KR101925133B1 - 필리게닌 이부프로펜 에스테르, 이의 제조 방법, 및 이의 용도 - Google Patents

필리게닌 이부프로펜 에스테르, 이의 제조 방법, 및 이의 용도 Download PDF

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KR101925133B1
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Abstract

본 발명은 화학식 (I)에 의해 표현되는 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 의약 화합물, 이의 제조 방법, 및 항-바이러스, 해열처치, 항-염증 및 진통 등에서의 이의 용도를 제공한다.
Figure 112017021686319-pct00045

Description

필리게닌 이부프로펜 에스테르, 이의 제조 방법, 및 이의 용도{PHILLYGENIN IBUPROFEN ESTER, PREPARATION METHOD THEREFOR, AND APPLICATIONS THEREOF}
본 발명은 제약 화학 분야에 속하며, 구체적으로는 본 발명은 필리게닌 이부프로펜 에스테르(phillygenin ibuprofen ester)의 제조 방법 및 상기 화합물의 항바이러스, 해열, 항염증 및 진통 약리학적 효과에 관한 것이다.
필리게놀(phillygenol)로도 언급되는 필리게닌은 필리린(phillyrin)의 아글리콘 부분이다. 이는 물푸레나무과의 포르시티아(Forsythia) 속의 식물종 포르시티아 서스펜사 (툰베리) 바흘(Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl)의 주요 활성 성분이며, 이의 구조는 하기 화학식 (II)로 표현된다. 최근의 약리학적 연구는 필리게닌이 항바이러스, 항산화, 혈중 지질 감소, 자유 라디칼 청소, 항-박테리아, 항-종양, 항염증 등의 효과를 갖는 것을 나타낸다.
Figure 112017021686319-pct00001
필리게닌 분자는 불안정하고 쉽게 산화되며, 분자 형태는 산성 환경에서 변화되기 쉽다. 필리게닌 분자는 래트 장 박테리아에 의해 모의실험된 필리린 대사의 연구를 통해 장내 균무리에 의해 새로운 대사물로 매우 쉽게 대사되는 것으로 밝혀졌다.
이부프로펜은 비-스테로이드성 항-염증 및 진통 효과 약물이며, 이의 구조는 화학식 (III)에 의해 표현되나, 장기간 투약은 소화불량, 위궤양, 및 간 독성 등과 같은 부작용을 야기시킬 것이다. 1989년에, 이탈리아의 안젤리니(Angelini)사는 이부프로펜 및 과이아콜로부터 합성된 이부프로펜 과이아콜 에스테르를 개발하고 시판하였으며, 이부프로펜 과이아콜 에스테르는 인간 위장관에서 분해되지 않고, 혈액에 진입한 후에 이부프로펜 및 과이아콜로 분해되고, 생체내에서 이부프로펜의 해열, 진통, 및 항염증 효과를 발휘한 채로 남아 있고, 그 동안 위장관에 대한 이의 자극을 감소시키고, 간 독성을 감소시킨다. 2004년에, 심양 약과 대학(Shenyang Pharmaceutical University)의 시울리 자오(Xiuli Zhao)는 이부프로펜과 유게놀의 에스테르화를 수행하여 유게놀 이부프로펜 에스테르의 약학적 화합물을 획득하였으며, 이는 또한 생체 내에서 항바이러스, 해열, 진통, 항-염증 효과를 갖는다. 또한, 유게놀 이부프로펜 에스테르의 약학적 화합물은 유게놀의 개선된 안정성을 갖는다(중국 특허 공개 번호 CN1597656A).
지금까지, 필리게닌으로부터의 에스테르 화합물의 합성 및 약리학적 활성에 대한 보고 및 기록은 아직 발견되지 않았으며, 따라서 본 발명자는 필리게닌과 이부프로펜의 에스테르화 반응을 통해 필리게닌 이부프로펜 에스테르를 획득하였고, 더욱 안정적이고, 항-바이러스, 해열, 항-염증, 및 진통 등의 다양한 약리학적 효과를 갖는 새로운 화합물을 획득한 것으로 예상한다.
본 발명의 목적은 상기 선행 기술의 현존하는 문제점을 고려한 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 새로운 항-바이러스 화합물, 이의 제조 방법 및 이의 용도를 제공하는 것이며, 본 발명에 의해 제공되는 필리게닌 이부프로펜 에스테르는 항바이러스, 해열, 진통 및 항-염증 효과를 갖고, 항-바이러스, 해열 및 진통의 치료를 위한 의약 또는 건강 제품을 제조하기 위해 이용될 수 있으며; 필리게닌 이부프로펜 에스테르에 대한 제조 방법은 작업하기에 간단하고 편리하고, 산업적 규모의 생성에 적합하다.
본 발명의 목적을 달성하기 위해, 한 양태에서, 본 발명은 하기 화학식 (I)로 표현되는 일반 구조식을 갖는 필리게닌 이부프로펜 에스테르 화합물을 제공한다:
Figure 112017021686319-pct00002
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 순서에 따라 수행되는 단계를 포함하는 필리게닌 이부프로펜 에스테르 화합물에 대한 제조 방법을 제공한다:
A) 이부프로펜은 염소화제를 이용한 염소화 반응에 적용되어 이부프로펜 클로라이드를 제조하고;
Figure 112018053664007-pct00003
B) 촉매의 존재하에서 필리게닌과 이부프로펜 클로라이드 사이에서 에스테르화 반응이 수행되어 생성물이 획득된다.
Figure 112017021686319-pct00004
여기서, 단계 A)의 염소화제는 티오닐 클로라이드, 포스포러스 트리클로라이드, 포스포러스 펜타클로라이드, 포스포러스 옥시클로라이드 또는 포스포러스 옥시펜타클로라이드로부터 선택된다.
특히, 염소화 반응의 반응 온도는 10-30℃이다.
특히, 이부프로펜 대 염소화제의 몰비는 1:10-1:12, 바람직하게는 1:10이다.
특히, 반응 시간은 12시간 내지 24시간, 바람직하게는 15시간 내지 24시간이다.
특히, 첫째로, 이부프로펜은 유기 용매에 용해된 후, 염소화제와 혼합된 후, 염소화 반응이 수행된다.
여기서, 사용된 유기 용매의 양은 1 mol의 이부프로펜마다 3 L 내지 4 L의 유기 용매, 바람직하게는 4 L의 유기 용매에 용해되는 양이다.
특히, 유기 용매는 톨루엔, 벤젠, 아세톤, 디클로로메탄, 및 트리클로로메탄, 바람직하게는 디클로로메탄 및 아세톤, 더욱 바람직하게는 디클로로메탄으로부터 선택된다.
특히, 제조 방법은 진공 상태에서의 염소화 반응 및 유기 용매의 제거 후의 혼합물의 농축 처리로 이부프로펜 클로라이드를 획득하는 것을 추가로 포함한다.
특히, 증발 처리가 감압하에서 수행되어 유기 용매를 제거한다.
여기서, 단계 B)의 촉매는 유기 염기 또는 무기 염기로부터 선택된다.
특히, 필리게닌 대 촉매의 비는 1:1 내지 1.2:1, 바람직하게는 1:1이다.
여기서, 무기 염기는 소듐 카르보네이트, 포타슘 카르보네이트, 소듐 바이카르보네이트 또는 포타슘 바이카르보네이트로부터 선택되고; 유기 염기는 피리딘, 트리에틸아민, N,N-디메틸포름아미드 또는 금속 알콕시드로부터 선택된다.
특히, 금속 알콕시드는 소듐 메탄올레이트 또는 포타슘 터트-부톡시드로부터 선택된다.
여기서, 단계 B)에서의 필리게닌 대 단계 A)에서의 이부프로펜의 몰비는 0.8:1 내지 1.2:1, 바람직하게는 1:1이다.
특히, 에스테르화 반응의 온도는 30℃ 내지 70℃, 바람직하게는 40℃ 내지 60℃이고; 에스테르화 반응의 반응 시간은 12시간 내지 24시간, 바람직하게는 15시간 내지 20시간이다.
여기서, 단계 B)에서의 에스테르화 반응은 필리게닌 및 이부프로펜 클로라이드가 유기 용매에 첨가된 후에 가열 상태로 수행된다.
특히, 유기 용매는 톨루엔, 벤젠, 아세톤, 디클로로메탄, 및 트리클로로메탄, 바람직하게는 디클로로메탄 및 아세톤으로부터 선택된다.
특히, 먼저 필리게닌이 유기 용매에 용해되고; 이후, 촉매가 첨가되고, 혼합물이 균일하게 혼합된 후; 단계 A)에서 제조된 이부프로펜 클로라이드가 균일하게 혼합된 혼합물에 첨가되고, 에스테르화 반응이 교반 및 가열의 상태에서 수행된다.
특히, 유기 용매는 톨루엔, 벤젠, 아세톤, 디클로로메탄, 및 트리클로로메탄, 바람직하게는 디클로로메탄 및 아세톤으로부터 선택된다.
특히, 사용된 유기 용매의 양은 1 mol의 필리게닌마다 15 L 내지 25 L의 유기 용매, 바람직하게는 20 L의 유기 용매에 용해되는 양이다.
특히, 제조 방법은 에스테르화 반응 후의 생성물이 분리 및 정제 처리에 적용되는 단계 C)를 추가로 포함하며; C-1) 에스테르화 반응 후의 혼합물은 냉각되고, 온도가 감소하고; C-2) 이후, 혼합물은 필터 처리에 적용되고, 여과액은 농축 처리에 적용되고, 용매가 제거되고; C-3) 이후, 유기 용매가 제거된 후의 고체 물질은 재결정화 처리에 적용되어 필리게닌 이부프로펜 에스테르가 획득된다.
여기서, 단계 C-1)에서의 에스테르화 반응 후의 혼합물은 20℃ 내지 30℃로 냉각되고; 단계 C-2)에서의 농축 처리는 유기 용매를 제거하기 위해 진공 상태에서 냉각된 혼합물을 증발시키는 것이고; 단계 C-3)에서의 재결정화 처리의 용매는 석유 에테르 또는 헥산이다.
상기 언급된 방법에 의해 제조된 본 발명의 화합물은 필리게닌 이부프로펜 에스테르이며, 이는 실온에서 백색 고체이다. 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 구조는 하기와 같이 확인되고 분석된다:
고해상도 질량 스펙트럼: 583.26663; C34H40O7Na+1;
적외선 흡수 스펙트럼: 특징적 흡수 피크 (cm-1) 2953.73 (-CH3); 2867.21 (-CH2-); 29835.45 (Ar-OCH3); 1760.11 (C=O); 1606.25, 1591.38, 1514.46 (Ar-CH); 및 1270.57, 1042.86 (Ar-O-C).
1H-NMR: (CDCl3, 600 MHz) δppm: 6.856-6.961 (m, 6H), 7.135-7.145 (m, 2H), 7.322-7.335 (d, 2H, J = 7.8Hz), 4.860-4.853 (d, 1H, J = 4.2 Hz), 4.494-4.484 (d, 1H, J = 6 Hz), 4.145-4.129 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 3.988-3.976 (d, 1H, J = 7.2 Hz), 3.900-3.843 (s, 8H), 3.720-3.713 (s, 3H), 3.346-3.323 (s, 2H), 2.891-2.881 (d, 1H, J = 6 Hz), 2.481-2.470 (d, 2H, J = 6.6 Hz), 1.882-1.860 (s, 1H), 1.620-1.609 (d, 3H, J = 6.6 Hz), 0.920-0.910 (s, 6H).
13C-NMR: (CDCl3, 125 MHz) δppm: 172.901(C-28), 151.374(C-12), 148.880(C-18), 148.056(C-13), 140.635(C-35), 140.203(C-17), 139.486 (C-10), 137.436(C-9), 130.971(C-31), 129.328(C-33), 127.445(C-36), 127.445(C-37), 122.578(C-34), 118.045(C-20), 117.767(C-16), 111.097(C-15), 110.035(C-14), 110.015(C-19), 109.020(C-11), 87.345(C-6), 82.043(C-4), 71.107(C-1), 69.830(C-8), 55.958(C-OMe), 55.933(C-OMe), 55.851(C-OMe), 54.694(C-2), 50.101(C-3), 45.107(C-38), 45.040(C-30), 30.252(C-39), 22.448(C-40, 41), 18.803(C-32).
Figure 112017021686319-pct00005
또 다른 양태에서, 본 발명은 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 항바이러스 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 항바이러스 약물 또는 건강 제품의 제조에서의 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 해열, 진통, 및 항-염증 약물 또는 건강 제품의 제조에서의 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 용도를 제공한다.
여기서, 본 발명은 필리게닌 이부프로펜 에스테르를 함유하고, 항바이러스, 해열, 진통, 항-염증 효능을 갖는 약학적 또는 건강 제품 조성물을 제공한다.
특히, 약학적 조성물은 본 발명의 필리게닌 이부프로펜 에스테르, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다.
여기서, 약학적으로 허용되는 부형제는 비-독성 고체, 반-고체 또는 액체 충전제, 희석제, 담체, pH 조절제, 이온 강도 조절제, 연장-방출제 또는 조절-방출제, 캡슐화 물질 또는 다른 약학적 부형제를 나타낸다. 사용되는 담체는 해당 투여 방법에 적합화될 수 있고, 당업자에게 널리 공지된 부형제와 함께 주입액, 동결건조된 분말(주입용), 스프레이, 경구 용액, 경구 현탁액, 정제, 캡슐, 위-내성 정제, 환약, 분말, 과립, 지속-방출 또는 지연-방출 제형 등으로 제형화될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 첫번째 양태의 필리게닌 이부프로펜 에스테르는 주입에 의해 또는 소화관을 통해 투여되고, 따라서 본 발명의 약학적 조성물은 바람직하게는 주입액 또는 소화관 투여를 통하는 제형이며, 즉, 주입에 의하거나 소화관을 통해 투여하도록 제형화되기에 적합화된 부형제가 특히 바람직하다. 여기서, 본원에서 "소화관을 통한 투여"는 경구 투여, 위내 투여, 및 관장 투여 등을 포함하고, 바람직하게는 경구 투여인 환자의 소화관을 통해 의약 제형을 투여하는 접근법을 나타내며, 예를 들어, 당업자에게 널리 공지된 부형제가 경구 용액, 경구 현탁액, 정제, 캡슐, 장용 정제, 환약, 분말, 과립, 지속-방출 또는 지연-방출 제조물 등을 제형화시키기 위해 이용될 수 있고; 주입 제조물은 주로 주입액 및 분말-주입액이다.
본 발명의 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 새로운 화합물은 항바이러스, 해열, 진통 및 항-염증 효능을 갖고, 항바이러스, 해열, 진통, 항-염증 약물 또는 건강 제품을 제조하기 위해 이용될 수 있으며; 필리게닌 이부프로펜 에스테르는 에스테르화 반응에 의해 제조되고, 제조 방법은 가벼운 반응 조건, 높은 수율, 낮은 에너지 소모, 환경 친화성, 용이한 조절 작업 과정 조건, 및 확실한 품질 제어성의 장점을 갖고, 산업적 대-규모 생성에 적합하다.
상기 언급된 에스테르화 반응에서, 필리게닌은 적합한 유기 용매에 용해되고, 이부프로펜 클로라이드가 반응 시스템에 첨가되어 10시간 내지 24시간 동안 에스테르화 반응이 수행된다. 반응이 중지된 후, 반응 액체는 중성이 될때까지 물로 세척되고, 건조제가 첨가되어 물이 최종적으로 제거되고, 유기 용매가 감압하에서 증발되어 백색 고체가 획득되고, 생성된 고체가 재결정화되어 필리게닌 이부프로펜 에스테르가 획득된다.
도 1은 본 발명의 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 1H-NMR 스펙트럼이다;
도 2는 본 발명의 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 13C-NMR 스펙트럼이다;
도 3은 본 발명의 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 적외선(IR) 흡수 스펙트럼이다;
도 4는 인플루엔자 바이러스 폐렴으로 감염된 모델 마우스의 폐 조직의 병리학적 절편으로, 여기서
A는 정상 마우스의 폐 조직이고; B는 인플루엔자 바이러스 폐렴에 감염된 마우스의 폐 조직이고; C는 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 고용량 그룹에서의 처리 후의 인플루엔자 바이러스 폐렴에 감염된 마우스의 폐 조직이고; D는 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 중간 용량 그룹에서의 처리 후의 인플루엔자 바이러스 폐렴에 감염된 마우스의 폐 조직이고; E는 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 저용량 그룹에서의 처리 후의 인플루엔자 바이러스 폐렴에 감염된 마우스의 폐 조직이고; F는 타미플루에 의한 처리 후의 인플루엔자 바이러스 폐렴에 감염된 마우스의 폐 조직이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 하기 실시예를 통해 추가로 기재될 것이다. 그러나, 이들 실시예는 단지 본 발명의 예시이고, 본 발명의 범위에 대한 어떠한 제한으로도 해석되어선 안된다. 또한, 실시예에서의 시약 및 원료 물질은 상업적 공급원으로부터 획득될 수 있고, 더욱 상세하게는, 유기 합성 지침, 약물 감독 및 관리 기관의 지침, 및 해당 장치 및 시약의 제조업체의 설명서 등을 참조할 수 있다.
실시예 1
1. 염소화 반응
이부프로펜(2.06 g, 0.01 mol)을 3-목 플라스크에 공급하고, 40 mL의 디클로로메탄에 용해시키고; 티오닐 클로라이드(11.9 g, 0.1 mol)의 염소화 시약을 3-목 플라스크에 첨가하고, 반응을 15시간 동안 실온(20℃)에서 수행하고, 디클로로메탄을 감압(즉, 진공 조건하)을 이용하여 증발시켜 이부프로펜 클로라이드를 획득하였고, 여기서 이부프로펜 대 염소화제의 몰비는 1:10이었다;
2. 에스테르화
필리게닌(3.72 g, 0.01 mol)을 200 ml의 아세톤을 함유하는 3-목 플라스크에 두고, 혼합물을 균일하게 혼합하고; 이후 포타슘 카르보네이트(1.5 g, 0.01 mol)의 촉매를 첨가하고, 혼합물을 균일하게 교반한 후; 단계 1)에서 제조된 이부프로펜 클로라이드(2.24 g, 0.01 mol)를 3-목 플라스크에 적가하고; 혼합물을 교반하면서 60℃로 가열하고, 에스테르화 반응을 60℃의 온도를 유지하면서 15시간 동안 수행하였다;
3. 분리 및 정제 처리
에스테르화 반응 후에 생성된 혼합물을 실온(20℃-25℃)으로 냉각시키고; 혼합물을 여과시키고, 고체 잔여물을 제거하고, 여과액을 감압을 이용하여 증발시켜 아세톤 용매를 회수하고, 고체 잔여물을 획득하였다;
용매를 회수한 후에 생성된 고체를 디클로로메탄에 용해시키고, 생성된 용액을 중성이 될때까지 물로 세척하고, 무수 소듐 설페이트를 이용하여 건조시키고, 디클로로메탄 용매를 진공의 조건(즉, 감압)하에서 증발시켜 백색 고체를 획득하였다.
생성된 백색 고체를 석유 에테르를 이용한 재결정화 처리에 적용시켜 98%의 수율로 필리게닌 이부프로펜 에스테르(5.49 g)를 획득하였다.
필리게닌 이부프로펜 에스테르는 백색 고체이고; 융점이 110℃이고; 용해도는 메탄올, 클로로포름, 및 디클로로메탄 등에서 가용성이다.
고해상도 질량 스펙트럼: 583.26663 C34H40O7Na+1; 분자량: 561.
적외선 흡수 스펙트럼: 특징적 흡수 피크 (cm-1) 2953.73 (-CH3); 2867.21 (-CH2-); 29835.45 (Ar-OCH3); 1760.11 (C=O); 1606.25, 1591.38, 1514.46 (Ar-CH); 1270.57, 1042.86 (Ar-O-C), 도 3에 제시된 바와 같음.
1H-NMR: (CDCl3, 600 MHz) δppm: 6.856-6.961 (m, 6H), 7.135-7.145 (m, 2H), 7.322-7.335 (d, 2H, J = 7.8Hz), 4.860-4.853 (d, 1H, J = 4.2 Hz), 4.494-4.484 (d, 1H, J = 6 Hz), 4.145-4.129 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 3.988-3.976 (d, 1H, J = 7.2 Hz), 3.900-3.843 (s, 8H), 3.720-3.713 (s, 3H), 3.346-3.323 (s, 2H), 2.891-2.881 (d, 1H, J = 6 Hz), 2.481-2.470 (d, 2H, J = 6.6 Hz), 1.882-1.860 (s, 1H), 1.620-1.609 (d, 3H, J = 6.6 Hz), 0.920-0.910 (s, 6H), 도 1에 제시된 바와 같음.
13C-NMR: (CDCl3, 125 MHz) δppm: 172.901(C-28), 151.374(C-12), 148.880(C-18), 148.056(C-13), 140.635(C-35), 140.203(C-17), 139.486 (C-10), 137.436(C-9), 130.971(C-31), 129.328(C-33), 127.445(C-36), 127.445(C-37), 122.578(C-34), 118.045(C-20), 117.767(C-16), 111.097(C-15), 110.035(C-14), 110.015(C-19), 109.020(C-11), 87.345(C-6), 82.043(C-4), 71.107(C-1), 69.830(C-8), 55.958(C-OMe), 55.933(C-OMe), 55.851(C-OMe), 54.694(C-2), 50.101(C-3), 45.107(C-38), 45.040(C-30), 30.252(C-39), 22.448(C-40, 41), 18.803(C-32), 도 2에 제시된 바와 같음.
실시예 2
1. 염소화 반응
이부프로펜(2.06 g, 0.01 mol)을 3-목 플라스크에 공급하고, 40 mL의 디클로로메탄에 용해시키고; 포스포러스 옥시클로라이드(15.3 g, 0.1 mol)의 염소화 시약을 3-목 플라스크에 첨가하고, 반응을 15시간 동안 실온(30℃)에서 수행하고, 디클로로메탄을 감압(즉, 진공 조건하)을 이용하여 증발시켜 이부프로펜 클로라이드를 획득하였고, 여기서 이부프로펜 대 염소화제의 몰비는 1:10이었다;
2. 에스테르화 반응
필리게닌(3.72 g, 0.01 mol)을 200 ml의 디클로로메탄 용매를 함유하는 3-목 플라스크에 두고, 혼합물을 균일하게 혼합하고; 이후 트리에틸아민(1.5 ml, 0.01 mol)의 촉매를 첨가하고, 혼합물을 균일하게 교반한 후; 단계 1)에서 제조된 이부프로펜 클로라이드(2.24 g, 0.01 mol)를 3-목 플라스크에 적가하고; 혼합물을 교반하면서 40℃로 가열하고, 에스테르화 반응을 40℃의 온도를 유지하면서 20시간 동안 수행하였다;
3. 분리 및 정제 처리
에스테르화 반응 후에 생성된 혼합물을 실온(20℃-25℃)으로 냉각시키고; 혼합물을 여과시키고, 고체 잔여물을 제거하고, 여과액을 감압을 이용하여 증발시켜 디클로로메탄 용매를 회수하고, 고체 잔여물을 획득하였다;
용매를 회수한 후에 생성된 고체를 디클로로메탄에 용해시키고, 생성된 용액을 중성이 될때까지 물로 세척하고, 무수 소듐 설페이트를 이용하여 건조시키고, 디클로로메탄 용매를 진공의 조건(즉, 감압)하에서 증발시켜 백색 고체를 획득하였다.
생성된 백색 고체를 석유 에테르를 이용한 재결정화 처리에 적용시켜 97%의 수율로 필리게닌 이부프로펜 에스테르(5.44 g)를 획득하였다.
재결정화에 의해 획득된 백색 고체의 물리화학적 특성, 스펙트럼 데이터 및 질량 스펙트럼 데이터는 실시예 1에서 제조된 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 것들과 일치하였다.
실시예 3
1. 염소화 반응
이부프로펜(2.06 g, 0.01 mol)을 3-목 플라스크에 공급하고, 40 mL의 디클로로메탄에 용해시키고; 포스포러스 옥시펜타클로라이드(20.8 g, 0.1 mol)의 염소화 시약을 3-목 플라스크에 첨가하고, 반응을 15시간 동안 실온(10℃)에서 수행하고, 디클로로메탄을 감압(즉, 진공 조건하)을 이용하여 증발시켜 이부프로펜 클로라이드를 획득하였고, 여기서 이부프로펜 대 염소화제의 몰비는 1:10이었다;
2. 에스테르화 반응
필리게닌(3.72 g, 0.01 mol)을 200 ml의 트리클로로메탄 용매를 함유하는 3-목 플라스크에 두고, 혼합물을 균일하게 혼합하고; 이후 소듐 메톡시드(1.5 ml, 0.01 mol)의 촉매를 첨가하고, 혼합물을 균일하게 교반한 후; 단계 1)에서 제조된 이부프로펜 클로라이드(2.24 g, 0.01 mol)를 3-목 플라스크에 적가하고; 혼합물을 교반하면서 50℃로 가열하고, 에스테르화 반응을 50℃의 온도를 유지하면서 17시간 동안 수행하였다;
3. 분리 및 정제 처리
에스테르화 반응 후에 생성된 혼합물을 실온(20℃-30℃)으로 냉각시키고; 혼합물을 여과시키고, 고체 잔여물을 제거하고, 여과액을 감압을 이용하여 증발시켜 트리클로로메탄 용매를 회수하고, 고체 잔여물을 획득하였다;
용매를 회수한 후에 생성된 고체를 디클로로메탄에 용해시키고, 생성된 용액을 중성이 될때까지 물로 세척하고, 무수 소듐 설페이트를 이용하여 건조시키고, 디클로로메탄 용매를 진공의 조건(즉, 감압)하에서 증발시켜 백색 고체를 획득하였다.
생성된 백색 고체를 석유 에테르를 이용한 재결정화 처리에 적용시켜 98%의 수율로 필리게닌 이부프로펜 에스테르(5.49 g)를 획득하였다.
재결정화에 의해 획득된 백색 고체의 물리화학적 특성, 스펙트럼 데이터 및 질량 스펙트럼 데이터는 실시예 1에서 제조된 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 것들과 일치하였다.
시험예 1: 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 항바이러스 시험
1 시험관내 항바이러스 시험
1.1 시험 재료
(1) 약물
① 필리게닌 이부프로펜 에스테르: Dalian Fusheng Natural Drug Development Co., Ltd.에 의해 제조되고, 영역 표준화 방법을 통해 2개의 고성능 액체 크로마토그래피 검출기, 즉, 자외선 검출기 및 증기화 광-산란 검출기에 의해 결정된 백색 고체(실시예 1에서 제조됨); 이의 순도는 99.1%이다.
② 리바비린 주입액: Henan Runhong Co., Ltd.에 의해 제조된 무색 및 투명 용액, 제품 로트 번호(lot No.): 1206261, National medical Permitment No.: H19993553, 100 mg/ml, 본 시험을 위한 양성 대조군 약물로서 채택됨;
③ 오셀타미버 포스페이트(oseltamivir phosphate): 중국 약품 생물 제품 검정소(National Institute for Control of Pharmaceutical & Biological Products)로부터 이용가능함, Batch No. 101096-200901; 100 mg/각각, 본 시험을 위한 양성 대조군 약물로서 채택됨;
④ 필리게닌: Dalian Fusheng Natural Drug Development Co., Ltd.에 의해 제조되고, 영역 표준화 방법을 통해 2개의 고성능 액체 크로마토그래피 검출기, 즉, 자외선 검출기 및 증기화 광-산란 검출기에 의해 결정된 백색 고체; 이의 순도는 99.1%이다.
⑤ 이부프로펜: 중국 약품 생물 제품 검정소로부터 구입, Batch No.: 0179-9702를 가짐.
상기 언급된 약물을 모두 정제수에 용해시키고, 여과시키고, 멸균시키고, 서브패키징시키고, 대기(standby) 적용을 위해 4℃에서 저장하였다; 이들 모두는 본 시험에서 시험되는 약물이었다.
(2) 세포주
Vero(아프리카 녹색 원숭이 신장 세포) 세포주가 지린 대학(Jilin University)의 기초 의학 과학 대학에 의해 보존되었다.
(3) 바이러스 균주
① 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 호흡기세포 융합 바이러스(RSV): 중국 예방 의약품 아카데미(Chinese Academy of Preventive Medicine)의 바이러스학 연구소로부터 구입;
② 콕사키 바이러스 B3(CVB3): 중국과학원 우한병독 연구소(Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences)로부터 구입;
③ 콕사키 바이러스 A16(CoxA16) 및 엔테로바이러스 EV71: 일본 센다이 국립 병원(Sendai National Hospital of Japan)으로부터 구입;
④ 아데노바이러스(AdV): 노먼 베쑨 의과 대학 제1 병원(The First Hospital of Norman Bethune Medical University)의 소아 연구 학과로부터 구입;
⑤ 단순 헤르페스 바이러스 타입 I(HSV-1): 중국 약품 생물 제품 검정소 보건부(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, Ministry of Health)로부터 구입.
(4) 주요 장비 및 시약
생물학적 안전 캐비넷: BHC-1300 II A/B3, AIRTECH;
CO2 인큐베이터: MCO-18AIC, SANYO;
도립현미경: CKX41, OLYMPUS;
전자식 분석 저울: AR1140/C, DHAUS;
배양 배지: DMEM, HyClone;
소 태아 혈청: HyClone;
트립신: Gibco;
MTT: Sigma;
DMSO: Tianjin Beilian Fine Chemicals Development Co., Ltd.
1.2 시험 방법
(1) 세포 제조
Vero 세포를 1-2일 동안 계대배양하여 막을 형성시키고, 경계선이 분명하고, 3차원 느낌 및 디옵터가 강한 경우, 이들을 췌장 효소로 분해시켰고; 세포 표면 상에 바늘-유사 웰이 존재한 경우, 분해액을 완전 배출시켰고, 세포를 수밀리리터의 배양 배지에 분산시키고, 계수한 후, 배양 배지(10% 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM)로 약 5x107 세포/L로 희석시키고, 세포가 단층으로 성장할 때까지 96-웰 배양 플레이트에 접종시켰다.
(2) 약물 독성의 결정
세포독성 시험: 약물을 세포독성의 결정을 위해 표 1-1의 농도에 따라 희석시켰다.
표 1-1: 약물 희석 참조표(단위: g/L)
Figure 112017021686319-pct00006
유지 용액(2%의 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM)으로 다양한 농도로 희석된 상기 약물을 포어 당 0.2 ml로 Vero 단층 세포에 적가하고, 각각의 농도에 대해, 약물을 각각 6개의 포어에 6중으로 첨가하였다. 또한, 6개의 포어를 정상 대조군(약물 없음)으로 설정한 한편, 또 다른 6개의 포어를 블랭크 대조군(배지 단독)으로 설정하였다. 세포를 5% CO2 하에서 37℃에서 인큐베이터에서 성장시키고, CEP를 도립현미경으로 매일 관찰하고, 기록하였다. 72시간 후, 20 μL(5 mg mL-1)의 MTT 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 4시간 동안 연속적으로 인큐베이션시키고, 각각의 웰의 배양 배지를 흡입하고, 폐기시키고, 100 μL의 DMSO를 각각의 웰에 첨가하고, 5분 동안 진탕시키고, OD 값을 492 nm에서 측정하여 세포 생존률을 계산하였다. SPSS 18.0 통계 소프트웨어에서, 세포 생존률을 프로빗 회귀 분석(Probit Regression Analysis)에 적용시켜, Vero 세포에 대한 약물의 최대 비-독성 농도(TC0) 및 중간 독성 농도(TC50)를 계산하였다.
(3) 다양한 바이러스의 TCID50의 결정
다양한 바이러스를 10배 감소에 의해 희석시켜 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5의 다양한 희석을 갖도록 하였다. 정상 세포 대조군을 설정하면서, 단층 Vero 세포를 함유하는 96-포어 배양 플레이트의 6중 포어 각각에 각각의 희석에 대한 100 μl 희석액을 차례로 접종시켰다. 플레이트를 5% CO2에서 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시킨 후, 바이러스 용액을 제거하고, 5% CO2에서 37℃에서의 추가 인큐베이션을 위해 100 μL 세포 유지 배지를 각각의 포어에 첨가하였다. 세포병변 효과를 3일로부터 현미경 하에서 검사하고, 결과를 결정하고, 7-8일에 기록하였다. 바이러스 역가를 종점으로서 세포 포어의 50%에서 양성 세포병증이 발생하도록 하는 최대 희석 역가를 이용하여 카버 방법(karber method)에 의해 계산하였다.
Figure 112017021686319-pct00007
TCID50: 50% 조직구 감염 용량
XM: 바이러스의 가장 높은 농도 희석액의 대수
d: 희석 계수(배수)의 대수;
∑pi: 각각의 희석액에 대한 세포병증 백분율의 합계;
(4) 바이러스-유도 세포병증에 대한 약물의 영향
단층 세포로 덮인 플레이트 내의 배양 배지를 흡인하고, 폐기시키고, 세포를 100TCID50에 해당하는 바이러스 공격량으로 접종시키고, 2시간 동안 5% CO2와 함께 37℃에서 인큐베이터에서 흡수시킨 후, 특정 농도(대략 최대 비-세포독성 농도)의 각각의 약물 유체를 첨가하였다. 각각의 농축을 200 μL/웰을 이용하여 6 포어에서 6중으로 수행하였다. 리바비린 주입액 및 오셀타미버 포스페이트는 양성 대조군 그룹으로 제공한 한편, 바이러스-유도 CPE에 대한 약물의 효과를 시험하기 위해 정상 대조군 그룹(바이러스 및 약물이 없음) 및 바이러스 대조군 그룹(바이러스는 첨가하나 약물은 없음)을 설정하였다. 72시간 후, MTT 비색법을 이용하여 492 nm 파장하에서 OD 값을 측정하고, 약물의 항바이러스 유효율(ER%)을 계산하였다. 항바이러스 효율에 대한 다양한 약물 그룹에서 유의한 차이가 존재하는지 결정하기 위해 SPSS 18.0 통계 소프트웨어에서의 분산 분석(ANOVA) 방법을 이용하였다.
ER% = (약물-처리 그룹의 평균 OD 값 - 바이러스 대조군 그룹의 평균 OD 값)/(세포 대조군 그룹의 평균 OD 값 - 바이러스 대조군 그룹의 평균 OD 값) x 100%
1.3 시험 결과
(1) 다양한 바이러스의 TCID 50
Figure 112017021686319-pct00008
Figure 112017021686319-pct00009
Figure 112017021686319-pct00010
Figure 112017021686319-pct00011
Figure 112017021686319-pct00012
Figure 112017021686319-pct00013
Figure 112017021686319-pct00014
Figure 112017021686319-pct00015
(2) 약물 독성의 결정
1) 약물의 세포독성의 결정
Vero 세포에 대한 약물의 최대 비-독성 농도(TC0) 및 중간 독성 농도(TC50) 및 항바이러스 시험에 사용된 약물의 농도가 표 1-2에 제시되었다.
표 1-2: 약물 세포독성 시험의 결과(단위: g/L)
Figure 112017021686319-pct00016
2) 바이러스-유도 세포병증에 대한 약물의 보호 효과의 결과
다양한 바이러스에 저항하는데 있어서의 약물의 유효율 및 ANOVA-방법 1원 분산 분석의 결과에 대해서는, 세부사항에 대해 표 3을 참조한다.
표 1-3: 약물의 항바이러스 유효율(ER%)의 통계 표
Figure 112017021686319-pct00017
표 1-3에 제시된 바와 같이, 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 타입 I(HSV-I) 및 엔테로바이러스 EV71에 대한 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 억제율 및 유효율 둘 모두는 바이러스 대조군 그룹에 비해 명백한 차이와 함께 99% 초과이며, 통계적으로 유의하다. 다수의 바이러스에 대한 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 항바이러스 효능은 필리게닌, 리바비린 및 오셀타미버 포스페이트의 것보다 우수하였다.
2. 생체내 항바이러스 시험
2.1 시험 물질
(1) 시험 동물
쿤밍(Kunming) 마우스(Medicinal Animal No. 10-5219)가 지린 대학의 노먼 베쑨 과학 센터(Norman Bethune Science center)의 실험 동물 센터에 의해 제공되었다.
(2) 검출 기계 및 시약
Figure 112017021686319-pct00018
2.2 시험 방법
(1) 인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스로 인한 마우스의 중간 치사 용량의 결정
인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스(세포 용해질)를 10배 감소에 의해 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 및 10-5의 농도를 갖는 바이러스 액체로 희석시켰다. 120마리의 쿤밍 마우스를 채택하고, 이 중 60마리를 인플루엔자 바이러스 그룹에 대해 제공하고, 나머지 60마리를 파라인플루엔자 바이러스 그룹에 대해 제공하고, 개별적으로 6개의 그룹으로 무작위로 나누고; 마우스를 에테르로 가볍게 마취시키고, 0.03 mL/마우스로 다양한 희석액을 갖는 바이러스 액체로 비내 감염시켰다. 그 동안, 블랭크 대조군을 설정하고, 바이러스 액체를 염수로 대체하였다. 사망 및 생존을 관찰 지표로 이용하였고, 관찰을 감염 14일 후까지 매일 수행하였다. 감염 후 24시간 이내에 사망한 마우스는 비특이적 사망이었고, 계산에 넣지 않았고, 바이러스 액체 LD50을 카버 방법을 이용하여 계산하였다. 계산식은
Figure 112017021686319-pct00019
이다[여기서, LD50: 중간 치사 용량; XM: 바이러스의 가장 높은 농도 희석의 대수; d: 희석 계수(배수)의 대수; ∑pi: 각각의 희석 세포병증 백분율의 합계].
(2) 항-인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스 감염에 의해 야기된 폐렴에 대한 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 내성에 대한 연구
1) 시험 동물 및 그룹 나누기
840마리의 4주령의 쿤밍 마우스를 채택하여 2개의 시험을 수행하였다. 420마리의 마우스를 채택하고, 인플루엔자 바이러스에 의해 감염된 마우스에 대한 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 폐 지수 및 폐 지수의 억제율을 결정하는 시험을 위해 21개의 그룹(각각의 그룹에 대해 20마리)으로 무작위로 나누었고; 시험을 각각의 횟수에 70마리의 마우스로 3회 반복하였다. 추가의 420마리의 마우스를 채택하고, 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 폐 현탁액 바이러스 적혈구응집 역가를 결정하기 위해 21개의 그룹(각각의 그룹에 대해 20마리의 마우스)으로 무작위로 나누었고; 시험을 각각의 횟수에 70마리의 마우스로 3회 반복하였다.
2) 감염 방법
탈지솜을 200-300 mL 비커에 두고, 적합한 양의 디에틸 에테르(솜을 막 적시는 정도)를 거기에 첨가하였다. 탈지솜을 함유하는 비커를 거꾸로 뒤집고, 마우스를 그 안에서 마취한 경우 극도로 흥분하였고, 뚜렷이 약해진 경우 마우스를 등을 대고 눕게 하고, 마우스를 0.03 ml/콧구멍으로 15LD50 인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스로 비내 감염시켰고, 정상 대조군 그룹에서 바이러스 현탁액을 생리식염수로 대체하였다.
3) 투여 방법 및 투여량
마우스에 이들을 감염시키기 하루 전 필리게닌 이부프로펜 에스테르 그룹, 리바비린 및 오셀타미버 포스페이트를 위내 투여하였다. 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 높은 투여 용량, 중간 투여 용량 및 낮은 투여 용량은 각각 13.0, 8.0, 및 4.0 mg/kg이었고, 리바비린의 투여 용량은 연속 5일 동안 하루에 1회로 58.5 mg/kg이었고, 바이러스 대조군 그룹의 마우스에 동일 부피의 생리식염수를 투여하였다.
4) 관찰 지표
① 폐 지수 결정
약물을 마우스에 투여하고 5일 후에, 먼저 마우스를 8시간 동안 음용수를 금지시킨 후; 마우스를 칭량한 후, 이들의 안구를 분리시키고, 상기 동물을 안구적출을 통한 출혈에 의해 희생시키고; 이후, 흉부의 개방 후에 폐를 분리시키고, 생리식염수로 2회 세척한 후, 필터 종이로 표면으로부터 수분을 제거하고, 전자 저울을 이용하여 칭량하였다. 폐 지수 및 폐 지수의 억제율을 하기 식에 따라 계산하였다:
폐 지수 = (마우스 폐 중량/마우스 체중) x 100%; 폐 지수의 억제율 = (감염 모델 그룹의 평균 폐 지수 - 시험 그룹의 평균 지수)/감염 모델 그룹의 평균 폐 지수 x 100%.
② 폐 현탁액 바이러스 적혈구응집 역가의 결정
마우스 폐의 다양한 그룹을 처리 5일 후에 각각 채집하고, 저온에서 균질화기에 의해 균질액으로 분쇄시키고; 균질액을 생리식염수를 이용하여 10%의 폐 조직 현탁액으로 희석시키고; 원심분리를 수행하여 상층액을 획득하고, 이를 2배 희석시킨 후, 0.2 ml/웰로 적정 플레이트로 떨어뜨리고; 0.2 ml의 1% 닭 적혈구 현탁액을 각각의 웰에 첨가하고, 균일하게 혼합하고; 적정 플레이트를 30분 동안 실온 환경에 두어 적혈구응집 역가를 관찰하고 기록하였다. 종점은 적혈구가 (++)가 되도록 응집된 경우인 것으로 보이고, 이의 역가를 현탁액 희석 배수에 의해 표현하였다.
③ 폐의 조직형태학적 관찰
처리 5일 후에, 각각의 그룹의 마우스의 폐를 채집하고, 이들의 내장의 일반적인 병리학적 변화를 육안으로 관찰하고, 기록하였다. 폐를 생리식염수로 헹구고, 이의 수분을 필터 종이를 이용하여 흡인시키고, 폐의 일부를 10% 포름알데하이드로 고정시키고, 파라핀에 포매시키고, 절편화시키고, 폐 조직 절편을 HE로 염색한 후, 현미경 하에서 관찰하고, 사진을 찍었다.
2.3 시험 결과 및 분석
(1) 인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스로 인한 마우스의 중간 치사 용량의 결과
시험 그룹의 쿤밍 마우스를 각각 30 μL의 다양한 농도의 인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스 액체로 비내 감염시키고; 감염 3일 후, 처음 3개 그룹(바이러스 농도를 기초로 하여 10-1 그룹, 10-2 그룹 및 10-3 그룹)의 마우스 모두는 모피 털운동(pilomotor fur), 진전, 감소된 식욕 등의 다양한 정도의 질병 증상을 경험하였고; 5일 후에, 마우스는 비틀거렸고; 6일 후에, 가장 높은 바이러스 농도 그룹(10-1 그룹)의 마우스는 사망하기 시작하였고, 감염 7일 후에 나머지 그룹에서 연속적으로 사망이 발생하였다. 14일의 관찰이 완료된 후, 각각의 그룹의 마우스의 사망률을 계수하였고, 결과는 하기 표 1-4 및 표 1-5에 제시되었다. 계산에 의해, 인플루엔자 바이러스의 LD50은 10-2.9의 희석액이었고, 파라인플루엔자 바이러스의 LD50은 10-2.5의 희석액이었다.
표 1-4: 인플루엔자 바이러스의 중간 치사 용량의 시험 결과
Figure 112017021686319-pct00020
바이러스의 LD50 값을 카버 방법에 의해 계산하였다. 인플루엔자 바이러스의 LogLD50 값은 하기와 같았다:
Figure 112017021686319-pct00021
표 1-5: 파라인플루엔자 바이러스의 중간 치사 용량의 시험 결과
Figure 112017021686319-pct00022
바이러스의 LD50 값을 카버 방법에 의해 계산하였다. 파라인플루엔자 바이러스의 LogLD50 값은 하기와 같았다:
Figure 112017021686319-pct00023
(2) 인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스 감염에 의해 야기된 폐렴에 대한 내성에 대한 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 결과
① 폐 지수 결정
마우스를 인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스로 감염시킨 후, 평균 폐 지수는 감염 모델 그룹에 비해 필리게닌 이부프로펜 에스테르가 3.25-13.0 mg/kg/d의 농도 범위에서 특정한 보호 효과를 갖고, 모든 폐 지수가 명백히 감소하였고; 인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스에 대한 고용량의 필리게닌 이부프로펜 에스테르 그룹의 치료 효과가 필리게닌 그룹보다 훨씬 나은 것을 나타내었다(P< 0.05). 결과는 표 1-6 및 1-7에서 관찰될 수 있다.
표 1-6: 인플루엔자 바이러스 감염된 마우스(n=3)의 폐 지수 및 폐 지수의 억제율에 대한 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 영향
Figure 112017021686319-pct00024
표 1-7: 파라인플루엔자 바이러스 감염된 마우스(n=3)의 폐 지수 및 폐 지수의 억제율에 대한 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 영향
Figure 112017021686319-pct00025
② 폐 현탁액의 바이러스 적혈구응집 역가의 결정
마우스를 인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스로 감염시킨 후, 감염 모델 그룹의 폐 조직의 바이러스 적혈구응집 역가(InX)는 각각 32.40 및 33.11이었고, 5일 동안 다양한 농도의 필리게닌 이부프로펜 에스테르를 이용한 처리 후, 둘 모두의 폐 조직의 바이러스 적혈구응집 역가는 다소 감소하였고, 감염 모델 그룹과 비교하여, 차이는 유의하였고(P< 0.01); 여기서, 높은 투여량 및 중간 투여량의 필리게닌 이부프로펜 에스테르 그룹의 인플루엔자 및 파라인플루엔자 바이러스 적혈구응집 역가는 둘 모두 모델 그룹의 것보다 유의하게 낮았고, 억제율은 둘 모두 유의한 차이와 함께 필리게닌 그룹의 것보다 높았다(P<0.05, p<0.01). 시험 결과는 표 1-8 및 1-9에서 관찰될 수 있다.
표 1-8: 인플루엔자 바이러스 감염된 마우스의 폐 현탁액의 적혈구응집 역가에 대한 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 효과
Figure 112017021686319-pct00026
표 1-9: 파라인플루엔자 바이러스 감염된 마우스(n=3)의 폐 현탁액의 적혈구응집 역가에 대한 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 효과
Figure 112017021686319-pct00027
③ 폐 조직학의 검출 결과
현미경적으로, 인플루엔자 및 파라인플루엔자 바이러스 유도 폐렴 모델 그룹의 마우스의 사이질 폐, 예를 들어, 기관지, 세기관지 및 폐포벽이 울혈, 부종, 및 림프구 침윤, 단핵 세포 침윤, 폐포벽 확장, 및 폐포의 염증 반응으로 고통받는 것이 바이러스 폐렴 모델 그룹에서 관찰될 수 있다. 높은 투여량 및 중간 투여량의 필리게닌 이부프로펜 에스테르 그룹에서, 마우스의 폐 병변은 유의하게 완화되었고, 폐 형태학적 구조는 부분적으로 정상이었다. 병리학적 사진이 도면에서 상세하게 관찰될 수 있다.
인플루엔자 바이러스 폐렴 모델의 마우스 폐 조직의 병리학적 절편의 현미경 검사 결과는 도 4에 제시되며; 도 A는 정상 마우스의 폐 조직을 제시하고; 도 B는 인플루엔자 바이러스 폐렴 마우스의 폐 조직을 제시하고; 도 C는 높은 투여량의 필리게닌 이부프로펜 에스테르로 처리된 후의 인플루엔자 바이러스 폐렴 마우스 모델 마우스의 폐 조직을 제시하고; 도 D는 중간 투여량의 필리게닌 이부프로펜 에스테르로 처리된 후의 인플루엔자 바이러스 폐렴 마우스 모델 마우스의 폐 조직을 제시하고; 도 E는 낮은 투여량의 필리게닌 이부프로펜 에스테르로 처리된 후의 인플루엔자 바이러스 폐렴 마우스 모델 마우스의 폐 조직을 제시하고; 도 F는 타미플루로 처리된 후의 인플루엔자 바이러스 폐렴 마우스 모델 마우스의 폐 조직을 제시한다.
2.4 결론
생체내 항바이러스 시험 결과는 3.25-13 mg/kg/d의 투여량 범위의 필리게닌 이부프로펜 에스테르가 인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스 뿐만 아니라 이에 의해 야기된 마우스 바이러스 폐렴에 대해 비교적 유의한 억제 효과를 갖고, 3.25 mg/kg/d 내지 13 mg/kg/d의 투여량 범위에서 폐 지수 및 이의 적혈구응집 역가를 유의하게 감소시킬 수 있고, 또한 폐 조직 병리학을 유의하게 개선시킬 수 있고, 모델 대조군 그룹에 비해 유의한 차이를 갖고, 중간-투여량 및 높은-투여량의 필리게닌 이부프로펜 에스테르 그룹의 치료 효과가 필리게닌 그룹보다 명백히 낫고(*P<0.05 또는 **P<0.01), 또한 리바비린 및 오셀타미버 포스페이트 그룹보다 나은 경향을 나타내는 것을 나타내었다.
시험예 2: 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 해열, 진통 및 항-염증 효과의 시험
1.1 시험 재료
(1) 시험 동물:
위스타(Wistar) 래트, 체중: 120-250 g, 수컷 및 암컷 조합, 인증 번호: Medicinal Animal No. 10-5219; 재패니즈 화이트(Japanese white) 토끼, 수컷, 체중: 1.5-2.0 kg, 인증 번호: Medicinal Animal No. 10-5115, 모두 Changchun Gaoxin Medical Animal Experimental Center에 의해 제공되었고, 동물 먹이는 지린 대학의 실험 동물 학과에 의해 제공되었다.
(2) 시험 약물:
필리게닌 이부프로펜 에스테르: 영역 표준화 방법을 통해 UV 검출기 및 증기화 광-산란 검출기 둘 모두가 장비된 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 결정시 99.1%의 순도를 갖는 Dalian Fusheng Natural Medicine Development Co., Ltd.에 의해 생성된 백색 고체(실시예 1에서 제조됨). 시험에 사용되는 경우, 이는 0.5% 소듐 카르복시메틸셀룰로스와 함께 요망되는 농도로 제조되었다.
1.2 주요 장비 및 시약
YLS-7A 래트 발가락 종창 측정 기계: Equipment Station, Shandong Academy of Medical Services;
722 가시광선 분광광도계: Shanghai Spectrum Instruments Co., Ltd.에 의해 제조됨;
휴대용 디지털 온도계: 모델 WSC-411P, the Third Factory of Pudong, Shanghai;
필로카르핀: Tianjin People's Pharmaceutical Factory, 로트 번호: 20130112;
히스타민: Shanghai Institute of Biochemistry, 로트 번호: 20130115;
5-하이드록시트립타민: Shanghai Institute of Biochemistry, 로트 번호: 20130623;
에반스 블루(Evans blue): Shanghai Chemical Reagent Procurement and Supply Station, 로트 번호: 20130217;
클로르페니라민 말레에이트 정제: Changchun Economic Development Zone Pharmaceutical Co., Ltd., 로트 번호: 20130801;
카라기난: Jilin Drug Research Institute, 로트 번호: 20130502;
파라세타몰 정제: Liaoyuan Baikang Pharmaceutical Co., Ltd., 로트 번호: 20130512;
아스피린 정제: Baicheng Wanda Pharmaceutical Co., Ltd., 로트 번호: 20130305;
맥주 효모: Beijing AOBOX Biotechnology Co., Ltd., 로트 번호: 2013020;
장티푸스 및 파라티푸스 백신: Changchun Institute of Biological Products, 로트 번호: 20130216.
1.3 통계 방법
통계 분석은 2-샘플 비교와 함께 순위합 검정, X2 검정 및 t 검정에 적용시켰다.
2.1. 래트 발 부분의 땀 분비에 대한 필리게닌 이부프로펜 에스테르 효과의 시험(착색 방법)
(1) 재료 및 방법
본 시험을 땀샘이 래트 발바닥에 분포하고, 요오드 및 전분이 땀과 조우하는 경우 자색 반응을 갖는다는 메커니즘을 기초로 하여 땀 분비의 변화를 관찰하도록 설계하였다.
시험에서, 동일한 수컷 및 암컷 수와 함께 120-150 g 체중의 350마리의 위스타 래트를 선택하였다. 상기 래트를 체중 및 성별에 의해 35개의 그룹, 즉, 대조군 그룹(0.5% 카르복시메틸셀룰로스)에 대해 5개의 그룹, 2.5, 5, 및 10mg/kg의 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 각각의 용량에 대해 5개의 그룹, 이부프로펜(300mg/kg)에 대해 5개의 그룹, 필리게닌(10mg/kg)에 대해 5개의 그룹 및 양성 약물 필로카르핀(35mg/kg)에 대해 5개의 그룹으로 무작위로 나누었고, 각각의 그룹은 10마리의 래트를 가졌다. 래트를 자작의 래트 고정 백에 두고, 2개의 뒷다리를 노출시켰다. 우측 발 위의 오물을 무수 에탄올로 적신 솜 면봉으로 가볍게 닦아 깨끗하게 만들었다. 또한, 필로카르핀 용액에 대해 피하 주입을 이용하였고, 모든 다른 그룹에 대해 위내 투여를 이용하였다. 투여 1시간 후(필로카르핀 그룹의 투여 30분 후), 각각의 그룹의 래트의 우측발의 본래의 땀 및 발버둥침에 의해 야기된 땀을 먼저 건조된 솜 면봉으로 닦아 건조시키고, Hetian-Gao Yuan의 시약 A 액체(2 g의 요오드가 100 ml의 무수 에탄올에 용해됨)로 코팅한 후, 완전한 건조 후, Hetian-Gao Yuan의 시약 B 액체(50 g의 가용성 전분 및 100 ml의 피마자유가 취해지고, 균일하게 혼합됨)의 얇은 코팅을 코팅하였다. 각각 1, 5, 10, 15 및 20분 동안 B 액체를 코팅한 후, 어두운 자색 포인트(즉, 땀 포인트)의 색 및 수를 주의깊게 관찰하기 위해 확대경을 이용하였다. 시험이 완료된 후, 그룹 사이의 차이를 비교하기 위해 2-샘플 비교와 함께 순위합 검정에 따라 통계 방법을 수행하였다.
(2) 결과
대조군 그룹과 비교하여, 5, 10, 15 및 20분 동안 B 액체를 코팅한 후에 래트 발 부분의 땀 분비에 대한 10 mg/kg의 필리게닌 이부프로펜 에스테르 그룹에 대해 명백한 촉진 효과가 관찰되었고(*P<0.05), 양성 약물 필로카르핀과 동등한 래트 발 부분의 땀 분비를 촉진하는 특징의 효과를 가졌고; 여기서 고용량, 중간 용량 및 저용량의 필리게닌 이부프로펜 에스테르는 투여 5 내지 20분, 10 내지 20분, 및 20분 후에 각각 래트 발 땀 분비 촉진에 대한 유의한 효과를 나타내었고; 고용량 및 중간 용량의 필리게닌 이부프로펜 에스테르는 필리게닌보다 투여 5 내지 20분 및 10 내지 15분 후에 땀 분비 촉진에 대해 더 나은 치료 효과를 갖는 한편(#P<0.05), 고용량은 이부프로펜보다 투여 20분 후에 땀 분비 촉진에 대해 더 나은 치료 효과를 가졌다. 표 2-1, 2-2, 2-3, 2-4 및 2-5를 참조한다.
표 2-1: 래트 발 부분의 땀 분비에 대한 필리게닌 이부프로펜 에스테르 효과의 시험(착색 방법)
Figure 112017021686319-pct00028
표 2-2: 래트 발 부분의 땀 분비에 대한 필리게닌 이부프로펜 에스테르 효과의 시험(착색 방법)
Figure 112017021686319-pct00029
표 2-3: 정상 래트 발 부분의 땀 분비에 대한 필리게닌 이부프로펜 에스테르 효과의 시험(착색 방법)
Figure 112017021686319-pct00030
표 2-4: 정상 래트 발 부분의 땀 분비에 대한 필리게닌 이부프로펜 에스테르 효과의 시험(착색 방법)
Figure 112017021686319-pct00031
표 2-5: 래트 발 부분의 땀 분비에 대한 필리게닌 이부프로펜 에스테르 효과의 시험(착색 방법)
Figure 112017021686319-pct00032
2.2 래트 발 부분의 땀 분비에 대한 필리게닌 이부프로펜 에스테르 효과의 시험(조직 형태학 관찰 방법)
(1) 재료 및 방법
본 시험은 래트 땀샘이 흥분한 경우 땀 분비 증가에 더하여 땀샘 상피 세포의 형태가 또한 변한다는 메커니즘을 기초로 하였다. 땀샘 상피 세포의 빈 세포의 수 증가 및 확장이 광학현미경 하에서 관찰될 수 있다. 상기 확대된 공포는 전자현미경 하에서 땀샘 상피 세포 팽창, 파열, 융합 및 분비 소포 확대에서 미토콘드리아를 나타내며, 래트 발 부분에서의 땀샘 상피 세포의 형태학적 관찰을 통해, 땀샘의 분비 활성이 공지될 수 있다.
시험에서, 동일한 수컷 및 암컷 수와 함께 120-160 g 체중의 70마리의 위스타 래트를 선택하였다. 상기 래트를 체중 및 성별에 의해 7개의 그룹, 즉, 블랭크 대조군(0.5% 카르복시메틸셀룰로스) 그룹, 2.5, 5, 및 10 mg/kg 필리게닌 이부프로펜 에스테르 그룹, 이부프로펜 그룹(300 mg/kg), 필리게닌 그룹(10 mg/kg) 및 양성 약물 필로카르핀(35 mg/kg) 그룹으로 무작위로 나누었고, 각각의 그룹은 10마리의 래트를 가졌다. 또한, 필로카르핀 용액에 대해 피하 주입을 이용하였고, 모든 다른 그룹에 대해 위내 투여를 이용하였다. 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 투여 1시간 후(필로카르핀의 투여 30분 후), 우측 뒷발을 발목 관절에서 즉시 절단하여 우측 뒷발의 발바닥을 즉시 해체하고, 10% 포름알데하이드 용액에 두었고, 고정, 탈수, 포매, 절편화 및 HE 염색에 대해 통상적인 방법을 이용하였다. 각각의 그룹의 래트 발가락 부분에서의 땀샘 상피 세포에서의 변화를 광학현미경 하에서 관찰하여 공포 발생률(즉, 공극률, 공포 발생의 백분율 = 공포의 땀샘의 수/관찰된 땀샘의 수 x 100%)를 주로 관찰하고, 통계 분석을 위해 X2 검정을 통해 그룹 사이의 차이를 비교하였다.
(2) 결과
대조군 그룹과 비교하여, 5 및 10 mg/kg의 필리게닌 이부프로펜 에스테르 그룹에 의해 래트 발가락 부분의 땀 분비에서 명백한 촉진 효과가 관찰되었으며(p<0.01 또는 p<0.001), 표 2-6을 참조한다.
표 2-6: 래트 발가락 부분의 땀 분비에 대한 필리게닌 이부프로펜 에스테르 효과의 시험(조직 형태학 관찰 방법)
Figure 112017021686319-pct00033
2.3 맥주 효모 유도 래트 열에 대한 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 효과
(1) 재료 및 방법
180-200 g 체중의 수컷 위스타 래트를 선택하였다. 시험 전, 정상 직장 온도를 2회 측정(각 횟수에 대해 일정한 간격을 가짐)하기 위해 WSC-411P 휴대용 디지털 온도계를 이용하였고, 2회 측정의 평균 값을 래트의 정상 체온으로 취하였다. 이후, 36.5℃ 내지 38℃ 사이의 체온을 갖는 70마리의 래트를 선택하여 체중에 의해 7개의 그룹, 즉, 모델(0.5% 카르복시메틸셀룰로스) 그룹, 2.5, 5, 및 10 mg/kg 필리게닌 이부프로펜 에스테르 그룹, 양성 약물 파라세타몰(100 mg/kg) 그룹, 이부프로펜 그룹(즉, 프로드러그 대조군 그룹, 300 mg/kg), 필리게닌 그룹(100 mg/kg)으로 무작위로 나누었고, 각각의 그룹은 10마리의 래트를 가졌다. 래트의 각각의 그룹을 10 ml/kg의 10%의 신선한 맥주 효모 현탁액을 이용한 역 피하 주입에 적용시켜 열을 유도하였다. 6.0시간 동안 10%의 신선한 맥주 효모 현탁액의 투여 후, 필리게닌 이부프로펜 에스테르 및 파라세타몰 둘 모두를 위내 투여에 적용시키고, 모델 그룹에 동일 부피의 0.5% 카르복시메틸셀룰로스를 위내 투여하였다. 직장 온도를 투여 1시간, 2시간, 3시간 및 4시간 후에 각각 측정하였다. 체온에서의 변화를 관찰하였고, 그룹 사이의 차이를 해열 백분율을 통한 그룹간 t 검정 처리에 의해 비교하였다.
Figure 112017021686319-pct00034
(2) 결과
6시간 동안 각각의 그룹의 래트에서의 10%의 신선한 맥주 효모 현탁액의 피하 주입 후, 체온은 약 1.5℃만큼 증가하였고, 이는 열 유도 전의 것과 유의하게 상이하였고(p<0.001), 이는 래트 열을 야기시키는 맥주 효모의 모델이 성공적으로 확립된 것을 나타낸다. 모델 그룹과 비교하여, 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 중간 용량 및 고용량 그룹(5, 10 mg/kg)은 투여 1시간, 2시간, 3시간 및 4시간 후에 맥주 효모 현탁액에 의해 유도된 래트 열에 대해 유의한 냉각 효과를 가졌고(p<0.05, 또는 p<0.01, P<0.001); 필리게닌 및 이부프로펜 그룹과 비교하여, 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 고용량 그룹(10 mg/kg)은 투여 1시간, 2시간, 3시간 및 4시간 후에 맥주 효모 현탁액에 의해 유도된 래트 열에 대해 유의한 냉각 효과를 가졌고, 상기 유의한 냉각 효과는 필리게닌(p<0.01 또는 P<0.001) 및 이부프로펜(p<0.05 또는 p<0.01)보다 명백히 더 나았으며; 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 중간 용량 그룹(5 mg/kg)은 투여 1시간, 2시간, 3시간 및 4시간 후에 맥주 효모 현탁액에 의해 유도된 래트 열에 대해 유의한 냉각 효과를 가졌고, 상기 냉각 효과는 필리게닌보다 명백히 더 나았고(p<0.05 또는 p<0.01); 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 중간 용량 그룹(5 mg/kg)은 투여 2시간, 3시간 및 4시간 후에 맥주 효모 현탁액에 의해 유도된 래트 열에 대해 유의한 냉각 효과를 가졌고, 상기 냉각 효과는 이부프로펜 그룹(p<0.05)보다 명백히 더 나았다. 상기 시험 결과는 필리게닌 이부프로펜 에스테르 화합물의 냉각 및 해열 치료 효과가 이의 포르시티아신(forsythiasin) 및 이부프로펜의 전구체 화합물보다 유의하게 더 나은 것을 나타내었고; 상기 시험 결과는 표 2-7에서 관찰될 수 있다.
2.4 장티푸스 및 파라티푸스 백신에 의해 유도된 토끼 열에 대한 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 효과
(1) 재료 및 방법
1.5-2.0 kg 체중의 재패니즈 수컷 큰귀 백색 토끼. 시험 전, 정상 직장 온도를 2회 측정(각 횟수에 대해 일정한 간격을 가짐)하기 위해 WSC-411P 휴대용 디지털 온도계를 이용하였고, 평균 값을 정상 체온으로 채택하였다. 이후, 38-39.6℃의 체온을 갖는 48마리의 재패니즈 큰귀 백색 토끼를 선택하고, 체중에 의해 8개의 그룹, 즉, 블랭크 대조군(생리식염수) 그룹, 모델 대조군(0.5% 카르복시메틸셀룰로스) 그룹, 이부프로펜 그룹(300 mg/kg), 필리게닌 그룹(10 mg/kg), 1.25, 2.5, 및 5 mg/kg 필리게닌 이부프로펜 에스테르 그룹 및 양성 약물 파라세타몰(50 mg/kg) 그룹으로 무작위로 나누었다. 토끼를 고정기에 고정시켰다. 블랭크 대조군 그룹에 귀 가장자리를 통해 1 ml/kg의 생리식염수를 정맥내 주입하였고; 모델 대조군 그룹 및 약물 그룹에 귀 가장자리를 통해 0.8 ml/kg의 장티푸스 및 파라티푸스 백신을 정맥내 주입하였다. 토끼의 체온 상승이 1℃를 초과한 경우(약 1-1.5시간을 필요로 함, 본 시험에서는 1시간으로 제한함), 블랭크 대조군 그룹 및 모델 그룹에 1 ml/kg의 0.5% 카르복시메틸셀룰로스를 위내 투여하고, 약물 그룹에 필리게닌 이부프로펜 에스테르 및 파라세타몰을 위내 투여하였다. 30, 60, 90, 120, 180 및 240분 동안 투여 후에 직장 온도를 측정하여 체온에서의 변화를 관찰하였고, 그룹 사이의 차이를 해열 백분율을 통한 그룹간 t 검정 처리에 의해 비교하였다.
Figure 112017021686319-pct00035
(2) 결과
1시간 동안 토끼의 귀 가장자리를 통한 장티푸스 및 파라티푸스 백신을 이용한 정맥내 주입 후, 체온 상승은 약 1℃였고, 이는 장티푸스 및 파라티푸스 백신이 토끼 열 모델을 제조하기 위해 이용될 수 있음을 나타내었다. 블랭크 대조군 그룹과 비교하여, 모델 그룹의 체온은 300분의 관찰 기관 동안 지속적으로 증가하였고(p<0.05-p<0.001); 모델 그룹과 비교하여, 30-240분 동안 투여 후의 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 고용량 및 중간 용량 그룹(5, 10 mg/kg) 및 60-240분 동안 투여 후의 저용량 그룹(5 mg/kg)은 장티푸스 및 파라티푸스 백신에 의해 유도된 토끼 열에 대해 유의한 해열 효과를 갖고(p<0.05-p<0.001); 30-240분 동안 투여 후의 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 고용량 및 중간 용량 그룹(5, 10 mg/kg) 및 60-240분 동안 투여 후의 저용량 그룹(5 mg/kg)은 장티푸스 및 파라티푸스 백신에 의해 유도된 토끼 열에 대해 유의한 해열 효과를 가졌고, 이는 필리게닌의 전구체 화합물의 그룹보다 명백히 더 나았고(p<0.05-p<0.001); 60-240분 동안 투여 후의 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 고용량 및 중간 용량 그룹(10 mg/kg)은 장티푸스 및 파라티푸스 백신에 의해 유도된 토끼 열에 대해 유의한 해열 효과를 가졌고, 이는 이부프로펜 그룹보다 명백히 더 나았으며(p<0.05 또는 p<0.01); 상기 시험 결과는 표 2-8에서 관찰될 수 있다.
2.5 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 진통 시험
(1) 재료 및 방법
72마리의 쿤밍 마우스를 6개의 그룹으로 무작위로 나누었고, 각각의 그룹은 12마리의 마우스를 가졌다. ① 블랭크 정상 대조군 그룹(즉, 염수 그룹, 10 mg/kg); ② 양성 약물 아스피린 그룹(200 mg/kg); ③ 이부프로펜 그룹(300 mg/kg); ④ 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 고용량 그룹(300 mg/kg); ⑤ 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 중간 용량 그룹(150 mg/kg); ⑥ 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 저용량 그룹(75 mg/kg). 각각의 그룹의 약물을 1시간 동안 위내 투여한 후, 마우스에 0.7% 아세트산 용액(10 ml/kg)을 복막내 투여하였다. 투여 후 15분 이내에 몸부림치는 마우스의 수를 기록하였다. 몸부림의 수를 진통 효과를 평가하기 위한 평가 지표로 취하였다.
(2) 결과
아세트산에 의해 유도된 마우스 동통에 대한 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 진통 효과는 표 5에서 관찰될 수 있다. 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 저용량, 중간 용량 및 고용량 그룹과 블랭크 대조군 그룹(생리식염수) 비교시, 유의한 차이가 관찰되었고(P<0.01), 이는 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 모든 다양한 용량 그룹이 진통 효과를 갖는 것을 나타낸다. 여기서, 고용량 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 진통 치료 효과는 현저하였고, 양성 약물 아스피린 및 프로드러그 이부프로펜보다 나았다; 세부사항에 대해서는 표 2-9를 참조한다.
표 2-9: 미스카운트(miscount)에 의해 유도된 마우스 동통에 대한 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 효과
Figure 112017021686319-pct00036
2.6 카라기난에 의해 유도된 래트 발가락 종창에 대한 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 효과
(1) 재료 및 방법
120-150 g의 체중을 갖는 70마리의 수컷 위스타 래트를 선택하여, 체중에 의해 7개의 그룹, 즉, 블랭크 대조군(0.5% 카르복시메틸셀룰로스) 그룹, 2.5, 5, 및 10 mg/kg 필리게닌 이부프로펜 에스테르 그룹, 프로드러그 이부프로펜(300 mg/kg) 그룹, 필리게닌 그룹(10 mg/kg) 및 양성 약물 아스피린(200 mg/kg) 그룹으로 무작위로 나누었고, 각각의 그룹은 10마리의 래트를 가졌다. 시험 그룹을 설하 정맥내 주입에 의해 투여하였다. 시험 전, 각각의 그룹의 래트의 우측 뒷발의 정상 부피를 측정하기 위해 모세관 확대 측정 방법을 이용하였다. 오차를 피하기 위해, 측정 위치를 고정시키고, 투여 전 및 투여 후 둘 모두 한 사람이 작업을 수행하였다. 2개의 측정의 평균 값을 투여 전 래트의 우측 뒷발의 정상 부피로 취하였다. 투여 후, 0.1 ml의 1% 카라기난을 래트의 우측 뒷발의 발에 즉시 피하 주입하여 염증을 유도하였다. 염증 유도 15, 30, 60, 120, 180, 240, 300 및 360분 후의 우측 발의 부피를 측정하였다. 그룹 사이의 차이를 래트 염증 유도 전 및 후에 발 부피의 차이 백분율(종창 비)을 통해 그룹간 t 검정 처리에 의해 비교하였다.
Figure 112017021686319-pct00037
결과
블랭크 대조군 그룹과 비교하여, 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 고용량 그룹은 투여 후 30분 내지 360분 이내에 카라기닌에 의해 유도된 래트 발 종창에 대해 유의한 억제 효과(p<0.05-p<0.001)를 가졌고, 이는 프로드러그 필리게닌보다 명백히 더 나았고(p<0.05-p<0.001), 투여 30분 후에서의 치료 효과는 프로드러그 이부프로펜보다 명백히 더 나았고(p<0.05); 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 중간 용량 그룹은 투여 후 30분 내지 240분 이내에 카라기닌에 의해 유도된 래트 발 종창에 대해 유의한 억제 효과를 가졌고(p<0.05-p<0.01), 투여 30분-120분 후에서의 이의 치료 효과는 프로드러그 필리게닌보다 명백히 더 나았고, 투여 240분 후에서의 치료 효과는 프로드러그 이부프로펜보다 명백히 더 나았다. 본 시험 결과는 필리게닌 이부프로펜 에스테르가 비교적 명백한 항-염증 효과를 갖고, 이의 치료 효과가 필리게닌 및 이부프로펜의 프로드러그보다 나은 것을 입증하였다. 표 2-10을 참조한다.
표 2-7: 맥주 효모에 의해 야기된 래트 열에 대한 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 영향(
Figure 112017021686319-pct00038
±s,n=10)
Figure 112017021686319-pct00039
표 2-8: 장티푸스 및 파라티푸스 백신에 의해 야기된 토끼 열 체온에 대한 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 효과(
Figure 112017021686319-pct00040
±s,n=6)
Figure 112017021686319-pct00041
표 2-10: 카라기난에 의해 유도된 래트 발 종창에 대한 필리게닌 이부프로펜 에스테르의 억제 효과(
Figure 112017021686319-pct00042
±s, n=10)
Figure 112017021686319-pct00043

Claims (12)

  1. 하기 화학식 (I)에 의해 표현되는 일반 구조식을 갖는 필리게닌 이부프로펜 에스테르(phillygenin ibuprofen ester) 화합물:
    Figure 112018053664007-pct00044
    .
  2. A) 이부프로펜을 염소화제를 이용한 염소화 반응에 적용시켜 이부프로펜 클로라이드를 획득하는 단계; 및
    B) 촉매의 작용과 함께 필리게닌과 이부프로펜 클로라이드 사이에서 에스테르화 반응을 수행하여 최종 생성물을 획득하는 단계를 순차적으로 수행하는 것을 포함하는,
    제 1항에 따른 필리게닌 이부프로펜 에스테르 화합물의 제조 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 단계 A)에서의 염소화제가 티오닐 클로라이드, 포스포러스 트리클로라이드, 포스포러스 펜타클로라이드, 포스포러스 옥시클로라이드 또는 포스포러스 옥시펜타클로라이드로부터 선택됨을 특징으로 하는 제조 방법.
  4. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 단계 B)에서의 촉매가 유기 염기 또는 무기 염기로부터 선택됨을 특징으로 하는 제조 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 무기 염기가 소듐 카르보네이트, 포타슘 카르보네이트, 소듐 바이카르보네이트 또는 포타슘 바이카르보네이트로부터 선택되고; 유기 염기가 피리딘, 트리에틸아민, N,N-디메틸포름아미드 또는 금속 알콕시드로부터 선택됨을 특징으로 하는 제조 방법.
  6. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 단계 B)에서의 필리게닌 대 단계 A)에서의 이부프로펜의 몰비가 0.8-1.2:1임을 특징으로 하는 제조 방법.
  7. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 필리게닌 및 이부프로펜 클로라이드가 유기 용매에 첨가된 후에 단계 B)에서의 에스테르화 반응이 교반과 함께 수행됨을 특징으로 하는 제조 방법.
  8. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 에스테르화 반응 후의 생성물이 분리 및 정제 처리에 적용되고, 에스테르화 반응 후에 반응 용매가 생성물로부터 제거된 후, 고체가 재결정화 처리에 적용되는 단계 C를 추가로 포함함을 특징으로 하는 제조 방법.
  9. 제 1항에 따른 필리게닌 이부프로펜 에스테르를 유효성분으로 포함하는 항바이러스 조성물.
  10. 바이러스 감염을 치료하기 위한 제 1항에 따른 필리게닌 이부프로펜 에스테르를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물.
  11. 제 10항에 있어서, 바이러스 감염이 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 호흡기세포 융합 바이러스(RSV), 단순 대상포진 바이러스 타입-I(HSV-I) 및 콕사키바이러스 A16에 의해 야기되는 바이러스 감염인, 약학적 조성물.
  12. 제 1항에 따른 필리게닌 이부프로펜 에스테르를 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 항바이러스 약물.
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