CN115887522A

CN115887522A - 甘草提取物在制备治疗和/或预防黄病毒类病毒感染药物中的应用

Info

Publication number: CN115887522A
Application number: CN202211353832.2A
Authority: CN
Inventors: 余林中; 刘俊珊; 卢子滨; 石玲珠; 曹惠慧
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2022-10-31
Filing date: 2022-10-31
Publication date: 2023-04-04

Abstract

本发明公开了甘草提取物在制备治疗和/或预防黄病毒类病毒包括登革病毒尤其是登革2型病毒感染药物中的应用。甘草提取物为甘草正丁醇提取物。试验表明甘草正丁醇提取物对2型登革病毒有良好的抑制吸附活性，可作为临床治疗由登革2型病毒引起的疾病的候选药物，具有十分良好的药用前景。

Description

甘草提取物在制备治疗和/或预防黄病毒类病毒感染药物中的应用

技术领域

本发明属于中药技术领域，具体涉及甘草提取物在制备治疗和/或预防黄病毒类病毒感染药物中的应用，尤其涉及甘草的正丁醇提取物在制备治疗和/或预防登革病毒感染药物中的应用。

背景技术

登革病毒(Dengue virus，DENV)是小包膜病毒黄病毒属家族的成员，可引起登革热及重症登革热。DENV根据包膜蛋白E的表面抗原性不同，一共分为DENV-1，DENV-2，DENV-3，DENV-44种血清型，其中DENV-2传播流行最为广泛。

目前，登革病毒感染的机制尚不明确，临床上尚未有有效的抗登革病毒药物，而疫苗的开发也由于登革病毒四种不同的血清型以及其本身具有的抗体依赖增强作用举步维艰。因此，研制有效的抗登革病毒药物迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供甘草提取物在制备治疗和/或预防黄病毒类病毒尤其是登革病毒感染药物中的应用，以充分挖掘甘草的医药价值，为治疗登革热开辟中草药途径。

本发明的目的还在于提供一种采用所述甘草提取物作为活性成分用于治疗和/或预防黄病毒类病毒(包括登革热病毒尤其是登革2型病毒)感染的药物组合物。

本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：甘草提取物在制备治疗和/或预防黄病毒类病毒感染药物中的应用。

甘草是豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、胀果甘草Glycyrrhizainflate Bat.或光果甘草Glycyrrhizaglabra L.的干燥根和根茎，具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药的功效。现代药理研究表明甘草具有抗病毒、肾上腺皮质激素样作用、调节身体免疫力、抗炎抗变态反应等作用。但是，甘草抗登革病毒的活性及其作用机制尚不清楚。本发明旨在阐明甘草正丁醇提取物抗黄病毒类病毒比如抗登革病毒的作用。

优选的，所述黄病毒类病毒为登革病毒。

优选的，所述登革病毒为登革2型病毒。

优选的，所述甘草提取物为甘草的正丁醇提取物。

优选的，所述甘草提取物通过以下方法制备获得：

(1)乙醇提取：取甘草，依次采用不同体积浓度的乙醇浸泡，超声提取，合并上清液，回收溶剂得甘草混悬液，备用；

(2)极性分离：取甘草混悬液，依次用水饱和的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到甘草正丁醇提取物，经旋蒸和干燥，得到甘草正丁醇提取物粉末。

在该甘草提取物的制备方法中：

优选的，步骤(1)中乙醇的体积浓度依次为90％，70％和50％，甘草和乙醇的料液比为1∶8～1∶12，常温浸泡时间为1.5～2.5h，超声提取时，超声波频率为40KHz，提取时间为20～40min。

更佳的，步骤(1)中乙醇的体积浓度依次为90％，70％和50％，甘草和乙醇的料液比为1∶10，常温浸泡时间为2h，超声波频率为40KHz，提取时间为30min。

优选的，步骤(2)中水饱和的石油醚、乙酸乙酯、或正丁醇与甘草混悬液的体积比为2∶1～4∶1，萃取次数为3～5次。

更佳的，优选的，步骤(2)中水饱和的石油醚、乙酸乙酯、或正丁醇与甘草混悬液的体积比为3∶1，萃取次数为3次。

优选的，步骤(2)中将甘草正丁醇提取物经减压旋转蒸发除去溶剂，冷冻干燥得到甘草提取物。

优选的，所述药物含有甘草提取物及药学上可接受的辅料。

本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：一种药物组合物，含有作为活性成分的所述的甘草提取物，以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

本发明中的药物组合物还进一步包括含有作为活性成分的所述的甘草提取物或甘草提取物的活性单体，其药学上可接受的盐或它们的溶剂合物，以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

优选的，所述药学上可接受的赋形剂包括溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂和粘合剂中的一种或两种以上的组合。

在本发明的技术方案中，所述药物组合物包括多种临床药物剂型，如胶囊剂、颗粒剂、片剂、注射剂、脂质体纳米粒、缓释剂、控释剂或分散片等。

本发明具有以下优点：本发明证实了甘草正丁醇提取物对于登革2型病毒具有良好吸附抑制作用，可作为临床治疗由登革2型病毒引起的疾病的候选药物，具有十分良好的药用前景。

附图说明

图1是实施例1中甘草正丁醇提取物LC-MS/MS正离子模式(A)和负离子模式(B)总离子流图；

图2是实施例3中甘草正丁醇提取物对DENV-2感染BHK-21细胞的保护作用；

图3是实施例4中甘草正丁醇提取物对感染DENV-2的BHK-21细胞内E蛋白和NS1蛋白mRNA合成的抑制作用；

图4是实施例5中甘草正丁醇提取物对感染DENV-2的BHK-21细胞内病毒蛋白合成的抑制作用；

图5是实施例6中甘草正丁醇提取物抑制DENV-2吸附宿主细胞；

图6是实施例7中甘草正丁醇提取物抑制DENV-2感染K562、Huh7、Vero和C6/36细胞系；

图7是实施例8中甘草正丁醇提取物对感染DENV-2的ICR乳鼠的保护作用。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。以下采用的原料，如无特殊说明，均为市售产品。

实施例1

本实施例提供的甘草提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)乙醇提取

本实施例所用于提取试验的甘草购自康美药业股份有限公司，甘草依次采用不同体积浓度的乙醇浸泡，超声提取，合并上清液，回收溶剂得甘草混悬液，备用；

乙醇的体积浓度依次为90％，70％和50％，甘草和乙醇的料液比为1∶10，常温浸泡时间为2.0h，超声波频率为40KHz，提取时间为30min。

(2)极性分离

取甘草混悬液，置于分液漏斗中，依次用水饱和的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到甘草正丁醇提取物。

水饱和的石油醚、乙酸乙酯、或正丁醇与甘草混悬液的体积比为3∶1，萃取次数为3次。

将上述甘草正丁醇提取物减压旋转蒸发挥去溶剂，冷冻干燥得到甘草正丁醇提取物粉末，备用。

甘草正丁醇提取物LC-MS/MS正离子模式(A)和负离子模式(B)总离子流图如图1所示，结果表明GRE在正离子、负离子模式下均有响应值较高的特征吸收峰，其中共鉴定出27个化合物，包括：L-脯氨酸、5-羟甲基糖醛、盐酸葫芦巴碱、鸟嘌呤、烟碱、夏佛塔苷、豆苷、异佛来心苷、芹糖甘草苷、甘草苷、甘草素、柚皮素、芒柄花苷、刺芒柄花素、美迪紫檀素、光甘草内酯、皂皮酸、毛蕊异黄酮、甘草酸、甘草次酸、淫羊藿素、8-异戊烯基柚皮素、甘草黄酮A、光甘草定、Kanzonol C、α-亚麻酸、桑黄酮等。

本发明接下来采用DENV-2(由南方医科大学姚新刚教授提供)感染乳仓鼠肾细胞(Baby Hamster Syrian Kidney，BHK-21，由南方医科大学赵卫教授提供)为模型，评价了甘草正丁醇提取物对DENV-2感染BHK-21细胞的抑制活性。试验首先检测甘草正丁醇提取物对BHK-21细胞的细胞毒性，以不同浓度的甘草正丁醇提取物作用于BHK-21细胞，以了解细胞在不同甘草正丁醇提取物浓度下的存活率，为后续的甘草正丁醇提取物对DENV-2的抑制作用实验提供参考数据。接下来，以不同浓度的甘草正丁醇提取物作用于已经感染了DENV-2的BHK-21细胞，从细胞存活率、病毒关键蛋白mRNA表达水平、蛋白质表达水平三个方面来获得甘草正丁醇提取物对病毒的抑制作用。试验进一步证明了甘草正丁醇提取物通过抑制病毒复制周期的吸附过程而发挥抗病毒作用，并且甘草正丁醇提取物在K562、Huh7、Vero和C6/36细胞系上均能起到抗登革病毒感染的作用。此外，甘草正丁醇对感染登革病毒的ICR乳鼠具有保护作用。

具体如下实施例2-8中所示：

实施例2

甘草正丁醇提取物对BHK-21细胞的毒性评价试验

试验方法：取对数生长期的BHK-21细胞以8×10³个/孔的密度接种于96孔板中，每孔加入100μL的含10％FBS的RPMI1640培养液。培养24h后，弃去旧培养基并加入含不同浓度实施例1中制备的甘草正丁醇提取物(7.81、15.63、31.25、62.5、125、250、500、1000μg/mL)的RPMI1640维持液(2％FBS)。继续培养72h，避光每孔加入20μL的5mg/mLMTT溶液，在培养箱中放置4h后，弃去上清液，每孔加入100μL的DMSO，轻轻拍打板边缘使结晶充分溶解，在酶标仪570nm波长处检测各孔的OD值。

计算BHK-21细胞存活率：细胞存活率％＝甘草提取物组平均OD值/空白组平均OD值×100％。

试验结果：7.81～250μg/mL甘草正丁醇提取物作用于BHK-21细胞72h后，和不给药组相比，细胞存活率＞90％，提示甘草正丁醇提取物在低于125μg/mL浓度下，无明显细胞毒性，安全性高(表1)。

表1不同浓度的甘草正丁醇提取物对BHK-21细胞的毒性试验

实施例3

甘草正丁醇提取物对DENV-2感染后BHK-21细胞的保护试验

试验方法：取对数生长期的BHK-21细胞以8×10³个/孔的密度接种于96孔板中。培养24h后，弃去旧培养基并用PBS清洗2次，同时给予200PFU DENV-2和不同浓度的甘草正丁醇提取物(2.5、5、10、20、40μg/mL)或阳性药物肝素(50、100μg/mL)，37℃感染1h。吸附完成后，吸弃含药病毒液，PBS洗2次清洗未吸附的病毒，加入200μL含2％FBS的RPMI1640培养基于37℃、5％CO₂培养箱中培养96h。待观察到模型组细胞出现明显的病变时，每孔加入10μLCCK-8试剂，并在450nm波长处检测各孔OD值，计算细胞存活率。使用肝素作为阳性药。

细胞存活率％＝甘草正丁醇提取物组平均OD值/空白组平均OD值×100％。

空白组是指不给甘草正丁醇提取物也不给其他药物的组别，图2中第一列黑色的代表空白组，不给药处理。

试验结果：甘草正丁醇提取物GRE在5μg/mL浓度下对感染DENV-2的BHK-21细胞的存活率达到80％，10μg/mL时达到95％，说明甘草正丁醇提取物GRE对DENV-2感染导致的BHK-21细胞死亡具有显著的保护作用。后续实验采用2.5、5、10μg/mL的甘草正丁醇提取物GRE，50μg/mL的肝素H作为阳性药物(图2)。

实施例4

甘草正丁醇提取物对DENV-2关键蛋白E蛋白和NS1蛋白的mRNA表达抑制试验

试验方法：BHK-21细胞以1×10⁵接种于6孔板中，病毒感染及甘草正丁醇提取物处理如实施例3中方法进行(甘草正丁醇提取物浓度分别为2.5、5、10μg/mL，50μg/mL肝素作为阳性药物组)。培养至48h后，根据试剂盒的说明书，使用Trizol试剂从细胞中提取总mRNA。按照日本Takara公司PrimeScript^TM RT reagent Kit(Perfect Real Time)将1000ng的mRNA逆转录为cDNA。配制20μL PCR反应体系用以扩增cDNA，40个扩增循环条件设置如下：在95℃变性2min，在95℃退火10s，并在60℃延伸30s。最后，根据目的基因标准曲线计算样品中目的基因mRNA的拷贝数。目标蛋白RNA的正反引物及相应探针序列见表2。

表2 E蛋白和NS1蛋白RNA的正反引物及相应探针序列

试验结果表明：浓度为2.5、5、10μg/mL甘草正丁醇提取物GRE可抑制DENV-2中结构蛋白E蛋白和非结构蛋白NS1蛋白的mRNA表达，呈浓度依赖性，并且10μg/mL甘草正丁醇提取物GRE的抑制效果优于阳性药肝素H(图3)。

实施例5

甘草正丁醇提取物对DENV-2关键蛋白E蛋白和NS1蛋白的蛋白质表达抑制试验

试验方法：BHK-21细胞以2×10⁵接种于60mm细胞培养皿中，病毒感染及甘草正丁醇提取物处理如实施例3中方法进行(甘草正丁醇提取物浓度分别为2.5、5、10μg/mL，50μg/mL肝素作为阳性药物组)。培养至48h后，从细胞中提取总蛋白，用10％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，随后转移到PVDF膜上。转膜后用5％脱脂牛奶在室温条件下封闭2h后，加入相应的E蛋白、NS1蛋白和β-actin蛋白一抗，4℃孵育过夜。用TBST洗涤三次后，加入相应的二抗，在4℃孵育2h。TBST冲洗三次后，采用Bio-Rad成像系统，使用ECL发光检测试剂盒检测发光情况。

试验结果表明：随着甘草正丁醇提取物GRE浓度增高，DENV-2中结构蛋白E蛋白和非结构蛋白NS1蛋白的表达水平逐渐降低，表明甘草正丁醇提取物GRE可以抑制登革病毒中关键蛋白E蛋白和NS1蛋白的表达水平(图4)。

实施例6

甘草正丁醇提取物抑制DENV-2吸附宿主细胞

试验方法：试验使用DENV-2(200PFU)感染BHK-21细胞，给予实施例1中制备的甘草正丁醇提取物(10μg/mL)或肝素(50μg/mL)进行治疗。对于改变药物添加时间试验，细胞或病毒在含化合物的100μL培养基中预孵育3h(“Pre Cells”和“Pre virus”)；或感染时，同时给予细胞DENV-2和药物(“Co”)；或感染后，先用病毒感染细胞1h，再加入化合物(Post)。对于变温分析试验，BHK-21先在4℃感染DENV-2(200PFU)1h。之后，用冷PBS清洗细胞2次，并将细胞转移到37℃培养箱培养4d。病毒吸附和感染期间，在不同的时间点给予细胞含甘草正丁醇提取物或肝素的RPMI-1640溶液(-1h，0h，1h，2h)。4d后，采用CCK-8法测定甘草正丁醇提取物对DENV-2感染的抑制作用。

病毒感染的各个阶段包括：病毒吸附、病毒进入/融合和细胞内复制。利用改变药物添加时间以及变温分析实验可确定甘草正丁醇提取物在体外病毒复制周期的哪一个阶段发挥抗病毒作用。

试验研究结果表明：甘草正丁醇提取物GRE抑制登革病毒活性仅出现在病毒吸附进入阶段，而在其他三个阶段没有明显的作用(图5中A图)。使用肝素H作为阳性药物，进一步明确了甘草正丁醇提取物GRE通过抑制病毒吸附宿主细胞起抗病毒作用(图5中B图)。

因此，甘草正丁醇提取物对2型登革病毒有良好的抑制吸附活性，用于登革病毒感染的治疗和/或防治具有显著的进步，可作为临床治疗由登革2型病毒引起的疾病的候选药物，具有十分良好的药用前景。

实施例7

甘草正丁醇提取物对感染DENV-2的不同细胞系的保护试验

试验方法：K562(1×10⁶个/孔)、Huh7(1×10⁵个/孔)、Vero(2×10⁵个/孔)和C6/36(1×10⁶个/孔)细胞接种于6孔板中培养24h，病毒感染及药物处理如实施例3中所述(甘草正丁醇提取物浓度分别为2.5、5、10μg/mL)。qRT-PCR法检测详见实施例4。

为了确定甘草正丁醇提取物在不同细胞中的抗病毒特异性，本实验使用了其他来源的4个细胞系，分别是K562、Huh7、Vero和C6/36细胞。K562、Huh7、Vero细胞均来自于中国科学院生物化学与细胞生物学研究所；C6/36细胞由南方医科大学赵卫教授慷提供。

试验结果表明：与在BHK-21细胞上的结果相似，qRT-PCR检测结果显示，甘草正丁醇提取物GRE在这些细胞系中均具有剂量依赖性的抗DENV-2活性(图6)。

实施例8

甘草正丁醇提取物对感染DENV-2ICR乳鼠的体内保护试验

试验方法：7日龄ICR乳鼠随机分为5组，每组8只，组别为空白组、模型组、甘草正丁醇提取物低剂量组(2.5mg/kg)、甘草正丁醇提取物中剂量组(5mg/kg)，甘草正丁醇提取物高剂量组(10mg/kg)。将DENV-2或对照RPMI-1640接种于ICR乳鼠的脑内(400PFU)和腹腔(4×10⁵PFU)构建登革热模型，分别于造模后的第1、3、5d灌胃给予甘草正丁醇提取物或等体积水，每天监测ICR乳鼠感染DENV后的体重、临床评分和生存率，连续10d。疾病症状分级如下：0分为健康症状，1分为轻微症状(活动能力下降和驼背姿势)，2分为边缘痉挛，3分为移动困难(前肢或后肢虚弱)，4分为瘫痪，5分为死亡。

试验结果表明：甘草正丁醇提取物GRE减轻了感染DENV-2乳鼠的体重变化(图7中A图)和临床评分(图7中B图)。同时，感染DENV-2的乳鼠在6～10天内发生严重疾病并死亡，而甘草正丁醇提取物GRE治疗延迟了DENV-2诱导的死亡(图7中C图)。上述结果表明甘草正丁醇提取物GRE对DENV-2诱导的乳鼠致病和致死具有一定的保护作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.甘草提取物在制备治疗和/或预防黄病毒类病毒感染药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征是：所述黄病毒类病毒为登革病毒。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征是：所述登革病毒为登革2型病毒。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征是：所述甘草提取物为甘草的正丁醇提取物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征是所述甘草提取物通过以下方法制备获得：

6.根据权利要求5所述的应用，其特征是：步骤(1)中乙醇的体积浓度依次为90％，70％和50％，甘草和乙醇的料液比为1∶8～1∶12，常温浸泡时间为1.5～2.5h，超声提取时频率为40KHz，提取时间为20～40min。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征是：步骤(2)中水饱和的石油醚、乙酸乙酯、或正丁醇与甘草混悬液的体积比为2∶1～4∶1，萃取次数为3～5次。

8.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征是：所述药物含有甘草提取物及药学上可接受的辅料。

9.一种用于治疗和/或预防黄病毒类病毒感染的药物组合物，其特征是：所述药物组合物包括作为活性成分的甘草提取物以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

10.一种用于治疗和/或预防登革热病毒感染的药物组合物，其特征是：所述药物组合物包括作为活性成分的甘草提取物以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。