱导的糖尿病大鼠的血糖；Ardestani A等发现（Int.J Biol. Macromol.,2007,41,572-578.）不同浓度的香附子水醇提取物（25-250μg/mL）能显著抑制晚期糖基化终产物（AGES）的形成。由此可见，香附子的确具备治疗糖尿病的潜力。Tran HHT等（Pharm.Biol.,2014,52,74-77.）采用常规系统分离方法，从香附子中分离出了三种二苯乙烯二聚体化合物（cassigarol E,scirpusin A、scirpusin B），具有一定的AGH抑制活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以体外α-葡萄糖苷酶抑制活性为导向、化学分离与活性评价同步进行的二苯乙烯三聚体化合物的制备方法及其作为制备α-葡萄糖苷酶抑制剂药物的应用。
为实现本发明的上述目的，本发明提供五种二苯乙烯三聚体化合物的制备方法，包括如下步骤。
步骤1、药材超声提取：将香附子粉末用80%甲醇冷浸后超声提取，所得提取物用水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别得到石油醚提取部位、乙酸乙酯提取部位及正丁醇提取部位；将各提取部位分别制成不同浓度的DMSO溶液，进行体外AGH抑制活性检测，确定乙酸乙酯活性部位活性最强。
步骤2、硅胶柱层析分离：所述乙酸乙酯提取部位采用硅胶常压层析分离，分别用不同比例的石油醚、二氯甲烷、甲醇混合溶剂梯度洗脱，所述二氯甲烷与甲醇的体积比分别为9:1、7:3、5:5；然后分别收集各洗脱液，减压浓缩回收溶剂，得各提取部位；将各提取部位分别制成不同浓度的DMSO溶液，进行体外AGH抑制活性检测，确定二氯甲烷与甲醇的体积比为7:3的提取部位活性最强。
步骤3、大孔树脂柱层析分离：将步骤2中所得活性最强部位用HPD101型大孔吸附树脂分离，分别用40%甲醇水溶液、60%甲醇水溶液、80%甲醇水溶液、100%甲醇梯度洗脱；分别收集各洗脱液，减压浓缩回收溶剂，得各提取部位；将各提取部位分别制成不同浓度的DMSO溶液，进行体外AGH抑制活性检测，确定60%甲醇水溶液的提取部位活性最强。
步骤4、凝胶柱层析分离：将步骤3中所得活性最强部位用Sephadex LH-20凝胶纯化分离，甲醇洗脱，流速控制为30mL/h，每0.25个柱体积（即0.25BV）收集一次，共收集洗脱液4BV；将各洗脱液进行体外AGH抑制活性检测，确定2.25-3.25 BV洗脱部位活性最强。
步骤5、反相制备HPLC分离：将步骤4中所得活性最强洗脱部位采用反相制备型高效液相色谱进行纯化，40%甲醇-60%水溶液等度洗脱，分别收集保留时间为8.1 min、10.6min、11.9 min、17.7 min和19.6 min的流份，冷冻干燥后分别得到纯度大于95%的五种二苯乙烯三聚体化合物。
所述保留时间为8.1min的流份冷冻干燥后得到(±)-(E)-cyperusphenol A，即化合物1；所述保留时间为10.6 min的流份冷冻干燥后得到cyperusphenol B，即化合物2；所述保留时间为11.9 min的流份冷冻干燥后得到cyperusphenol D，即化合物3；所述保留时间为17.7 min的流份冷冻干燥后得到(E)-mesocyperusphenol A，即化合物4；所述保留时间为19.6min的流份冷冻干燥后得到cyperusphenol C，即化合物5。
所述五种二苯乙烯三聚体化合物（即化合物1-5）的结构式分别依次如下所示。
本发明还提供五种二苯乙烯三聚体化合物作为制备α-葡萄糖苷酶抑制剂药物的应用，可用于防治Ⅱ型糖尿病。
与现有技术相比本发明的有益效果。
本发明提供的五种二苯乙烯三聚体的制备方法，以对硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷为底物的酶-抑制药的体外筛选模型为活性指导，经硅胶、大孔树脂、凝胶的初步柱分离后，以制备型高效液相色谱为主要分离手段，通过一步高效液相制备，可同时直接获得纯度大于95%的五种二苯乙烯三聚体。并且，以体外AGH抑制活性为导向，首次将体外AGH抑制活性检测与香附子有效成分分离相结合，避免了香附子的常规系统分离法中存在的工作量大、周期长、过程繁琐等不足，具有目标明确、经济环保等优点。该制备方法能有效减少分离工作的盲目性，省去了一些不必要的分离制备过程，实现了化学分离与活性评价的同步进行。除此之外，以制备型高效液相色谱同时制备五种二苯乙烯三聚体具有分离制备工艺简单、分离过程快速省时、制备产品纯度高、原料充分利用的特点。另外，本发明首次公开了五种二苯乙烯三聚体化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，以及其作为制备α-葡萄糖苷酶抑制剂药物的应用。该二苯乙烯三聚体化合物AGH抑制活性比二苯乙烯二聚体（Scirpusins A、Scirpusins B）强约5-10倍，比阳性对照药（阿卡波糖）强1000倍，是一类AGH强效抑制剂。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步详细说明本发明。
本实施例提供的五种二苯乙烯三聚体化合物（即化合物1-5）的制备方法，包括如下步骤。
步骤1、药材超声提取：将香附子药材（购于大连市阳光大药房）粉碎，取粉末240g，用2500mL的80%甲醇冷浸24h后超声提取3次，每次1h，合并三次提取液，减压回收得到提取物总浸膏25.5g。然后用300mL的水分散，再依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，分别合并各萃取液，减压浓缩回收溶剂，分别得到石油醚提取部位、乙酸乙酯提取部位、正丁醇提取部位。将石油醚提取部位、乙酸乙酯提取部位、正丁醇提取部位分别制成3.0mg/mL与0.3mg/mL的DMSO溶液，各取20μL进行体外AGH抑制活性检测，得到活性最强的乙酸乙酯活性部位5.4g。
步骤2、硅胶柱层析分离：取乙酸乙酯活性部位浸膏5g，少量乙酸乙酯溶解，湿法上样，硅胶常压层析（40×2.5cm）分离，柱体积120mL；分别用3倍柱体积（BV）的石油醚、二氯甲烷、甲醇混合溶剂梯度洗脱，所述二氯甲烷与甲醇的体积比分别为9:1、7:3、5:5，然后分别收集各洗脱液，减压浓缩回收溶剂，得各提取部位；将各部位分别制成300μg/mL与30μg/mL的DMSO溶液，各取20μL进行体外AGH抑制活性检测，得到活性最强的二氯甲烷与甲醇的体积比为7:3的部位0.7g。
步骤3、大孔树脂柱层析分离：将步骤2中所得活性最强部位用4mL 40%甲醇溶解，15000rpm离心，取上清液0.44g，HPD101型大孔吸附树脂柱（40×2.5cm）分离，柱体积30mL；分别用5BV的40%甲醇水溶液、60%甲醇水溶液、80%甲醇水溶液、100%甲醇梯度洗脱，分别收集各洗脱液，减压浓缩回收溶剂，得各提取部位；将各提取部位分别制成300μg/mL与30μg/mL的DMSO溶液，各取20μL进行体外AGH抑制活性跟踪检测，得到活性最强的60%甲醇水溶液的部位0.21g。
步骤4、凝胶柱层析分离：将步骤3中所得活性最强部位用3mL甲醇溶解，SephadexLH-20凝胶柱（80×1cm）纯化分离，柱体积60mL，洗脱溶剂为纯甲醇，流速控制为30mL/h，每0.25个柱体积（即0.25BV）收集一次，共收集洗脱液4BV；将各管洗脱液各取20μL，直接进行体外AGH抑制活性检测，得到活性最强的2.25-3.25 BV洗脱部位0.12g。
步骤5、反相制备HPLC分离：将步骤4中所得活性最强洗脱部位采用反相制备型高效液相色谱进行纯化，色谱柱：Chromatorex C18（2cm×25cm，5μm）；流动相：40%甲醇-60%水溶液，等度洗脱；检测波长：212nm；样品：将步骤4中所得活性最强部位用40%甲醇溶解成25mg/mL的供试品溶液，分若干次全部进样。在上述条件下，分别收集保留时间为8.1min、10.6min、11.9min、17.7min和19.6min的流份，冷冻干燥后分别得到纯度大于95%的化合物1（7.44mg）、化合物2（3.61mg）、化合物3（6.37mg）、化合物4（15.95mg）、化合物5（6.10mg）。
所述化合物1的理化性质数据为：淡黄色固体粉末，HR-ESI-MS(m/z):711.1881[M-H]-，经计算分子式为C42H32O11。所述化合物1的NMR光谱数据与文献（PhytochemistryLetters,2012,5(2):267-270.）中记载的(±)-(E)-cyperusphenol A的NMR光谱数据一致，证实化合物1为式1所示的(±)-(E)-cyperusphenol A。
所述化合物2的理化性质数据为：灰白色固体粉末，HR-ESI-MS(m/z): 727.1795[M-H]-，经计算分子式为C42H32O12。化合物2的NMR光谱数据与文献（Fitoterapia,2012,83(8):1420-1429.）中记载的cyperusphenol B的NMR光谱数据一致，证实化合物2为式2所示的cyperusphenol B。
所述化合物3的理化性质数据为：淡黄色固体粉末，HR-ESI-MS(m/z): 725.1662[M-H]-，经计算分子式为C42H30O12。化合物3的NMR光谱数据与文献（Fitoterapia,2012,83(8):1420-1429.）中记载的cyperusphenol D的NMR光谱数据一致，证实化合物3为式3所示的cyperusphenol D。
所述化合物4的理化性质数据为：淡黄色固体粉末，HR-ESI-MS(m/z):711.1881[M-H]-，经计算分子式为C42H32O11。所述化合物4的NMR光谱数据与文献（PhytochemistryLetters,2012,5(2):267-270.）中记载的(E)-mesocyperusphenol A的NMR光谱数据一致，证实化合物4为式4所示的(E)-mesocyperusphenol A。
所述化合物5的理化性质数据为：灰白色固体粉末，HR-ESI-MS(m/z): 711.1881[M-H]-，经计算分子式为C42H32O11。所述化合物5的NMR光谱数据与文献（Fitoterapia,2012,83(8):1420-1429.）中记载的cyperusphenol C的NMR光谱数据一致，证实化合物5为式5所示的cyperusphenol C。
为进一步验证本发明的有益效果，本实施例对化合物1-5、阳性对照（阿卡波糖）、二苯乙烯二聚体（Scirpusins A、Scirpusins B）及分离过程中各活性部位进行AGH抑制实验。
采用对硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）为底物的酶-抑制药筛选模型进行活性筛选。将0.48 mL磷酸缓冲液（67 mM，pH 6.8），0.02 mL谷胱甘肽（3 mM），0.05mL PNPG（10mM）和0.02mL待测样品溶液混合均匀后于37℃孵育10min，然后加入0.02mLα-葡萄糖苷酶（0.3U/mL）混合均匀后于37℃孵育20min。所有的试剂均用磷酸缓冲液（67mM，pH6.8）配制。酶解反应用2.4 mL碳酸钠水溶液（100 mM）终止，随即于410nm波长下检测吸光度（AS）。
对照样品配制方法与上述相同，仅将待测样品溶液替换为磷酸缓冲液。
空白样品和空白对照的配制方法也基本与上述相同，仅分别将样品和对照样品中的α-葡萄糖苷酶溶液替换为磷酸缓冲液即可。样品抑制活性（%）计算公式为：抑制率（%）=100%×[(AS-ASB)/(AC-ACB)]。
其中，AS、ASB、AC及ACB分别代表样品、空白样品、对照样品和空白对照组的吸光度。所有数据重复测定三次。
化合物1-5、阳性对照（阿卡波糖）、二苯乙烯二聚体（Scirpusins A、ScirpusinsB）及分离过程中各活性部位的AGH抑制活性如表1-表5所示。
表1：化合物1-5、阳性对照及二苯乙烯二聚体的AGH抑制活性（均值±标准差）。
化合物名称 IC50(ug/mL)
化合物1 (±)-(E)-cyperusphenol A 1.02±0.06
化合物2 (E)-mesocyperusphenol A 1.16±0.11
化合物3 cyperusphenol B 0.62±0.09
化合物4 cyperusphenol C 1.19±0.20
化合物5 Cyperusphenol D 1.20±0.11
二苯乙烯二聚体 Scirpusins A 9.85±0.80
二苯乙烯二聚体 Scirpusins B 6.21±0.22
阳性对照 阿卡波糖 1081±133
由表1可知，本实施例二苯乙烯三聚体化合物AGH抑制活性比二苯乙烯二聚体（Scirpusins A、Scirpusins B）强约5-10倍，比阳性对照药（阿卡波糖）强1000倍，是一类AGH强效抑制剂。
表2：分离步骤1中各部位的AGH抑制活性。
AGH抑制百分率（%） AGH抑制百分率（%）
100 ug/mL 10 ug/mL
石油醚提取部位 95.5 82.6
乙酸乙酯提取部位 98.3 91.7
正丁醇提取部位 40.0 22.6
表3：分离步骤2中各部位的AGH抑制活性。
AGH抑制百分率（%） AGH抑制百分率（%）
10 ug/mL 1 ug/mL
石油醚提取部位 53.6 12.5
二氯甲烷提取部位 64.2 27.8
二氯甲烷：甲醇=9:1部位 80.7 75.3
二氯甲烷：甲醇=7:3部位 98.2 92.9
二氯甲烷：甲醇=5:5部位 87.0 72.2
表4：分离步骤3中各部位的AGH抑制活性。
AGH抑制百分率（%） AGH抑制百分率（%）
10 ug/mL 1 ug/mL
40%甲醇水部位 59.9 45.2
60%甲醇水部位 94.3 91.2
80%甲醇水部位 89.1 73.8
100%甲醇部位 69.2 46.7
表5：分离步骤4中各部位的AGH抑制活性。
AGH抑制百分率（%） AGH抑制百分率（%）
0.25BV 5.3 2.25BV 36.7
0.5BV 3.6 2.5BV 42.3
0.75BV 10.1 2.75BV 40.9
1BV 8.3 3BV 44.1
1.25BV 15.4 3.25BV 34.0
1.5BV 6.7 3.5BV 20.5
1.75BV 8.8 3.75BV 14.6
2BV 18.9 4BV 6.8
由表2-表5可知，分离步骤1中乙酸乙酯提取部位的活性最强，分离步骤2中二氯甲烷与甲醇的体积比为7:3的提取部位活性最强，分离步骤3中60%甲醇水溶液的提取部位活性最强，分离步骤4中2.25-3.25 BV洗脱部位的活性最强。

Claims (6)

1.五种二苯乙烯三聚体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、药材超声提取：将香附子粉末用80%甲醇冷浸后超声提取，所得提取物用水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到各提取部位；将各提取部位分别制成不同浓度的DMSO溶液，进行体外AGH抑制活性检测，确定乙酸乙酯提取部位活性最强；
步骤2、硅胶柱层析分离：所述乙酸乙酯提取部位采用硅胶常压层析分离，分别用不同比例的石油醚、二氯甲烷、甲醇混合溶剂梯度洗脱；然后分别收集各洗脱液，减压浓缩回收溶剂，得各提取部位；将各提取部位分别制成不同浓度的DMSO溶液，进行体外AGH抑制活性检测，确定活性最强的提取部位；
步骤3、大孔树脂柱层析分离：将步骤2中所得活性最强部位用HPD101型大孔吸附树脂分离，分别用不同比例的甲醇、水混合溶剂梯度洗脱；分别收集各洗脱液，减压浓缩回收溶剂，得各提取部位；将各提取部位分别制成不同浓度的DMSO溶液，进行体外AGH抑制活性检测，确定活性最强的提取部位；
步骤4、凝胶柱层析分离：将步骤3中所得活性最强部位用Sephadex LH-20凝胶纯化分离，甲醇洗脱，流速控制为30mL/h，每0.25个柱体积收集一次，共收集洗脱液4BV；将各洗脱液进行体外AGH抑制活性检测，确定2.25-3.25 BV洗脱部位活性最强；
步骤5、反相制备HPLC分离：将步骤4中所得活性最强洗脱部位采用反相制备型高效液相色谱进行纯化，40%甲醇-60%水溶液等度洗脱，分别收集保留时间为8.1 min、10.6 min、11.9 min、17.7 min和19.6 min的流份，冷冻干燥后分别得到纯度大于95%的五种二苯乙烯三聚体化合物；
所述的五种二苯乙烯三聚体的结构式分别为：
其中，所述保留时间为8.1min的流份冷冻干燥后得到(±)-(E)-cyperusphenol A；所述保留时间为10.6 min的流份冷冻干燥后得到cyperusphenol B；所述保留时间为11.9min的流份冷冻干燥后得到cyperusphenol D；所述保留时间为17.7 min的流份冷冻干燥后得到(E)-mesocyperusphenol A；所述保留时间为19.6min的流份冷冻干燥后得到cyperusphenol C。
2.如权利要求1所述的五种二苯乙烯三聚体的制备方法，其特征在于，所述步骤2中采用二氯甲烷与甲醇混合溶剂梯度洗脱，所述二氯甲烷与甲醇的体积比分别为9:1、7:3、5:5。
3.如权利要求2所述的五种二苯乙烯三聚体的制备方法，其特征在于，所述步骤2中二氯甲烷与甲醇的体积比为7:3的提取部位活性最强。
4.如权利要求1所述的五种二苯乙烯三聚体的制备方法，其特征在于，所述步骤3中不同比例的甲醇、水混合溶剂分别为：40%甲醇水溶液、60%甲醇水溶液、80%甲醇水溶液、100%甲醇。
5.如权利要求4所述的五种二苯乙烯三聚体的制备方法，其特征在于，所述60%甲醇水溶液的提取部位活性最强。
6.如权利要求1所述的五种二苯乙烯三聚体在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂药物中的应用。
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