CN102462674A

CN102462674A - 姜黄素及其衍生物在制备治疗人巨细胞病毒感染药物中的应用

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Publication number: CN102462674A
Application number: CN2010105448302A
Authority: CN
Inventors: 刘丽宏; 姜合作; 蓝苑元; 兰安杰
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-11-04
Filing date: 2010-11-16
Publication date: 2012-05-23
Anticipated expiration: 2030-11-16
Also published as: CN102462674B

Abstract

本发明涉及姜黄素及其衍生物在制备治疗和预防人巨细胞病毒感染相关疾病的药物和/或保健品中中的应用。所述药物的有效成分是姜黄素和/或去甲氧基姜黄素和/或双去甲氧基姜黄素，可以含有药学可接受的载体或其它组份。所述相关疾病包括心脑血管疾病、肾病、肝病、肺病等并有巨细胞病毒感染，以及烧伤、接受免疫抑制治疗等的患者发生巨细胞病毒感染。所述药物可以制成各种剂型，包括散剂、片剂、微丸、胶囊、微囊、颗粒剂、液体制剂、自乳化制剂、自微乳化制剂或脂质体制剂。

Description

姜黄素及其衍生物在制备治疗人巨细胞病毒感染药物中的应用

技术领域

本发明涉及姜黄素及其衍生物在制备治疗和预防人巨细胞病毒感染相关疾病的药物和/或保健品中的应用。所述药物的有效成分是姜黄素和/或去甲氧基姜黄素和/或双去甲氧基姜黄素，可以含有药学可接受的载体或其它组份。所述相关疾病包括心脑血管疾病、肾病、肝病、肺病等并有巨细胞病毒感染，以及烧伤、接受免疫抑制治疗等的患者发生巨细胞病毒感染。所述药物可以制成各种剂型，包括散剂、片剂、微丸、胶囊、微囊、颗粒剂、液体制剂、自乳化制剂、自微乳化制剂或脂质体制剂。

背景技术

人类巨细胞病毒(Human cytomegalovirus HCMV)属疱疹病毒科亚属，又称疱疹病毒5型，核心为双股线形DNA病毒。巨细胞病毒感染非常普遍，在发达国家，其感染率为40-60％，而在发展中国家，常人感染率可达100％。在我国，儿童感染率为85％左右。HCMV为弱致病因子，正常人一般为潜伏感染或无症状的亚临床感染，但当机体免疫力低下(如胎儿、婴幼儿)、免疫抑制或缺陷时，原发感染或潜伏感染的HCMV可被激活引起活动性HCMV感染，导致各种疾病，并加重一些常见病患者原有疾病的症状甚至引起死亡。过去的二十年，由于器官移植、肿瘤患者、艾滋病患者的大量增加，使HCMV感染更为普遍，HCMV感染致死率明显上升，同时HCMV也是先天性感染最常见病因之一。

目前，人们逐渐认识到人体许多疾病的发生都与HCMV感染有关。与巨细胞病毒感染相关的疾病主要有以下几种：1)原发性高血压患者存在较高的活动性巨细胞病毒感染；2)巨细胞病毒感染导致细胞内皮受损从而参与了冠心病的发病过程；3)肺部感染性疾病合并HCMV感染；4)慢性乙型肝炎合并巨细胞病毒感染，可加重肝功能障碍；5)肾功能衰竭透析患者HCMV感染率明显升高；6)烧伤后人巨细胞病毒感染率显著升高，尤其以大面积烧伤患者更甚；7)其它接受免疫抑制剂疗法的患者合并人类巨细胞病毒感染，其中以恶性肿瘤接受化疗合并HCMV感染最为常见。此外，HCMV感染还与横断性脊髓炎、多神经根炎、Guillain-Barre综合征、心肌炎、血小板减少症、溶血性贫血、各类血细胞减少、继发性硬化性胆管炎、静脉血栓形成、Joubert′s综合征、糖尿病、系统性红斑狼疮、肾病综合征、Meniere′s病、类风湿关节炎、慢性牙周炎等有关。

抗病毒治疗常用阿昔洛韦、更昔洛韦、膦甲酸钠、西多福韦、巨细胞病毒免疫球蛋白以及单克隆抗体等，然而，目前临床上尚缺乏治疗该病毒的有效措施。

更昔洛韦(ganciclovir，GCV)体外抗单纯疱疹病毒和巨细胞病毒的活性10～100倍强于阿昔洛韦，被许可用于爱滋病病人的巨细胞病毒视网膜炎，以及用于器官移植病人以预防巨细胞病毒感染，目前，仍然是治疗HCMV感染的首选药物。更昔洛韦对各个类型的巨细胞病毒感染的效果不一，单独用于治疗巨细胞病毒肺炎的疗效较差，但与巨细胞病毒免疫球蛋白联合应用后，可显著提高临床治疗效果。虽然更昔洛韦在抗巨细胞病毒感染的早期治疗可获一定效果，然而长时间服用更昔洛韦则又会因为发生白细胞减少而不得不终止治疗，但是一旦停止治疗，感染的病情往往又会复发。此外，更昔洛韦在人体各个系统、环境皆会出现程度不一的不良反应。近年来，GCV的耐药株有渐多趋势，加上GCV价格昂贵等不可克服的缺点，使其在临床的应用受到了很大的限制。

另外，膦甲酸钠能抑制疱疹病毒的DNA聚合酶和HIV-l的逆转录酶，并且对耐受GCV的巨细胞病毒感染有效。膦甲酸钠近已获批准用于并发巨细胞病毒视网膜炎的爱滋病病人。但因膦甲酸钠有肾毒性、电解质失衡、抽搐、恶心等副作用，病人不易耐受。

姜黄素(Curcumin)及其衍生物是姜科姜黄属植物姜黄(Curcumalonga L.)的主要活性成分，也存在于姜科其他植物中。姜黄素可溶于甲醇、乙醇、碱、醋酸、丙酮和氯仿等有机溶剂，在水中溶解度很低(50μmol/L)。姜黄素一直被用于食用色素和传统中药，因其较强的抗氧化活性，在肝病、黄疸、消化不良、尿路感染、风湿关节炎和毒虫叮咬等病症中有一定的疗效。在最近几十年中，姜黄素一直都是国际上医药领域的研究热点，更多的证据表明，姜黄素在预防和治疗早期老年性痴呆、乳腺癌、直肠癌等具有显著的优势。

姜黄素及其衍生物在我国资源丰富，提取分离的工艺简单，价格低廉，能广泛应用于治疗多种疾病。毒理学研究显示：小鼠灌胃给姜黄素，其LD50大于2g/kg；在大鼠口服姜黄素剂量高达5g/kg时，没有发现任何明显的毒性；在用ICR小鼠进行最大耐受量试验时，即使给药剂量为人口服剂量的600倍，也未见动物死亡。由此可见，姜黄素无明显的毒副作用，因而具有可靠的安全性。

目前，尚未见报道关于姜黄素及其衍生物在制备治疗和预防人巨细胞病毒感染相关疾病的药物中的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种姜黄素及其衍生物的新应用：以姜黄素和/或其衍生物为有效成分，制备用于治疗和预防人巨细胞病毒感染相关疾病的药物和/或保健品。所制成的药物疗效好、毒副作用小并且可长期使用。

在本发明中，相关疾病包括心脑血管疾病、肾病、肝病、肺病等并有巨细胞病毒感染，以及烧伤、接受免疫抑制治疗等的患者发生巨细胞病毒感染。

姜黄素(curcumin)及其衍生物双去甲氧基姜黄素(bisdemethoxycurcumin)和去甲氧基姜黄素(demethoxycurcumin)皆为β-二酮类化合物，它们结构式如下。β-二酮类化合物的中间亚甲基(O＝C-CH₂-C＝O)容易失去质子而产生抗氧化活性，故姜黄素、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素具有相同的抗氧化活性基团。目前，姜黄素及其衍生物的提取分离制备方法已有成熟的技术和工艺，并已有商品出售。

姜黄素

双去甲氧基姜黄素

去甲氧基姜黄素

在本发明中，姜黄素和/或其衍生物可与在药学上接受的组分和/或载体混合，制成口服制剂、胃肠外给药制剂或外用制剂等多种剂型的药物，尤其是制成自乳化制剂或自微乳化制剂或脂质体制剂的药物。

在这里，药学上可接受的组分是可与姜黄素和/或衍生物联合防治人巨细胞病毒感染相关疾病的化合物或组合物。药学上可接受的载体有：口服制剂加入的填充剂、润湿剂和粘合剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、芳香剂、着色剂，胶囊壳囊材、增塑剂、稳定剂，以及避光剂等；乳剂包括自乳化制剂加入的油相、表面活性剂、助表面活性剂、稳定剂、增稠剂等；胃肠外给药如注射剂所用的载体和溶剂包括增溶剂、抗氧剂、抑菌剂、局部止痛剂、pH调节剂、等渗调节剂等；外用制剂所用的基质等。

在姜黄素制备成自乳化制剂或自微乳化制剂时，优选的制剂载体是无水乙醇、丙二醇、甘油、中碳链甘油三酯、丙二醇二癸酸酯/二辛酸酯、吐温80、聚氧乙烯蓖麻油等中的一种或多种。

对本发明进行药理药效学研究，通过体外HCMV AD169毒株感染实验的测定结果显示，姜黄素能有效地提高受HCMV感染的HEL细胞的存活率，对HCMV导致的HEL细胞病变亦有明显的抑制作用。在小鼠体内小鼠睾丸MCMV感染实验中，在显微镜下观察睾丸组织病理改变，结果显示，姜黄素能明显减轻小鼠曲细精管基膜坏死和管周肌样细胞变性，并且生精细胞排列整齐；同时睾丸组织MCMV原位杂交结果显示，姜黄素给药组的小鼠睾丸组织中血管各层、生精小管管周肌样细胞及睾丸包膜等均没有阳性杂交信号出现，因此，姜黄素对小鼠睾丸MCMV感染有明显的预防和治疗作用。

本发明的应用，所述保健品为口服形式。

本发明的应用，所述姜黄素在药物和/或保健品中的质量百分比含量为1％至100％。

本发明的应用，所述“药物和/或保健品”的含义是，上述所列举的姜黄素可以用于制备药物，也可以制备保健品。

图1是细胞对照组HEL细胞图(1∶100倍放大)；

图2是病毒对照组HEL细胞图(1∶100倍放大)；

图3是姜黄素1μmol/L组HEL细胞图(1∶100倍放大)；

图4是正常对照组HE染色结果图(1∶100倍放大)；

图5是病毒对照组HE染色结果图(1∶100倍放大)；

图6是姜黄素60mg/Kg组HE染色结果图(1∶100倍放大)；

图7是更昔洛韦60mg/Kg组HE染色结果图(1∶100倍放大)；

图8是正常对照组MCMV原位杂交结果图(1∶100倍放大)；

图9是病毒对照组MCMV原位杂交结果图(1∶100倍放大)；

；

图10是姜黄素60mg/Kg组MCMV原位杂交结果图(1∶100倍放大)；

图11是更昔洛韦60mg/Kg组MCMV原位杂交结果图(1∶100倍放大)；

具体实施方式

下面用实施例具体说明本发明，这些实施例不应理解为任何意义上的对本发明的限制。

针对本发明所进行的药理药效学研究表明，本发明对人巨细胞病毒感染相关疾病的治疗和预防可以取得意想不到的有益效果，记载的药理药效学实验结果如下。

1.姜黄素体外抗HCMV活性测定：

HCMV AD169毒株感染性测定：制备细胞密度为1×10⁵的HEL细胞悬液，取无菌96孔板按每孔100μL接种，置CO₂培养箱中培养至单层。用维持液将上述病毒液进行连续10倍的稀释，稀释度为10^-1-10^-12。弃培养液，每孔接种100μL病毒稀释液，每个稀释度接种4个孔，CO₂培养箱中吸附1h，并设4孔正常细胞对照。弃培养孔中液体，换入含0.5％低熔点琼脂维持液2mL覆盖，置5％CO₂，37℃培养5-7天，取出培养板，10％甲醛固定30min，去掉孔中的琼脂块，0.5％结晶紫染色5min，蒸馏水冲洗，倒置显微镜下计数空斑。

药物配制：姜黄素以DMSO配制成母液，浓度为10mg/mL，以维持液进行稀释，浓度分别为50、25、12.5、6.25、3.1、1μmol/mL、

姜黄素细胞毒性实验：HEL细胞以1×10⁵密度接种于96孔培养板中，每孔100μL，置5％CO₂，37℃培养箱中培养至单层，加入以上浓度的姜黄素，每个浓度4复孔，另设4复孔未处理细胞作为对照。每3天换一次含药物的维持液，观察细胞生长情况，7天后弃培养液，各孔加入含0.5mg/mL MTT的无血清培养液100μL，CO₂培养箱内孵育4h，弃去培养液，每孔加入DMSO100μL，充分混匀后在酶标仪570nm波长下测定吸光度(OD值)，计算细胞存活率(％)＝实验组OD值/对照组OD值×100％，同样方法检测更昔洛韦的细胞存活率，计算药物的TC₅₀和TC₀，试验重复3次，取3次平均值作为试验结果。

药物体外对病毒增殖的抑制作用：取生长良好的HEL，以1×10⁵密度接种于96孔培养板中，每孔100μL，置5％CO₂，37℃培养箱中培养至单层，同步化24h后以每孔约100TCID₅₀病毒的攻击量攻击细胞，置于5％CO₂培养箱中，37℃吸附1h，弃上清；将药液以TD₀为最低稀释度作3个稀释浓度分别加入细胞孔中，每孔150μL，每一稀释度设8孔，同时设立细胞对照组、病毒对照组；更换维持液隔天1次；在5％CO₂培养箱中，37℃培养约8d，待病毒对照组细胞病变达到70-80％时，每孔加入5mg/ml中性红染液100μL，置5％CO₂培养箱中，37℃培养箱中培养2h取出后用生理盐水洗3次，添加脱色液100μL，室温放置10min，置酶标仪570nm波长下测吸光度(OD值)，按下列公式计算细胞存活率。试验重复3次，取平均值作为试验结果。细胞存活率(％)＝实验组(或病毒对照组)OD值/对照组OD值×100％。

姜黄素能有效地提高受HCMV感染的HEL细胞的存活率，以及显著地抑制HCMV导致的HEL细胞病变的发生，其的最低有效剂量为1μmol/L。结果见表1和附图1-3。

表1不同剂量姜黄素对HCMV活性的影响：

＊P＜0.01vs病毒对照组

2.姜黄素体内抗巨细胞病毒的研究

小鼠胚肺成纤维细胞NIH/3T3购自中国医学科学院细胞所，MCMVSmith由华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科病毒室惠赠。细胞与病毒按常规方法培养传代，病毒滴度为10^4.9TCID₅₀/0.1mL。实验动物为清洁级BALB/c雄性小鼠8-10周龄，体重20±2g，购自北京维通利华科技有限公司。

小鼠睾丸MCMV感染模型的建立：实验前鼠尾采血0.1mL/只，取血清进行ELISA检测，选择MCMV-IgM阴性小鼠进行实验，动物分为6组，即正常对照组、病毒对照组、更昔洛韦(GCV)组、姜黄素大、中、小剂量组，正常对照组于两侧睾丸处接种DMEM25μL，其余各组均接种等量的MCMV悬液。病毒接种24h后开始给药，给药方式为腹腔注射(0.5ml/次)：

正常对照组：不接种病毒，给与NS 14天。

病毒对照组：接种病毒，给与NS 14天。

GCV组：接种病毒，给与更昔洛韦60mg/Kg 14天。

姜黄素大剂量组：接种病毒，给与姜黄素60mg/Kg 14天。

姜黄素中剂量组：接种病毒，给与姜黄素30mg/Kg 14天。

姜黄素小剂量组：接种病毒，给与姜黄素15mg/Kg 14天。

给药结束后第二天处死小鼠，取两侧睾丸石蜡包埋。睾丸组织经HE染色，显微镜下观察组织的病理改变；同时采用单相寡核苷酸探针mRNA原位杂交方法检测睾丸组织MCMV感染情况，MCMV M83基因(相当于HCMV pp65基因)mRNA序列为5′CGAGACCTCCATGTCCTTCATGC 3′，5′末端进行地高辛标记，原位杂交按说明书进行，DAB染色。光镜下分析结果，细胞内出现棕黄色颗粒者判断为杂交信号阳性。

HE染色结果显示：正常对照组小鼠睾丸组织生精细胞及间质细胞排列整齐；病毒对照组曲细精管基膜坏死，管周肌样细胞变性，生精细胞排列紊乱，大部分凝固性坏死；姜黄素大剂量组只可见局部曲细精管轻微萎缩改变，但较病毒对照组明显减轻，生精细胞排列整齐，效果较更昔洛韦组显著。见图附4-7。

MCMV原位杂交结果显示：病毒对照组睾丸间质细胞和生精细胞胞浆中可见棕黄色颗粒状阳性着色，并且组织中血管各层、生精小管管周肌样细胞及睾丸包膜等亦均有强阳性杂交信号出现；姜黄素大剂量组未见有阳性杂交信号的细胞出现，且效果明显优于更昔洛韦组。见图附8-11。

以上实验证明，姜黄素具有较强的抗HCMV感染作用，与目前临床上应用于抗HCMV感染的药物更昔洛韦相比，姜黄素的作用更明显，尤其对更昔洛韦耐药株感染者；并且姜黄素具有可靠的安全性，将具有良好的应用前景。

以下通过实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1制备口服使用的姜黄素自乳化制剂

取姜黄素400mg，加无水乙醇(食用)20mL至姜黄素完全溶解，再加中碳链甘油三酯(药用)35g、聚氧乙烯蓖麻油(药用)15g、甘油15g，用力研磨至稳定的混合体系，制得姜黄素自乳化制剂样品。该样品加水稀释50倍，轻轻搅拌很快溶解分散形成浅黄色乳液，显微镜下观测，乳滴粒径小于0.5μm。

实施例2制备口服使用姜黄素自乳化半固体制剂

取姜黄素400mg，加无水乙醇(食用)20mL至姜黄素完全溶解，再加丙二醇二癸酸酯/二辛酸酯(药用)13g、土温80(药用)4g、熔融的PEG4000(药用)10g，用力研磨至稳定的混合体系，然后在室温下将无水乙醇挥干，制得姜黄素自乳化半固体制剂样品。该样品加水稀释50倍，轻轻搅拌很快溶解分散形成浅黄色乳液，显微镜下观测，乳滴粒径小于0.5μm。

实施例3制备注射用姜黄素自微乳化制剂

取姜黄素400mg，加无水乙醇(食用)20mL至姜黄素完全溶解，再加丙二醇二癸酸酯/二辛酸酯(药用)30g、土温80(药用)20g、丙二醇15g，用力研磨至稳定的混合体系，制得姜黄素自微乳化制剂样品。该样品加水稀释50倍，轻轻搅拌很快溶解分散形成浅黄色、显乳光的澄清液，显微镜下观测，乳滴粒径小于0.1μm。

实施例4制备注射用姜黄素自微乳化制剂

取姜黄素400mg，加无水乙醇(食用)20ml至姜黄素完全溶解，再加中碳链甘油三酯(药用)15g、聚氧乙烯蓖麻油(药用)15g、甘油20g，用力研磨至稳定的混合体系，制得姜黄素自微乳化制剂样品。该样品加水稀释50倍，轻轻搅拌很快溶解分散形成浅黄色、显乳光的澄清液，显微镜下观测，乳滴粒径小于0.1μm。

Claims

1.抗姜黄素及其衍生物在制备治疗和预防人巨细胞病毒感染相关疾病的药物和/或保健品中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物的有效成分是姜黄素和/或其衍生物去甲氧基姜黄素和/或双去甲氧基姜黄素。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述相关疾病包括心脑血管疾病、肾病、肝病、肺病等并有巨细胞病毒感染，以及烧伤、接受免疫抑制治疗等的患者发生巨细胞病毒感染。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物含有在药学上可接受的组分和/或载体。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物为口服制剂、胃肠外给药制剂或外用制剂。

6.如权利要求1所述的应用，其特征是姜黄素及其衍生物在药物和/或保健品中的质量百分比含量为1％至100％。