JP2000511928A

JP2000511928A - フィラントゥスウスリエンシスおよび／またはフィラントゥスウリナリアの抽出物を含むｂ型肝炎治療用医薬組成物

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Publication number: JP2000511928A
Application number: JP10510601A
Authority: JP
Inventors: チュン，タイ・ホ
Original assignee: ヘパガード・カンパニー・リミテッド
Priority date: 1996-08-16
Filing date: 1996-08-16
Publication date: 2000-09-12
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Also published as: GB2331460B; GB9903338D0; GB2331460A; WO1998007437A1; JP3249136B2

Abstract

(57)【要約】Ｂ型肝炎に対して治療活性を示すフィラントゥスウスリエンシス(Phyllanthus ussuriensis)またはフィラントゥスウリナリア(Phyllanthus urinaria)の抽出物がＢ型肝炎治療用医薬組成物の製剤化に用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】フィラントゥスウスリエンシスおよび／またはフィラントゥスウリナリアの抽出物を含むＢ型肝炎治療用医薬組成物発明の分野本発明は、Ｂ型肝炎に対して治療効果を示すフィラントゥスウスリエンシスおよび／またはフィラントゥスウリナリアの抽出物ならびにそれを含むＢ型肝炎治療用医薬組成物に関する。発明の背景Ｂ型肝炎ウイルス(“ＨＢＶ”)は人体に感染するヘパドナビリデ(Hepadnaviri dae )の一種である。ＨＢＶに感染したヒトは６０〜１１０日の潜伏期を経て種々の程度の症状を示す。感染者の９０〜９５％は完全に回復し得るが、一部は慢性活動性肝炎、肝硬変または肝癌に発展することがある。慢性Ｂ型肝炎は、しばしば慢性ウイルス肝炎症、リンパ腫および／または慢性腎臓障害を引き起して患者を死亡に至らしめる。現在、全世界に約２億名のＨＢＶ保菌者がいると報告されており、世界規模の深刻な衛生学的問題を起こす可能性がある。１９８１年にＨＢＶワクチンが開発されて以降、新生児を含めて感染しやすいヒトにＨＢＶ予防接種を実施したが、ＨＢＶ保菌者の数は実質的には減少しなかった。これは、母体から胎児へのＨＢＶの垂直形感染がＨＢＶ保菌者となる主要径路であるためである(Chung，D．K．et al.，J．Catholic Med．Coll.，27：25 6は267(1976)；Chung，W．K．et al.，J．Infec．Dis.，151：280は286(1985)) 。Ｂ型肝炎ｅ抗原(ＨＢｅＡｇ)−陽性保菌者から生まれる赤ん坊は胎盤を通じてはほとんど感染しないが、出産途中または損傷した胎盤を通じてＨＢＶに暴露されるか、胎盤を通じてＨＢｅＡｇに感作する場合、ＨＢＶに対して免疫学的欠陥を示し、慢性ＨＢＶ保菌者になり得る。最近、ＰＣＲ(polymerase chain reaction)技術を用いてＨＢＶ保菌者の血液に存在するＨＢＶＤＮＡを検出することができるようになり、したがって、ＨＢｅＡｇを唯一のＨＢＶ指標として用いる方法は旧式になった。ＨＢＶ保菌者の数を減らすためには、新生児用の効果的な抗−ＨＢＶワクチンを開発し、また、保菌者、特に妊娠した女性において、血中ＨＢｅＡｇ濃度を下げるよりは、血中ＨＢＶＤＮＡの量を効果的に減らす方法を開発することが必須である。これまで種々のＨＢＶ治療剤が開発されたが、あまり成功していない。さらに、アラ−エー（Ara−A，Parke，Davis，U.S.A.）およびアシクロビル(Acyclovir ，Wellcome Foundation，England)のような現在用いられている薬剤は毒性が強いという問題がある。ホスホノホーメート（Phosphonoformate；Foscarnet；Ast ra，U.S.A.）、スラミン（Suramin；Bayer，Germany）、およびファムシクロビル（Famciclovir；Smith−Kline Beecham，England）などが効能のあるＨＢＶ治療剤であるといわれているが、これらの有効性を検証するためには追加的な試験が必要である。ベンカテスワランら（Venkateswaran et al.，Proc.Natl．Acad Sci.，U.S.A. ，84，274(1987)）、ブルムバーグら(Blumberg et al.，Cancer Detection and Prevention，14，195(1989))、およびヤナギら(Yanagi et al.，Abstracts of P apers Presented at the 1989 Meeting on Hepatitis B Virus）September 25， 1989)はインドで民間薬として用いられていたフィラントゥス属（Phyllanthus）（Euphorbiaceae；タカトウダイグサ科）植物を用いてＢ型肝炎を治療しようと試みた。フィラントゥス属植物の世界中の用途および生化学的分析結果を網羅するウナンダーらの包括的な総説(Unander，D．W．et al.，Journal of Ethnopharmacolo gy，34，97−133(1991))によれば、フィラントゥスの５５０種中７種、すなわち、フィラントゥスニルリ(P.niruri)、フィラントゥスアイリ−シャウイ(P.air yshawii)、フィラントゥスアマルス（P.amarus）、フィラントゥスフラターナスウェブスター（P.fraternus Webster）、フィラントゥスウリナリア（P.ur inaria）、フィラントゥスガストロエミ(P.gasstroemi)Muell−Argおよびフィラントゥスチモイデス（P.thymoides）が黄痘または肝炎の治療に用いられてきた。Ｐ.アマルス（P.amarus）およびＰ.ニルリ（P.niruri）はウッドチャックＢ型肝炎 (Venkateswaran,P.S.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,84,274(1987))およびカモＢ型肝炎(Nis.,J.,et al.，J.of Med.Virol.,32,212−218(1990))に対して薬効を有すると報告された。しかし、これらは臨床的適用においては薬効を示さなかった１と報告された(Leelarasamee,A.,et al.,Lancet,1,335(1990))。また、シードらは、Ｐ.チモイデスが試験管中でフィラントゥス属の種々の植物中最も高いＨＢｓＡｇへの結合力を示すと報告した。しかし、ＨＢｓＡｇと結合することはＰ.チモイデスでなく特定なレクチン(lectin)であり、Ｐ.チモイデスは生体内(in vivo)試験においてカモＢ型肝炎に対して抗ウイルス活性を示さなかったことが後に報告された（Shead,A.et al.，“Neutralization but not C ure of Duct Hepatitis B by Australian Phyllanthus Extracts”,Abstract 60 2，In：Scientific Program and Abstracts Volume,the 1990 International Sy mposium on Viral Hepatitis and Liver Disease,April 4−8,1990,Houston，Te xas，U.S.A.）。前述のように、たとえば、Ｐ.アマルス、Ｐ.ニルリのようなフィラントゥス属の数種は民間療法において黄痘または肝炎の治療のため用いられ、いくつの試験管中実験に基づいてＢ型肝炎に対して薬効があると主張されてきた。しかし、このような進展にもかかわらず、ヒトＢ型肝炎の治療のための前記フィラントゥス属植物の効果は十分に確立されておらず、ヒト、特に妊婦および子供に投与したとき安全かつ毒性が少なく、副作用を示さないＢ型肝炎治療剤の開発が求められている。発明の要約したがって、本発明の目的は、Ｂ型肝炎に対する治療効果があり、臨床的に安全なフィラントゥス属(Phyllanthus)植物の抽出物を提供することである。本発明の他の目的は、副作用なしにＢ型肝炎患者を治療するための、前記抽出物を含む医薬組成物を提供することである。本発明の一つの態様は、Ｂ型肝炎に対して効果的な治療活性を示すフィラントゥスウスリエンシス(Phyllanthus ussuriensis)またはフィラントゥスウリナリア(Phyllanthus urinaria)の抽出物、およびその抽出物と薬剤学的に許容可能な担体を含むＢ型肝炎治療用医薬組成物である。図面の簡単な説明本発明の前記およびその他の目的および特徴は、添付の図面に関連させた本発明の下記説明から明らかになり、ここで図１は、ＨＢＶＤＮＡポリメラーゼの活性に対するフィラントゥスウスリエンシスおよびフィラントゥスウリナリア抽出物の生体内阻害効果を示す。図２Ａおよび２Ｂは、Ｐ.ウリナリア抽出物の０.１％水溶液の添加前と添加後に電子顕微鏡で観察したＨＢＶ粒子を示す。発明の詳細な説明本発明によって、フィラントゥスウスリエンシスまたはフィラントゥスウリナリアの抽出物は、抗−ＨＢｓＡｇ抗体(ＨＢｓＡｂ)−様の物質を含み、ＨＢＶＤＮＡポリメラーゼの活性を阻害する能力を有し、哺乳動物に対する毒性およびマイトジェン性をほとんど示さず、かつＢ型肝炎ウイルス粒子の著しい変形を惹起することが判明した。本発明に用いられるＰ.ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリアはタカトウダイグサ科（Euphorbiaceae）のフィラントゥス属に属する一年生草本であり、大韓民国の南部に自生する。Ｐ.ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリアの植物学的特性および走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した外見は次の通りである。表１表１からわかるように、Ｐ.ウリナリアは、比較的多量の赤い色素を有し、種子に横皺が寄っているという特徴がある。一方、Ｐ.ウスリエンシスは、縦シマを有する種子を結び米国自生のＰ.アマルスと類似である。Ｐ.ウスリエンシスまたはＰ.ウリナリアの抽出物は下記の好ましい態様によって製造し得る。Ｐ.ウスリエンシスまたはＰ.ウリナリアを水で洗浄し、室温で乾燥した後、細片に切り刻む。植物細片を２５〜６０倍、好ましくは５０倍容量の水と混合し、混合物を６０〜９０℃、好ましくは８０℃の温度で３〜５時間、好ましくは４時間加熱して水性粗抽出物を得る。粗抽出物を遠心分離し、濾過した後、冷凍乾燥して抽出物粉末を得る。この粉末は、使用するまで４℃で保管する。また、Ｐ.ウスリエンシスまたはＰ.ウリナリアの有機粗抽出物は、２５〜６０倍、好ましくは５０倍容量の有機溶媒を用いて１０〜４０℃、好ましくは２０〜３０℃の温度で１２〜４８時間、好ましくは２４時間抽出する以外は、前記と同様の手順に従って製造し得る。有機溶媒の例には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトン、メタノールおよびエタノールを含む。次いで、前記と同様の手順に従って有機粗抽出物から粉末状抽出物が得られる。本発明のＰ.ウスリエンシスまたはＰ.ウリナリアの抽出物は、血清またはＢ型肝炎ワクチン中のＨＢｓＡｇに対して高い結合能を有する。この抽出物は、１２５ｍｇ／ｍｌ以上の濃度でＨＢｓＡｇのＨＢｓＡｂとの結合に対して拮抗的阻害効果を示す。また、本発明の抽出物は、３４μｇ／ｍｌ以上の濃度でＨＢＶＤＮＡポリメラーゼの活性を阻害するが、阻害効果はその濃度が増加するにつれて上昇する。特に、Ｐ.ウリナリアの抽出物は０.１％の濃度でＢ型肝炎ウイルス粒子の著しい変形を惹起する。さらに、本発明の抽出物は強い効能にもかかわらず、マウスおよびイヌを用いた試験において毒性やマイトジェン性をほとんど示さない。より具体的には、Ｐ .ウリナリアの抽出物は７０ｍｇ／ｋｇの投与量でマウスに腹腔内投与するとき毒性を示さなかったが、これは体重５０ｋｇのヒトに３,５００ｍｇの抽出物を腹腔内投与することに相当する。また、Ｐ.ウスリエンシスまたはＰ.ウリナリアの抽出物を正常のマウスに投与した場合、マウスのｓＧＯＴ、ｓＧＰＴ、ＡＬＰ（アルカリ性ホスファターゼ）およびビリルビン濃度が変化しない事実からみて、この抽出物は肝機能に副作用を起こさないことがわかる。サルモネラタイピムリウムＴＡ１００およびＴＡ９８を用いたＡｍｅｓ試験において、Ｐ.ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリアの抽出物は陰性と判定されるためマイトジェン性はない。なお、本発明の抽出物を１２０日間投与したイヌは肝機能に異常を示さない。さらに、Ｐ.ウリナリアの抽出物をイヌに投与したときＨＢｓＡｂ−陽性反応が観察されるが、この結果はＨＢｓＡｂ−類似物質がイヌの血清中に形成されることを示す。一方、ヒトのＨＢＶと似ているウッドチャック肝炎ウイルス(Woodchuck hepat itis virus：WHV)が北米産ウッドチャック（マルモタモナックス；Marmota mo nax）から発見され、ウッドチャックのＷＨＶの感染がヒトと類似する慢性肝炎を誘発し得ることが実験的に立証された(Summers,J.,Smolec,J.M.and Snyder．R .,Proc,Natl.Acad.Sci.U.S.A.,75,4533−4537(1978))。本発明のＰ.ウリナリア抽出物を感染ウッドチャックに投与すると、ウッドチャックの血中ＷＨＶＤＮＡの濃度が著しく減少する。ヒトを用いた臨床試験においてもＰ.ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリアの抽出物は良い結果を示した。即ち、Ｐ.ウスリエンシスまたはＰ.ウリナリアの抽出物を健康なＨＢＶ保菌者、軽度の慢性肝炎と推定されるＨＢＶ保菌者および肝硬変が併発した慢性活動性Ｂ型肝炎患者に５０ｍｇ／ｋｇ体重／日の量を実際に投与した結果、投与３ヶ月後にはＨＢＶＤＮＡがもはや検出されなかった。血清ＨＢｓＡｂ検出試験の場合には、Ｐ.ウリナリアの抽出物の投与３ヶ月後に陽性結果が得られたが、放射状同位元素法では陰性と判定された。この結果は、Ｐ.ウリナリアの抽出物が生体内でＨＢｓＡｇに特異的に結合する物質を含むことを暗示する。また、Ｐ.ウリナリアの抽出物は投与３ヶ月後に肝硬変が併発した慢性活動性Ｂ型肝炎患者の血清ＧＯＴおよびＧＰＴ濃度を著しく改善した。前述の通り、Ｐ.ウスリエンシスまたはＰ.ウリナリアの抽出物は、毒性がほとんどなく、副作用を起こさない、Ｂ型肝炎の治療のための効果的な薬剤として用いられ得る。したがって、本発明はさらに、活性成分としてＰ.ウスリエンシスまたはＰ.ウリナリアの抽出物を薬剤学的に許容可能な賦形剤、担体または希釈剤とともに配合して含む、Ｂ型肝炎治療用医薬組成物を提供する。医薬製剤はこの組成物を用いて任意の通常の手順に従って製造することができる。製剤の製造においては、活性成分を担体と混合するか、担体で希釈するか、カプセル、サシェット(sachet)または他の容器である担体中に封入することが好ましい。担体が希釈剤として働く場合、これは活性成分のためのビヒクル、賦形剤または媒体として作用する固体、半固体または液体物質であってもよい。したがって、製剤は錠剤、丸剤、粉剤、サシェット、エリキシル(elixir)、懸濁液、溶液、シロップ、エーロゾル、軟質および硬質のゼラチンカプセル、滅菌注射溶液、滅菌包装粉剤などの形であってもよい。適当な担体、賦形剤および希釈剤の例は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラル油である。製剤は充填剤、凝集防止剤、潤滑剤、湿潤剤、香味剤、乳化剤、防腐剤などをさらに含み得る。本発明の組成物は患者に投与された後、活性成分は速放出、徐放出および遅延放出するように当分野で公知の任意の方法を用いて製剤化し得る。医薬製剤は、経口、経皮、皮下、静脈内および筋肉内注射を含む種々の経路を通じて投与され得る。活性成分の通常の一日投与量は約２０〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは４０〜８０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり得、単一投与量または分割投与量で投与することができる。しかし、実際に投与される活性成分の量は、治療する疾患、選択された投与経路、患者の年齢、性別および体重および疾患の程度を含む種々の関連因子を考慮して決定されものであり、したがって、前記投与量は本発明の範囲を制限しない。下記製造例および試験例は本発明の範囲を制限するものではなく、これをさらに詳細に説明するためのものである。また、固体混合物中の固体、液体中の液体、および液体中の固体に対して下記に与えられた百分率は特に指示しない限り、各々ｗｔ／ｗｔ、ｖｏｌ／ｖｏｌおよびｗｔ／ｖｏｌに基づく。製造例：Ｐ.ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリア抽出物の製造Ｐ.ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリアを韓国慶尚北道達城郡玉浦面および韓国済州道の野原で各々採集し、水で洗浄し、室温で通風乾燥した後、細かい断片に切り刻んだ。Ｐ.ウスリエンシスまたはＰ.ウリナリアの断片に植物２０ｇ当り１,０００ｍｌの量で蒸留水を加え、混合物を８０℃で４時間加熱して抽出物を得た。抽出物を３,０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上澄液をワットマンＮｏ.２濾紙を通して濾過した後、０.４５μｍ Seitz−型濾紙（Amicon,U.S.A.）で濾過した。濾液を冷凍乾燥して粉末状抽出物１.６ｇ（収率８％）を得、これを４℃にて保管した。また、表２に記載した種々の有機溶媒を用いてＰ.ウスリエンシスまたはＰ.ウリナリアの有機抽出物を製造し、これから前記と同様の手順に従って粉末状抽出物を製造した。この抽出条件および収率を表２に示す。表２ ^*1)Ｐ.ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリアからの収率は互いにほとんど等しい。前記粉末状抽出物は水によく溶けるため（２５℃で２０％以上）、これをヒトに１日２回または３回投与したとき、体重ｋｇ当り４０ｍｇの一日投与量を２または３個の分画に分けた後、各分画を蒸留水５０〜１００ｍｌに溶かして単位投与量とした。動物試験における１日投与量は通常ヒト投与量の約３倍であり、適正量は動物の種類、大きさおよび体重によって決定した。試験例１：ＨＢｓＡｇ−陽性血清とＰ.ウスリエンシスまたはＰ.ウリナリア抽出物の沈降反応ＨＢｓＡｇ−陽性血清(Liver Reserch Institute，School of Medicine，Kyun gpook National University,Korea）０.５ｍｌずつを５ｍｌ容量の試験管に入れ、Ｐ.ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリアの２％水性抽出物を徐々に加えて血清試料上に層を形成し、沈降環の形成を観察した。Ｐ.ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリアの抽出物のいずれも白色沈降環の形成を誘導したため、これらがＨＢｓＡｇ−陽性血清試料と反応したことがわかる。試験例２：ＨＢｓＡｇに対するＰ.ウスリエンシスまたはＰ.ウリナリア抽出物の結合親和度（１）ＨＢｓＡｇ力価の測定ＨＢｓＡｇに対するＰ.ウスリエンシスまたはＰ.ウリナリア抽出物の結合親和力はＨＢｓＡｇのＨＢｓＡｂとの結合に対する抽出物の阻害活性を測定することによって決定し、ＨＢｓＡｇ力価はＥＬＩＳＡキット（Enzygnost^R ＨＢｓＡｇ monoclonal II、Behring社）を用いて製造者のプロトコルに従って測定した。（２）ＨＢｓＡｇ−陽性血清を用いた親和度検査製造例で製造したＰ.ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリアの粉末状抽出物を蒸留水に溶かして最終濃度を各々１０、５、２.５、１.２５および０.６３ｍｇ／ｍｌに調整した。生成した溶液４００μｌずつをＢ型肝炎患者から得られたＨＢｓＡｇ−陽性血清４００μｌと混合し、この混合物を２０℃で１時間反応させた。反応物を３,０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して上澄液を得た。上澄液中のＨＢｓＡｇの力価は前記（１）と同様の方法に従って測定し、これからＨＢｓＡｇ力価の減少を決定した。血清ＨＢsＡｇとＨＢｓＡｂの結合の阻害においてＰ. ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリア抽出物の活性は抽出物を用いなかったコントロールの値を基準とする百分率をもって示した。その結果を表３に示す。表３Ｐ.ウスリエンシスまたはＰ.ウリナリア抽出物による血清ＨＢｓＡｇとＨＢｓＡｂの結合阻害（％）（３）Ｂ型肝炎ワクチン中のＨＢｓＡｇを用いた親和度検査製造例で製造したＰ.ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリアの粉末状抽出物を蒸留水に溶かして最終濃度を各々０.６３、０.３１および０.１６ｍｇ／ｍｌに調整した。得られた溶液各４００μｌを、ヘパバックス（Hepavax^R；２０μｇ；Ko rea Green Cross Corp.,Korea）を５０倍容量の蒸留水で希釈して製造したＨＢｓＡｇ溶液４００μｌと混合し、この混合物を２０℃で１時間反応させた。得られた混合物中のＨＢｓＡｇの力価は前記（１）と同様の方法に従って測定し、これからＨＢｓＡｇ力価の減少を決定した。Ｂ型肝炎ワクチン中のＨＢｓＡｇとＨＢｓＡｂの結合阻害においてＰ.ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリア抽出物の活性は抽出物を用いなかったコントロールの値を基準とする百分率をもって示した。その結果を表４に示す。表４Ｐ.ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリア抽出物によるＢ型肝炎ワクチン中ＨＢｓＡｇとＨＢｓＡｂの結合阻害（％）（４）ＨＢｓＡｇに対する結合におけるＰ.ウスリエンシスまたはＰ.ウリナリアの抽出物とＨＢｅＡｂの間の拮抗的関係ＨＢｓＡｇに対する結合において、Ｐ.ウスリエンシスまたはＰ.ウリナリアの抽出物とＨＢｓＡｂの拮抗的関係は下記手順に従って調査した。製造例で製造したＰ.ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリアの粉末状抽出物を蒸留水に溶かして最終濃度を各々１０、５、２.５および１.２５ｍｇ／ｍｌに調整した。得られた溶液４００μｌずつをＨＢｓＡｂ−陽性血清４００μｌと混合し、生成した混合物中のＨＢｓＡｂの力価はEnzygnost^R Anti−ＨＢｓマイクロキット（Behring Co.,U.S.A.）を用いて製造者のプロトコルに従って測定した。ＨＢｓＡgとＨＢｓＡｂの結合を阻害においてＰ.ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリア抽出物の拮抗的阻害活性は抽出物を用いなかったコントロールの値を基準とする百分率をもって示した。その結果を表５に示す。表５Ｐ.ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリア抽出物によるＨＢｓＡgとＨＢｓＡｂの結合阻害（％）前記表５からわかるように、Ｐ.ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリアの抽出物は１．２５ｍｇ／ｍｌの濃度でかなりの拮抗的活性を示した。試験例３：ＨＢＶＤＮＡポリメラーゼの活性に対するＰ.ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリア抽出物の阻害活性製造例で製造したＰ.ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリアの粉末状抽出物を蒸留水に溶かして最終濃度を各々３４０.６、６８.１、３４.１および６.８ｍｇ／ｍｌに調整し、生成した溶液をＨＢＶ粒子(Dane patricle)と反応させた後、ＤＮＡポリメラーゼの阻害程度を次のように測定した。ＨＢＶ粒子を含有する血清０.２ｍｌを２.３ｍｌの溶液１(０.０１Ｍトリス− ＨＣＬ（ｐＨ７.４）、０.１５ＭＮａＣｌ)と混合した後、４℃で１０,０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。生成した上澄液を２.５ｍｌの溶液２(３０％( ｗ／ｖ)スクロース、０.０１Ｍトリス−ＨＣｌ(ｐＨ７.４）、０.１５ＭＮａＣｌ、０.００１ＭＥＤＴＡ、０.１％２−メルカプトエタノール、１ｍｇウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）)上に置いた後、４℃で５０,０００ｒｐｍで４時間遠心分離した。生成したペレットを２５μｌの溶液３（０.０１Ｍトリス−ＨＣＬ（ｐＨ７.４）、０.１５ＭＮａＣｌ)１％ＮＰ−４０、０.１％２−メルカプトエタノール）に懸濁した。前記懸濁液に前記で製造した各々の抽出物溶液２５μ ｌとポリメラーゼ混合液［０.２Ｍトリス−ＨＣＬ（ｐＨ７.４）、０.０８ＭＭｇＣｌ₂、０.２４ＭＮＨ₄Ｃｌ)１ｍＭｄＡＴＰ)１ｍＭｄＴＴＰ、０.００２５ｎＭ³Ｈ−ｄＧＴＰ（二つとも不活性であり、２１Ｃｉ／ｍＭである）］２５ μｌを加えた。混合液を３７℃で３時間反応させた後、ワットマン３ｍｍ濾紙に点滴した。濾紙を１５％トリクロロ酢酸と９０％エタノールで洗浄した後、空気中で乾燥した。各点の放射能はデンシトメーター(Densitometer,Biomed.Instrument Inc.,U.S .A.)を用いて測定し、ＤＮＡポリメラーゼ活性の阻害程度（％）はＰ.ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリア抽出物の不存在下で測定されたＤＮＡポリメラーゼの活性を１００％として決定した。その結果を図１に示すが、ここでＨＢＶＤＮＡポリメラーゼの活性は３４.１μｇ／ｍｌ以上で抽出物の濃度の増加に比例して減少することが観察された。試験例４：Ｐ.ウスリエンシス抽出物のＨＢＶ粒子に対する影響ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇ−陽性患者から得られた血清を20％スクロースクッション上に重層し、超遠心分離機(Sorvall^R)を用いて４℃、１００,０００ｘｇで４時間遠心分離してＨＢＶ粒子を得た後、ペレット化されたＨＢＶ粒子を２０倍体積のリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）に懸濁させた。一方、Ｐ.ウリナリア抽出物の２％水溶液を蒸留水で希釈して最終濃度が各々０.２％および０.１％になるように調整した。各々の生成した溶液を前記で製造したＨＢＶ粒子懸濁液の同量と混合し、混合液を室温で３０分間放置した。生成した混合物をグリッド上に一滴落とし、１％リンタングステン酸でネガティブ染色した。グリッドをＰＢＳで２回洗浄し、グリッド上に残った水分をワットマンＮｏ. １濾紙で完全に除去した。その後グリッドを電子顕微鏡(Zeiss)で観察し、写真撮影した。ＨＢＶ粒子に対するＰ.ウリナリア抽出物の影響を観察し、抽出物希釈液の代わりに蒸留水を用いたコントロールのものと比べた。図２Ａおよび２ＢはＰ.ウリナリア抽出物の０.１％水溶液を加える前と後に電子顕微鏡で観察したＨＢＶ粒子を示す。図２Ａおよび２Ｂからわかるように、Ｐ .ウリナリア抽出物は０.１％濃度でＨＢＶ粒子の著しい変形を惹起する。試験例５：マウスに対するＰ.ウリナリア抽出物の急性毒性一群当り１０匹(雄５匹および雌５匹)からなる５群のマウスにＰ.ウリナリア抽出物を各々７０、８４、１００、１２０および１４４ｍｇ／ｋｇ体重の量で腹腔内投与した。投与７日後にマウスの致死および内部臓器の異常の可否を観察した。その結果を表６に示す。表６マウスに対するＰ.ウリナリア抽出物の急性毒性＊Ａ＝（事例）／（死亡したマウスの数）＊Ｂ＝（事例）／（生存したマウスの数）表６からわかるように、Ｐ.ウリナリア抽出物は７０ｍｇ／ｋｇ体重の量で腹腔内投与したとき毒性を示さなかったが、これは体重５０ｋｇであるヒトに抽出物３,５００ｍｇを腹腔内投与したことに該当する。試験例６：Ｐ.ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリア抽出物が正常のマウスの肝機能に及ぼす影響体重約２００ｇのマウス３匹にＰ.ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリア抽出物の２％水溶液を２日間飲料水の代わりに経口投与した後、血液試料を採取した。その後、ｓＧＯＴ(serum glutamic oxaloacetic transaminase)、ｓＧＰＴ(seru m glutamic pyruvic transaminase)、血清アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）および血清ビリルビン活性をＡＳＴ／ＧＯＴ、ＡＬＴ／ＧＰＴ、ＡＬＰおよび血清ビリルビン診断キット(Sigma Chemicals Co.,U.S.A.)を用いて製造者のプロトコールに従って測定した。前記試験結果を下記表７に示す。表７前記表７からわかるように、Ｐ.ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリアの抽出物は肝機能の指標であるｓＧＯＴ、ｓＧＰＴ、ＡＬＴおよびビリルビン濃度を変更しなかったため、正常のマウスの肝機能に悪影響を与えないことが確認された。試験例７：Ｐ.ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリア抽出物の変異原性(Ames試験) Ｐ.ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリア抽出物の変異原性はエームス(Ames，B .n.,et al.,Proc．Nat．Acad Sci．U.S.A.,72,2433−2427(1975))およびナガオら(Nagao,M.,et al.,Ann．Rev．Genet.,12,117−159(1978))の方法に従って測定した。サルモネラタイヒムリウム(Salmolella typhimurium)ＴＡ１００とＴＡ９８はエームスらによって開発されたヒスチジン栄養要求性変異株であるが、環境性マイトジェンまたは発癌物質と接触してヒスチジン非要求株に変るため、マイトジェンの調査に用いられる。Ｐ.ウスリエンシスまたはＰ.ウリナリア抽出物を２０００ｍｇ／１００ｍｌの濃度で蒸留水に溶かした後、各々５、１０、５０および１００μｌずつをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と混合して最終容量を１００μｌにした。マウスの肝１００ｇに０.１５ＭＫＣＬ１０ｍｌを加え、Potter−Elvejhem 型ホモギナイザーを用いて均質化した。均質液を９０００ｘｇで１０分間遠心分離して微粒子分画を得、これをＳ９分画と命名した。Ｓ９分画をマイトジェンまたは発癌性物質の活性化のために用い、そのタンパク質量を４ｍｇ％に調節した。前記で製造した抽出物溶液を各々二つの試験管に０.５ｍｌずつ入れた。試験管を二つの群に分けた後、一群の試験管にはＳ９分画０.５ｍｌおよび５０μｍｏｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７.４）０.５ｍｌを加え、一方、他群の試験管には何も加えなかった。各試験管に２μＭＮＡＤＨ、２μｍｏｌＮＡＤＰＨ、２.５ μｍｏｌグルコース−６−ホスフェート、０.２５単位グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、４μＭＭｇＣｌ₂および１６.５μＭＫＣｌを含む０ .５ｍｌのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７.４）を加えて微生物活性化溶液１ｍｌを調製した。各試験管中にＴＡ１００またはＴＡ９８菌株２ｘ１０⁸細胞を含む培養液０. １ｍｌを加え、試験管を３７℃で２０分間放置した。各試験管の内容物を４５℃ で２ｍｌ寒天溶液（０.７％寒天(agar)、０.６％ＮａＣｌ）と混合し、混合物を直ちに寒天プレート上に塗布した。プレートを３７℃で二日間培養した後、ヒスチジン非要求株の発生を検査した。比較試験として、抽出物溶液の代わりにＤＭＳＯ中の２−(２−フリル)−３− (５−ニトロ−２−フリル)アクリロアミド（“ＡＦ−２”）１００μｌ（０.０１μｇ／μｌ）を用いて前記と同様の手順を繰り返した。ＡＦ−２は発癌性物質として知られている(Sugimura，T．and Nagao，M.,Modification of Mutagenic Activity,in：F．J．de Serres and A．Hollaender(Eds.),Chemical Mutagens,P rinciples and Methods for their Protection,Vol.6,Plenum,New York，pp41− 60,1980)。また、抽出物またはＡＦ−２を使用せずに対照実験を行った。抽出物は形成されたコロニーの数が対照群に比べて２倍以上であるときマイトジェン性と判断した。各実験は２回繰り返し、抽出物のマイトジェン性は二つの試験の平均値に基づいて判定した。その結果を下記表８に示す。表８Ｓ.タイヒムリウム変異株のコロニーの数表８からわかるように、Ｐ.ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリアの抽出物Ames 試験で陰性結果を示したため、この抽出物はマイトジェン性がないと決定した。試験例８：イヌを用いたＰ.ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリア抽出物の毒性試験各々の体重が約１２ｋｇである雄１匹、雌１匹からなる韓国産雑種犬の２群に製造例に従って製造したＰ.ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリア抽出物を毎日２回ずつ２００ｍｇ／ｋｇ体重の量で１２０日間経口投与した。その後、各イヌから血液試料を採取し、Autochemical Analyzer(Dupont,U.S.A.,Dimension 380)を用いて表９に記載した種々の肝機能を検査した。２匹の平均値を表９に示す。表９前記表９からわかるように、Ｐ.ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリア抽出物は１２０日間これを投与したイヌの肝機能に何ら異常を惹起しなかった。また、イヌにＰ.ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリア抽出物２００ｍｌを投与した後、３０分、６０分および１２０分後に血液試料を採取し、ＨＢｓＡｂ試験キット(Abbott,U.S.A.)でＨＢｓＡｂの出現可否を測定した。その結果を下記表１０に示す。表１０Ｐ.ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリア抽出物の投与後ＨＢｓＡｂの出現前記表１０からわかるように、Ｐ.ウリナリア抽出物をイヌに投与した場合にはＨＢｓＡｂ−陽性反応が観察された反面、Ｐ.ウスリエンシス抽出物を投与した場合にはＨＢｓＡｂ−陰性反応が観察された。また、イヌにＰ.ウスリエンシス抽出物を投与した後Ｐ.ウリナリア抽出物を投与するとＨＢｓＡｂ−陽性反応を示す反面、Ｐ.ウリナリア抽出物を投与した後、Ｐ.ウスリエンシス抽出物を投与するとＨＢｓＡｂ−陽性反応を示さなかった。したがって、Ｐ.ウリナリア抽出物が生体内で血液中にＨＢｓＡｂ−様活性を示す成分を含むという結論を下した。試験例９：ウッドチャック(wood chuck)モデルにおけるＰ.ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリア抽出物の活性ヒトＨＢＶと似ているＷＨＶ(woodchuck hepatitis virus)に感染したウッドチャック６匹にＰ.ウリナリア抽出物を６００ｍｇ／ｋｇ体重／日の容量で１２週間投与し、所定の時間に血清ＷＨＶＤＮＡ濃度（ｐｇ／ｍｌ）を測定した。投与前と投与後のウッドチャックの血清ＷＨＶＤＮＡ濃度の変化を表１１に示す。表１１表１１からわかるように、投与５週間前にウッドチャックのＷＨＶＤＮＡの濃度は試験群８,２００〜２,９００ｐｇ／ｍｌ、対照群１２,０００〜１,３００ｐｇ／ｍｌであり、投与直前には試験群９,１００〜２,２００ｐｇ／ｍｌ、対照群１３,０００〜１,３００ｐｇ／ｍｌであった。しかし、Ｐ.ウリナリア抽出物の投与１２週間後対照群のＷＨＶＤＮＡ濃度は１１，０００〜１,３００ｐｇ／ｍｌと高いままであったが、試験群のＷＨＶＤＮＡ濃度は６つの試験群中４群において２２０−７ｐｇ／ｍｌと著しく低い値に減少した。試験例１０：Ｐ.ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリア抽出物の臨床的効果Ｐ.ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリア抽出物の臨床的効果は健康なＨＢＶ保菌者、軽度の慢性肝炎を有すると推定されるＨＢＶ保菌者および肝硬変が併発した慢性活動性Ｂ型肝炎患者を試験対象として次のようにして調査した。（１）健康なＨＢＶ保菌者ＨＢｓＡｇ（＋）ＨＢｓＡｂ（−）ＨＢｅＡｇ（＋）ＨＢｅＡｂ（−）である以外は肝機能試験で比較的正常の結果を示した健康なＨＢＶ保菌者にＰ.ウリナリア抽出物を１日３回４０ｍｇ／ｋｇ体重／日の量で２４ヶ月間投与した。各単位投与量、すなわち、１日容量の３分の１を水５０ｍｌに溶かした後、食後１時間に投与した。治療中血清学的指標の変化を表１２に示す。表１２＊ＮＤ：測定しなかった。表１２からわかるように、治療を開始してから９.５ヶ月以後にＨＢｓＡｂ− 陽性反応が観察された反面、放射性同位元素法キット(Sorin Biomedica Co.,Ita ly)を用いて製造者のプロトコールに従って測定すると、血清はＨＢｓＡｂ−陰性であった。また、ＨＢｅＡｂおよび血清ＨＢＶＤＮＡは治療２.５ヶ月後に各々陽性および陰性として検出された。（２）軽度の慢性肝炎が推定されるＨＢＶ保菌者肝機能検査においてＨＢｓＡｇ（＋）ＨＢｓＡｂ（−）ＨＢｅＡｇ（＋）ＨＢｅＡｂ（−）ａｎｔｉ−ＨＢｃ（＋）の結果に基づいて慢性活動性肝炎を患っていると推定され、ＧＯＴが警戒領域に属する２３.９、ＧＰＴが警戒領域に属する６３.０を示す患者に、Ｐ.ウスリエンシス抽出物を１１ヶ月間投与した後、Ｐ .ウリナリア抽出物を１７ヶ月間投与した。抽出物の容量および投与方法は前記( １)と同じであった。治療中血清学的指標の変化を表１３に示す。表１３表１３からわかるように、Ｐ.ウスリエンシス抽出物を投与してから１ヶ月後にＨＢＶ感染指標はＨＢｓＡｇ（＋）ＨＢｓＡｂ（−）ＨＢｅＡｇ（＋）ＨＢｅＡｂ（−）およびＨＢＶＤＮＡ（＋）の状態を維持し、ＧＯＴおよびＧＰＴ値は警戒領域にとどまった。しかし、Ｐ.ウスリエンシス抽出物を投与してから４ヶ月後にはＨＢＶＤＮＡが検出されなくなり、他の指標は変化しなかった。Ｐ.ウリナリア抽出物を投与したとき、治療３ヶ月後にＨＢｓＡｂ−陽性反応が観察されたが、放射性同位元素法を用いると、ＨＢｓＡｂ−陰性結果が得られた。この結果はＰ.ウリナリア抽出物中にＨＢｓＡｇに特異的に結合するＨＢｓＡｂ−類似物質が存在することを示唆する。また、Ｐ.ウリナリア抽出物を投与している間、ＨＢｓＡｂおよび血清ＨＢＶＤＮＡは常に各々陽性および陰性が検出された。（３）肝硬変を併発した慢性活動性Ｂ型肝炎患者肝機能検査において、ＧＯＴ／ＧＰＴ＝１２９／１８４、ＨＢｓＡｇ（＋）ＨＢｅＡｇ（＋）ＨＢｓＡｂ（＋）ＨＢｅＡｂ（−）を示す肝硬変を併発した慢性活動性Ｂ型肝炎患者にＰ.ウリナリア抽出物を（１）と同様の手順に従って３ヶ月間投与した。治療中血清学的指標の変化を表１４に示す。表１４表１４からわかるように、Ｐ.ウリナリア抽出物を用いた治療３ヶ月後にＨＢＶＤＮＡ−陰性反応が観察され、トランスアミナーゼ値は非常によくなった。しかし、患者は肝硬変を併発しているため継続的な観察が必要であった。前記試験例の結果からわかるように、Ｐ.ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリアの水性抽出物は毒性がほとんどなく、副作用を惹起しない効果的なＨＢＶ治療剤として用いられ得る。製剤例：Ｐ.ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリアの抽出物を含む医薬製剤（１）Ｐ.ウスリエンシスまたはＰ.ウリナリアの抽出物を含むカプセルの製造下記成分を用いて硬質ゼラチンカプセルを製造した：量（ｍｇ／カプセル）活性成分８００（Ｐ.ウスリエンシスまたはＰ.ウリナリアの抽出物）乾燥澱粉１１００ステアリン酸マグネシウム１００総量２０００ｍｇ前記成分を混合し、２０００ｍｇ単位量で硬質ゼラチンカプセルに充填した。（２）Ｐ.ウスリエンシスおよびＰ.ウリナリアの抽出物を含むカプセルの製造下記成分を用いて硬質ゼラチンカプセルを製造した：量（ｍｇ／カプセル）活性成分Ｐ.ウスリエンシスの抽出物２００Ｐ.ウリナリアの抽出物６００乾燥澱粉１１００ステアリン酸マグネシウム１００総量２０００ｍｇ前記成分を混合し、２０００ｍｇ単位量で硬質ゼラチンカプセルに充填した。本発明を前記具体的態様に関連させて記述したが、当分野の熟練者によって本発明に対する多様な変形および変化させるとができ、これらもまた添付の特許請求範囲によって定義される本発明の範囲内に属する。

Claims

【特許請求の範囲】１．Ｂ型肝炎に対して治療活性を示すフィラントゥスウスリエンシス(Phy llanthus ussuriensis)および／またはフィラントゥスウリナリア(Phyllanthu s urinaria)の抽出物。２．フィラントゥスウスリエンシス(Phyllanthus ussuriensis)またはフィラントゥスウリナリア(Phyllanthus urinaria)を水で抽出して製造される請求項１記載の抽出物。３．治療的有効量の請求項１に記載の抽出物および薬剤学的に許容可能な担体を含むＢ型肝炎治療用医薬組成物。