CN104650108B - 连翘脂素硫酸酯及其衍生物、制备方法及其应用 - Google Patents

连翘脂素硫酸酯及其衍生物、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了如下式所示的连翘脂素硫酸酯衍生物、制备方法及其抗病毒应用等。

Description

连翘脂素硫酸酯及其衍生物、制备方法及其应用
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体而言，本发明涉及连翘脂素硫酸酯衍生物及其制备方法，以及这一类衍生物在抗病毒方面的药理作用。
背景技术
连翘脂素，为连翘苷的糖配基部分，又称作连翘苷元，为木犀科连翘属植物连翘的主要活性成分，其结构如下式所示，现代药理研究表明，连翘脂素有抗病毒、抗氧化、降低血脂、清楚自由基、抑菌、抗肿瘤、抗炎等作用。
连翘脂素分子不稳定，易被氧化，且在酸性环境下分子构型容易发生改变。通过大鼠肠内菌模拟连翘苷的代谢研究发现，极易被肠道内菌群代谢为新的代谢物。
通过含酚类结构药物代谢研究发现，含酚羟基结构的药物易被体内硫酸酯酶代谢为酚的硫酸酯衍生物，并具有良好的活性。例如大豆黄素硫酸酯衍生物、依达拉奉硫酸酯衍生物、染料木素硫酸酯衍生物、白藜芦醇硫酸酯衍生物等等。因此我们设计出连翘苷苷元的硫酸酯衍生物，并进行了化学合成及药理研究。
发明内容
本发明的要解决的技术问题是采用化学合成方法制备连翘脂素硫酸酯衍生物。本发明提供的连翘脂素硫酸酯衍生物。另外，本发明还提供了制备连翘脂素硫酸酯衍生物的方法，适合工业化放大生产。
首先，本发明提供了如下式所示的连翘脂素硫酸酯及其衍生物，
其中，R为H、Na+、K+、NH4 +、四甲基铵、四乙基铵、甲基胺基、二甲基胺基、三甲基胺基、三乙基胺基、二乙基胺基、乙基胺基、乙醇胺基、二乙醇胺基、哌啶基、哌嗪基或吡嗪基。
其次，本发明提供了药物组合物，其包括本发明连翘脂素硫酸酯衍生物，以及药学上可接受的辅料。
在本文中，药学上可接受的辅料指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、载体、pH调节剂、离子强度调节剂、缓释或控释剂、包裹材料或其他制剂辅料。所用载体可与相应的给药形式相适应，可使用本领域技术人员所知晓的辅料配成注射剂、(注射用)冻干粉、喷雾剂、口服溶液、口服混悬液、片剂、胶囊、肠溶片、丸剂、粉剂、颗粒剂、持续释放或延迟释释放等制剂。优选本发明第一方面的连翘脂素硫酸酯衍生物通过注射或经消化道方式给药，因此，本发明的药物组合物优选为注射剂或经消化道给药的制剂，即适于配制成注射和经消化道方式给药的辅料特别优选的。其中，“经消化道给药”在本文中指药物制剂通过患者消化道的给药方式，包括口服、灌胃给药和灌肠给药等，优选是口服，如可使用本领域技术人员所知晓的辅料配成口服溶液、口服混悬液、片剂、胶囊、肠溶片、丸剂、粉剂、颗粒剂、持续释放或延迟释释放等制剂；其中，注射给药的制剂主要是针剂和粉针剂。
再次，本发明提供了一种连翘脂素硫酸酯及其衍生物的制备方法，包括如下顺序进行的步骤：
1)将连翘脂素溶于有机溶剂，制得连翘脂素溶液；
2)首先向连翘脂素溶液中加入硫酸化试剂，混合均匀；然后进行酯化反应，得到产物混合液；
3)加入碱调节混合液pH值为8-10；
4)分离、纯化，即得。
其中，步骤1)中所述有机溶剂选择吡啶、N,N-二甲基甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺或二氯甲烷中的一种。
其中，步骤2)中在0～5℃的温度下向连翘脂素溶液中加入所述的硫酸化试剂。
特别是，在0℃的温度下向连翘脂素溶液中加入所述的硫酸化试剂，并搅拌均匀。
特别是，所述硫酸化试剂选择氯磺酸、三氧化硫三乙胺络合物、三氧化硫吡啶络合物或三氧化硫三甲胺络合物，优选为氯磺酸。
特别是，所述连翘脂素溶液中的连翘脂素与所述的硫酸化试剂的摩尔比为1：1-10，优选为1：2。
其中，步骤2)中所述酯化反应的温度为0-110℃。
特别是，所述连翘脂素与氯磺酸进行所述的酯化反应的反应温度为0-10℃，优选为10℃；所述连翘脂素与三氧化硫三乙胺络合物、三氧化硫吡啶络合物或三氧化硫三甲胺络合物进行所述的酯化反应的反应温度为100-110℃。
尤其是，所述连翘脂素与三氧化硫三乙胺络合物、三氧化硫吡啶络合物或三氧化硫三甲胺络合物进行所述的酯化反应后，还包括将酯化反应后的混合物降温后再加入碱，调节混合液的pH值为8-10。
特别是，将酯化反应后的混合物降低至室温(10-30℃)。
其中，步骤3)中所述pH值优选为10；所述碱选择有机碱或无机碱。
特别是，所述无机碱选择碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠、氢氧化钾或氨水中的一种，优选为氢氧化钠、氢氧化钾溶液或氨水；所述有机碱选择四甲基铵、四乙基铵、甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、三乙基胺、二乙基胺、乙基胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪或吡嗪。
其中，步骤4)中采用硅胶柱层析分离产物混合液。
特别是，所述硅胶选用GF254硅胶。
本发明的优势在于，本发明的连翘脂素硫酸酯衍生物的制备方法易于控制，产品的综合得率高，适宜工业化大规模生产。
附图说明
图1流感病毒肺炎模型小鼠肺组织病理切片镜检图；
图2副流感病毒肺炎模型小鼠肺组织病理切片镜检图。
具体实施方式
以下通过实施例进一步描述本发明，但这些实施例仅是说明本发明，而不应理解为对本发明范围的任何限制。另外，实施例中的试剂、原料都可以通过商业渠道获得，如有未尽之处，可以参考有机合成指南、药品监管机构的指引以及相应仪器、试剂的厂商说明书等。
实施例1
1、将连翘脂素(4g，10.75mmo)加入180ml干燥的无水吡啶中，搅拌溶解，制得连翘脂素溶液；
2、在冰浴条件下，向连翘脂素溶液中滴加氯磺酸(1.4ml，约21.5mmol)的二氯甲烷溶液，边滴加边搅拌，滴加速度为1滴(约50ul/滴)/2s；即，本实施例中连翘脂素与氯磺酸的摩尔比为1:2。
3、滴加结束后，在搅拌状态下升温并保持温度为10℃，进行酯化反应；
4、在保持温度为10℃的情况下酯化反应完全，反应1h后加入氢氧化钠的甲醇溶液(5ml)，调节pH值为10，接着将反应混合物减压蒸馏去除溶剂，然后上样于GF254硅胶柱层析，洗脱液为氯仿和甲醇的混合液，其中氯仿与甲醇的体积比为9:1。硅胶柱层析得到连翘脂素硫酸钠(化合物1)。
连翘脂素硫酸钠(3g)为白色固体，溶于水、乙醇。在TLC板上展开(层析液为氯仿/甲醇10：1，Rf为0.4)后喷雾10％H2SO4-乙醇试剂呈现紫红色。ESI-MS谱中，m/z[M-Na]-为451，分子量为474。
化合物1的1H-NMR(600MHz，d6-DMSO)如下：
δ(ppm):7.4(1H，d，J＝8.4Hz，H-)，6.9(5H，m，Ar-H)，4.8(1H，d，J＝4.8Hz，H-6)，4.38(H，d，J＝6.6Hz，H-8)，4.10(1H，d，J＝9.0Hz，H-2)，3.75(12H，d，J＝8.4Hz，H-8,4，O-CH3)，3.11(1H，t，J＝8.1Hz，H-5)，2.85(1H，d，J＝7.2Hz，H-1)；
化合物1的13C-NMR(150MHz，d6-DMSO)如下：
δ(ppm):150.99(C-3″)，148.97(C-3′)，148.10(C-4″)，142.51(C-4′)，137.20(C-1″)，131.73(C-1′)，121.33(C-5′)，118.09(C-6′)，118.06(C-6″)，112.09(C-5″)，110.94(C-2′)，110.00(C-2″)，87.22(C-2)，81.76(C-6)，70.87(C-8)，69.44(C-4)，56.23(C-OCH3)，55.99(C-OCH3)，54.54(C-OCH3)，53.37(C-1)，49.78(C-5)ppm
根据ESI-MS、1H-NMR和13C-NMR的测试数据，确定化合物1的分子式为：C21H23O9SNa，结构式为：
实施例2
1、将连翘脂素(4g，10.75mmo)加入180ml干燥的无水吡啶中，搅拌溶解，制得连翘脂素溶液；
2、在冰浴条件下，向连翘脂素溶液中滴加氯磺酸(1.4ml，约21.5mmol)的二氯甲烷溶液，边滴加边搅拌，滴加速度为1滴(约50ul/滴)/2s；即，本实施例中连翘脂素与氯磺酸的摩尔比为1:2。
3、滴加结束后，在搅拌状态下升温并保持温度为10℃，进行酯化反应；
4、在保持温度为10℃的情况下酯化反应完全，反应1h后加入氢氧化钾的甲醇溶液(5ml)，调节pH值为10，接着将反应混合物减压蒸馏去除溶剂，然后上样于GF254硅胶柱层析，洗脱液为氯仿和甲醇的混合液，其中氯仿与甲醇的体积比为9:1。硅胶柱层析得到连翘脂素硫酸钾(化合物2)。
连翘脂素硫酸钾(3g)为白色固体，溶于水、乙醇。在TLC板上展开(层析液为氯仿/甲醇10：1，Rf为0.4)后喷雾10％H2SO4-乙醇试剂呈现紫红色。ESI-MS谱中，m/z[M-K]-为451，分子量为490。
化合物2的1H-NMR(600MHz，d6-DMSO)如下：
δ(ppm):7.4(1H，d，J＝8.4Hz，H-)，6.9(5H，m，Ar-H)，4.8(1H，d，J＝4.8Hz，H-6)，4.38(H，d，J＝6.6Hz，H-8)，4.10(1H，d，J＝9.0Hz，H-2)，3.75(12H，d，J＝8.4Hz，H-8,4，O-CH3)，3.10(1H，t，J＝8.1Hz，H-5)，2.84(1H，d，J＝7.2Hz，H-1)；
化合物2的13C-NMR(125MHz，d6-DMSO)如下：
δ(ppm):150.99(C-3″)，148.97(C-3′)，148.10(C-4″)，142.51(C-4′)，137.20(C-1″)，131.73(C-1′)，121.33(C-5′)，118.09(C-6′)，118.06(C-6″)，112.09(C-5″)，110.95(C-2′)，110.00(C-2″)，87.23(C-2)，81.76(C-6)，70.87(C-8)，69.44(C-4)，56.21(C-OCH3)，55.99(C-OCH3)，54.52(C-OCH3)，53.37(C-1)，49.78(C-5)ppm
根据ESI-MS、1H-NMR和13C-NMR的测试数据，确定化合物2的分子式为：C21H23O9SK；结构式为：
实施例3
1、将连翘脂素(4g，10.75mmo)加入180ml干燥的无水吡啶中，搅拌溶解，制得连翘脂素溶液；
2、在冰浴条件下，向连翘脂素溶液中滴加氯磺酸(1.4ml，约21.5mmol)的二氯甲烷溶液，边滴加边搅拌，滴加速度为1滴(约50ul/滴)/2s；即，本实施例中连翘脂素与氯磺酸的摩尔比为1:2。
3、滴加结束后，在搅拌状态下升温并保持温度为10℃，进行酯化反应；
4、在保持温度为10℃的情况下酯化反应完全，反应1h后加入氨水(5ml)，调节pH值为8，接着将反应混合物减压蒸馏去除溶剂，然后上样于GF254硅胶柱层析，洗脱液为氯仿和甲醇的混合液，其中氯仿与甲醇的体积比为9:1。硅胶柱层析得到连翘脂素硫酸铵(化合物3)。
连翘脂素硫酸铵(3g)为白色固体，溶于水、乙醇。在TLC板上展开(层析液为氯仿/甲醇10：1，Rf为0.4)后喷雾10％H2SO4-乙醇试剂呈现紫红色。ESI-MS谱中，m/z[M-NH4]-为451，分子量为469。
化合物3的1H-NMR(600MHz，d6-DMSO)如下：
δ(ppm):7.4(1H，d，J＝8.4Hz，H-)，6.9(5H，m，Ar-H)，4.8(1H，d，J＝4.8Hz，H-6)，4.38(H，d，J＝6.6Hz，H-8)，4.10(1H，d，J＝9.0Hz，H-2)，3.75(12H，d，J＝8.4Hz，H-8,4，O-CH3)，3.12(1H，t，J＝8.1Hz，H-5)，2.86(1H，d，J＝7.2Hz，H-1)；
化合物3的13C-NMR(125MHz，d6-DMSO)如下：
δ(ppm):150.99(C-3″)，148.97(C-3′)，148.10(C-4″)，142.51(C-4′)，137.20(C-1″)，131.73(C-1′)，121.32(C-5′)，118.09(C-6′)，118.06(C-6″)，112.09(C-5″)，110.94(C-2′)，110.00(C-2″)，87.22(C-2)，81.76(C-6)，70.87(C-8)，69.44(C-4)，56.21(C-OCH3)，55.99(C-OCH3)，54.52(C-OCH3)，53.37(C-1)，49.78(C-5)ppm
根据ESI-MS、1H-NMR和13C-NMR的测试数据，确定化合物3的分子式为：C21H27NO9S；结构式为：
实施例4
1、将连翘脂素(4g，10.75mmol)加入180ml干燥的无水N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌溶解，制得连翘脂素溶液；
2、在冰浴条件下，向连翘脂素溶液中滴加含三氧化硫三乙胺复合物(3.89g，约21.5mmol)的二氯甲烷溶液，边滴加边搅拌，滴加速度为1滴(约50ul/滴)/2s；即，本实施例中连翘脂素与三氧化硫三乙胺复合物的摩尔比为1:2。
3、滴加结束后，在搅拌状态下升温并保持温度为110℃，进行酯化反应；
4、在保持温度为110℃的情况下酯化反应完全，反应1h后降温到室温，加入氨水(5ml)，调节pH值为8，接着将反应混合物减压蒸馏去除溶剂，然后上样于GF254硅胶柱层析，洗脱液为氯仿和甲醇的混合液，其中氯仿与甲醇的体积比为9:1。硅胶柱层析得到连翘脂素硫酸铵(化合物3)。
连翘脂素硫酸铵(3g)为白色固体，溶于水、乙醇。在TLC板上展开(层析液为氯仿/甲醇10：1，Rf为0.4)后喷雾10％H2SO4-乙醇试剂呈现紫红色。ESI-MS谱中，m/z[M-NH4]-为451，分子量为469。
化合物3的1H-NMR(600MHz，d6-DMSO)如下：
δ(ppm):7.4(1H，d，J＝8.4Hz，H-)，6.9(5H，m，Ar-H)，4.8(1H，d，J＝4.8Hz，H-6)，4.38(H，d，J＝6.6Hz，H-8)，4.10(1H，d，J＝9.0Hz，H-2)，3.75(12H，d，J＝8.4Hz，H-8,4，O-CH3)，3.12(1H，t，J＝8.1Hz，H-5)，2.86(1H，d，J＝7.2Hz，H-1)；
化合物3的13C-NMR(125MHz，d6-DMSO)如下：
δ(ppm):150.99(C-3″)，148.97(C-3′)，148.10(C-4″)，142.51(C-4′)，137.20(C-1″)，131.73(C-1′)，121.32(C-5′)，118.09(C-6′)，118.06(C-6″)，112.09(C-5″)，110.94(C-2′)，110.00(C-2″)，87.22(C-2)，81.76(C-6)，70.87(C-8)，69.44(C-4)，56.21(C-OCH3)，55.99(C-OCH3)，54.52(C-OCH3)，53.37(C-1)，49.78(C-5)ppm
根据ESI-MS、1H-NMR和13C-NMR的测试数据，确定化合物3的分子式为：C21H27NO9S；结构式为：
实施例5
1、将连翘脂素(4g，10.75mmo)加入180ml干燥的无水N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌溶解，制得连翘脂素溶液；
2、在冰浴条件下，向连翘脂素溶液中滴加含三氧化硫吡啶复合物(3.68g，约21.5mmol)的二氯甲烷溶液，边滴加边搅拌，滴加速度为1滴(约50ul/滴)/2s；即，本实施例中连翘脂素与三氧化硫吡啶复合物的摩尔比为1:2。
3、滴加结束后，在搅拌状态下升温并保持温度为110℃，进行酯化反应；
4、在保持温度为110℃的情况下酯化反应完全，反应1h后降温到室温，加入氢氧化钾的甲醇溶液(5ml)，调节pH值为8，接着将反应混合物减压蒸馏去除溶剂，然后上样于GF254硅胶柱层析，洗脱液为氯仿和甲醇的混合液，其中氯仿与甲醇的体积比为9:1。硅胶柱层析得到连翘脂素硫酸钾(化合物2)。
连翘脂素硫酸钾(3g)为白色固体，溶于水、乙醇。在TLC板上展开(层析液为氯仿/甲醇10：1，Rf为0.4)后喷雾10％H2SO4-乙醇试剂呈现紫红色。ESI-MS谱中，m/z[M-K]-为451，分子量为490。
化合物2的1H-NMR(600MHz，d6-DMSO)如下：
δ(ppm):7.4(1H，d，J＝8.4Hz，H-)，6.9(5H，m，Ar-H)，4.8(1H，d，J＝4.8Hz，H-6)，4.38(H，d，J＝6.6Hz，H-8)，4.10(1H，d，J＝9.0Hz，H-2)，3.75(12H，d，J＝8.4Hz，H-8,4，O-CH3)，3.10(1H，t，J＝8.1Hz，H-5)，2.84(1H，d，J＝7.2Hz，H-1)；
化合物2的13C-NMR(125MHz，d6-DMSO)如下：
δ(ppm):150.99(C-3″)，148.97(C-3′)，148.10(C-4″)，142.51(C-4′)，137.20(C-1″)，131.73(C-1′)，121.33(C-5′)，118.09(C-6′)，118.06(C-6″)，112.09(C-5″)，110.95(C-2′)，110.00(C-2″)，87.23(C-2)，81.76(C-6)，70.87(C-8)，69.44(C-4)，56.21(C-OCH3)，55.99(C-OCH3)，54.52(C-OCH3)，53.37(C-1)，49.78(C-5)ppm
根据ESI-MS、1H-NMR和13C-NMR的测试数据，确定化合物2的分子式为：C21H23O9SK；结构式为：
实施例6
1、将连翘脂素(4g，10.75mmo)加入180ml干燥的无水N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌溶解，制得连翘脂素溶液；
2、在冰浴条件下，向连翘脂素溶液中滴加含三氧化硫三甲胺复合物(2.99g，约21.5mmol)的二氯甲烷溶液，边滴加边搅拌，滴加速度为1滴(约50ul/滴)/2s；即，本实施例中连翘脂素与三氧化硫三甲胺复合物的摩尔比为1:2。
3、滴加结束后，在搅拌状态下升温并保持温度为100℃，进行酯化反应；
4、在保持温度为100℃的情况下酯化反应完全，反应1h后降温到室温，加入氢氧化钾的甲醇溶液(5ml)，调节pH值为8，接着将反应混合物减压蒸馏去除溶剂，然后上样于GF254硅胶柱层析，洗脱液为氯仿和甲醇的混合液，其中氯仿与甲醇的体积比为9:1。硅胶柱层析得到连翘脂素硫酸钾(化合物2)。
连翘脂素硫酸钾(3g)为白色固体，溶于水、乙醇。在TLC板上展开(层析液为氯仿/甲醇10：1，Rf为0.4)后喷雾10％H2SO4-乙醇试剂呈现紫红色。ESI-MS谱中，m/z[M-K]-为451，分子量为490。
化合物2的1H-NMR(600MHz，d6-DMSO)如下：
δ(ppm):7.4(1H，d，J＝8.4Hz，H-)，6.9(5H，m，Ar-H)，4.8(1H，d，J＝4.8Hz，H-6)，4.38(H，d，J＝6.6Hz，H-8)，4.10(1H，d，J＝9.0Hz，H-2)，3.75(12H，d，J＝8.4Hz，H-8,4，O-CH3)，3.10(1H，t，J＝8.1Hz，H-5)，2.84(1H，d，J＝7.2Hz，H-1)；
化合物2的13C-NMR(125MHz，d6-DMSO)如下：
δ(ppm):150.99(C-3″)，148.97(C-3′)，148.10(C-4″)，142.51(C-4′)，137.20(C-1″)，131.73(C-1′)，121.33(C-5′)，118.09(C-6′)，118.06(C-6″)，112.09(C-5″)，110.95(C-2′)，110.00(C-2″)，87.23(C-2)，81.76(C-6)，70.87(C-8)，69.44(C-4)，56.21(C-OCH3)，55.99(C-OCH3)，54.52(C-OCH3)，53.37(C-1)，49.78(C-5)ppm
根据ESI-MS、1H-NMR和13C-NMR的测试数据，确定化合物2的分子式为：C21H23O9SK；结构式为：
试验例1连翘脂素硫酸酯衍生物抗病毒作用试验
1体外抗病毒试验
1.1试验材料
(1)药物
1)连翘脂素硫酸酯衍生物：连翘脂素硫酸钠、连翘脂素硫酸钾、连翘脂素硫酸铵，均为白色粉末，大连富生天然药物开发有限公司生产，分别经高效液相色谱两种检测器紫外检测器和蒸发光散射检测器面积归一化法测定，其纯度分别为99.9％、99.5％、99.2％。
2)利巴韦林注射液，无色透明液体，由河南润弘股份有限公司生产，产品批号：1206261，国药准字：H19993553，100mg/ml，作为本次试验阳性对照药物。
3)磷酸奥司他韦，中国药品生物制品检定所。产品批号：101096-200901，100mg/支作为本次试验阳性对照药物。
上述药品均用纯净水溶解，滤过，除菌分装，4℃备用，为本次试验待测药物。
(2)细胞株
Vero(非洲绿猴肾细胞细胞)由吉林大学基础医学院保存细胞株。
(3)病毒株
1)流感病毒购于中国预防医学科学院病毒研究所。
2)副流感病毒购于中国预防医学科学院病毒研究所。
3)呼吸道合胞病毒(RSV)购于中国预防医学科学院病毒研究所。
4)柯萨奇病毒B3(CVB3)株来源于美国,为本教研室保存。
5)柯萨奇病毒A16(CoxA16)株由日本仙台国立医院馈赠，于本教研室保存。
6)肠道病毒EV71株由日本仙台国立医院馈赠，于本教研室保存。
7)腺病毒(AdV)来源于白求恩医科大学一院儿科研究室。
8)单纯疱疹病毒I型(HSV-1)购于卫生部药品生物制品检定所。
(4)主要设备与试剂：
1.2试验方法
(1)细胞准备
Vero细胞传代培养1-2d，使之成片，界线清晰，立体感及折光度强时，用胰酶消化，待细胞面出现针尖样小孔，吸尽消化液，取数毫升培养液吹散细胞，计数，用培养液(含10％胎牛血清的DMEM)稀释至约5×107个/L后，接种于96孔培养板内，待细胞长成单层。
(2)药物毒性测定
细胞毒性试验：将药物按表1所示浓度进行稀释，用于细胞毒性测定。
表1药物稀释参照表(单位：g/L)
将上述用维持液(含2％胎牛血清的DMEM)稀释好的不同浓度的药品滴加于Vero单层细胞上，每孔0.2ml，每个浓度6个复孔，另设6孔正常对照(不加药物的正常对照组)和6孔空白对照(培养液)，置37℃，5％CO2培养箱中培养，每日置倒置显微镜观察CPE并记录。72h后，每孔加入MTT溶液20μL(5mg·mL－1)，继续孵育4h，吸弃各孔培养液，每孔加入100μLDMSO，振荡5min，492nm测定OD值，计算细胞存活率。在SPSS 18.0统计软件中，将细胞存活率进行Probit回归分析，计算药物对Vero细胞的最大无毒浓度(TC0)和半数毒性浓度(TC50)。
(3)各种病毒TCID50的测定
将各种病毒进行10倍递减稀释为10-1,10-2,10-3，10-4，10-5，10-6不同稀释度，按序接种于单层的Vero细胞96孔培养板上，每孔100μL，每个稀释度6孔，同时设正常细胞对照组。置37℃，5％CO2中孵育2h，弃病毒液，随即每孔加细胞维持液100μL，置37℃，5％CO2中培养。第3天开始在显微镜下观察细胞病变结果，第7-8天判定结果并做好记录，以能使50％细胞孔发生阳性病变的最高稀释度作为终点，用karber法计算病毒滴度。
公式
TCID50：50％组织细胞感染量
XM：病毒最高浓度稀释度的对数
d：稀释度系数(倍数)的对数
Σpi：每个稀释度病变百分数的总和
(4)药物对病毒致细胞病变作用的影响
取已长满单层细胞的培养板，吸弃培养液，以100TCID50对应的病毒攻击量接种细胞，37℃，5％CO2培养箱吸附2h，加入特定浓度(最大无毒浓度左右)的各药液，每浓度6个复孔培养，200μL/孔。设利巴韦林注射液和磷酸奥司他韦为阳性药物对照组，同时设正常对照组(不加病毒不加药)和病毒对照组(加病毒但不加药物的对照组)，观察药物对病毒致CPE的影响。72h后，用MTT比色法，在492nm波长下测定OD值，计算药物抗病毒有效率(ER％)。在SPSS 18.0统计软件中用ANOVA法比较各药物抗病毒有效率之间的显著性差异。
ER％＝(药物处理组平均OD值－病毒对照组平均OD值)/(细胞对照组平均OD值－病毒对照组平均OD值)×100％
1.3试验结果
(1)各种病毒的TCID50
副流感病毒：
流感病毒：
CVB3：
HSV-1：
AdV：
RSV：
CoxA16：
EV71：
(2)药物毒性测定
1)药物对细胞毒性的测定
各药物对Vero细胞的最大无毒浓度(TC0)、半数毒性浓度(TC50)及药物抗病毒实验用浓度见表2。
表2药物细胞毒性实验结果(单位：g/L)
2)药物对病毒致细胞病变保护作用结果
药物抗各种病毒的有效率及ANOVA法单因素方差分析结果，详见表3。
表3药物抗病毒有效率(ER％)统计表
表3结果显示，连翘脂素硫酸盐——连翘脂素硫酸钠、连翘脂素硫酸钾、连翘脂素硫酸铵抑制流感病毒、副流感病毒、柯萨奇病毒(CoxA16)的有效率均大于90％，与病毒对照组相比差异具有统计学意义；对呼吸道合胞病毒RSV、单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-I)的抑制率均大于80％作用，有效率均高于80％，与病毒对照组相比差异具有统计学意义；且三种连翘脂素硫酸盐衍生物对上述病毒的疗效表现优于利巴韦林和磷酸奥司他韦的趋势。
2.体内抗病毒试验
2.1实验材料
(1)实验动物
昆明种小鼠由吉林大学白求恩医学部实验动物中心提供，医动字第10-5219号。
2)检测试剂
主要实验仪器
2.2实验方法
(1)流感病毒和副流感病毒对小鼠半数致死量的测定
将流感病毒和副流感病毒(细胞裂解液)10倍递比稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5浓度的病毒液。取昆明种小鼠120只，流感病毒和副流感病毒组各60只，分别随机分成6组，乙醚轻度麻醉小鼠，滴鼻感染不同稀释度病毒液0.03mL/只。同时设空白对照，用生理盐水代替病毒悬液。以死亡和生存为观察指标，每天观察，直至感染后的14天。感染24h内死亡的为非特异死亡，不予统计，Karber法计算病毒液LD50。计算公式：[其中：LD50：半数致死量；XM：病毒最高浓度稀释度的对数；d：稀释度系数(倍数)的对数；Σpi：每个稀释度病变百分数的总和]。
(2)环氧烷糖苷抗流感病毒和副流感病毒感染所致肺炎的研究
1)试验动物及分组
取四周龄的昆明小鼠360只，进行2项试验。取小鼠180只，随机分成18组，每组10只，用于连翘脂素硫酸盐对流感病毒感染小鼠肺指数和肺指数抑制率的测定试验。另取小鼠180只，随机分成18组，每组10只，用于连翘脂素硫酸盐对肺悬液病毒血凝滴度的测定试验。
2)感染方法
在200～300mL大小的烧杯内放入一团脱脂棉，然后倒入适量的乙醚(使脱脂棉变湿即可)，把装有脱脂棉的烧杯倒扣过来，把小鼠放入进行麻醉，见小鼠极度兴奋，明显呈无力样时，将小鼠仰卧，滴鼻感染15LD50流感病毒和副流感病毒0.03ml/鼻孔，正常对照组用生理盐水代替病毒悬液。
3)给药方法及给药剂量
连翘脂素硫酸钠，连翘脂素硫酸钾药物组和利巴韦林对照组，分别于感染前一天开始常规灌胃给药，连翘脂素硫酸钠、连翘脂素硫酸钾高、中、低给药剂量分别为13.0、6.5、3.25mg/kg，利巴韦林阳性药给药剂量为58.5mg/kg，每天一次，连续给药5d，病毒对照组灌服相同体积的生理盐水。
4)观察指标
①肺指数测定
小鼠用药后第5天，先禁食水8小时，称体重后摘眼球放血处死动物，打开胸腔摘出全肺，以生理盐水洗涤两次，用滤纸吸干表面水份，电子天平称肺重，按下列公式计算计算肺指数和肺指数抑制率：
肺指数＝(小鼠肺重/小鼠体重)×100％。
肺指数抑制率＝(感染模型组平均肺指数-实验组平均肺指数)/感染模型组平均肺指数×100％。
②肺悬液病毒血凝滴度测定
分别取治疗后第5天的各组小鼠肺，低温下置匀浆器研磨成匀浆，生理盐水稀释为10％的肺组织悬液，离心取上清，倍比稀释，按0.2ml/孔滴于滴定板上,每孔加入0.2ml 1％鸡红细胞悬液,混匀,置室温30min,观察记录血凝滴度。以红细胞凝集(++)时为終点，以悬液稀释倍数表示其滴度。
③肺组织形态学观察
分别取治疗后第5天的各组小鼠肺，肉眼观察记录脏大体病变情况。生理盐水中漂洗干净，用滤纸吸干，取一部分10％甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色，显微镜下观察并拍照。
2.3实验结果及分析
(1)流感病毒和副流感病毒对小鼠半数致死量的测定结果
实验组昆明种小鼠分别被滴鼻感染不同浓度流感病毒、副流感病毒液30μL，感染第3天前3组(病毒浓度为10-1组、10-2组、10-3组)小鼠均出现不同程度的发病症状：耸毛、发抖、饮食减少等；第5天小鼠出现走路摇摆不定；第6天最高病毒浓度组小鼠开始出现死亡，其余各组于感染后第7天陆续出现死亡现象。观察14天结束后，统计各组小鼠死亡数目，结果见下表4、5。计算该流感病毒的LD50为稀释度10-2.9，副流感病毒的LD50为稀释度10-2.5。
表4流感病毒半数致死量试验结果统计
Karber法计算病毒的LD50。流感病毒的LogLD50如下：
表5副流感病毒半数致死量试验结果统计
Karber法计算病毒的LD50。副流感病毒的LogLD50如下：
(2)连翘脂素硫酸盐抗流感病毒和副流感病毒感染所致肺炎的作用结果
①肺指数测定
流感病毒和副流感病毒感染小鼠后，平均肺指数结果显示：与感染模型组比较，正常对照组、各浓度药物组和利巴韦林组肺指数明显降低(P<0.05)，连翘脂素硫酸盐浓度在3.25～13.0mg/kg/d范围内有一定保护作用，肺指数均明显降低，但连翘脂素硫酸盐高剂量组降低较其他两组更明显，但各组间比较无明显差异(P>0.05)。连翘脂素硫酸盐中、高剂量组优于利巴韦林组(P>0.05)。结果见表6、7。
表6连翘脂素硫酸盐对流感病毒感染小鼠肺指数和肺指数的抑制率
*表示与病毒对照组比较#表示与利巴韦林组比较
表7连翘脂素硫酸盐对副流感病毒感染小鼠肺指数和肺指数抑制率的影
*表示与病毒对照组比较#表示与利巴韦林组比较
②肺悬液病毒血凝滴度测定
流感病毒和副流感病毒感染小鼠后，感染模型组肺组织病毒血凝滴度(InX)分别为32.33和33.86，不同浓度环氧烷糖苷治疗5天后，肺组织病毒血凝滴度均有所下降，与感染模型组比较，差异有显著性,(P<0.05)。连翘脂素硫酸盐高、中、低剂量组与利巴韦林组比较，病毒血凝滴度均高于利巴韦林组，差异有显著性(P<0.05)，连翘脂素硫酸盐高剂量组血凝滴度与其他两组比较差异显著(P<0.05)。副流感病毒感染小鼠的连翘脂素硫酸盐高剂量与利巴韦林组比较无明显差异(P>0.05)，连翘脂素硫酸盐中、低剂量组均明显高于利巴韦林组，差异有显著性(P<0.05)，连翘脂素硫酸盐高剂量组血凝滴度与连翘脂素硫酸盐低剂量组比较差异显著(P<0.05)，见表8、9。
表8连翘脂素硫酸盐对流感病毒感染小鼠肺悬液血凝滴度的影响
*表示与病毒对照组比较#表示与利巴韦林组比较
表9连翘脂素硫酸盐对副流感病毒感染小鼠肺悬液血凝滴度的影响
*表示与病毒对照组比较#表示与达菲组比较
③肺组织学检测结果
流感病毒和副流感病毒肺炎模型组小鼠肺脏大多数有充血，水肿病变，有些呈暗褐色外观的实变区，严重病例呈现棕红色的出血病灶。镜下可见，支气管、细支气管壁、肺泡壁等肺间质充血、水肿以及淋巴细胞、单核细胞浸润，肺泡壁增宽，肺泡呈炎症反应。流感病毒和副流感病毒肺炎小鼠模型经连翘脂素硫酸盐治疗后，各组鼠肺大体病变明显减轻，部分肺组织形态结构正常；与感染模型组相比，肺泡间隔较薄，肺泡壁和细支气管壁单个核细胞浸润数量较少，腔内无渗出，病变明显减轻。连翘脂素硫酸盐治疗副流感病毒肺炎的中、高剂量组与感染模型组相比，肺泡间隔明显较薄，单个核细胞浸润数量较少，腔内无渗出，病变明显减轻。
流感病毒肺炎模型小鼠肺组织病理切片镜检检测结果如图1所示，图1A为正常小鼠肺组织；图1B为流感病毒肺炎小鼠的肺组织；图1C为流感病毒肺炎小鼠模型经阳性药物利巴韦林的治疗后的小鼠的肺组织；图1D为流感病毒肺炎小鼠模型经连高剂量翘脂素硫酸盐治疗后的小鼠的肺组织；图1E为流感病毒肺炎小鼠模型经连中剂量翘脂素硫酸盐治疗后的小鼠的肺组织；图1F为流感病毒肺炎小鼠模型经连低剂量翘脂素硫酸盐治疗后的小鼠的肺组织。
副流感病毒肺炎模型小鼠肺组织病理切片镜检检测结果如图2所示，图2A为正常小鼠肺组织；图2B为副流感病毒肺炎小鼠的肺组织；图2C为副流感病毒肺炎小鼠模型经阳性药物利巴韦林的治疗后的小鼠的肺组织；图2D为流感病毒肺炎小鼠模型经连高剂量翘脂素硫酸盐治疗后的小鼠的肺组织；图2E为副流感病毒肺炎小鼠模型经连中剂量翘脂素硫酸盐治疗后的小鼠的肺组织；图2F为副流感病毒肺炎小鼠模型经连低剂量翘脂素硫酸盐治疗后的小鼠的肺组织。
2.4结论
体内抗病毒试验结果显示，连翘脂素硫酸盐(连翘脂素硫酸钠和连翘脂素硫酸钾)在3.25mg/kg/d～13mg/kg/d的剂量范围对流感病毒和副流感病毒及所引起的小鼠病毒性肺炎具有较明显的抑制作用，能明显降低其肺指数和血凝滴度，肺组织病理学也有明显改善，与模型对照组比较差异显著。

Claims (7)

1.一种具有如下化学结构式所示的连翘脂素硫酸酯衍生物，
其中，R为H、Na+、K+、NH4 +、四甲基铵、四乙基铵、甲基胺基、二甲基胺基、三甲基胺基、三乙基胺基、二乙基胺基、乙基胺基、乙醇胺基、二乙醇胺基、哌啶基、哌嗪基或吡嗪基。
2.一种如权利要求1所述的连翘脂素硫酸酯衍生物的制备方法，包括如下顺序进行的步骤：
1)将连翘脂素溶于有机溶剂，制得连翘脂素溶液；
2)首先向连翘脂素溶液中加入硫酸化试剂，混合均匀；然后进行酯化反应，得到产物混合液；
3)加入碱调节混合液pH值为8-10；
4)分离、纯化，即得。
3.权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述硫酸化试剂选择氯磺酸、三氧化硫三乙胺络合物、三氧化硫吡啶络合物或三氧化硫三甲胺络合物。
4.权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述碱选择有机碱或无机碱。
5.一种如权利要求1所述的连翘脂素硫酸酯衍生物在制备抗病毒药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抗病毒药物选择抗流感病毒药物、抗副流感病毒药物、抗呼吸道合胞病毒药物、抗单纯疱疹病毒Ⅰ型药物、抗柯萨奇病毒A16药物。
7.一种抗病毒药物，其特征在于含有连翘脂素硫酸酯衍生物，其中所述连翘脂素硫酸酯衍生物具有如下化学结构式：
其中，R为H、Na+、K+、NH4 +、四甲基铵、四乙基铵、甲基胺基、二甲基胺基、三甲基胺基、三乙基胺基、二乙基胺基、乙基胺基、乙醇胺基、二乙醇胺基、哌啶基、哌嗪基或吡嗪基。
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