CN102180853B

CN102180853B - 抗ev71的黄酮类化合物，及其在制药中的应用

Info

Publication number: CN102180853B
Application number: CN2011100552018A
Authority: CN
Inventors: 罗晓东; 彭涛; 朱钦昌; 刘亚平; 蔡祥海
Original assignee: Kunming Institute of Botany of CAS; Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Botany of CAS; Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Priority date: 2011-03-09
Filing date: 2011-03-09
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2031-03-09
Also published as: CN102180853A

Abstract

具有如下结构式的黄酮类化合物或其药学上可接受的盐，其具有抑制肠道病毒尤其是EV71病毒活性，。

Description

抗EV71的黄酮类化合物,及其在制药中的应用

技术领域

本发明涉及黄酮类化合物在抗肠道病毒尤其是抗EV71病毒中的应用，具体地可用于手足口病、疱疹性咽峡炎、瘫痪性疾病、神经源性肺水肿、无菌性脑膜炎、脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹性疾病等多种与神经系统相关的疾病。

背景技术

手足口病是肠道病毒引起的常见传染病之一，患者以婴幼儿为主，大多数病例症状轻微，主要表现为发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹等特征，多数患者可以自愈。少数病例可发生脑膜炎、脑炎、心肌炎和肺炎等重症，个别重症患儿病情恶化快，易发生死亡，少年儿童和成人感染后大多不发病，但能够传播病毒。

手足口病疫情由EV71感染引起，传染性强，潜伏期为2～7天，病程一般为7～10天。病毒可通过咳嗽、喷嚏、谈话等日常接触传播给健康人群，特别是婴幼儿。人类感染EV71病毒后可获得免疫力，但目前尚无疫苗预防，可以复发或再感染。EV71感染引起重症的比例高于其他类型肠道病毒，重症患儿病死率较高，目前尚无特效治疗药物。

肠道病毒71型（EV71）属于小RNA病毒科（Picornaradae）肠道病毒属（Enterovirus）的成员，归属于人类肠道病毒A。1974年Schmidt等人首次报道从美国加利福尼亚暴发的表现为神经系统症状疾病（1969～1973年）的患者中分离到EV71，随后，世界上许多国家相继报道了EV71病毒在不同地区的流行情况，EV71病毒已在世界范围内引起多次暴发与流行，人们逐渐认识到EV71病毒是手足口病的主要病原。目前已知EV71的感染可以导致手足口病、疱疹性咽峡炎、瘫痪性疾病、神经源性肺水肿、无菌性脑膜炎（asepic meningitis）、脑炎（encephalitis）和脊髓灰质炎样的麻痹性疾病（poliomyelitis-like paralysis）等多种与神经系统相关的疾病。EV71可导致大范围的暴发流行，可伴有严重的CNS并发症或致死性肺水肿。近年来，EV71病毒的流行在亚太地区呈上升趋势，1975年保加利亚大流行,共有705名患儿感染，死亡44例；1997年马来西亚大流行感染2628人，死亡30多人；1998年，台湾地区暴发EV71的大流行，约有12万以上的人被感染，死亡78人。因此，有关EV71的病毒生物学特性、致病机理、诊断和预防等的研究日益受到人们的重视。

EV71病毒主要是通过口腔进入消化道。病毒首先在咽和肠道淋巴组织进行繁殖扩增，然后通过形成病毒血症进行扩散，进一步在网状内皮细胞中扩增，最终侵犯脑膜、脊髓和皮肤等靶器官。

EV71在致病性方面具有肠道病毒所共有的特点，即相同血清型的毒株在同一地区流行会引起临床症状相同疾病的暴发，但是有时也会出现相同血清型毒株分别引起散在的或流行性的临床症状不同（甚至无明显临床症状）的病例。此外，不同的肠道病毒感染可以产生相同的临床症状。两种以上的肠道病毒能够同时在消化道进行繁殖，但是有些情况下，不同肠道病毒在生长繁殖过程中会出现一种病毒的繁殖对另外一种病毒的生长产生抑制的现象。有文章报道，同一血清型EV71毒株感染能够引起临床症状明显不同的疾病暴发，提示不同EV71毒株的致病机制可能有所不同。

此种肠道传染病的感染渠道相当普遍，可以感染的人群也非常广泛，但儿童是主要发病人群。很多成人因为自身免疫力强，感染病毒后并不发病或发病无症状，成为隐性的病毒传播源。对潜在未发病的病毒感染者的发现和有效的感染源控制，是目前防止疫情扩大所面临的最大挑战。当前国内手足口病治疗用药主要有抗病毒药物（病毒唑、病毒灵等）、B族维生素（VB2等）及部分清热解毒的中药等。因此，发现高效、低毒的EV71抑制剂对手足口病治疗新药开发具有显著意义。

发明内容

本发明提供式（I）化合物在制备预防或治疗与肠道病毒尤其是EV71病毒感染相关的疾病的药物中的应用，优选地可用于手足口病、疱疹性咽峡炎、瘫痪性疾病、神经源性肺水肿、无菌性脑膜炎、脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹性疾病等多种与神经系统相关的疾病：

其中

虚线部分代表单键或双键，优选代表双键；

R¹-R¹⁰分别独立地选自氢、羟基、C_1-8烷基、C_2-8烯基、C_1-8烷氧基、C_1-8烷基羰氧基、C_1-8烷氧羰氧基、C_3-8环烷氧基羰氧基、氨基、C_1-8烷基氨基、N,N-二C_1-8烷基氨基、N-C_1-8烷基羰基氨基，并且R¹-R⁴中至少有一个是羟基，并且R⁵-R¹⁰不能全是氢。

在其中一个优选实施例中，R⁵选自羟基、甲氧基、乙氧基、乙酰氧基。

在另一个优选实施例中，R²和/或R⁴是羟基。

在又一个优选实施例中，R⁵是甲氧基且R⁴是羟基。

在又一个优选实施例中，R²、R⁵是甲氧基且R⁴是羟基，具有式（Ia）所示的结构：

在最优选的实施例中，式（I）化合物选自4',5-二羟基-3,3',6,7-四甲氧基-黄酮、4',5-二羟基-3,6,7-三甲氧基黄酮、5,4'-二羟基-3,3',7-三甲氧基黄酮、3',5-二羟基-3,4',6,7-四甲氧基黄酮。

本发明的另一方面，提供一种用于预防或治疗与EV71病毒感染相关的疾病的药物组合物，其包含式（I）化合物或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的载体和/或稀释剂，其中式（I）化合物或其药学上可接受的盐抑制EV71病毒的IC₅₀低于100μg，优选低于10μg。其可以作为适宜口服或非肠道给药（例如经静脉内、皮下或肌肉内给药）的制剂形式。所述的口服给药的制剂形式为片剂、缓释片、控释片、锭剂、硬或软胶囊、水性或油混悬剂、乳剂、可分散的散剂或颗粒剂、糖浆剂或酏剂、滴丸、微丸或口服溶液，所述的非肠道给药的制剂形式为灭菌的水性或油性溶液、无菌粉末、脂质体、乳剂、微乳剂、纳米乳剂或微囊。

本发明的药物组合物可以通过常规方法，利用本领域熟知的常规药物赋形剂来获得。所以，用于口服使用的组合物可以含有例如一种或多种着色剂、甜味剂、矫味剂和/或防腐剂。

用于片剂制剂的适宜的可药用赋形剂包括例如，惰性稀释剂例如乳糖、碳酸钠、磷酸钙或碳酸钙；制粒和崩解剂例如玉米淀粉和藻酸；粘合剂例如淀粉；润滑剂例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉；防腐剂例如对羟基苯甲酸乙酯或丙酯，和抗氧剂，例如抗坏血酸。片剂制剂可以是未包衣的，也可以采用包衣以改变其崩解作用以及活性成分在胃肠道内的后续吸收作用，或改进其稳定性和/或外观，在任意情况中，均可使用该领域熟知的常规包衣剂和方法。

口服使用的组合物可以是硬明胶胶囊的形式，其中活性成分与惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，或是软明胶胶囊形式，其中活性成分与水或油例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。

水性混悬剂一般含有微粉形式的活性成分和一种或多种助悬剂，所述助悬剂例如为羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯-吡咯烷酮、西黄蓍胶和阿拉伯胶；分散或湿润剂，例如卵磷脂或烯基氧化物与脂肪酸的缩合物（例如聚氧乙烯硬脂酸酯），或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，例如十七氧化亚乙基鲸蜡醇，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸与己糖醇的偏酯的缩合产物，例如聚氧化乙烯山梨糖醇一油酸酯，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如聚乙烯脱水山梨糖醇一油酸酯。水性混悬剂还可含有一种或多种防腐剂（例如对羟基苯甲酸乙酯或丙酯）、抗氧剂（例如抗坏血酸）、着色剂、矫味剂、和/或甜味剂（例如蔗糖，糖精和天冬酰苯丙氨酸甲酯）。

可通过将活性成分悬浮在植物油（例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油）或矿物油（例如液体石蜡）中来配制油性混悬剂。油性混悬剂也可含有增稠剂例如蜂蜡、固体石蜡或鲸蜡醇。可以加入如上所述的甜味剂和矫味剂以提供可口的口服制剂。这些组合物可以通过加入抗氧剂例如抗坏血酸来防腐。

适合通过加入水制成水性混悬剂的可分散的散剂和颗粒剂一般含有活性成分和分散剂或湿润剂、助悬剂和一种或多种防腐剂。适当的分散或湿润剂和助悬剂如上所述。也存在另外的赋形剂例如甜味剂、矫味剂和着色剂。

本发明药物组合物也可以采用水包油的乳剂的形式。油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油，或者矿物油，例如液体石蜡或者它们的混合物。适当的乳化剂可以是例如，天然树胶例如阿拉伯胶或西黄芪胶，天然磷脂例如大豆卵磷脂，和衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯（例如脱水山梨糖醇一油酸酯），以及所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧化乙烯脱水山梨糖醇一油酸酯。乳剂也可含有甜味剂、矫味剂和防腐剂。

糖浆剂和酏剂可与甜味剂（例如甘油、丙二醇、山梨糖醇、阿司帕坦或蔗糖）配制，并且也可含有缓和剂、防腐剂、矫味剂和/或着色剂。

所述药物组合物还可以是注射用无菌水性或油性混悬剂的形式，其可以按照已知方法利用一种或多种适宜的分散或湿润剂和助悬剂来配制，这些试剂如上所述。无菌注射制剂也可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的注射用无菌水性或油性混悬剂，例如在1，3-丁二醇中的溶液。

有关制剂的其他信息可参考Comprehensive Medicinal Chemistry的第5卷，25.2章(Corwin Hanschl；Chairman of Editorial Board)，PergamonPress1990。

可以根据被治疗宿主和具体给药途径的不同，来确定与一种或多种赋形剂混合以制备单一剂量形式活性成分的量。例如，用于对人口服给药的制剂一般含有例如0.5mg-2g的活性剂以及适当的和常规量的赋形剂（约占组合物总重的5-98％）。单位制剂中一般约含有1mg-500mg的活性成分。有关给药途径和给药方案的进一步信息可参考ComprehensiveMedicinal Chemistry的第5卷，25.3章(Corwin Hanschl；Chairman ofEditorial Board)，Pergamon Press1990。

供治疗或预防目的的式（I）化合物的给药量，应根据病症的性质和严重性、动物或患者的年龄和性别和给药途径，按照药物的已知原理来改变。

在基于治疗或预防目的使用式（I）化合物时，一般是以日剂量在例如0.001mg-100mg/kg体重的范围内给药，如有需要可以分剂量给药。通常，以肠胃外途径给药时采用较低剂量，例如经静脉内给药时，一般采用例如0.001mg-10mg/kg体重范围内的剂量。

本发明所述EV71活性的升高，可应用于单独治疗中，或者与一种或多种其他物质和/或适应症治疗联合。这样的联合治疗是可以通过各个治疗组分的同时、顺序或分开施用的方式达到的。同时治疗可以采用单一片剂或采用分开的片剂形式。例如，在手足口病的治疗中，可以包括下列主要种类的治疗：（1）抗病毒剂，（2）免疫增强剂。

本发明的式（I）化合物或其盐可通过用于制备此类化合物或结构上相关化合物的任何已知方法来制备，包括从植物中提取分离和化学合成。可以利用常规方法，对式（I）化合物的酚羟基（如果存在的话）进行醚化或酰化，或对官能团进行保护和脱保护。

附图说明：

图1为本发明化合物结构图；

图2－4为LP系列结构相近的黄酮类化合物进行抗EV71体外活性评价示意图；

图5为Chrysosplenetin 和penduletin 抑制EV71的空斑形成；

图6为Chrysosplenetin 和penduletin 抑制EV71病毒增殖；

图7为Chrysosplenetin 和penduletin降低病毒蛋白VP1的表达；

图8为Chrysosplenetin 和penduletin作用阶段分析；

图9为chrysosplenetin 和penduletin 主要在病毒复制早期起作用；

图10为chrysosplenetin 和penduletin抑制EV71细胞间的转播。

具体实施方式：

下面先用本发明的活性实验例来说明本发明的药理作用结果：

活性实验筛选实验：基于对感染细胞存活检测的抗EV71体外活性评价系统：

针对图1中LP系列结构相近的黄酮类化合物进行抗EV71体外活性评价，图2 中除特别标示的浓度外，其它的都使用12.5μg/ml的样品浓度。在该实验中LP系列全部样品在所设浓度下都表现一定的活性，其中LP7和LP19活性最好，而两批LP10和LP11未表现很强活性，且低浓度活性似乎更高。显微镜下观查，LP10和LP11都能保护细胞不出现EV71感染的细胞病变，

图3和图4是降低样品浓度后进行实验的结果。图3为单浓度（2.5ug/ml）实验结果，图4为从2.5μg/ml往下倍比稀释3个浓度的实验结果。结果显示，在降低浓度后LP7,LP9,LP15,LP16和LP21抗EV71活性都不高，而LP10，LP11，LP18,LP19却表现出很好的活性。LP10、LP11和LP18的活性有随着浓度降低而升高的趋势，表明三者的细胞毒性依然存在。而LP19则是随着浓度降低而降低的趋势，表明LP19没有细胞毒性。因此从图3和图4可以得到结论是，LP10,LP11,是系列黄酮中活性最强的2个，因此进一步针对LP10和LP11，即chrysosplenetin（金腰带素）和 penduletin （喷杜素）进行深入研究。

活性实验1：基于细胞病变效应（CPE）检测的抗EV71活性实验及细胞毒性实验：

结果显示，无论是在Vero细胞还是在RD细胞上，chrysosplenetin（金腰带素）和 penduletin （喷杜素）都能非常有效地抑制EV71引起的CPE，它们的IC50值都很低。与利巴韦林（SI=8.7）比较，chrysosplenetin (SI=69.5)和penduletin (SI=200)具有更高的活性和SI指数。结果表明，chrysosplenetin 和penduletin具有非常好的抑制EV71活性。

该实验同时使用Vero和RD两种细胞。96孔培养板内长成单层的细胞被同时加入100TCID₅₀的EV71病毒液和梯度稀释的chrysosplenetin（金腰带素）和 penduletin （喷杜素）溶液，实验设置病毒对照组，正常细胞对照组和样品毒性对照组。培养板在37℃培养3～4天后，使用AlamarBlue法检测细胞的存活率，并根据以下公式计算CPE抑制率：抑制率（％）= (处理组校正平均荧光值–病毒对照组平均荧光值)∕( 正常细胞对照平均荧光值 – 病毒对照组平均荧光值)。然后利用软件Microsoft Excel的Forecast 功能计算半数抑制浓度（IC50）。chrysosplenetin 和penduletin 的细胞毒性分析采用同样的AlamarBlue法。梯度浓度的样品溶液加到Vero或RD细胞上，37℃培养3天后进行细胞存活检测，并计算半数细胞毒性浓度（CC50）。利巴韦林(ribavirin)是一种广谱的抗病毒药物，在该实验中被用作对照。样品的选择指数（SI）最终通过公式CC50/IC50确定。

活性实验2：抑制空斑形成实验：

结果显示随着chrysosplenetin（金腰带素）和 penduletin （喷杜素）的浓度增大，EV71形成的空斑数就越少，其半数抑制浓度分别为0.14μM 和0.20μM。在1.25μM的浓度下，都能完全抑制EV71形成空斑。该结果再次表明其具有非常好的体外抗EV71感染活性。

24孔板内的Vero细胞单层被接种40～80PFU/孔的EV71和梯度稀释的样品溶液，37℃共同作用2h后更换含相应样品浓度的1％甲基纤维素覆盖培养基，37℃继续培养4天后，甲醛固定，结晶紫染色，最后进行空斑计数并与对照比较计算空斑形成百分率。

活性实验3：抑制EV71子代病毒增殖实验：

结果显示，chrysosplenetin（金腰带素）和 penduletin （喷杜素）都能以浓度依赖的方式显著降低子代病毒的产生，表明它们能有效抑制EV71的增殖。

96孔培养板内长成单层的Vero细胞被接种100TCID₅₀的EV71病毒液和梯度浓度的样品液，37℃培养4天后，收集细胞和上清，经三次反复冻融后，进行空斑实验，确定其滴度。通过与病毒对照比较，计算其子代病毒获得率。

活性实验4：抑制EV71子代病毒增殖实验：

结果显示，随着chrysosplenetin（金腰带素）和 penduletin （喷杜素）的浓度升高，VP1的条带越来越弱，直至消失，而内参未见明显变化。该结果表明，chrysosplenetin 和penduletin都能有效降低EV71的VP1蛋白表达。

12孔培养板内的Vero细胞接种1MOI的EV71，37℃ 吸附1小时后，吸弃病毒液并使用培养液洗一次，更换含有梯度浓度样品的培养液。37℃培养24小时后，收集细胞，并使用RIPA进行裂解获取总蛋白。15μl的细胞裂解液被用于随后的SDS-PAGE电泳。电泳后进行WesternBlot分析，一抗使用自制的VP1单克隆抗体5C3，内参为GAPDH, 二抗为HRP标记的羊抗鼠抗体。

活性实验5：chrysosplenetin和penduletin的作用阶段分析：

结果显示，在A、B、C三种处理方式中，无论是chrysosplenetin 还是penduletin，都只在A处理下表现出显著的抑制活性。该结果提示，chrysosplenetin 和penduletin主要是作用于病毒感染后阶段。

分析chrysosplenetin 和penduletin可能的作用机制，基于不同处理的作用阶段分析实验被执行。96孔板内的Vero细胞先4℃预冷10分钟，然后分别进行三种不同的处理：A. 细胞先接种500TCID50的EV71, 4℃吸附1.5小时后，吸弃并洗涤，然后换上含梯度浓度样品的培养液，4℃作用1.5小时；B.细胞先用梯度浓度样品液4℃进行处理1.5小时后，吸弃并洗涤，然后换上含500TCID50的EV71病毒液，4℃吸附1.5小时，然后吸弃并更换培养液；C.梯度浓度样品液与500TCID50的EV71病毒液先4℃混合1.5小时，然后加至预冷的Vero细胞上继续4℃ 1.5小时，然后吸弃并更换培养液。最后都转移至37℃继续培养5天后使用AlamarBlue法进行细胞存活检测。并与对照比较计算其抑制率。

活性实验6：chrysosplenetin和penduletin的作用时间点实验：

结果显示，在病毒感染后4小时以前加入chrysosplenetin 或penduletin，能几乎100％抑制病毒的复制。在6小时加入，则抑制活性降低，从感染后8小时到14小时之间加入抑制活性没有明显变化，都维持在50%左右。结果表明，chrysosplenetin 和penduletin主要在病毒复制早期发挥作用，但同时在病毒复制后期也发挥一定的作用，提示两者可能具有多个靶点。

为了进一步研究chrysosplenetin 和penduletin的作用机制，对其进行药物作用时间点实验。2.5 μM的 chrysosplenetin 或penduletin分别在Vero细胞感染1MOI EV71后的0、2、4、6、8、10、12、14小时加入, 在感染后16小时，则吸弃溶液并收集细胞，通过冻融裂解细胞后，对细胞裂解液进行空斑滴定实验，计算病毒的收获率。

活性实验7：chrysosplenetin和penduletin对EV71的细胞间传播实验：

结果显示，chrysosplenetin 和penduletin都能明显减小EV71的空斑大小，与对照比较，所设的三个浓度组都具显著差异（P<0.01）。结果表明，chrysosplenetin 和penduletin对EV71的细胞间传播也具有显著抑制活性。

以40PFU/孔的病毒量感染6孔板内的Vero细胞，37℃ 吸附2小时后，吸弃病毒液并洗涤，然后加入含梯度浓度样品的覆盖培养基，继续培养6～8天，最后显微镜下拍照，每个浓度随机选取不少于15个空斑使用Image-Pro Plus 6.0 软件进行直径测量，并计算其平均空斑面积。

结论：CPE抑制、空斑减数、子代病毒收获和VP1蛋白表达4个体外实验的结果看表明，无论是chrysosplenetin还是penduletin都能抑制EV71引起的CPE和空斑形成，都能减少EV71子代病毒的收获和VP1蛋白的表达，表现出了显著的抑制EV71体外活性。作用阶段分析、药物作用时间点实验与及病毒胞间传播抑制实验结果表明，chrysosplenetin和penduletin有相似的作用机制，主要作用在病毒感染后复制的早期，但对后期也有一定的抑制作用，同时对EV71的细胞间传播也具有显著作用。

本发明的工业实用性：

本发明的式（I）化合物或其药学上可接受的盐抑制EV71病毒的IC₅₀低于100μg，优选低于10μg，最选低于5μg，并且在低浓度下具有增强的抑制活性，可以制成药物用于治病，所述药物用于预防或治疗与肠道病毒尤其是EV71病毒感染相关的疾病，包括手足口病、疱疹性咽峡炎、瘫痪性疾病、神经源性肺水肿、无菌性脑膜炎、脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹性疾病等多种与神经系统相关的疾病。

下面的制备实施例以及本发明的化合物或其药学上可接受的盐的制剂的制备实施例，可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明：

实施例1：

化合物chrysosplenetin和penduletin的制备：

中药臭灵丹叶（Laggera Pterodonta） 150 g粉碎，以有机溶剂（甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等）提取，提取3-5次，减压回收溶剂得浸膏，浸膏在水和有机溶剂（石油醚、氯仿、乙酸乙酯等）中分配萃取，得到有机层反复进行柱层析，最终得到 chrysosplenetin (26 mg) 和 penduletin (8 mg)。

实施例2：注射液制剂的制备

按实施例1的方法先制得chrysosplenetin和penduletin，以及利用有机酸（酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等）或无机酸（盐酸，硫酸，磷酸等）制成的盐，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。

实施例3：粉针剂的制备

按实施例1的方法先制得chrysosplenetin和penduletin，以及利用有机酸（酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等）或无机酸（盐酸，硫酸，磷酸等）制成的盐，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于2安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。

实施例4：粉剂的制备

按实施例1的方法先制得chrysosplenetin和penduletin，以及利用有机酸（酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等）或无机酸（盐酸，硫酸，磷酸等）制成的盐，与赋形剂重量比为9:1的比例加入赋形剂，制成粉剂。

实施例5：片剂的制备

按实施例1的方法先制得chrysosplenetin和penduletin，以及利用有机酸（酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等）或无机酸（盐酸，硫酸，磷酸等）制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:5-1:10的比例加入赋形剂，制粒压片。

实施例6：口服液制剂的制备

按实施例1的方法先制得chrysosplenetin和penduletin，以及利用有机酸（酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等）或无机酸（盐酸，硫酸，磷酸等）制成的盐，按常规口服液制法制成口服液。

实施例7：胶囊剂、颗粒剂、或冲剂的制备

按实施例1的方法先制得chrysosplenetin和penduletin，以及利用有机酸（酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等）或无机酸（盐酸，硫酸，磷酸等）制成的盐，按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂或冲剂。

实施例8：胶囊剂、颗粒剂、或冲剂的制备

按实施例1的方法先制得chrysosplenetin和penduletin，按其与赋形剂重量比为3:1的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂或冲剂。

Claims

1.一种具有如下结构式的黄酮类化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防肠道病毒感染相关的疾病的药物中的应用，

其中

虚线部分代表单键或双键；

其中，R¹-R³、R⁶-R¹⁰分别独立地选自氢、羟基、C_2-8烯基、C_1-8烷氧基、C_1-8烷基羰氧基；

R⁴是羟基；

R⁵选自羟基、甲氧基、乙氧基、乙酰氧基。

2.根据权利要求1的应用，所述的肠道病毒是EV71病毒。

3.根据权利要求2的应用，所述的式（I）化合物具有式（Ia）所示的结构：

其中R¹、R³、R⁶-R¹⁰具有如权利要求1的含义。

4.根据权利要求1的应用，所述的式（I）化合物选自：

4',5-二羟基-3,3',6,7-四甲氧基-黄酮、4',5-二羟基-3,6,7-三甲氧基黄酮、5,4'-二羟基-3,3',7-三甲氧基黄酮、3',5-二羟基-3,4',6,7-四甲氧基黄酮。

5.根据权利要求1-4任一项的应用，所述的肠道病毒为EV71病毒，所述的与肠道病毒感染相关的疾病选自手足口病、疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎、脑炎、瘫痪性疾病、脊髓灰质炎样的麻痹性疾病、神经源性肺水肿。

6.根据权利要求1-4任一项的应用，其中所述的治疗或预防肠道病毒感染相关的疾病的药物为包含所述的式（I）化合物或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的载体和/或稀释剂的药物组合物，其中所述的式（I）化合物或其药学上可接受的盐抑制EV71病毒的IC₅₀低于100μM。

7.根据权利要求6的应用，其中式（I）化合物或其药学上可接受的盐抑制EV71病毒的IC₅₀低于10μM。

8.根据权利要求7的应用，其特征在于所述药物组合物作为适宜口服或注射给药的制剂形式。

9.根据权利要求8的应用，所述的口服给药的制剂形式为片剂、锭剂、硬或软胶囊、滴丸、微丸、水性或油混悬剂、乳剂、可分散的散剂或颗粒剂、口服溶液、糖浆剂或酏剂，所述的注射给药的制剂形式为灭菌的水性或油性溶液、无菌粉末、脂质体、乳剂或微囊。

10.根据权利要求9的应用，所述的片剂为缓释片、控释片，所述的乳剂为微乳剂或纳米乳剂。