RU2642784C2

RU2642784C2 - Форзициазида сульфат и его производные, способ его получения и его применение

Info

Publication number: RU2642784C2
Application number: RU2016124221A
Authority: RU
Inventors: Ли ФУ; Хунюй ФАНЬ; Шо ВАН
Original assignee: Ли ФУ
Priority date: 2013-11-18
Filing date: 2014-11-06
Publication date: 2018-01-26
Also published as: KR20160085886A; KR101850902B1; WO2015070724A1; EP3072895B1; JP6466444B2; CN104650108A; JP2016537359A; AU2014350785A1; AU2014350785B2; RU2016124221A; CA2930338C; US20160355524A1; EP3072895A4; CN104650108B; US9670224B2; EP3072895A1; CA2930338A1; ES2749611T3

Abstract

Изобретение относится к форзициазида сульфату и его производным, представленным следующей формулой, где R представляет собой Na⁺, K⁺ или NH⁺, и способу их получения, а также к противовирусному лекарственному средству на их основе и его применению. 4 н. и 6 з.п. ф-лы, 9 табл., 2 ил.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области медицинской химии, и в частности, к производным форзициазида сульфата, и к способам их получения, а также к фармакологическим эффектам таких производных с точки зрения резистентности вирусов.

Предшествующий уровень техники

Форзициазид, агликоновая часть форзицина, также известный как филлигенин, является главным активным компонентом Forsythia suspense (Форзиции свисающей) из рода Forsythia (Форзиция) семейства Oleaceae (Маслиновые), и имеет структуру, как представлено ниже. Современные фармакологические исследования показали, что форзициазид обладает антивирусным, антиоксидантным эффектом, снижает липиды крови, является акцептором свободных радикалов, обладает антибактериальным, противоопухолевым, противовоспалительным эффектом, и тому подобное.

Форзициазид имеет нестабильные молекулы, которые подвержены окислению и легко изменяют конфигурацию в кислой среде. Исследования, имитирующие метаболизм форзицина кишечными бактериями крысы, показали, что форзицин легко метаболизируется кишечной флорой с образованием нового метаболита.

Исследования метаболизма лекарств с фенольной структурой установили, что лекарства со структурой фенольного гидроксилата легко метаболизируются сульфатазами in vivo с образованием фенол-сульфатных производных, и обладают хорошей активностью. Например, производные даидзеин сульфата, производные эдаравон сульфата, производные генистеин сульфата, производные ресвератол сульфата, и тому подобные. Таким образом, мы получили сульфатные производные филлигенина, и провели химический синтез и фармакологические исследования.

Раскрытие изобретения

Техническая проблема, решаемая настоящим изобретением, заключается в получении производных форзициазида сульфата посредством способа химического синтеза. Настоящее изобретение обеспечивает производные форзициазида сульфата. Кроме того, настоящее изобретение также обеспечивает способ получения производных форзициазида сульфата, и пригодно для производства в промышленном масштабе.

Во-первых, настоящее изобретение обеспечивает форзициазида сульфат и его производные, представленные следующей формулой:

где R является Н, Na⁺, K⁺, NH₄ ⁺, тетраметиламмонием, тетраэтиламмонием, метиламино, диметиламино, триметиламино, триэтиламино, диэтиламино, этиламино, этаноламино, диэтаноламино, пиперидилом, пиперазинилом или пиразинилом.

Во-вторых, настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, включающую производные форзициазида сульфата по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества.

При этом фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества означают нетоксичные твердые, полутвердые или жидкие наполнители, разбавители, носители, регуляторы рН, регуляторы ионной силы, агент медленного высвобождения или контролируемого высвобождения, материал оболочки или другие фармакологические вспомогательные вещества. Используемый носитель может быть приспособлен к соответствующему способу применения лекарства; можно применять вспомогательные вещества, хорошо известные специалистам в данной области техники для получения инъекций, лиофилизированного порошка (для инъекций), спреев, пероральных растворов, пероральных суспензий, таблеток, капсул, кишечнорастворимых таблеток, пилюль, порошков, гранул, составов пролонгированного высвобождения или отсроченного высвобождения, и тому подобного. Производные форзициазида сульфата по первому аспекту настоящего изобретения являются предпочтительными, и вводятся путем инъекции или через пищеварительный тракт; таким образом, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению предпочтительно является составами для инъекций или составами, вводимыми через пищеварительный тракт; т.е. вспомогательные материалы, пригодные для получения инъекций или составов, вводимых через пищеварительный тракт, являются особо предпочтительными, где «введение через пищеварительный тракт» означает подход к введению лекарственных препаратов через пищеварительный тракт пациента, включая пероральное введение, внутрижелудочное введение, введение посредством клизмы, и тому подобное, предпочтительно пероральное введение; например, вспомогательные вещества, хорошо известные специалистам в данной области техники, можно применять для получения пероральных растворов, пероральных суспензий, таблеток, капсул, кишечнорастворимых таблеток, пилюль, порошков, гранул, составов пролонгированного высвобождения или отсроченного высвобождения и тому подобного; где составы для инъекций являются главным образом инъекционными формами и порошками для инъекций.

В-третьих, настоящее изобретение обеспечивает способ получения форзициазида сульфата и его производных, включающий следующие последовательно выполняемые этапы:

(1) растворение форзициазида в органическом растворителе для получения раствора форзициазида;

(2) вначале добавление сульфатирующего агента в раствор форзициазида и тщательное перемешивание; затем проведение реакции этерификации для получения жидкой смеси продукта;

(3) добавление основания для установки значения рН жидкой смеси до 8-10;

(4) разделение и очистка жидкой смеси для получения готового продукта;

где органический растворитель на этапе (1) выбран из пиридина, N,N-диметилформамида, N,N-диметилацетамида или дихлорметана;

где сульфатирующий агент добавляют в раствор форзициазида при 0-5°С.

В частности, сульфатирующий агент добавляют в раствор форзициазида при 0°С, и перемешивают до однородного состояния.

В частности, сульфатирующий агент выбирают из хлорсульфоновой кислоты, комплекса серы триоксида-триэтиламина, комплекса серы триоксида-пиридина, или комплекса серы триоксида-триметиламина, и предпочтительно, хлорсульфоновой кислоты.

В частности, молярное отношение форзициазида в растворе форзициазида к сульфатирующему агенту составляет 1:1-10, и предпочтительно 1:2.

При этом температура реакции этерификации на этапе (2) составляет 0-110°С.

В частности, температура реакции этерификации, выполняемой с форзициазидом и хлорсульфоновой кислотой, составляет 0-10°С, и предпочтительно 10°С; температура реакции этерификации, проводимой с форзициазидом и комплексом серы триоксид-триэтиламин, комплексом серы триоксид-пиридин или комплексом серы триоксид-триметиламин, составляет 100-110°С.

В частности, после выполнения реакции этерификации с форзициазидом и комплексом серы триоксид-триэтиламин, комплексом серы триоксид-пиридин или комплексом серы триоксид-триметиламин, способ дополнительно включает охлаждение смеси реакции этерификации, и добавление основания для доведения рН смеси до 8-10.

В частности, смесь реакции этерификации охлаждают до комнатной температуры (10-30°С), при этом значение рН на этапе (3) предпочтительно составляет 10; основание выбрано из органического основания или неорганического основания.

В частности, неорганическое основание выбрано из раствора натрия карбоната, калия карбоната, натрия бикарбоната, калия бикарбоната, натрия гидроксида, калия гидроксида, или водного раствора аммиака, и предпочтительно раствора натрия гидроксида, калия гидроксида или водного раствора аммиака; органическое основание выбрано из тетраметиламмония, тетраэтиламмония, метиламина, диметиламина, триметиламина, триэтиламина, диэтиламина, этиламина, этаноламина, диэтаноламина, пиперидина, пиперазина или пиразина.

При этом жидкую смесь продукта разделяют с применением колоночной хроматографии на силикагеле на этапе (4).

В частности, в качестве силикагеля выбирают силикагель GF254.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает применение форзициазида сульфата и его производных для изготовления противовирусных лекарственных средств.

При этом противовирусные лекарственные средства выбраны из лекарств против вируса гриппа, лекарств против вируса парагриппа, лекарств против респираторно-синцитиального вируса, лекарств против вируса простого герпеса I типа, и лекарств против вируса Коксаки А16.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает противовирусное лекарственное средство, содержащее форзициазида сульфат или производные форзициазида сульфата.

Преимущества настоящего изобретения являются следующими: способ получения производных форзициазида сульфата по настоящему изобретению является легко контролируемым, выход продукта является высоким, и способ пригоден для производства в промышленном масштабе; производные форзициазида сульфата по настоящему изобретению обладают значительным противовирусным эффектом, и ингибирующая эффективность по отношению к вирусам достигает более 80%; результаты антивирусных тестов in vivo показывают, что производные форзициазида сульфата обладают относительно высокими ингибирующими эффектами в отношении вируса гриппа и вируса парагриппа, кроме того, при вызванной этими вирусами мышиной пневмонии позволяют значительно уменьшить легочный индекс и титр гемагглютинации, а также обеспечить существенное улучшение легочной гистопатологии.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 является изображением, полученным при микроскопии среза легочной ткани, полученной на мышиной модели пневмонии, вызванной вирусом гриппа; и

фиг. 2 является изображением, полученным при микроскопии среза легочной ткани, полученной на мышиной модели пневмонии, вызванной вирусом парагриппа.

Осуществление изобретения

Настоящее изобретение далее описано посредством следующих вариантов осуществления. Однако эти варианты осуществления приведены только с целью иллюстрации, и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения. Кроме того, все реагенты и сырьевые материалы в вариантах осуществления могут быть коммерческими; если это не упомянуто, может быть приведена ссылка на руководство по органическому синтезу, указания по применению лекарственных средств и соответствующие инструкции производителей на оборудование и реагенты, и тому подобное.

Вариант осуществления 1

1. Форзициазид (4 г, 10,75 ммоль) добавляли в 180 мл безводного пиридина, и перемешивали до растворения, для получения раствора форзициазида.

2. На ледяной бане дихлорметановый раствор хлорсульфоновой кислоты (1,4 мл, примерно 21,5 ммоль) добавляли по каплям в раствор форзициазида, при перемешивании, и скорость капельного добавления составила 1 каплю (примерно 50 мкл на каплю) в 2 секунды, т.е. молярное отношение форзициазида к хлорсульфоновой кислоте в настоящем варианте осуществления составило 1:2.

3. После завершения капельного добавления в условиях перемешивания температуру поднимали и поддерживали при 10°С, и проводили реакцию этерификации;

4. В условиях сохранения температуры 10°С реакцию этерификации завершали, при проведении реакции в течение 1 часа, добавляли метаноловый раствор (5 мл) натрия гидроксида для доведения значения рН до 10, реакционную смесь затем выпаривали при сниженном давлении для удаления растворителя, затем образец загружали на хроматографическую колонку, загруженную силикагелем GF254, проводили элюцию жидкой смесью хлороформа и метанола, где объемное отношение хлороформа и метанола составило 9:1. Форзициазида натрия сульфат (соединение 1) получали посредством колоночной хроматографии на силикагеле.

Форзициазида натрия сульфат (3 г) является белым твердым веществом, растворимым в воде и этаноле. После нанесения на пластину для ТСХ (с раствором для хроматографии хлороформ/метанол 10:1, и Rf 0,4) он показал пурпурно-красную окраску при распылении 10% реагента H₂SO₄-этанола. На спектре тандемной масс-спектрометрии с электрораспылительной ионизацией m/z[M-Na]^- равно 451, молекулярная масса 474.

¹Н-ЯМР (600 МГц, d₆-ДМСО) соединения 1 является следующим: δ (имп./мин): 7.4 (1H, d, J=8.4 Гц, Н-), 6.9 (5Н, m, Ar-Н), 4.8 (1Н, d, J=4.8 Гц, Н-6), 4.38 (Н, d, J=6.6 Гц, Н-8), 4.10 (1H, d, J=9.0 Гц, Н-2), 3.75 (12Н, d, J=8.4 Гц, Н-8,4, О-СН3), 3.11 (1H, t, J=8.1 Гц, Н-5), 2.85 (1Н, d, J=7.2 Гц, Н-1);

¹³С-ЯМР (150 МГц, d₆-ДМСО) соединения 1 является следующим: δ (имп./мин): 150.99 (С-3''), 148.97 (С-3'), 148.10 (С-4''), 142.51 (С-4'), 137.20 (С-1''), 131.73 (С-1'), 121.33 (С-5'), 118.09 (С-6'), 118.06 (С-6''), 112.09 (С-5''), 110.94 (С-2'), 110.00 (С-2''), 87.22 (С-2), 81.76 (С-6), 70.87 (С-8), 69.44 (С-4), 56.23 (С-ОСН3), 55.99 (С-ОСН3), 54.54 (С-ОСН3), 53.37 (С-1), 49.78 (С-5) имп./мин.

В соответствии с данными тандемной масс-спектрометрии с электрораспылительной ионизацией, ¹Н-ЯМР и ¹³С-ЯМР, определено, что молекулярной формулой соединения 1 является: C₂₁H₂₃O₉SNa, а структурной формулой является:

Вариант осуществления 2

3. После завершения капельного добавления в условиях перемешивания температуру поднимали и поддерживали при 10°С, и проводили реакцию этерификации.

4. В условиях сохранения температуры 10°С реакцию этерификации завершали, при проведении реакции в течение 1 часа, добавляли метаноловый раствор (5 мл) калия гидроксида для доведения значения рН до 10, реакционную смесь затем выпаривали при сниженном давлении для удаления растворителя, затем образец загружали на хроматографическую колонку, загруженную силикагелем GF254, проводили элюцию жидкой смесью хлороформа и метанола, где объемное отношение хлороформа и метанола составило 9:1. Форзициазида калия сульфат (соединение 2) получали посредством колоночной хроматографии на силикагеле.

Форзициазида калия сульфат (3 г) является белым твердым веществом, растворимым в воде и этаноле. После нанесения на пластину для ТСХ (с раствором для хроматографии хлороформ/метанол 10:1, и Rf 0,4) он показал пурпурно-красную окраску при распылении 10% реагента H₂SO₄-этанола. На спектре тандемной масс-спектрометрии с электрораспылительной ионизацией m/z[M-K]^- равно 451, молекулярная масса 490.

¹Н-ЯМР (600 МГц, d₆-ДМСО) соединения 2 является следующим: δ (имп./мин): 7.4 (1Н, d, J=8.4 Гц, Н-), 6.9 (5Н, m, Ar-Н), 4.8 (1Н, d, J=4.8 Гц, Н-6), 4.38 (Н, d, J=6.6 Гц, Н-8), 4.10 (1Н, d, J=9.0 Гц, Н-2), 3.75 (12Н, d, J=8.4 Гц, Н-8,4, O-СН₃), 3.10 (1H, t, J=8.1 Гц, Н-5), 2.84 (1Н, d, J=7.2 Гц, H-1);

¹³С-ЯМР (125 МГц, d₆-ДМСО) соединения 2 является следующим: δ (имп./мин): 150.99 (С-3''), 148.97 (С-3'), 148.10 (С-4''), 142.51 (С-4'), 137.20 (С-1''), 131.73 (С-1'), 121.33 (С-5'), 118.09 (С-6'), 118.06 (С-6''), 112.09 (С-5''), 110.95 (С-2'), 110.00 (С-2''), 87.23 (С-2), 81.76 (С-6), 70.87 (С-8), 69.44 (С-4), 56.21 (С-ОСН₃), 55.99 (С-ОСН₃), 54.52 (С-ОСН₃), 53.37 (С-1), 49.78 (С-5) имп./мин.

В соответствии с данными тандемной масс-спектрометрии с электрораспылительной ионизацией, ¹Н-ЯМР и ¹³С-ЯМР, определено, что молекулярной формулой соединения 2 является: C₂₁H₂₃O₉SK, а структурной формулой является:

Вариант осуществления 3

4. В условиях сохранения температуры 10°С реакцию этерификации завершали, при проведении реакции в течение 1 часа, добавляли раствор аммиака (5 мл) для доведения значения рН до 8, реакционную смесь затем выпаривали при сниженном давлении для удаления растворителя, затем образец загружали на хроматографическую колонку, загруженную силикагелем GF254, проводили элюцию жидкой смесью хлороформа и метанола, где объемное отношение хлороформа и метанола составило 9:1. Форзициазида аммония сульфат (соединение 3) получали посредством колоночной хроматографии на силикагеле.

Форзициазида аммония сульфат (3 г) является белым твердым веществом, растворимым в воде и этаноле. После нанесения на пластину для ТСХ (с раствором для хроматографии хлороформ/метанол 10:1, и Rf 0,4) он показал пурпурно-красную окраску при распылении 10% реагента H₂SO₄-этанола. На спектре тандемной масс-спектрометрии с электрораспылительной ионизацией m/z[M-NH₄]^- равно 451, молекулярная масса 469.

¹Н-ЯМР (600 МГц, d₆-ДМСО) соединения 3 является следующим: δ (имп./мин): 7.4 (1Н, d, J=8.4 Гц, Н-), 6.9 (5Н, m, Ar-H), 4.8 (1H, d, J=4.8 Гц, H-6), 4.38 (H, d, J=6.6 Гц, H-8), 4.10 (1H, d, J=9.0 Гц, H-2), 3.75 (12H, d, J=8.4 Гц, H-8,4, O-СН₃), 3.12 (1H, t, J=8.1 Гц, Н-5), 2.86 (1Н, d, J=7.2 Гц, Н-1);

¹³С-ЯМР (125 МГц, d₆-ДМСО) соединения 3 является следующим: δ (имп./мин): 150.99 (С-3''), 148.97 (С-3'), 148.10 (С-4''), 142.51 (С-4'), 137.20 (С-1''), 131.73 (С-1''), 121.32 (С-5'), 118.09 (С-6'), 118.06 (С-6''), 112.09 (С-5''), 110.94 (С-2'), 110.00 (С-2''), 87.22 (С-2), 81.76 (С-6), 70.87 (С-8), 69.44 (С-4), 56.21 (С-ОСН₃), 55.99 (С-ОСН₃), 54.52 (С-ОСН₃), 53.37 (С-1), 49.78 (С-5) имп./мин.

В соответствии с данными тандемной масс-спектрометрии с электрораспылительной ионизацией, ¹Н-ЯМР и ¹³С-ЯМР, определено, что молекулярной формулой соединения 3 является: C₂₁H₂₇NO₉S; а структурной формулой является:

Вариант осуществления 4

1. Форзициазид (4 г, 10,75 ммоль) добавляли в 180 мл безводного N,N-диметилформамида, и перемешивали до растворения, для получения раствора форзициазида.

2. На ледяной бане дихлорметановый раствор, содержащий соединение серы триоксида-триэтиламина (3,89 г мл, примерно 21,5 ммоль) добавляли по каплям в раствор форзициазида, при перемешивании, и скорость капельного добавления составила 1 каплю (примерно 50 мкл на каплю) в 2 секунды, т.е. молярное отношение форзициазида к соединению серы триоксида-триэтиламина в настоящем варианте осуществления составило 1:2.

3. После завершения капельного добавления в условиях перемешивания температуру поднимали и поддерживали при 110°С, и проводили реакцию этерификации;

4. В условиях сохранения температуры 110°С реакцию этерификации завершали, при проведении реакции в течение 1 часа, температуру снижали до комнатной температуры, добавляли раствор аммиака (5 мл) для доведения значения рН до 8, реакционную смесь затем выпаривали при сниженном давлении для удаления растворителя, затем образец загружали на хроматографическую колонку, загруженную силикагелем GF254, проводили элюцию жидкой смесью хлороформа и метанола, где объемное отношение хлороформа и метанола составило 9:1. Форзициазида аммония сульфат (соединение 3) получали посредством колоночной хроматографии на силикагеле.

¹Н-ЯМР (600 МГц, d₆-ДМСО) соединения 3 является следующим: δ (имп./мин): 7.4 (1H, d, J=8.4 Гц, Н-), 6.9 (5Н, m, Ar-Н), 4.8 (1Н, d, J=4.8 Гц, Н-6), 4.38 (Н, d, J=6.6 Гц, Н-8), 4.10 (1Н, d, J=9.0 Гц, Н-2), 3.75 (12Н, d, J=8.4 Гц, Н-8,4, O-СН₃), 3.12 (1H, t, J=8.1 Гц, Н-5), 2.86 (1Н, d, J=7.2 Гц, H-1);

¹³С-ЯМР (125 МГц, d6-ДМСО) соединения 3 является следующим: δ (имп./мин): 150.99 (С-3''), 148.97 (С-3'), 148.10 (С-4''), 142.51 (С-4'), 137.20 (С-1''), 131.73 (С-1''), 121.32 (С-5'), 118.09 (С-6'), 118.06 (С-6''), 112.09 (С-5''), 110.94 (С-2'), 110.00 (С-2''), 87.22 (С-2), 81.76 (С-6), 70.87 (С-8), 69.44 (С-4), 56.21 (С-ОСН₃), 55.99 (С-ОСН₃), 54.52 (С-ОСН₃), 53.37 (С-1), 49.78 (С-5) имп./мин.

Вариант осуществления 5

2. На ледяной бане дихлорметановый раствор, содержащий соединение серы триоксида-пиридина (3,68 г, примерно 21,5 ммоль) добавляли по каплям в раствор форзициазида, при перемешивании, и скорость капельного добавления составила 1 каплю (примерно 50 мкл на каплю) в 2 секунды, т.е. молярное отношение форзициазида к соединению серы триоксида-пиридина в настоящем варианте осуществления составило 1:2.

4. В условиях сохранения температуры 110°С реакцию этерификации завершали, при проведении реакции в течение 1 часа, температуру снижали до комнатной температуры, добавляли метанольный раствор калия гидроксида (5 мл) для доведения значения рН до 8, реакционную смесь затем выпаривали при сниженном давлении для удаления растворителя, затем образец загружали на хроматографическую колонку, загруженную силикагелем GF254, проводили элюцию жидкой смесью хлороформа и метанола, где объемное отношение хлороформа и метанола составило 9:1. Форзициазида калия сульфат (соединение 2) получали посредством колоночной хроматографии на силикагеле.

¹Н-ЯМР (600 МГц, d₆-ДМСО) соединения 2 является следующим: δ (имп./мин): 7.4 (1Н, d, J=8.4 Гц, Н-), 6.9 (5Н, m, Ar-Н), 4.8 (1Н, d, J=4.8 Гц, Н-6), 4.38 (Н, d, J=6.6 Гц, Н-8), 4.10 (1H, d, J=9.0 Гц, Н-2), 3.75 (12Н, d, J=8.4 Гц, Н-8,4, O-СН₃), 3.10 (1Н, t, J=8.1 Гц, Н-5), 2.84 (1Н, d, J=7.2 Гц, Н-1);

Вариант осуществления 6

2. На ледяной бане дихлорметановый раствор, содержащий соединение серы триоксида-триметиламина (2,99 г, примерно 21,5 ммоль) добавляли по каплям в раствор форзициазида, при перемешивании, и скорость капельного добавления составила 1 каплю (примерно 50 мкл на каплю) в 2 секунды, т.е. молярное отношение форзициазида к соединению серы триоксида-триметиламина в настоящем варианте осуществления составило 1:2.

3. После завершения капельного добавления в условиях перемешивания температуру поднимали и поддерживали при 100°С, и проводили реакцию этерификации;

4. В условиях сохранения температуры 100°С реакцию этерификации завершали, при проведении реакции в течение 1 часа, температуру снижали до комнатной температуры, добавляли метанольный раствор калия гидроксида (5 мл) для доведения значения рН до 8, реакционную смесь затем выпаривали при сниженном давлении для удаления растворителя, затем образец загружали на хроматографическую колонку, загруженную силикагелем GF254, проводили элюцию жидкой смесью хлороформа и метанола, где объемное отношение хлороформа и метанола составило 9:1. Форзициазида калия сульфат (соединение 2) получали посредством колоночной хроматографии на силикагеле.

¹Н-ЯМР (600 МГц, d₆-ДМСО) соединения 2 является следующим: δ (имп./мин): 7.4 (1H, d, J=8.4 Гц, Н-), 6.9 (5Н, m, Ar-Н), 4.8 (1H, d, J=4.8 Гц, Н-6), 4.38 (Н, d, J=6.6 Гц, Н-8), 4.10 (1Н, d, J=9.0 Гц, Н-2), 3.75 (12Н, d, J=8.4 Гц, Н-8,4, O-СН₃), 3.10 (1Н, t, J=8.1 Гц, Н-5), 2.84 (1H, d, J=7.2 Гц, Н-1);

Пример анализа 1. Анализ противовирусной активности производных форзициазида сульфата

1. Антивирусный тест in vitro

1.1. Материалы анализа

(1) Лекарственные средства

1) Производные форзициазида сульфата: форзициазида натрия сульфат, форзициазида калия сульфат и форзициазида аммония сульфат, которые являются белым порошком и производятся Dalian Fusheng Natural Medicinal Development Co. Ltd.; их анализировали, соответственно, двумя детекторами для высокоэффективной жидкостной хроматографии, т.е. ультрафиолетовым детектором и испарительным нефелометрическим детектором, посредством способа нормализации площади; чистота составила 99,9%, 99,5% и 99,2%, соответственно.

2) Рибавирин для инъекций, который является бесцветной прозрачной жидкостью, производимой Henan Runhong Pharmaceutical Co., ltd., номер серии продукта: 1206261, номер национальной медицинской регистрации: Н19993553; его концентрация составила 100 мг/мл; и он использовался в качестве положительного контроля в настоящем анализе.

3) Осельтамивир фосфат, производимый Национальным институтом контроля фармацевтических и биологических продуктов. Номер серии продукта: 101096-200901. Осельтамивир фосфат использовали в качестве положительного контроля в настоящем анализе, где каждая доза для инъекции составила 100 мг.

Все вышеупомянутые лекарства растворяли в очищенной воде, фильтровали, стерилизовали, паковали и хранили при 4°С для последующего применения; все они являются лекарствами, исследуемыми в настоящем анализе.

(2) Клеточный штамм

Клеточный штамм клеток Vero (клетки почки африканских зеленых мартышек) хранился в Колледже основных медицинских наук Цзилиньского университета.

(3) Вирусные штаммы

1) Вирус гриппа, полученный из Института вирусологии Китайской Академии профилактической медицины.

2) Вирус парагриппа, полученный из Института вирусологии Китайской Академии профилактической медицины.

3) Респираторно-синцитиальный вирус (RSV), полученный из Института вирусологии Китайской Академии профилактической медицины.

4) Вирус Коксаки, штамм В₃ (CVB₃), полученный из Америки и хранящийся в учебно-исследовательском отделе.

5) Вирус Коксаки, штамм А16 (СохА16), полученный в дар из Национального госпиталя Сендая из Японии, и хранящийся в учебно-исследовательском отделе.

6) Энтеровирус, штамм EV71, полученный в дар из Национального госпиталя Сендая из Японии, и хранящийся в учебно-исследовательском отделе.

7) Аденовирус (AdV), полученный из педиатрической лаборатории Научного центра здоровья имени Нормана Бетьюна Цзилиньского университета.

8) Вирус простого герпеса I типа (HSV-1), полученный из Национального института контроля фармацевтических и биологических продуктов.

(4) Основное оборудование и реагенты:

Кабинет биологической безопасности	ВНС-1300 IIA/В3, AIRTECH
CO₂ инкубатор	МСО-18AIC, SANYO
Инвертированный микроскоп	CKX41, OLYMPUS
Электронные аналитические весы	AR1140/С, DHAUS
Среда для культивирования	DMEM, HyClone
Эмбриональная телячья сыворотка	HyClone
Трипсин	Gibco
МТТ	Sigma
ДМСО	Tianjin Beilian Fine Chemicals Development Co., Ltd.

1.2. Способ анализа

(1) Приготовление клеток

Клетки Vero подвергали субкультивированию в течение 1-2 суток, и готовили пластины, где граница раздела была чистой; при стереоскопическом восприятии и сильном увеличении обрабатывали трипсином; при наличии иглоподобных ячеек на поверхности клеток пищеварительный сок полностью адсорбировался, несколько миллилитров культурального бульона брали для диспергирования клеток, которые затем подсчитывали и разбавляли средой для культивирования (DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки) до примерно 5×10⁷/л, и инокулировали в 96-луночном планшете для культивирования, пока клетки не формировали монослой.

(2) Определение токсичности лекарственного средства

Анализ цитотоксичности: лекарства разбавляли в соответствии с концентрациями, указанными в таблице 1, для определения цитотоксичности.

Вышеупомянутые лекарства, разбавленные раствором для хранения (DMEM с 2% эмбриональной телячьей сывороткой) до различных концентраций, добавляли по каплям к монослою клеток Vero, в каждую ячейку по 0,2 мл, по 6 ячеек для каждой концентрации, и дополнительно обеспечивали 6 ячеек для нормального контроля (группа нормального контроля без добавления дополнительных лекарств) и 6 ячеек для холостого контроля (культуральной среды); планшет помещали в инкубатор с 5% СО₂ при 37°С для культивирования, наблюдая цитопатический эффект с инвертированным микроскопом каждый день, и регистрируя. Спустя 72 часа добавляли 20 мкл (5 мг/мл) раствора МТТ в каждую ячейку, и продолжали инкубацию в течение 4 часов, удаляли аспирацией культуральную среду из каждой ячейки, добавляли 100 мкл ДМСО в каждую ячейку, и встряхивали в течение 5 минут, измеряли значение ОП при 492 нм для расчета доли выживших клеток. С помощью статистического программного обеспечения SPSS 18.0 подвергали число долю выживших клеток регрессионному анализу методом пробит для расчета максимальной нетоксичной концентрации (ТС₀) и полумаксимальной токсичной концентрации (ТС₅₀) лекарства на клетках Vero.

(3) Определение TCID₅₀ (дозы заражения 50% культуры ткани) для разных вирусов.

Разные вирусы разбавляли с 10-кратным декрементом для получения различных разведений 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5 и 10^-6, и последовательно инокулировали ими монослой клеток Vero в 96-луночном планшете для культивирования, по 100 мкл в каждую ячейку, по 6 ячеек на каждое разведение, и при этом обеспечивалась контрольная группа нормальных клеток. Их инкубировали в инкубаторе с 5% СО₂ в течение 2 часов, жидкость с вирусами удаляли, затем добавляли 100 мкл раствора для поддержки клеток в каждую ячейку, и культивировали в 5% СО₂ при 37°С. Результаты цитопатического воздействия наблюдали под микроскопом с 3-го дня, результаты определяли на 7-8 день и регистрировали, при этом брали наивысшее разведение в виде конечной точки, где в 50% клеток из ячейки наблюдалось положительной поражение, и рассчитывали титр вируса с применением методом Карбера.

Формула:

TCID₅₀: доза инфицирования 50% гистиоцитов

ХМ: логарифм наивысшей концентрации разведения вируса

d: логарифм коэффициента разбавления (множитель)

Σpi: сумма процентов поражения для каждого разведения

(4) Влияние лекарства на индуцированную вирусом цитотоксичность

Брали планшет для культивирования с монослоем клеток, удаляли аспирацией культуральную среду, клетки инокулировали количеством вируса, соответствующим 100TCID₅₀, и помещали в инкубатор с 5% СО₂ при 37°С на 2 часа, добавляли различные жидкости со специфическими концентрациями (около максимальной нетоксичной концентрации), готовили по 6 ячеек для культуры для каждой концентрации, по 200 мкл на ячейку. Рибавирин для инъекций и осельтамивир фосфат использовали в качестве положительной контрольной группы лекарств, использовали нормальную контрольную группу (без добавления вируса и лекарства) и вирусную контрольную группу (с добавлением вируса, но без лекарства), наблюдали влияние лекарства на вирус-индуцированный цитопатический эффект. Спустя 72 часа измеряли значение ОП при длине волны 492 нм с применением МТТ колориметрического метода для расчета уровня противовирусной эффективности (ER%) лекарства. С помощью статистического программного обеспечения SPSS 18.0 рассчитывали статистическую разницу антивирусной эффективности различных лекарств с применением метода ANOVA.

ER%=(среднее значение ОП в группе с применением лекарства - среднее значение ОП в группе контроля вируса)/(среднее значение ОП в группе контроля клеток - среднее значение ОП в группе контроля вируса)×100%

1.3. Результаты анализа

(1) TCID50 различных вирусов

Вирус гриппа:

Вирус парагриппа:

CVB3:

HSV-1:

AdV:

RSV:

СохА16:

EV71:

(2) Определение лекарственной токсичности.

(1) Определение цитотоксичности лекарств

Максимальная нетоксичная концентрация (ТС₀), полумаксимальная токсичная концентрация (ТС₅₀) лекарства на клетках Vero, и концентрации, использованные для антивирусного анализа, показаны в таблице 2.

(2) Результаты защитных эффектов лекарств в отношении вирус-индуцированной цитотоксичности и результаты одностороннего дисперсионного анализа ANOVA показаны в таблице 3.

Как показано в результатах в таблице 3, уровни эффективности форзициазида сульфата: форзициазида натрия сульфата, форзициазида калия сульфата и форзициазида аммония сульфата в ингибировании вируса гриппа, вируса парагриппа, вируса Коксаки (СохА16) были выше 90%, и при сравнении с группой вирусного контроля разница была статистически достоверной; уровни ингибирования респираторного синцитиального вируса RSV и вируса простого герпеса I типа (HSV-I) были выше 80%, уровни эффективности были выше 80%, и по сравнению с группой контроля вирусов различия были статистически значимыми; и терапевтические эффекты трех производных форзициазида сульфата в отношении вышеупомянутых вирусов превосходили эффекты рибавирина и осельтамивира фосфата. 2. Антивирусный анализ in vivo.

2.1. Экспериментальные материалы

1) Экспериментальные животные

Куньминские мыши были получены из Научного центра здоровья имени Нормана Бетьюна Цзилиньского университета, лабораторные животные №10-5219.

2) Реагенты для анализа

Главные экспериментальные приборы

2.2. Экспериментальный метод.

(1) Определение медианной летальной дозы мыши для вируса гриппа и вируса парагриппа.

Вирус гриппа и вирус парагриппа (клеточный лизат) разбавляли с 10-кратным декрементом с получением вирусных жидкостей с концентрациями 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4 и 10^-5. Использовали 120 куньминских мышей, 60 для группы вируса гриппа и остальные 60 для труппы вируса парагриппа, и их произвольно распределяли на 6 отдельных групп. Мыши получали легкую анестезию эфиром, и их инфицировали интраназально жидкостями с вирусом в различных разведениях по 0,03 мл на мышь. При этом использовали холостой контроль, и жидкости с вирусами заменяли солевым раствором. Частоту смерти и выживания регистрировали в качестве индексов наблюдения, наблюдение проводили каждый день и в течение 14 дней после инфекции. Мышей, умерших в течение 24 часов после инфекции, считали умершими от неспецифических причин и не учитывали, LD₅₀ вирусной жидкости рассчитывали с применением метода Карбера. Использовали следующую формулу для расчета:

[где: LD₅₀ - медианная летальная доза; ХМ - логарифм концентрации наивысшего разведения вируса; d - логарифм коэффициента разведения (множитель); и Σpi - сумма процента поражения для каждого разведения].

(2) Исследование влияния форзициазида сульфата на устойчивость к пневмонии, вызванной вирусом гриппа и вирусом парагриппа.

1) Экспериментальные животные и группы

Для выполнения двух анализов использовали 360 мышей в возрасте четырех недель. 180 мышей отбирали и произвольно разделяли на 18 групп (по 10 на каждую группу) для определения легочного индекса и уровня ингибирования легочного индекса для форзициазида сульфата у мышей, инфицированных вирусом гриппа. Остальных 180 мышей отбирали и произвольно разделяли на 18 групп (по 10 на каждую группу) для определения титра вирусной гемагглютинации в легочной суспензии для форзициазида сульфата.

2) Способ инфицирования

Обезжиренную вату помещали в 200-300 мл стакан, в который добавляли подходящее количество эфира (просто для смачивания ваты); стакан, содержащий обезжиренную вату, переворачивали вверх дном, и мышей подвергали анестезии в нем, и оставляли в положении лежа на спине, и под анестезией мышей инфицировали назально с 15LD₅₀ вируса гриппа и вируса парагриппа с 0,03 мл/мышь, а в нормальной контрольной группе суспензию вирусов заменяли нормальным солевым раствором.

3) Способ применения и используемая доза

Обычное внутрижелудочное применение проводили, соответственно, в экспериментальных группах для лекарств форзициазида натрия сульфата и форзициазида калия сульфата, и для контрольной группы с рибавирином за один день до инфицирования. Высокие, средние и низкие применяемые дозы для форзициазида натрия сульфата и форзициазида калия сульфата составили 13,0 мг/кг, 6,5 мг/кг и 3,25 мг/кг, соответственно, а доза применения лекарства рибавирина составила 58,5 мг/кг. Применение проводили один раз в день в течение пяти последующих дней. В группе вирусного контроля применяли солевой раствор такого же объема.

4) Индекс наблюдения

(1) Определение легочного индекса

На пятый день после применения лекарств у мышей их вначале лишали питьевой воды на 8 часов; затем мышей взвешивали, анестезировали и умерщвляли путем обескровливания; их грудные полости вскрывали для извлечения легких, которые промывали дважды обычным солевым раствором, и удаляли влагу с поверхности легких с применением фильтровальной бумаги; затем легкие взвешивали с применением электронных весов, и легочный индекс и уровень ингибирования легочного индекса рассчитывали с помощью следующего уравнений:

Легочный индекс = (масса легких мыши/масса мыши) × 100%;

Уровень ингибирования легочного индекса = (средний легочный индекс в экспериментальной группе с инфекцией - средний легочный индекс в экспериментальной группе)/средний легочный индекс в экспериментальной группе с инфекцией × 100%.

(2) Определение титра гемагглютинации вируса в легочной суспензии.

Различные группы легких мышей, соответственно, отбирали на пятый день после лечения, и измельчали посредством гомогенизатора при низкой температуре; гомогенат разбавляли до 10% суспензии легочной ткани нормальным солевым раствором; проводили центрифугирование для получения надосадочной жидкости, которую разбавляли в два раза и наносили на планшет для титрования по 0,2 мл на ячейку; добавляли 0,2 мл 1% суспензии куриных эритроцитов в каждую лунку и тщательно перемешивали; планшеты для титрования помещали в среду с комнатной температурой на 30 минут для наблюдения и регистрации титров гемагглютинации. Отмечали конечную точку, в которой агглютинация эритроцитов составила (++), и этот титр выражали по разведению суспензии.

(3) Наблюдение легочной гистоморфологии

Легкие различных мышей, соответственно, отбирали на пятый день после лечения; общие патологические изменения ткани наблюдали невооруженным глазом и регистрировали. Легкие промывали нормальным солевым раствором, и влагу удаляли фильтровальной бумагой; часть легких фиксировали 10% формальдегидом, заливали парафином, готовили срезы и окрашивали гематоксилином-эозином; проводили наблюдение и фотографирование под микроскопом.

2.3. Результаты экспериментов и их анализ

(1) Результаты определения медианной летальной дозы мышей для вируса гриппа и вируса парагриппа.

Куньминских мышей в экспериментальных группах соответственно инфицировали интраназально 30 мкл жидкостей с различными концентрациями вирусов гриппа и парагриппа; на третий день после инфицирования у всех мышей из первых трех групп (группа 10^-1, группа 10^-2 и группа 10^-3 на основе концентраций вирусов) отмечались симптомы заболевания различной степени: пиломоторные проявления, дрожь, снижение аппетита и тому подобное; на пятый день мыши спотыкались; на шестой день мыши в группе с наивысшей концентрацией вируса начинали умирать; и гибель отмечалась последовательно в оставшихся группах на седьмой день после инфицирования. После завершения наблюдения на 14 день подсчитывали смертность мышей в каждой группе; результаты показаны в таблицах 3 и 4. При подсчете значение LD₅₀ для вируса гриппа составило 10^-2,9, a LD₅₀ для вируса парагриппа составило 10^-2,5.

LD₅₀ вируса рассчитывали с применением метода Карбера. LogLD₅₀ вируса гриппа рассчитывали следующим образом:

LD₅₀ вируса рассчитывали с применением метода Карбера. LogLD₅₀ вируса парагриппа рассчитывали следующим образом:

(2) Результаты влияния форзициазида сульфата на устойчивость к пневмонии, вызванной вирусом гриппа и вирусом парагриппа.

(1) Определение легочного индекса

После инфицирования мышей вирусом гриппа и вирусом парагриппа результаты определения среднего легочного индекса показали, что при сравнении групп с моделью инфекции, легочные индексы нормальной контрольной группы, групп с применением лекарств с различными концентрациями и группы с рибавирином существенно снижались (р<0,05); когда концентрация форзициазида сульфата находилась в диапазоне от 3,25 до 13,0 мг/кг/сутки, достигался определенный защитный эффект, и все легочные индексы существенно снижались; хотя снижение в группе с высокой дозировкой форзициазида сульфата было более значительным, по сравнению с двумя другими группами, не отмечалось существенных различий при сравнении различных групп (р>0,05). Группы со средней и высокой дозировкой форзициазида сульфата превосходили группу рибавирина (р>0,05). Результаты см. в таблицах 5 и 6.

После инфицирования вышей вирусом гриппа и вирусом парагриппа, титры гемагглютинации легочной ткани (InX) в группе с моделью инфекции составили 32,33 и 33,86, соответственно; после лечения форзициазида сульфатом в различных концентрациях на 5 сутки титры вирусной гемагглютинации легочной ткани снижались до некоторой степени; по сравнению с группой с моделью инфекции разница была достоверной, (р<0,05). По сравнению с группой с рибавирином, титры вирусной гемагглютинации в группах с высокой, средней и низкой дозой форзициазида сульфата были более высокими, чем в группе рибавирина, разницы были достоверными (р<0,05); при сравнении, титры гемагглютинации в группе с высокой дозировкой форзициазида сульфата значительно отличались от титров в двух других группах (р<0,05), как показано в таблице 10. При сравнении не отмечено существенной разницы между группой с высокой дозировкой форзициазида сульфата и группой рибавирина у мышей, инфицированных вирусом парагриппа (р<0,05), группы со средней и низкой дозой форзициазида сульфата превосходили группу рибавирина, разницы были достоверными (р<0,05); при сравнении, титры гемагглютинации в группе с высокой дозировкой форзициазида сульфата достоверно отличались от титров в группе с низкой дозировкой форзициазида сульфата (р<0,05), как показано в таблицах 7 и 8.

(3) Результаты анализа гистологии легких.

Легкие у мышей в группе с моделью пневмонии, вызванной вирусами гриппа и парагриппа, в основном были застойными, пораженными отеком; в некоторых легких отмечались участки консолидации с темно-коричневым внешним видом, тяжелые поражения проявлялись коричневато-красными участками геморрагии. При микроскопическом анализе было видно, что интерстициальная легочная ткань, такая как в бронхах, бронхиолах и альвеолярных стенках, была подвержена гиперемии, отеку и инфильтрации лимфоцитами и мононуклеарными клетками, расширению альвеолярной стенки и воспалительной реакции легочных альвеол. После лечения мышей с моделью пневмонии, вызванной вирусом гриппа и парагриппа, форзициазида сульфатом, общие патологические изменения легких в каждой группе мышей существенно уменьшались, и часть легочной ткани имела нормальную форму и структуру, по сравнению с группой с моделью инфекции, альвеолярная перегородка была тоньше, число инфильтрирующих мононуклеарных клеток в альвеолярной стенке и стенке бронхиол было меньше, не отмечалось выхода в полость, и поражения существенно уменьшались. По сравнению с группой с моделью инфекции, группы со средней и высокой дозировкой форзициазида сульфата при лечении пневмонии, вызванной вирусом парагриппа, имели значительно более тонкую альвеолярную перегородку, меньшее число инфильтрирующих мононуклеарных клеток, отсутствие выхода в полость, и значительно уменьшенные поражения.

Результаты микроскопического анализа срезов патологической ткани легких мышей с моделью пневмонии, вызванной вирусом гриппа, показаны на фиг. 1; на фиг. 1А показана легочная ткань здоровой мыши; на фиг. 1В показана легочная ткань мыши с пневмонией, вызванной вирусом гриппа; на фиг. 1С показана легочная ткань мыши с моделью пневмонии, вызванной вирусом гриппа, после лечения рибавирином для положительного контроля; на фиг. 1D показана легочная ткань мыши с моделью пневмонии, вызванной вирусом гриппа, после лечения высокой дозой форзициазида сульфата; на фиг. 1Е показана легочная ткань мыши с моделью пневмонии, вызванной вирусом гриппа, после лечения средней дозой форзициазида сульфата; на фиг. 1F показана легочная ткань мыши с моделью пневмонии, вызванной вирусом гриппа, после лечения низкой дозой форзициазида сульфата.

Результаты микроскопического анализа срезов патологической ткани легких мышей с моделью пневмонии, вызванной вирусом парагриппа, показаны на фиг. 2; на фиг. 2A показана легочная ткань здоровой мыши; на фиг. 2В показана легочная ткань мыши с пневмонией, вызванной вирусом парагриппа; на фиг. 2С показана легочная ткань мыши с моделью пневмонии, вызванной вирусом парагриппа, после лечения рибавирином для положительного контроля; на фиг. 2D показана легочная ткань мыши с моделью пневмонии, вызванной вирусом парагриппа, после лечения высокой дозой форзициазида сульфата; на фиг. 2Е показана легочная ткань мыши с моделью пневмонии, вызванной вирусом парагриппа, после лечения средней дозой форзициазида сульфата; на фиг. 2F показана легочная ткань мыши с моделью пневмонии, вызванной вирусом парагриппа, после лечения низкой дозой форзициазида сульфата.

2.4. Выводы

Результаты антивирусного анализа in vivo показали, что форзициазида сульфаты (форзициазида натрия сульфат и форзициазида калия сульфат) проявляют относительно выраженный ингибирующий эффект против вируса гриппа и вируса парагриппа, а также мышиной вирусной пневмонии, вызванной ими, в диапазоне доз от 3,25 мг/кг/сутки до 13 мг/кг/сутки, позволяют значительно снизить легочный индекс и титр гемагглютинации, а также существенно облегчают патологические изменения легочной ткани, и обеспечивают достоверные отличия, по сравнению с модельной контрольной группой.

Claims

1. Форзициазида сульфат и его производные, представленные следующей химической структурной формулой:

где R является Na⁺, K⁺, NH₄ ⁺

2. Способ получения форзициазида сульфата и его производных по п. 1, включающий следующие последовательно выполняемые этапы:

(3) добавление основания для доведения значения рН жидкой смеси до 8-10;

(4) разделение и очистка жидкой смеси для получения готового продукта.

3. Способ получения по п. 2, где сульфатирующий агент на этапе (2) выбран из хлорсульфоновой кислоты, комплекса серы триоксида-триэтиламина, комплекса серы триоксида-пиридина или комплекса серы триоксида-триметиламина.

4. Способ получения по п. 2 или 3, где основание на этапе (3) выбрано из органического основания или неорганического основания.

5. Способ получения по п. 2 или 3, где органический растворитель на этапе (1) выбран из одного из пиридина, N,N-диметилформамида, N,N-диметилацетамида или дихлорметана.

6. Способ получения по п. 2 или 3, где сульфатирующий агент добавляют в раствор форзициазида при температуре 0-5°С на этапе (2).

7. Способ получения по п. 2 или 3, где молярное отношение форзициазида в растворе форзициазида к сульфатирующему агенту на этапе (2) составляет 1:1-10.

8. Применение форзициазида сульфата и его производных по п. 1 для изготовления противовирусного лекарственного средства.

9. Применение по п. 8, где противовирусное лекарственное средство выбрано из

средств против вируса гриппа, средств против вируса парагриппа, средств против респираторного синцитиального вируса, средств против вируса простого герпеса I типа, и средств против вируса Коксаки А16.

10. Противовирусное лекарственное средство, характеризующееся содержанием форзициазида сульфата или производных форзициазида сульфата.