一种黄槿中抗肿瘤有效部位的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种黄槿中抗肿瘤有效部位的制备方法及应用,属于医药生物技术领域。
背景技术
黄槿(Hibiscus tiliaceus)属锦葵科(Malvaceae)木槿属(Hibiscus),是一种具有重要生态、药用和观赏价值的半红树植物,广泛分布于中国、越南、柬埔寨、缅甸、印度、印度尼西亚、马来西亚、菲律宾及老挝等热带地区,我国主产于海南、广西、台湾、广东、福建等省,现已广泛种植栽培。据《全国中草药汇编》记载,黄槿具有清热止咳、解毒消肿等功效,在海南沿海居民地区作为药物用于毒蛇咬伤、痈疮肿毒、支气管炎等。因其既能在潮间带生存,并可在海滩上成为优势种,又能在陆地环境自然繁殖的两栖木本植物,具有重要的生态功能和独特的生境适应性,导致黄槿含有大量的结构新颖,特异性强,具有显著药用的活性分子。
1980年,国外学者从黄槿中发现报道了12个Furanosteroid族倍半萜类化合物。近40年间,国外学者对黄槿中该类化合物的报道较少。而国内学者对黄槿的化学成分研究较为肤浅,仅从中得到少量三萜、甾体类、苯丙素、黄酮、酰胺类等化学成分。在药理活性研究方面,国外的研究报道较少,而国内仅简单的针对黄槿提取物进行筛选,发现黄槿具有抗炎、镇痛、抗肿瘤、抗氧化等药理活性。在有效成分的提取工艺方面,尚且缺乏一种可同时提取多种有效成分的方法。
发明内容
本发明提供一种黄槿中抗肿瘤有效部位的制备方法及应用。
本发明采取的技术方案如下:
一种黄槿中抗肿瘤有效部位的制备方法,包括以下步骤:
(1)取黄槿药材树干,粉碎;
(2)使用有机溶剂加热回流或冷浸提取;所述有机溶剂为二氯甲烷或丙酮;
(3)过滤得到黄槿总提取液,减压浓缩至流体膏状物密度为0.9~1.2g/ml,得总浸膏;
(4)取所得总浸膏,使用硅胶干法拌样,待有机溶剂挥发干后,磨细,使用硅胶柱层析,以石油醚为洗脱剂,得到石油醚部位,再使用二氯甲烷-甲醇为洗脱剂,洗脱3~10个柱体积至红色变浅为止,收集洗脱液;
(5)使用大孔吸附树脂洗脱,以体积分数70~90%的乙醇溶液为洗脱剂,收集洗脱液,减压浓缩,真空冷冻干燥,获得干粉状有效部位。
优选的,二氯甲烷-甲醇的体积比为(38~42):1。
优选的,所述大孔吸附树脂为D101、D201和D411型大孔吸附树脂,三者质量比为(4~5):1:(1~2)。
优选的,回流时间为6~12h,回流提取3次,冷浸提取时间为24h,冷浸提取3次。
优选的,步骤(5)中,去除体积分数70%乙醇溶液洗脱后的洗脱液,收集体积分数80~90%乙醇溶液洗脱后的洗脱液;洗脱速度为1.8~2mL/min,洗脱时间1.5~2h。
本发明分析确定,通过本发明方法所得黄槿中抗肿瘤有效部位的主要成分为Hibiscone A、Hibiscone B和Hibiscone C,三者的化合物结构如下所示:
检测结果显示:有效部位中Hibiscone A、Hibiscone B和Hibiscone C的质量比为(4.2~5.8):(2.1~3.7):(70.3~77.6)。
本发明还对所得黄槿有效部位进行药效学研究,结果显示该有效部位对肝癌细胞、腹水瘤细胞、肺腺癌细胞、宫颈癌细胞或胃腺癌细胞等具有抑制作用,特别是对小鼠肝癌细胞H22具有明显抑制作用,提示本发明有效部位具有抗肿瘤活性。
基于药效学研究结果,本发明所得有效部位可在制备预防或治疗肿瘤疾病的药物中应用,或在制备预防肿瘤疾病的保健品中的应用。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
A.采用本发明方法,经过一系列的提取富集工艺步骤获得显著抗肿瘤活性的有效部位。所得有效部位中杂质明显减少,UPLC检测结果显示药效物质的含量达70%以上,符合国家五类新药规定的50%的含量标准。
B.本发明的黄槿有效部位原料来源丰富、价廉,制备方法简单,采用低极性溶剂充分萃取,使黄槿中的抗肿瘤活性物质富集,易于操作,成本低廉。
C.该有效部位在预防或治疗肿瘤疾病药物或保健品中具有重要用途。
附图说明
图1:黄槿有效部位和黄槿提取物的UPLC检测结果图。
图2:各组样品对H22荷瘤小鼠肿瘤形态体积的影响结果图。
图3:各组样品对H22荷瘤小鼠瘤重的影响结果图。
图4:各组样品对H22荷瘤小鼠肿瘤增殖率的影响结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1:
一种黄槿中抗肿瘤有效部位的制备方法,包括以下步骤:
(1)取黄槿药材树干,阴干,去除杂木;将黄槿药材切成小段,粉碎成0.5~2cm;
(2)使用有机溶剂(二氯甲烷)加热回流6~12h,回流提取3次;
(3)过滤得到黄槿总提取液,减压浓缩至流体膏状物密度为0.9g/ml,得总浸膏;
(4)取所得总浸膏,使用硅胶干法拌样,待有机溶剂挥发干后,磨细,使用硅胶(200-300目)柱层析,以石油醚为洗脱剂,洗脱3个柱体积得到石油醚部位,再使用二氯甲烷-甲醇(40:1)为洗脱剂,洗脱3~10个柱体积至红色变浅为止,收集洗脱液;
(5)使用大孔吸附树脂(D101)洗脱,分别以70%乙醇溶液和90%乙醇溶液为洗脱剂(每种洗脱剂洗脱3个柱体积),去除70%乙醇溶液洗脱后的洗脱液,收集90%乙醇溶液洗脱后的洗脱液,减压浓缩,真空冷冻干燥,获得干粉状有效部位。
实施例2:
一种黄槿中抗肿瘤有效部位的制备方法,包括以下步骤:
(1)取黄槿药材树干,阴干,去除杂木;将黄槿药材切成小段,粉碎成0.5~2cm;
(2)使用有机溶剂(丙酮)冷浸提取24h,提取3次;
(3)过滤得到黄槿总提取液,减压浓缩至流体膏状物密度为1.2g/ml,得总浸膏;
(4)将所得总浸膏,使用硅胶干法拌样,待有机溶剂挥发干后,磨细,使用硅胶(200-300目)柱层析,以石油醚为洗脱剂,洗脱10个柱体积得到石油醚部位,再使用二氯甲烷-甲醇(40:1)为洗脱剂,洗脱3~10个柱体积至红色变浅为止,收集洗脱液;
(5)使用大孔吸附树脂洗脱(D101),分别以70%乙醇溶液和80%乙醇溶液为洗脱剂(每种洗脱剂洗脱5个柱体积),去除70%乙醇溶液洗脱后的洗脱液,收集80%乙醇溶液洗脱后的洗脱液,减压浓缩,真空冷冻干燥,获得干粉状有效部位。
实施例3
实施例3与实施例2的主要区别是:
步骤(5)中,进行大孔吸附树脂洗脱时,色谱柱中依序装填D101、D201和D411型大孔吸附树脂(质量比为4:1:2)。
实施例4
实施例4与实施例2的主要区别是:
步骤(5)中,进行大孔吸附树脂洗脱时,色谱柱中依序装填D101、D201和D411型大孔吸附树脂(质量比为5:1:1)。
对比例1
将黄槿替换为白木,制备方法与实施例1相同。
取实施例制备所得有效部位,以及对比例1制备所得提取物,进行UPLC检测,结果见图1和表1。
表1
UPLC检测结果显示,通过富集工艺制备后,有效部位中杂质明显减少,有效成分的含量显著提高,达70%以上。其中,有效部位中Hibiscone B含量为2.1~3.7%,HibisconeC含量为70.3~77.6%,Hibiscone A含量为4.2~5.8%。
试验例1:黄槿有效部位抗肿瘤活性药效学研究-体外细胞实验
取实施例制备所得有效部位,以及对比例1制备所得提取物,参考文献报道的MTT法进行抗肿瘤细胞毒活性试验,结果见表2。
表2黄槿有效部位与白木提取物抗肿瘤细胞毒活性
结果显示:本发明所得有效部位可抑制肿瘤细胞增殖,其中,对H22细胞表现出最强的抗增殖活性,且对H22细胞的抗增殖活性(IC50=7.4~8.1μg/ml)优于对MGC细胞的抗增殖活性(IC50=31.9~42.2μg/ml),体现出一定的选择性。
试验例2:黄槿有效部位抗肿瘤活性药效学研究-体内动物实验
一、实验材料
实验动物:ICR小鼠,体重18~22g,雌雄各半;
细胞株:小鼠肝癌细胞H22;
去甲斑蝥素,华北制药股份有限公司,批号:FAX1607002,人每次口服5~15mg,每日3次;
1640培养基,胎牛血清,GIBCO。
二、实验方法
H22细胞经液氮中取出,离心弃去上层冻存液,加完全1640培养基重悬细胞,CO2培养箱中37℃,CO2浓度5%培养。传代3次后,离心收集细胞,使用生理盐水重悬细胞细胞计数仪测定细胞密度,加入适量生理盐水稀释细胞密度为100万个/mL,进行小鼠腹腔传代,每只小鼠腹腔注射0.2毫升每只。5~7天后,处死小鼠,取腹水离心,重复上述体内传代过程3次(第一次实验,受寒假影响,体内传代2次)。取小鼠腹水离心收集细胞,生理盐水重悬调节密度为1000万个/mL。每只小鼠腋下靠近背部皮下注射0.2mL。次日开始给药,连续给药10天。
三、给药剂量
小鼠分为模型组、阳性对照组和受试药(实施例1所得有效部位)高、中、低剂量组。模型组给予等体积赋形剂,第一次实验使用食用油溶解药物,第二次实验使用0.5%羧甲基纤维素钠。阳性对照药给药小鼠去甲斑蝥素,2片研磨碎,加CMC-Na混悬体积50毫升。每只小鼠给予0.2毫升每10克体重,相当于人每日口服30mg。受试药物给药剂量为0.1、0.07、0.035、0.0175g/kg。
四、实验结果
结果见图2-4,结果显示:黄槿提取物有效部位在35~100mg/kg剂量范围内能够明显抑制肿瘤增殖作用,且70~100mg/kg剂量范围内相对肿瘤增殖率≤40%,符合国家抗肿瘤药物活性指标。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明,不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干简单推演或替换。