KR20160085886A - 필리게놀 설페이트 및 이의 유도체, 및 이들의 제조 방법 및 용도 - Google Patents

필리게놀 설페이트 및 이의 유도체, 및 이들의 제조 방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

하기 화학식 (I)로 표현되는 필리게놀 설페이트 유도체, 이의 제조 방법 및 항바이러스 용도가 제공된다:

Description

필리게놀 설페이트 및 이의 유도체, 및 이들의 제조 방법 및 용도{PHILLYGENOL SULPHATE AND DERIVATIVE THEREOF, AND PREPARATION METHOD AND APPLICATION THEREOF}
기술 분야
본 발명은 약용 화학 분야에 속하며, 특히 포르시티아시드 설페이트(forsythiaside sulfate) 유도체 및 이의 제조 방법뿐만 아니라 바이러스 내성과 관련한 상기 유도체의 약리학적 효과에 관한 것이다.
배경 기술
포르시틴(forsythin)의 아글리콘 부분으로서의 포르시티아시드는 또한 필리게닌(phillygenin)으로 공지되어 있으며, 이는 물푸레나무과(family Oleaceae)의 포르시티아(Forsythia) 속의 포르시티아 서스펜사(Forsythia suspensa)의 주요 활성 성분으로, 하기 표시되는 바와 같은 구조를 갖는다. 현대의 약리학적 연구는 포르시티아시드가 항바이러스, 항산화제, 혈액 지질 저하, 자유 라디칼 청소, 항박테리아, 항종양, 항염증 효과 등을 갖는 것을 제시한다:
Figure pct00001
.
포르시티아시드는 산화되는 경향이 있고, 산성 환경에서 형태가 변하기 쉬운 불안정한 분자를 갖는다. 래트 장내 박테리아를 통한 포르시틴 대사 자극 연구에서 포르시틴은 장 균무리에 의해 새로운 대사물로 용이하게 대사되는 것으로 밝혀졌다.
페놀 구조 약물의 대사에 대한 연구에서 페놀 하이드록실의 구조를 갖는 약물이 생체 내 설파타제(sulfatase)에 의해 페놀 설페이트 유도체로 용이하게 대사되고, 우수한 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 다이드제인 설페이트(daidzein sulfate) 유도체, 에다라본 설페이트(edaravone sulfate) 유도체, 제니스테인 설페이트(genistein sulfate) 유도체, 레스베라트롤 설페이트(resveratrol sulfate) 유도체 등. 따라서, 본 발명자는 필리게닌의 설페이트 유도체를 설계하였고, 화학적 합성 및 약리학적 연구를 수행하였다.
발명의 개요
본 발명에 의해 해결되는 기술적 문제는 화학적 합성 방법에 의해 포르시티아시드 설페이트 유도체를 제조하는 것이다. 본 발명은 포르시티아시드 설페이트 유도체를 제공한다. 또한, 본 발명은 포르시티아시드 설페이트 유도체를 제조하기 위한 방법을 또한 제공하며, 이는 산업적 규모 확대 생산에 적합하다.
첫째로, 본 발명은 하기 식에 의해 표현되는 포르시티아시드 설페이트 및 이의 유도체를 제공한다:
Figure pct00002
상기 식에서, R은 H, Na+, K+, NH4 +, 테트라메틸 암모늄, 테트라에틸 암모늄, 메틸아미노, 디메틸아미노, 트리메틸아미노, 트리에틸아미노, 디에틸아미노, 에틸아미노, 에탄올아미노, 디에탄올아미노, 피페리딜, 피페라지닐 또는 피라지닐이다.
둘째로, 본 발명은 본 발명의 포르시티아시드 설페이트 유도체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
여기서, 약학적으로 허용되는 부형제는 비-독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 담체, pH 조절제, 이온 강도 조절제, 서방형 또는 조절-방출 작용제, 포장 물질 또는 다른 약학적 부형제를 나타낸다. 사용되는 담체는 해당 약물 투여 방식에 적합화될 수 있으며, 주사액, 동결-건조된 분말(주사용), 스프레이, 경구 용액, 경구 현탁액, 정제, 캡슐, 장용 정제, 환약, 분말, 과립, 지속-방출 또는 지연-방출 제조물 등으로 제형화시키기 위해 당업자에게 널리 공지된 부형제를 이용할 수 있다. 본 발명의 첫번째 양태의 포르시티아시드 설페이트 유도체가 바람직하며, 이는 주사에 의하거나 소화관을 통해 투여되고, 따라서 본 발명의 약학적 조성물은 바람직하게는 주사액 또는 소화관을 통해 투여되는 제조물이며, 즉, 주사액 또는 소화관을 통해 투여되는 제조물로 제형화되기에 적합한 보조 물질이 특히 바람직하고, 여기서 "소화관을 통한 투여"는 본원에서 경구 투여, 위내 투여, 관장 투여 등, 바람직하게는 경구 투여를 포함하는 환자의 소화관을 통해 약물 제조물을 투여하는 접근법을 나타내고, 예를 들어, 당업자에게 널리 공지된 부형제가 경구 용액, 경구 현탁액, 정제, 캡슐, 장용 정제, 환약, 분말, 과립, 지속-방출 또는 지연-방출 제조물 등으로 제형화하기 위해 이용될 수 있으며, 주사 제조물은 주로 주사액 및 분말-주사제이다.
셋째로, 본 발명은 포르시티아시드 설페이트 및 이의 유도체의 제조 방법을 제공하며, 상기 제조 방법은,
1) 포르시티아시드를 유기 용매에 용해시켜 포르시티아시드 용액을 획득하는 단계;
2) 먼저 황산화제를 포르시티아시드 용액에 첨가하고 잘 혼합한 후, 에스테르화 반응을 수행하여 생성 혼합물 액체를 획득하는 단계;
3) 염기를 첨가하여 혼합물 액체의 pH 값을 8-10으로 조정하는 단계; 및
4) 혼합물 액체를 분리시키고 정제하여 최종 생성물을 획득하는 단계를 순차적으로 수행하는 것을 포함한다.
단계 1)의 유기 용매는 피리딘, N,N-디메틸메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드 또는 디클로로메탄 중 하나로부터 선택된다.
황산화제는 0-5℃에서 포르시티아시드 용액에 첨가된다.
특히, 황산화제는 0℃에서 포르시티아시드 용액에 첨가되고, 균일하게 교반된다.
특히, 황산화제는 클로로설폰산, 황 트리옥시드-트리에틸아민 복합체, 황 트리옥시드-피리딘 복합체 또는 황 트리옥시드-트리메틸아민 복합체, 및 바람직하게는 클로로설폰산으로부터 선택된다.
특히, 포르시티아시드 용액 중 포르시티아시드 대 황산화제의 몰비는 1:1-10, 바람직하게는 1:2이다.
단계 2)에서 에스테르화 반응의 온도는 0-110℃이다.
특히, 포르시티아시드 및 클로로설폰산에 대해 수행되는 에스테르화 반응의 반응 온도는 0-10℃, 바람직하게는 10℃이고, 포르시티아시드 및 황 트리옥시드-트리에틸아민 복합체, 황 트리옥시드-피리딘 복합체 또는 황 트리옥시드-트리메틸아민 복합체에 대해 수행되는 에스테르화 반응의 반응 온도는 100-110℃이다.
특히, 포르시티아시드 및 황 트리옥시드-트리에틸아민 복합체, 황 트리옥시드-피리딘 복합체 또는 황 트리옥시드-트리메틸아민 복합체에 대해 수행되는 에스테르화 반응 후, 상기 방법은 에스테르화 반응의 혼합물을 냉각시킨 후, 염기를 첨가하여 혼합물의 pH 값을 8-10으로 조정하는 것을 추가로 포함한다.
특히, 에스테르화 반응의 혼합물은 실온(10-30℃)으로 냉각된다.
단계 3)에서 pH 값은 바람직하게는 10이고, 염기는 유기 염기 또는 무기 염기로부터 선택된다.
특히, 무기 염기는 소듐 카르보네이트, 포타슘 카르보네이트, 소듐 바이카르보네이트, 포타슘 바이카르보네이트, 소듐 하이드록시드, 포타슘 하이드록시드 또는 수성 암모니아, 바람직하게는 소듐 하이드록시드, 포타슘 하이드록시드 용액 또는 수성 암모니아 중 하나로부터 선택되고, 유기 염기는 테트라메틸 암모늄, 테트라에틸 암모늄, 메틸 아민, 디메틸 아민, 트리메틸 아민, 트리에틸 아민, 디에틸 아민, 에틸 아민, 에탄올 아민, 디에탄올 아민, 피페리딘, 피페라진 또는 피라진으로부터 선택된다.
생성물 혼합물 액체는 단계 4)에서 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 분리된다.
특히, 실리카 겔은 GF254 실리카 겔을 선택한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 항바이러스 약물의 제조에서의 포르시티아시드 설페이트 및 이의 유도체의 용도를 제공한다.
항바이러스 약물은 항-인플루엔자 약물, 항-파라인플루엔자 약물, 항-호흡기 세포융합 바이러스 약물, 항-단순 헤르페스 바이러스 타입-I 약물, 및 항-콕사키바이러스 A16 약물로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 포르시티아시드 설페이트 또는 포르시티아시드 설페이트 유도체를 함유하는 항바이러스 약물을 제공한다.
본 발명의 장점은 다음과 같다: 본 발명의 포르시티아시드 설페이트 유도체의 제조 방법은 제어하기에 용이하고, 생성물의 포괄적 수율이 높고, 산업적 대량 생산에 적합하고; 본 발명의 포르시티아시드 설페이트 유도체는 유의한 항바이러스 효과를 갖고, 바이러스에 대한 억제 효능은 80% 초과에 도달하고; 생체 내 항바이러스 시험의 결과는 포르시티아시드 설페이트 유도체가 인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스뿐만 아니라 이에 의해 야기되는 마우스 바이러스 폐렴에 대한 비교적 유의한 억제 효과를 갖고, 폐 지수 및 적혈구응집 역가를 유의하게 감소시킬 수 있고, 또한 폐 조직병리학을 유의하게 개선시키는 것을 나타낸다.
도면의 간단한 설명
도 1은 인플루엔자 바이러스 폐렴 모델 마우스의 폐 조직 병리 섹션의 현미경 시험 이미지이고;
도 2는 파라인플루엔자 바이러스 폐렴 모델 마우스의 폐 조직 병리 섹션의 현미경 시험 이미지이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 하기 구체예를 통해 추가로 기재된다. 그러나, 이들 구체예는 단지 예시를 위한 것을 의미하며, 본 발명의 범위에 대한 어떠한 제한으로 해석되어선 안된다. 또한, 구체예에서의 시약 및 원료 물질은 모두 상업적으로 이용 가능할 수 있고, 언급되지 않는 경우, 유기 합성 가이드, 약물 조절 투여의 가이드라인 및 장비 및 시약에 대한 상응하는 제조업체의 설명서 등이 참조될 수 있다.
구체예 1
1. 포르시티아시드(4 g, 10.75 mmol)가 180 ml의 건조된 무수 피리딘에 첨가되고, 용해를 위해 교반이 수행되어 포르시티아시드 용액이 획득된다;
2. 얼음 배쓰의 조건하에서, 클로로설폰산의 디클로로메탄 용액(1.4 ml, 약 21.5 mmol)이 포르시티아시드 용액으로 적가되고, 교반이 동시에 수행되고, 적가의 속도는 1 점적(약 50 ul/점적)/2 s이고, 즉, 본 구체예에서 포르시티아시드 대 클로로설폰산의 몰비는 1:2이다.
3. 교반 조건하에서 적가의 완료 후, 온도가 상승되고 10℃에서 유지되고, 에스테르화 반응이 수행된다;
4. 10℃에서 온도를 유지하는 조건하에서, 1시간 동안 반응 시 에스테르화 반응이 완료되고, 소듐 하이드록시드의 메탄올 용액(5 ml)이 첨가되어 pH 값이 10으로 조정되고, 반응 혼합물이 이후 감압을 이용하여 증류되어 용매가 제거된 후, 샘플이 GF254 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 상에 로딩되며, 용리액은 클로로포름 및 메탄올의 혼합물 액체이고, 여기서 클로로포름 대 메탄올의 체적비는 9:1이다. 포르시티아시드 소듐 설페이트(화합물 1)는 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 획득된다.
포르시티아시드 소듐 설페이트(3 g)는 백색 고체이고, 이는 물 및 에탄올 중에서 가용성이다. TLC 플레이트(크로마토그래피 용액은 클로로포름/메탄올 10:1이고, Rf는 0.4임) 상에서 스프레딩 후, 이는 10%의 H2SO4-에탄올 시약을 분무함으로써 자주색-적색을 나타낸다. ESI-MS 스펙트럼에서, m/z[M-Na]-는 451이고, 분자량은 474이다.
화합물 1의 1H-NMR (600 MHz, d6-DMSO)은 다음과 같다:
δ (ppm): 7.4 (1H, d, J=8.4Hz, H-), 6.9 (5H, m, Ar-H), 4.8 (1H, d, J=4.8Hz, H-6), 4.38 (H, d, J=6.6Hz, H-8), 4.10 (1H, d, J=9.0Hz, H-2), 3.75 (12H, d, J=8.4Hz, H-8,4, O-CH3), 3.11 (1H, t, J=8.1Hz, H-5), 2.85 (1H, d, J=7.2Hz, H-1);
화합물 1의 13C-NMR (150 MHz, d6-DMSO)은 다음과 같다:
δ (ppm): 150.99 (C-3"), 148.97 (C-3'), 148.10 (C-4"), 142.51 (C-4'), 137.20 (C-1"), 131.73 (C-1'), 121.33 (C-5'), 118.09 (C-6'), 118.06 (C-6"), 112.09 (C-5"), 110.94 (C-2'), 110.00 (C-2"), 87.22 (C-2), 81.76 (C-6), 70.87 (C-8), 69.44 (C-4), 56.23 (C-OCH3), 55.99 (C-OCH3), 54.54 (C-OCH3), 53.37 (C-1), 49.78 (C-5) ppm
ESI-MS, 1H-NMR 및 13C-NMR의 시험 데이터에 따르면, 화합물 1의 분자식은 C21H23O9SNa이고, 구조식은 하기와 같은 것으로 결정된다:
Figure pct00003
.
구체예 2
1. 포르시티아시드(4 g, 10.75 mmol)는 180 ml의 건조된 무수 피리딘으로 첨가되고, 용해를 위해 교반이 수행되어, 포르시티아시드 용액이 획득된다;
2. 얼음 배쓰의 조건하에서, 클로로설폰산의 디클로로메탄 용액(1.4 ml, 약 21.5 mmol)이 포르시티아시드 용액으로 적가되고; 교반이 동시에 수행되고, 적가의 속도는 1 점적(약 50 ul/점적)/2 s이고, 즉, 본 구체예에서 포르시티아시드 대 클로로설폰산의 몰비는 1:2이다.
3. 교반 조건하에서 적가 완료 후, 온도가 상승되고 10℃에서 유지되고, 에스테르화 반응이 수행된다;
4. 10℃에서 온도를 유지하는 조건하에서, 1시간 동안 반응 시 에스테르화 반응이 완료되고, 포타슘 하이드록시드의 메탄올 용액(5 ml)이 첨가되어 pH 값이 10으로 조정되고, 반응 혼합물이 이후 감압을 이용하여 증류되어 용매가 제거된 후, 샘플이 GF254 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 상에 로딩되며, 용리액은 클로로포름 및 메탄올의 혼합물 액체이고, 여기서 클로로포름 대 메탄올의 체적비는 9:1이다. 포르시티아시드 포타슘 설페이트(화합물 2)는 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 획득된다.
포르시티아시드 포타슘 설페이트(3 g)는 백색 고체이고, 이는 물 및 에탄올 중에서 가용성이다. TLC 플레이트(크로마토그래피 용액은 클로로포름/메탄올 10:1이고, Rf는 0.4임) 상에서 스프레딩 후, 이는 10%의 H2SO4-에탄올 시약을 분무함으로써 자주색-적색을 나타낸다. ESI-MS 스펙트럼에서, m/z[M-K]-는 451이고, 분자량은 490이다.
화합물 2의 1H-NMR (600 MHz, d6-DMSO)은 다음과 같다:
δ (ppm): 7.4 (1H, d, J=8.4Hz, H-), 6.9 (5H, m, Ar-H), 4.8 (1H, d, J=4.8Hz, H-6), 4.38 (H, d, J=6.6Hz, H-8), 4.10 (1H, d, J=9.0Hz, H-2), 3.75 (12H, d, J=8.4Hz, H-8,4, O-CH3), 3.10 (1H, t, J=8.1Hz, H-5), 2.84 (1H, d, J=7.2Hz, H-1);
화합물 2의 13C-NMR (125 MHz, d6-DMSO)은 다음과 같다:
δ (ppm): 150.99 (C-3"), 148.97 (C-3'), 148.10 (C-4"), 142.51 (C-4'), 137.20 (C-1"), 131.73 (C-1'), 121.33 (C-5'), 118.09 (C-6'), 118.06 (C-6"), 112.09 (C-5"), 110.95 (C-2'), 110.00 (C-2"), 87.23 (C-2), 81.76 (C-6), 70.87 (C-8), 69.44 (C-4), 56.21 (C-OCH3), 55.99 (C-OCH3), 54.52 (C-OCH3), 53.37 (C-1), 49.78 (C-5) ppm.
ESI-MS, 1H-NMR 및 13C-NMR의 시험 데이터에 따르면, 화합물 2의 분자식은 C21H23O9SK이고, 구조식은 하기와 같은 것으로 결정된다:
Figure pct00004
.
구체예 3
1. 포르시티아시드(4 g, 10.75 mmol)는 180 ml의 건조된 무수 피리딘으로 첨가되고, 용해를 위해 교반이 수행되어, 포르시티아시드 용액이 획득된다;
2. 얼음 배쓰의 조건하에서, 클로로설폰산의 디클로로메탄 용액(1.4 ml, 약 21.5 mmol)이 포르시티아시드 용액으로 적가되고; 교반이 동시에 수행되고, 적가의 속도는 1 점적(약 50 ul/점적)/2 s이고, 즉, 본 구체예에서 포르시티아시드 대 클로로설폰산의 몰비는 1:2이다.
3. 교반 조건하에서 적가 완료 후, 온도가 상승되고 10℃에서 유지되고, 에스테르화 반응이 수행된다;
4. 10℃에서 온도를 유지하는 조건하에서, 1시간 동안 반응 시 에스테르화 반응이 완료되고, 암모니아 물(5 ml)이 첨가되어 pH 값이 8로 조정되고, 반응 혼합물이 이후 감압을 이용하여 증류되어 용매가 제거된 후, 샘플이 GF254 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 상에 로딩되며, 용리액은 클로로포름 및 메탄올의 혼합물 액체이고, 여기서 클로로포름 대 메탄올의 체적비는 9:1이다. 포르시티아시드 암모늄 설페이트(화합물 3)는 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 획득된다.
포르시티아시드 암모늄 설페이트(3 g)는 백색 고체이고, 이는 물 및 에탄올 중에서 가용성이다. TLC 플레이트(크로마토그래피 용액은 클로로포름/메탄올 10:1이고, Rf는 0.4임) 상에서 스프레딩 후, 이는 10%의 H2SO4-에탄올 시약을 분무함으로써 자주색-적색을 나타낸다. ESI-MS 스펙트럼에서, m/z[M-NH4]-는 451이고, 분자량은 469이다.
화합물 3의 1H-NMR (600 MHz, d6-DMSO)은 다음과 같다:
δ (ppm): 7.4 (1H, d, J=8.4Hz, H-), 6.9 (5H, m, Ar-H), 4.8 (1H, d, J=4.8Hz, H-6), 4.38 (H, d, J=6.6Hz, H-8), 4.10 (1H, d, J=9.0Hz, H-2), 3.75 (12H, d, J=8.4Hz, H-8,4, O-CH3), 3.12 (1H, t, J=8.1Hz, H-5), 2.86 (1H, d, J=7.2Hz, H-1);
화합물 3의 13C-NMR (125 MHz, d6-DMSO)은 다음과 같다:
δ (ppm): 150.99 (C-3"), 148.97 (C-3'), 148.10 (C-4"), 142.51 (C-4'), 137.20 (C-1"), 131.73 (C-1'), 121.32 (C-5'), 118.09 (C-6'), 118.06 (C-6"), 112.09 (C-5"), 110.94 (C-2'), 110.00 (C-2"), 87.22 (C-2), 81.76 (C-6), 70.87 (C-8), 69.44 (C-4), 56.21 (C-OCH3), 55.99 (C-OCH3), 54.52 (C-OCH3), 53.37 (C-1), 49.78 (C-5) ppm.
ESI-MS, 1H-NMR 및 13C-NMR의 시험 데이터에 따르면, 화합물 3의 분자식은 C21H27NO9S이고, 구조식은 하기와 같은 것으로 결정된다:
Figure pct00005
.
구체예 4
1. 포르시티아시드(4 g, 10.75 mmol)는 180 ml의 건조된 무수 N,N-디메틸포름아미드로 첨가되고, 용해를 위해 교반이 수행되어, 포르시티아시드 용액이 획득된다;
2. 얼음 배쓰의 조건하에서, 황 트리옥시드 트리에틸아민 화합물(3.89 g，약 21.5 mmol)을 함유하는 디클로로메탄 용액이 포르시티아시드 용액으로 적가되고; 교반이 동시에 수행되고, 적가의 속도는 1 점적(약 50 ul/점적)/2 s이고, 즉, 본 구체예에서 포르시티아시드 대 황 트리옥시드 트리에틸아민 화합물의 몰비는 1:2이다.
3. 교반 조건하에서 적가 완료 후, 온도가 상승되고 110℃에서 유지되고, 에스테르화 반응이 수행된다;
4. 110℃에서 온도를 유지하는 조건하에서, 1시간 동안 반응 시 에스테르화 반응이 완료되고, 온도가 실온으로 감소되고, 암모니아 물(5 ml)이 첨가되어 pH 값이 8로 조정되고, 반응 혼합물이 이후 감압을 이용하여 증류되어 용매가 제거된 후, 샘플이 GF254 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 상에 로딩되며, 용리액은 클로로포름 및 메탄올의 혼합물 액체이고, 여기서 클로로포름 대 메탄올의 체적비는 9:1이다. 포르시티아시드 암모늄 설페이트(화합물 3)는 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 획득된다.
포르시티아시드 암모늄 설페이트(3 g)는 백색 고체이고, 이는 물 및 에탄올 중에서 가용성이다. TLC 보드(크로마토그래피 용액은 클로로포름/메탄올 10:1이고, Rf는 0.4임) 상에서 스프레딩 후, 이는 10%의 H2SO4-에탄올 시약을 분무함으로써 자주색-적색을 나타낸다. ESI-MS 스펙트럼에서, m/z[M-NH4]-는 451이고, 분자량은 469이다.
화합물 3의 1H-NMR (600 MHz, d6-DMSO)은 다음과 같다:
δ (ppm): 7.4 (1H, d, J=8.4Hz, H-), 6.9 (5H, m, Ar-H), 4.8 (1H, d, J=4.8Hz, H-6), 4.38 (H, d, J=6.6Hz, H-8), 4.10 (1H, d, J=9.0Hz, H-2), 3.75 (12H, d, J=8.4Hz, H-8,4, O-CH3), 3.12 (1H, t, J=8.1Hz, H-5), 2.86 (1H, d, J=7.2Hz, H-1);
화합물 3의 13C-NMR (125 MHz, d6-DMSO)은 다음과 같다:
δ (ppm): 150.99 (C-3"), 148.97 (C-3'), 148.10 (C-4"), 142.51 (C-4'), 137.20 (C-1"), 131.73 (C-1'), 121.32 (C-5'), 118.09 (C-6'), 118.06 (C-6"), 112.09 (C-5"), 110.94 (C-2'), 110.00 (C-2"), 87.22 (C-2), 81.76 (C-6), 70.87 (C-8), 69.44 (C-4), 56.21 (C-OCH3), 55.99 (C-OCH3), 54.52 (C-OCH3), 53.37 (C-1), 49.78 (C-5) ppm.
ESI-MS, 1H-NMR 및 13C-NMR의 시험 데이터에 따르면, 화합물 3의 분자식은 C21H27NO9S이고, 구조식은 하기와 같은 것으로 결정된다:
Figure pct00006
.
구체예 5
1. 포르시티아시드(4 g, 10.75 mmol)는 180 ml의 건조된 무수 N,N-디메틸포름아미드로 첨가되고, 용해를 위해 교반이 수행되어, 포르시티아시드 용액이 획득된다;
2. 얼음 배쓰의 조건하에서, 황 트리옥시드 피리딘 화합물(3.68 g, 약 21.5 mmol)을 함유하는 디클로로메탄 용액이 포르시티아시드 용액으로 적가되고; 교반이 동시에 수행되고, 적가의 속도는 1 점적(약 50 ul/점적)/2 s이고, 즉, 본 구체예에서 포르시티아시드 대 황 트리옥시드 피리딘 화합물의 몰비는 1:2이다.
3. 교반 조건하에서 적가 완료 후, 온도가 상승되고 110℃에서 유지되고, 에스테르화 반응이 수행된다;
4. 110℃에서 온도를 유지하는 조건하에서, 1시간 동안 반응 시 에스테르화 반응이 완료되고, 온도가 실온으로 감소되고, 포타슘 하이드록시드의 메탄올 용액(5 ml)이 첨가되어 pH 값이 8로 조정되고, 반응 혼합물이 이후 감압을 이용하여 증류되어 용매가 제거된 후, 샘플이 GF254 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 상에 로딩되며, 용리액은 클로로포름 및 메탄올의 혼합물 액체이고, 여기서 클로로포름 대 메탄올의 체적비는 9:1이다. 포르시티아시드 포타슘 설페이트(화합물 2)는 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 획득된다.
포르시티아시드 포타슘 설페이트(3 g)는 백색 고체이고, 이는 물 및 에탄올 중에서 가용성이다. TLC 보드(크로마토그래피 용액은 클로로포름/메탄올 10:1이고, Rf는 0.4임) 상에서 스프레딩 후, 이는 10%의 H2SO4-에탄올 시약을 분무함으로써 자주색-적색을 나타낸다. ESI-MS 스펙트럼에서, m/z[M-K]-는 451이고, 분자량은 490이다.
화합물 2의 1H-NMR (600 MHz, d6-DMSO)은 다음과 같다:
δ (ppm): 7.4 (1H, d, J=8.4Hz, H-), 6.9 (5H, m, Ar-H), 4.8 (1H, d, J=4.8Hz, H-6), 4.38 (H, d, J=6.6Hz, H-8), 4.10 (1H, d, J=9.0Hz, H-2), 3.75 (12H, d, J=8.4Hz, H-8,4, O-CH3), 3.10 (1H, t, J=8.1Hz, H-5), 2.84 (1H, d, J=7.2Hz, H-1);
화합물 2의 13C-NMR (125MHz, d6-DMSO)은 다음과 같다:
δ (ppm): 150.99 (C-3"), 148.97 (C-3'), 148.10 (C-4"), 142.51 (C-4'), 137.20 (C-1"), 131.73 (C-1'), 121.33 (C-5'), 118.09 (C-6'), 118.06 (C-6"), 112.09 (C-5"), 110.95 (C-2'), 110.00 (C-2"), 87.23 (C-2), 81.76 (C-6), 70.87 (C-8), 69.44 (C-4), 56.21 (C-OCH3), 55.99 (C-OCH3), 54.52 (C-OCH3), 53.37 (C-1), 49.78 (C-5) ppm.
ESI-MS, 1H-NMR 및 13C-NMR의 시험 데이터에 따르면, 화합물 2의 분자식은 C21H23O9SK이고, 구조식은 하기와 같은 것으로 결정된다:
Figure pct00007
.
구체예 6
1. 포르시티아시드(4 g, 10.75 mmol)는 180 ml의 건조된 무수 N,N-디메틸포름아미드로 첨가되고, 용해를 위해 교반이 수행되어, 포르시티아시드 용액이 획득된다;
2. 얼음 배쓰의 조건하에서, 황 트리옥시드 트리메틸아민 화합물(2.99 g, 약 21.5 mmol)을 함유하는 디클로로메탄 용액이 포르시티아시드 용액으로 적가되고; 교반이 동시에 수행되고, 적가의 속도는 1 점적(약 50 ul/점적)/2 s이고, 즉, 본 구체예에서 포르시티아시드 대 황 트리옥시드 트리메틸아민 화합물의 몰비는 1:2이다.
3. 교반 조건하에서 적가 완료 후, 온도가 상승되고 100℃에서 유지되고, 에스테르화 반응이 수행된다;
4. 100℃에서 온도를 유지하는 조건하에서, 1시간 동안 반응 시 에스테르화 반응이 완료되고, 온도가 실온으로 감소되고, 포타슘 하이드록시드의 메탄올 용액(5 ml)이 첨가되어 pH 값이 8로 조정되고, 반응 혼합물이 이후 감압을 이용하여 증류되어 용매가 제거된 후, 샘플이 GF254 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 상에 로딩되며, 용리액은 클로로포름 및 메탄올의 혼합물 액체이고, 여기서 클로로포름 대 메탄올의 체적비는 9:1이다. 포르시티아시드 포타슘 설페이트(화합물 2)는 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 획득된다.
포르시티아시드 포타슘 설페이트(3 g)는 백색 고체이고, 이는 물 및 에탄올 중에서 가용성이다. TLC 보드(크로마토그래피 용액은 클로로포름/메탄올 10:1이고, Rf는 0.4임) 상에서 스프레딩 후, 이는 10%의 H2SO4-에탄올 시약을 분무함으로써 자주색-적색을 나타낸다. ESI-MS 스펙트럼에서, m/z[M-K]-는 451이고, 분자량은 490이다.
화합물 2의 1H-NMR (600 MHz, d6-DMSO)은 다음과 같다:
δ (ppm): 7.4 (1H, d, J=8.4Hz, H-), 6.9 (5H, m, Ar-H), 4.8 (1H, d, J=4.8Hz, H-6), 4.38 (H, d, J=6.6Hz, H-8), 4.10 (1H, d, J=9.0Hz, H-2), 3.75 (12H, d, J=8.4Hz, H-8,4, O-CH3), 3.10 (1H, t, J=8.1Hz, H-5), 2.84 (1H, d, J=7.2Hz, H-1);
화합물 2의 13C-NMR (125MHz, d6-DMSO)은 다음과 같다:
δ (ppm): 150.99 (C-3"), 148.97 (C-3'), 148.10 (C-4"), 142.51 (C-4'), 137.20 (C-1"), 131.73 (C-1'), 121.33 (C-5'), 118.09 (C-6'), 118.06 (C-6"), 112.09 (C-5"), 110.95 (C-2'), 110.00 (C-2"), 87.23 (C-2), 81.76 (C-6), 70.87 (C-8), 69.44 (C-4), 56.21 (C-OCH3), 55.99 (C-OCH3), 54.52 (C-OCH3), 53.37 (C-1), 49.78 (C-5) ppm.
ESI-MS, 1H-NMR 및 13C-NMR의 시험 데이터에 따르면, 화합물 2의 분자식은 C21H23O9SK이고, 구조식은 하기와 같은 것으로 결정된다:
Figure pct00008
.
시험 예 1. 포르시티아시드 설페이트 유도체의 항바이러스 활성의 시험
1. 시험관 내 항바이러스 시험
1.1. 시험 물질
(1) 약물
1) 포르시티아시드 설페이트 유도체: 포르시티아시드 소듐 설페이트, 포르시티아시드 포타슘 설페이트 및 포르시티아시드 암모늄 설페이트, 이들은 모두 백색 분말이고, Dalian Fusheng Natural Medicinal Development Co. Ltd.에 의해 생산되고, 면적 표준화 방법을 통해 2개의 고성능 액체 크로마토그래피 검출기, 즉, 자외선 검출기 및 증기화 광산란 검출기에 의해 각각 측정되며, 이들의 순도는 각각 99.9%, 99.5% 및 99.2%이다.
2) 리바비린(Ribavirin) 주사액, 이는 Henan Runhong Pharmaceutical Co., ltd.에 의해 생산되는 무색의 투명한 액체이고, 제품 로트 번호는 1206261이고, 국가 약물 허가 번호는 H19993553이며, 이의 농도는 100 mg/ml이고, 본 시험에서 양성 대조군 약물로 이용된다.
3) 오셀타미버(Oseltamivir) 포스페이트, 이는 중국 약품 생물제품 검정소(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products)에 의해 생산된다. 제품 로트 번호는 101096-200901이다. 오셀타미버 포스페이트는 본 시험에서 양성 대조군 약물로 이용되며, 매 주사는 100 mg이다.
상기 언급된 약물은 모두 정제수에 용해되고, 여과되고, 멸균되고, 서브패키징되고(subpackaging)되고, 적용 대기를 위해 4℃에 저장되며, 이들 모두는 본 시험에서 시험되는 약물이다.
(2) 세포주
베로 세포(Vero cell)의 세포주(아프리카 녹색 원숭이 신장 세포)는 지린 대학(Jilin University)의 기초 의학 대학(College of Basic Medical Sciences)에 의해 보존된다.
(3) 바이러스 균주
1) 인플루엔자 바이러스, 중국 예방 의학 아카데미(Chinese Academy of Preventive Medicine)의 바이러스학 연구소로부터 구입함.
2) 파라인플루엔자 바이러스, 중국 예방 의학 아카데미의 바이러스학 연구소로부터 구입함.
3) 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 중국 예방 의학 아카데미의 바이러스학 연구소로부터 구입함.
4) 콕사키바이러스 B3(CVB3) 균주, America로부터 유래되고, 중국 교육 및 연구 관청(teaching and research office)에 의해 보존됨.
5) 콕사키바이러스 A16(CoxA16) 균주, 일본 센다이 국립 병원(Sendai National Hospital of Japan)에 의해 선물로 제공되고, 중국 교육 및 연구 관청에 의해 보존됨.
6) 엔테로바이러스 EV71 균주, 일본 센다이 국립 병원에 의해 선물로 제공되고, 중국 교육 및 연구 관청에 의해 보존됨.
7) 아데노바이러스(AdV), 지린 대학의 노먼 베튠 건강 과학 센터 제1병원(The First Hospital of Norman Bethune Health Science Center)의 소아과 연구실로부터 유래됨.
8) 단순 헤르페스 바이러스 타입-I(HSV-1), 중국 약품 생물제품 검정소로부터 구입됨.
(4) 주요 장비 및 시약:
생물 안전 작업대 BHC-1300 II A/B3, AIRTECH
CO2 인큐베이터 MCO-18AIC, SANYO
도립현미경 CKX41, OLYMPUS
전자식 분석 저울 AR1140/C, DHAUS
배양 배지 DMEM, HyClone
소 태아 혈청 HyClone
트립신 Gibco
MTT Sigma
DMSO Tianjin Beilian Fine Chemicals
Development Co., Ltd.
1.2. 시험 방법
(1) 세포의 제조
베로 세포가 1-2일 동안 계대배양되고, 절편화되고, 경계선이 명백하며; 입체 지각 및 디옵터가 강한 경우 트립신으로 처리되고, 세포 표면 상에 바늘-유사 웰(well)이 존재하는 경우 소화액이 완전히 흡수되고, 세포를 분산시키기 위해 수 밀리리터의 배양 브로쓰가 취해지고, 이후 계수되고, 배양 브로쓰(10% 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM)로 약 5×107/L로 희석되고, 세포가 단층으로 성장될 때까지 96-웰 배양 플레이트에 접종된다.
(2) 약물 독성의 결정
세포독성 시험: 세포독성의 결정을 위해 약물이 표 1에 표시된 농도에 따라 희석된다.
표 1. 약물 희석 참조 표(단위: g/L)
Figure pct00009
유지 용액(2%의 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM)으로 다양한 농도로 희석된 상기 언급된 약물이 베로 단층 세포로 적가되며, 각각의 웰은 0.2ml이고, 각 농도에 대해 6개의 중복 웰이 존재하고, 정상 대조군(약물이 첨가되지 않은 정상 대조군)에 대한 6개의 웰 및 블랭크 대조군(배양 배지)에 대한 6개의 웰이 추가로 제공되며, 이들은 배양을 위해 3℃에서 5% CO2 인큐베이터에 배치되고, 매일 도립현미경으로 CPE가 관찰되고, 기록된다. 72시간 후, 20μL(5 mg·mL-1)의 MTT 용액이 각 웰에 첨가되고, 4시간 동안 계속 인큐베이션되고, 각 웰 내의 배양 브로쓰가 흡인되고, 폐기되고, 100μL의 DMSO가 각 웰에 첨가되고, 5분 동안 진탕되고, 492 nm에서 OD 값이 측정되어 세포 생존률이 계산된다. SPSS 18.0 통계 소프트웨어에서, 세포 생존률이 프로빗(Probit) 회귀 분석에 적용되어 베로 세포에 대한 약물의 최대 비독성 농도(TC0) 및 절반 독성 농도(TC50)가 계산된다.
(3) 다양한 바이러스의 TCID50의 결정
다양한 바이러스가 10-1, 10-2, 10-3,10-4,10-5 및 10-6의 다양한 희석도를 갖도록 10배 감소량으로 희석되고, 단층 베로 세포 96-웰 배양 플레이트에 각 웰에 대해 100μL 및 각각의 희석액에 대해 6개의 웰로 순차적으로 접종되고, 동시에 정상 세포 대조군이 제공된다. 2시간 동안 37℃에서 5% CO2에서 인큐베이션되고, 바이러스 액체가 폐기된 후, 100μL의 세포 유지 용액이 각 웰에 첨가되고, 37℃에서 5% CO2에서 배양된다. 세포병변 결과가 3일째로부터 현미경 하에서 관찰되고, 결과가 7-8일째에 결정되고, 잘 기록되며, 세포 웰의 50%가 양성 병변이 발생한 경우에 가장 높은 희석액이 종점으로 취해지고, 바이러스 역가가 카버(karber) 방법을 이용하여 계산된다.
식
Figure pct00010
TCID50: 50% 조직구 감염 용량
XM: 바이러스의 가장 높은 농도의 희석액의 대수
d: 희석 계수(배수)의 대수
∑pi: 각각의 희석액 병변 백분율의 합계
(4) 바이러스-유도 세포병증에 대한 약물의 영향
단층 세포로 덮인 배양 플레이트가 채택되고, 배양 브로쓰가 흡인되고 폐기되고, 세포가 100TCID50에 상응하는 바이러스 공격의 양으로 접종되고, 2시간 동안 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 흡수되고, 특정 농도(대략 최대 비독성 농도)를 갖는 다양한 액체가 첨가되고, 각각의 농도에 관해 200μL/웰의 배양을 위해 6개의 중복 웰이 제공된다. 리바비린 주사액 및 오셀타미버 포스페이트가 양성 약물 대조군으로 제공되고, 정상 대조군(바이러스 및 약물이 첨가되지 않음) 및 바이러스 대조군(바이러스는 첨가되나, 약물은 첨가되지 않음)이 제공되며, 바이러스-유도 CPE에 대한 약물의 영향이 관찰된다. 72시간 후, MTT 비색 방법을 이용하여 492nm 파장 하에서 OD 값이 측정되어, 약물의 항바이러스 유효율(antiviral effective rate)(ER%)이 계산된다. SPSS 18.0 통계 소프트웨어에서, 다양한 약물의 항바이러스 효율에서의 유의한 차이가 ANOVA 방법을 이용하여 비교된다.
ER%=(약물 처리 그룹에서의 평균 OD 값-바이러스 대조군에서의 평균 OD 값)/(세포 대조군에서의 평균 OD 값-바이러스 대조군에서의 평균 OD 값)×100%
1.3. 시험 결과
(1) 다양한 바이러스의 TCID50
Figure pct00011
(2) 약물 독성의 결정
(1) 약물의 세포독성의 결정
베로 세포에 대한 약물의 최대 비독성 농도(TC0), 절반 독성 농도(TC50) 및 약물 항바이러스 시험에 사용된 농도가 표 2에 제시된다.
표 2. 약물 세포독성 시험 결과(단위: g/L)
Figure pct00012
(2) 바이러스-유도 세포병증에 대한 약물의 보호 효과의 결과
다양한 바이러스에 저항하는데 있어서의 약물의 유효율 및 ANOVA-방법의 일원 분산분석의 결과에 대해, 세부사항에 대해서는 표 3을 참조하라.
표 3. 약물의 항바이러스 유효율(ER%)의 통계 표
Figure pct00013
표 3의 결과에 제시된 바와 같이, 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 콕사키 바이러스(CoxA16)를 억제하는데 있어서의 포르시티아시드 설페이트-포르시티아시드 소듐 설페이트, 포르시티아시드 포타슘 설페이트, 및 포르시티아시드 암모늄 설페이트의 유효율은 모두 90%를 초과하고, 이는 바이러스 대조군과 대조되고, 차이는 통계적으로 유의하며; 호흡기 세포융합 바이러스 RSV 및 단순 헤르페스 바이러스 타입-I(HSV-I)에 대한 억제율은 둘 모두 80%를 초과하고, 유효율은 둘 모두 80%보다 높고, 이는 바이러스 대조군과 대조되고, 차이는 통계적으로 유의하며; 상기 언급된 바이러스에 대한 3개의 포르시티아시드 설페이트 유도체의 치료 효과는 리바비린 및 오셀타미버 포스페이트의 경향보다 우수하다.
2. 생체 내 항바이러스 시험
2.1. 실험 물질
(1) 실험 동물
쿤밍 마우스(Kunming mice)가 지린 대학의 노먼 베튠 건강 과학 센터에 의해 제공된다(의약 동물 번호 10-5219).
2) 시험 시약
주요 실험 기계
Figure pct00014
2.2. 실험 방법
(1) 인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스로 인한 마우스의 중간 치사 용량의 결정
인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스(세포 용해질)이 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 및 10-5의 농도를 갖는 바이러스 액체로 10배 감소로 희석된다. 120마리의 쿤밍 마우스가 획득되며, 이 중 60마리가 인플루엔자 바이러스 그룹에 대해 제공되고, 나머지 60마리가 파라인플루엔자 바이러스 그룹에 대해 제공되고, 개별적으로 6개의 그룹으로 무작위로 나뉘어진다. 마우스는 에테르로 가볍게 마취되고, 0.03mL/마우스의 다양한 희석액을 갖는 바이러스 액체로 비내 감염된다. 동시에 블랭크 대조군이 설정되고, 바이러스 액체가 염수로 대체된다. 사망 및 생존이 관찰 지표로 간주되며, 감염 후 14일 동안 매일 관찰이 수행된다. 감염 24시간 내에 사망한 마우스는 비특이적 사망이며, 계산되지 않고, 카버 방법을 이용하여 바이러스 액체 LD50이 계산된다. 계산식은
Figure pct00015
이다[여기서, LD50은 중간 치사 용량이고; XM은 바이러스의 가장 높은 농도의 희석액의 대수이고; d는 희석 계수(배수)의 대수이고; ∑pi는 각각의 희석액 병변 백분율의 합계이다].
(2) 항-인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스 감염에 의해 야기된 폐렴에 대한 내성에서의 포르시티아시드 설페이트에 대한 연구
1) 실험 동물 및 그룹
2개의 시험을 수행하기 위해 360마리의 4주령 마우스가 채택된다. 180마리의 마우가 채택되고, 인플루엔자 바이러스에 의해 감염된 마우스에 대한 포르시티아시드 설페이트의 폐 지수 및 폐 지수 억제율을 결정하는 시험을 위해 18개의 그룹(각각의 그룹에 대해 10마리)으로 무작위로 나뉘어진다. 나머지 180마리가 채택되고, 포르시티아시드 설페이트의 폐 현탁액 바이러스 적혈구응집 역가를 결정하는 시험을 위해 18개의 그룹(각각의 그룹에 대해 10마리)으로 무작위로 나뉘어진다.
2) 감염 방법
탈지솜(degreasing cotton)이 200~300mL 비커에 배치되고, 여기에 적합한 양의 에테르(단지 솜이 젖도록 만들기 위한 양)가 첨가되고, 탈지솜을 함유하는 비커가 거꾸로 뒤집히고, 이 안에서 마취되는 경우에 마우스가 극도로 흥분되고, 명백히 약해진 경우에 마우스가 등을 대고 눕도록 하며, 마우스가 0.03ml/콧구멍의 15LD50 인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스로 비내 감염되고, 정상 대조군 그룹에서는 바이러스 현탁액이 일반 염수로 대체된다.
3) 투여 방법 및 투여량
감염 하루 전 포르시티아시드 소듐 설페이트 및 포르시티아시드 포타슘 설페이트 약물 그룹 및 리바비린 대조군에 대해 각각 통상적인 위내 투여가 수행된다. 포르시티아시드 소듐 설페이트 및 포르시티아시드 포타슘 설페이트의 고, 중간 및 저 투여량은 각각 13.0 mg/kg, 6.5 mg/kg 및 3.25 mg/kg이며, 리바비린 양성 약물의 투여량은 58.5 mg/kg이다. 투여는 5일 연속 동안 하루에 1회 수행된다. 바이러스 대조군은 동일 부피의 일반 염수로 투여된다.
4) 관찰 지표
① 폐 지수 결정
약물이 마우스에 투여된지 5일 후에, 마우스는 먼저 8시간 동안 음용수가 억제되고; 이후 마우스가 칭량된 후, 이들의 눈이 제거되어, 상기 동물은 출혈에 의해 사망하며; 이들의 흉강이 개방되어 전체 폐가 꺼내지고, 일반 염수를 이용하여 2회 세척되고, 여과지를 이용하여 폐의 표면 상의 수분이 흡수되고; 이후 전자 저울을 이용하여 폐가 칭량되고, 폐 지수 및 폐 지수 억제율이 하기 식에 따라 계산된다:
폐 지수=(마우스 폐 중량/마우스 중량)×100%;
폐 지수 억제율=(감염 모델 그룹의 평균 폐 지수-실험 그룹의 평균 폐 지수)/감염 모델 그룹의 평균 폐 지수×100%.
② 폐 현탁액 바이러스 적혈구응집 역가의 결정
처리 5일 후에 다양한 그룹의 마우스 폐가 각각 취해지고, 저온에서 균질화기에 의해 균질액으로 분쇄되고; 일반 염수를 이용하여 균질액이 10%의 폐 조직 현탁액으로 희석되고; 원심분리가 수행되어 상층액이 획득되고, 이는 두배 희석되고, 0.2 ml/웰로 적정 플레이트로 떨어지고; 0.2 ml의 1% 닭 적혈구 현탁액이 각각의 구멍에 첨가되고, 잘 혼합되고; 적정 플레이트가 30분 동안 실온 환경에 배치되어, 적혈구응집 역가가 관찰되고 기록된다. 적혈구가 응집되어 (++)가 되는 경우에 종점이 나타나고, 이의 역가는 현탁액 희석 배수에 의해 표현된다.
③ 폐 조직형태학의 관찰
처리 5일 후에 다양한 마우스 폐가 각각 취해지고; 이들의 내장의 전반적인 병리학적 변화가 육안에 의해 관찰되고, 기록된다. 폐가 일반 염수로 헹궈 세척되고, 폐 상의 수분이 여과지를 이용하여 흡수되고; 폐의 일부가 10% 포름알데하이드로 고정되고, 파라핀-포매되고, 절편화되고, HE-염색되고; 현미경 하에서 관찰 및 사진찍기가 수행된다.
2.3. 실험 결과 및 분석
(1) 인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스로 인한 마우스의 중간 치사 용량의 결정 결과
실험 그룹의 쿤밍 마우스가 각각 다양한 농도의 인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스 액체 30 μL로 비내 감염되고; 감염 3일째에, 처음 3개 그룹(바이러스 농도를 기초로 한 10-1 그룹, 10-2 그룹 및 10-3 그룹)의 마우스 모두가 다양한 정도의 질병 증상인 모피 털운동(pilomotor fur), 진전, 감소된 식욕 등을 경험하고; 5일째에, 마우스가 비틀거리고; 6일째에, 가장 높은 바이러스 농도의 그룹의 마우스가 사망하기 시작하고, 감염 후 7일째에 나머지 그룹에서 연속적으로 사망이 발생한다. 14일의 관찰이 완료된 후, 각각의 그룹의 마우스의 사망률이 계산되고, 이의 결과가 표 3 및 4에 제시된다. 계산에 의해, 인플루엔자 바이러스의 LD50은 희석도 10-2.9이며, 파라인플루엔자 바이러스의 LD50은 희석도 10-2.5이다.
표 3. 인플루엔자 바이러스의 중간 치사 용량의 시험 결과의 통계
Figure pct00016
바이러스의 LD50이 카버 방법을 이용하여 계산된다. 인플루엔자 바이러스의 LogLD50은 하기와 같다:
Figure pct00017
표 4. 파라인플루엔자 바이러스의 중간 치사 용량의 시험 결과의 통계
Figure pct00018
바이러스의 LD50은 카버 방법을 이용하여 계산된다. 파라인플루엔자 바이러스의 LogLD50은 하기와 같다:
Figure pct00019
(2) 인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스 감염에 의해 야기된 폐렴에 대한 내성에서의 포르시티아시드 설페이트의 효과의 결과
① 폐 지수 결정
마우스가 인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스로 감염된 후, 평균 폐 지수 결과는 다음을 나타낸다: 감염 모델 그룹과 비교하여, 일반 대조군, 다양한 농도를 갖는 약물 그룹 및 리바비린 그룹의 폐 지수는 유의하게 감소하며(P<0.05); 포르시티아시드 설페이트의 농도가 3.25 내지 13.0 mg/kg/d의 범위 내인 경우 특정 보호 효과가 달성되고, 모든 폐 지수는 유의하게 감소하며; 다른 두 그룹과 비교하는 경우 포르시티아시드 설페이트의 고 투여량 그룹에서의 감소가 더욱 유의하나, 비교시 다양한 그룹에서 유의한 차이가 없다(P>0.05). 포르시티아시드 설페이트의 중간 및 고 투여량 그룹이 리바비린 그룹에 비해 우수하다(P>0.05). 결과에 대해, 표 5 및 6을 참조하라.
표 5. 인플루엔자 바이러스 감염 마우스의 폐 지수 및 폐 지수 억제율에 대한 포르시티아시드 설페이트의 영향
Figure pct00020
표 6. 파라인플루엔자 바이러스 감염 마우스의 폐 지수 및 폐 지수 억제율에 대한 포르시티아시드 설페이트의 영향
Figure pct00021
② 폐 현탁액 바이러스 적혈구응집 역가의 결정
마우스가 인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스로 감염된 후, 감염 모델 그룹의 폐 조직 적혈구응집 역가(InX)는 각각 32.33 및 33.86이며, 5일 동안 다양한 농도의 포르시티아시드 설페이트를 이용한 처리 후, 폐 조직 바이러스 적혈구응집 역가가 둘 모두 다소 감소하며; 감염 모델 그룹과 비교하여, 차이는 유의하다(P<0.05). 리바비린 그룹과 비교하여, 포르시티아시드 설페이트의 고, 중간, 및 저 투여량 그룹의 바이러스 적혈구응집 역가는 모두 리바비린 그룹의 바이러스 적혈구응집 역가보다 높고, 차이는 유의하며(P<0.05); 비교시, 표 10에 제시된 바와 같이 포르시티아시드 설페이트의 고 투여량 그룹의 적혈구응집 역가는 다른 두 그룹의 적혈구응집 역가와 유의하게 상이하다(P<0.05). 비교시, 파라인플루엔자 바이러스 감염 마우스의 포르시티아시드 설페이트의 고 투여량 그룹과 리바비린 그룹 사이에 유의한 차이는 없고(P>0.05), 포르시티아시드 설페이트의 중간 및 저 투여량 그룹은 둘 모두 리바비린 그룹에 비해 우수하고, 차이는 유의하며(P<0.05); 비교시, 표 7 및 8에 제시된 바와 같이 포르시티아시드 설페이트의 고 투여량 그룹의 적혈구응집 역가는 포르시티아시드 설페이트의 저 투여량 그룹의 적혈구응집 역가와 유의하게 상이하다(P>0.05).
표 7. 인플루엔자 바이러스 감염 마우스의 폐 현탁액 적혈구응집 역가에 대한 포르시티아시드 설페이트의 영향
Figure pct00022
표 8. 파라인플루엔자 바이러스 감염 마우스의 폐 현탁액 적혈구응집 역가에 대한 포르시티아시드 설페이트의 영향
Figure pct00023
③ 폐 조직학의 검출 결과
인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스 폐렴 모델 그룹의 마우스의 폐는 대부분 충혈되어 있고, 부종 병변으로 고통받으며; 일부 폐는 어두운 갈색 외형을 갖는 경화 부위인 것으로 판명되며, 심각하게 병에 걸린 부위는 갈색을 띤 적색 출혈 병소를 나타낸다. 현미경적으로, 간질성 폐, 예를 들어, 기관지, 세기관지 및 폐포벽이 충혈, 부종 및 림프구, 단핵 세포 침윤, 폐포벽 확장, 및 폐포의 염증 반응으로 고통받는 것이 관찰될 수 있다. 인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스 폐렴 마우스 모델이 포르시티아시드 설페이트로 처리된 후, 마우스의 각각의 그룹의 폐의 전반적인 병리학적 변화가 유의하게 감소되고, 폐 조직의 일부는 형태 및 구조에 있어서 정상이고; 감염 모델 그룹과 비교하여, 폐포 중격이 더 얇고, 폐포벽 및 세기관지벽의 단핵 세포의 침윤 수가 더 적고, 공동(cavity)에서의 누출이 없고, 병변이 유의하게 감소된다. 감염 모델 그룹과 비교시, 파라인플루엔자 바이러스 폐렴을 치료하는데 있어서 포르시티아시드 설페이트의 중간 및 고 투여량 그룹은 유의하게 더 얇은 폐포 중격을 갖고, 단핵 세포의 침윤 수가 덜하고, 공동 내에 누출이 없고, 유의하게 감소된 병변을 갖는다.
인플루엔자 바이러스 폐렴 모델의 마우스 폐 조직 병리학적 절편 현미경 검사 결과가 도 1에 제시되며; 도 1A는 정상 마우스의 폐 조직을 나타내고; 도 1B는 인플루엔자 바이러스 폐렴 마우스의 폐 조직을 나타내고; 도 1C는 양성 약물 리바비린으로 처리된 후의 인플루엔자 바이러스 폐렴 마우스 모델의 마우스의 폐 조직을 나타내고; 도 1D는 고 투여량의 포르시티아시드 설페이트로 처리된 후의 인플루엔자 바이러스 폐렴 마우스 모델의 마우스의 폐 조직을 나타내고; 도 1E는 중간 투여량의 포르시티아시드 설페이트로 처리된 후의 인플루엔자 바이러스 폐렴 마우스 모델의 마우스의 폐 조직을 나타내고; 도 1F는 저 투여량의 포르시티아시드 설페이트로 처리된 후의 인플루엔자 바이러스 폐렴 마우스 모델의 마우스의 폐 조직을 나타낸다.
파라인플루엔자 바이러스 폐렴 모델의 마우스 폐 조직 병리학적 절편 현미경 검사 결과가 도 2에 제시되며; 도 2A는 정상 마우스의 폐 조직을 나타내고; 도. 2B는 파라인플루엔자 바이러스 폐렴 마우스의 폐 조직을 나타내고; 도 2C는 양성 약물 리바비린으로 처리된 후의 파라인플루엔자 바이러스 폐렴 마우스 모델의 마우스의 폐 조직을 나타내고; 도 2D는 고 투여량의 포르시티아시드 설페이트로 처리된 후의 인플루엔자 바이러스 폐렴 마우스 모델의 마우스의 폐 조직을 나타내고; 도 2E는 중간 투여량의 포르시티아시드 설페이트로 처리된 후의 파라인플루엔자 바이러스 폐렴 마우스 모델의 마우스의 폐 조직을 나타내고; 도 2F는 저 투여량의 포르시티아시드 설페이트로 처리된 후의 파라인플루엔자 바이러스 폐렴 마우스 모델의 마우스의 폐 조직을 나타낸다.
2.4. 결론
생체 내 항바이러스 시험 결과는 포르시티아시드 설페이트(포르시티아시드 소듐 설페이트 및 포르시티아시드 포타슘 설페이트)가 3.25 mg/kg/d 내지 13 mg/kg/d의 투여량 범위에서 인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스뿐만 아니라 이에 의해 야기된 마우스 바이러스 폐렴에 대해 비교적 유의한 억제 효과를 갖고, 폐 지수 및 이의 적혈구응집 역가를 유의하게 감소시킬 수 있고, 또한 폐 조직 병리를 유의하게 개선시킬 수 있고, 모델 대조군에 비해 유의한 차이를 가짐을 나타낸다.

Claims (10)

  1. 하기 화학 구조식에 의해 표현되는 포르시티아시드 설페이트(forsythiaside sulfate) 및 이의 유도체:
    Figure pct00024

    상기 식에서, R은 H, Na+, K+, NH4 +, 테트라메틸 암모늄, 테트라에틸 암모늄, 메틸 아미노, 디메틸아미노, 트리메틸아미노, 트리에틸아미노, 디에틸아미노, 에틸아미노, 에탄올아미노, 디에탄올아미노, 피페리딜, 피페라지닐 또는 피라지닐이다.
  2. 제 1항에 따른 포르시티아시드 설페이트 및 이의 유도체의 제조 방법으로서,
    1) 포르시티아시드를 유기 용매에 용해시켜 포르시티아시드 용액을 획득하는 단계;
    2) 먼저 황산화제를 포르시티아시드 용액에 첨가하고 잘 혼합한 후, 에스테르화 반응을 수행하여 생성 혼합물 액체를 획득하는 단계;
    3) 염기를 첨가하여 혼합물 액체의 pH 값을 8-10으로 조정하는 단계; 및
    4) 혼합물 액체를 분리시키고 정제하여 최종 생성물을 획득하는 단계를 순차적으로 수행하는 것을 포함하는, 제조 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 단계 2)의 황산화제가 클로로설폰산, 황 트리옥시드-트리에틸아민 복합체, 황 트리옥시드-피리딘 복합체 또는 황 트리옥시드-트리메틸아민 복합체로부터 선택되는 제조 방법.
  4. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 단계 3)의 염기가 유기 염기 또는 무기 염기로부터 선택되는 제조 방법.
  5. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 단계 1)의 유기 용매가 피리딘, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드 또는 디클로로메탄 중 하나로부터 선택되는 제조 방법.
  6. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 황산화제가 단계 2)에서 0-5℃의 온도에서 포르시티아시드 용액 중에 첨가되는 제조 방법.
  7. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 단계 2)에서 포르시티아시드 용액 내 포르시티아시드 대 황산화제의 몰비가 1:1-10인 제조 방법.
  8. 항바이러스 약물의 제조에서의 제 1항에 따른 포르시티아시드 설페이트 및 이의 유도체의 용도.
  9. 제 8항에 있어서, 항바이러스 약물이 항-인플루엔자 약물, 항-파라인플루엔자 약물, 항-호흡기 세포융합 바이러스 약물, 항-단순 헤르페스 바이러스 타입-I 약물 및 항-콕사키바이러스 A16 약물로부터 선택되는 용도.
  10. 포르시티아시드 설페이트 또는 포르시티아시드 설페이트 유도체를 함유함을 특징으로 하는 항바이러스 약물.
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