CN114990054B - 一种辅助生殖用洗精受精液 - Google Patents

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Abstract

本发明属于辅助生殖领域，公开了一种辅助生殖用洗精受精液，作为体外受精培养药剂，包括：基础培养物料，用于搭建体外受精人工控制的体液环境；以及连翘酯苷A和磷脂酰丝氨酸；其中，连翘酯苷A能够清除活性氧，降低活性氧对精子和卵细胞的损害，还能提高精子活力，添加量为基于培养液总体积的1‑100mg/L；而磷脂酰丝氨酸在受精过程中，能促进精子的顶体反应，辅助精子进行顶体反应中的膜融合，从而提高受精率，添加量为基于培养液总体积的1‑100mg/L。两种物料具有显著的协同效果。本发明提供的体外受精培养液，可以提供稳定的受精环境，减少活性氧对精子和卵子的伤害，还能提高精子活力，促进精卵结合，从而提高受精率和囊胚形成率。

Description

一种辅助生殖用洗精受精液
技术领域
本发明属于辅助生殖技术领域，具体涉及一种辅助生殖用洗精受精液。
背景技术
体外受精是指人的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术，英文简称为IVF。精子和卵子在体外受精，需要受精培养液提供稳定的受精环境。精子和卵子在体外培养过程中产生过量的活性氧，不利于体外受精。
现有研究中发现，将小鼠受精卵暴露于21％含氧量的大气中，胚胎不能发育到4-细胞阶段或者严重发育滞后。过量的活性氧将破坏精子、卵细胞的细胞膜，引起脂质膜过氧化损伤，使负责跨膜信号传导的磷脂依赖性的蛋白激酶C迅速耗竭，影响信号传递。损坏DNA，损伤线粒体，影响精子活性，破坏精子功能。不利于获得正常的受精卵以及囊胚期的培养。
在辅助生殖技术中需采集良好的精子和母体的卵细胞进行受精和先期培养，该培养过程与受精液密切相关，因此体外受精液是否能够提供稳定的受精环境，营养物质将影响到精子、卵子是否能够正常结合，得到受精卵。目前使用的受精液调配的营养不全，或其物理或化学指标过余宽，在培养过程中容易使精子或卵细胞死亡、或精子获能不足活力较低、或卵细胞生存受到影响。有些受精液的稠度较高，稳定性差，有害成份去除不干净，严重影响受精卵的形成、发育和成长。且由于体外受精过程中会产生一定量的活性氧，普通的受精液、洗精液无法有效去除活性氧，则导致现有体外受精过程中始终存在一定的影响。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种体外受精培养液，能够可以提供稳定的受精环境，还通过特殊的添加物来减少活性氧对精子和卵子的伤害，促进精卵结合，从而提高受精率和囊胚形成率.
本发明所采用的技术方案为：
第一方面，本发明提供一种辅助生殖用洗精受精液，作为体外受精培养药剂，包括：
基础培养物料，用于搭建体外受精人工控制的体液环境；
以及连翘酯苷A和磷脂酰丝氨酸；
其中，连翘酯苷A的添加量为基于培养液总体积的1-100mg/L，而磷脂酰丝氨酸的添加量为基于培养液总体积的1-75mg/L。
其中连翘酯苷A能够清除过量活性氧对精子和卵细胞DNA带来的损伤，保护负责跨膜信号转导的蛋白激酶C。而磷脂酰丝氨酸有着能够促进精子膜、精子、卵细胞内线粒体膜流动，作为辅酶因子激活细胞膜上蛋白激酶C。
由于在受精过程中，精子顶体反应与磷脂酶A2被激活有关，天然激动剂受蛋白激酶C信号通路的调节，最终激活磷脂酶A2，引起胞外Ca2+内流，将磷脂水解为花生四烯酸和溶血磷脂酰胆碱，从而促进膜的融合即顶体反应。但磷脂酶A2含量过高也可能导致精子自发性顶体反应的发生，反而不利于整个受精过程，导致受精能力下降。
结合第一方面，本发明提供第一方面的第一种实施方式，所述连翘酯苷A的添加量为基于培养液总体积的25-75mg/L。
结合第一方面，本发明提供第一方面的第二种实施方式，所述连翘酯苷A的添加量为基于培养液总体积的25、50或75mg/L。
结合第一方面，本发明提供第一方面的第三种实施方式，所述磷脂酰丝氨酸的添加量为基于培养液总体积的5-30mg/L。
结合第一方面，本发明提供第一方面的第四种实施方式，所述磷脂酰丝氨酸的添加量为基于培养液总体积的5、15或30mg/L。
结合第一方面或第一方面的第一至四种实施方式，本发明提供第一方面的第五种实施方式，所述基础培养物料包括氯化钠、氯化钾、氯化钙、生物缓冲液、氢氧化钠、磷酸二氢钾、葡萄糖、牛磺酸、氨基酸、丙酮酸钠、乙二胺四乙酸和硫酸庆大霉素中的一种或多种。
结合第一方面或第一方面的第一至四种实施方式，本发明提供第一方面的第六种实施方式，所述基础培养物料包括：
氯化钠4000-8000mg/L、氯化钾300-600mg/L、氯化钙150-300mg/L、生物缓冲液300-600mg/L、氢氧化钠150-300mg/L、磷酸二氢钾20-80mg/L、葡萄糖300-700mg/L、牛磺酸10-40mg/L、氨基酸100-400mg/L、丙酮酸钠20-70mg/L、乙二胺四乙酸2-5mg/L和硫酸庆大霉素30-70mg/L。
本发明的有益效果为：
本发明中采用的基础物料作为基底，能够给体外受精过程可以提供稳定的受精环境；而其中将连翘酯苷A和磷脂酰丝氨酸用于制备体外受精培养液，能够区别于现有的药剂，进一步提高体外受精的成功率，并提升受精卵质量；
其中的连翘酯苷A能够清除过量活性氧对精子和卵细胞DNA带来的损伤，保护负责跨膜信号转导的蛋白激酶C，保障精子运动和精卵结合所需能量有正常线粒体支撑，提高了受精率和囊胚形成率；
磷脂酰丝氨酸有着能够促进精子膜、精子、卵细胞内线粒体膜流动，作为辅酶因子激活细胞膜上蛋白激酶C，促进生物信息传导的功能。可以调控精卵细胞膜关键蛋白功能状态，提升精卵识别能力，从而提高了受精率和囊胚形成率；
本发明在同时添加了连翘酯苷A与磷脂酰丝氨酸后，两种药剂有着明显的协同作用，能够显著提高精子活力，共同保证受精过程中精子与卵细胞膜上蛋白激酶C进行生物信息传导，保障了精子顶体反应的发生、促进了精卵识别，进一步提高了体外受精的成功率并提升了受精卵质量。
附图说明
图1是本发明实施例中实验组1的受精卵孵育后第一天的图像；
图2是本发明实施例中实验组2的受精卵孵育后第一天的图像；
图3是本发明实施例中实验组3的受精卵孵育后第一天的图像；
图4是本发明实施例中实验组4的受精卵孵育后第一天的图像；
图5是本发明实施例中实验组5的受精卵孵育后第一天的图像；
图6是本发明实施例中阳性对照组的受精卵孵育后第一天的图像；
图7是本发明实施例中阴性对照组的受精卵孵育后第一天的图像；
图8是本发明实施例中磷脂酰丝氨酸组的受精卵孵育后第一天的图像；
图9是本发明实施例中连翘酯苷A组的受精卵孵育后第一天的图像；
图10是本发明实施例中实验组1的受精卵孵育后第五天的图像；
图11是本发明实施例中实验组2的受精卵孵育后第五天的图像；
图12是本发明实施例中实验组3的受精卵孵育后第五天的图像；
图13是本发明实施例中实验组4的受精卵孵育后第五天的图像；
图14是本发明实施例中实验组5的受精卵孵育后第五天的图像；
图15是本发明实施例中阳性对照组的受精卵孵育后第五天的图像；
图16是本发明实施例中阴性对照组的受精卵孵育后第五天的图像；
图17是本发明实施例中磷脂酰丝氨酸组的受精卵孵育后第五天的图像；
图18是本发明实施例中连翘酯苷A组的受精卵孵育后第五天的图像。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步阐释。
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本申请实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。
在本申请的描述中，需要说明的是，若出现术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，或者是该申请产品使用时惯常摆放的方位或位置关系，仅是为了便于描述本申请和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本申请的限制。此外，本申请的描述中若出现术语“第一”、“第二”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
此外，本申请的描述中若出现术语“水平”、“竖直”等术语并不表示要求部件绝对水平或悬垂，而是可以稍微倾斜。如“水平”仅仅是指其方向相对“竖直”而言更加水平，并不是表示该结构一定要完全水平，而是可以稍微倾斜。
在本申请的描述中，还需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，若出现术语“设置”、“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本申请中的具体含义。
实施例1：
本实施例提供一种辅助生殖用洗精受精液，用于对人的精子、卵子受精过程和孵育过程提供营养和环境，通过人工控制的环境提高受精卵的孵育成功率。
其中，该洗精受精液包括基础物料和特殊物料，基础物料作为基本培养基，可直接采用现有技术中常规的体外受精孵育培养基材，用于保证精子、卵子以及受精卵的活性，避免其缺少营养物质而影响其孵育。
而本实施例中提供一种基于现有营养液培养基的洗精受精液，其添加的特殊物料用于解决受精和孵育过程中所产生的活性氧的影响，并且提高受精率和囊胚形成率，具体包括两种成分，即连翘酯苷A和磷脂酰丝氨酸。
其中，连翘酯苷A的使用量在40-60mg/L，而磷脂酰丝氨酸的使用量在10-50mg/L，该用量均基于配置好的受精洗精液的总体积。
优选地，将连翘酯苷A的使用量限定为45-55mg/L，最佳实施量为50mg/L；
而磷脂酰丝氨酸的使用量优选为10-30mg/L，最佳实施量为15mg/L。
需要说明的是，通过研究表明体外受精过程中，在受精过程中精卵细胞会产生的活性氧和精子在运动过程中产生的活性氧自由基。而过量活性氧或活性氧自由基会破坏精子、卵细胞的细胞膜，引起脂质膜过氧化损伤，，损坏DNA，损伤线粒体，影响精子活性，破坏精子功能。不利于获得正常的受精卵以及囊胚期的培养。
而其中的连翘酯苷A能够有效的清除活性氧，连翘酯苷A结构中的A环酚羟基和B环酚羟基对活性氧具有较好的清除能力，是一种天然抗氧化剂。但现有技术中并未将其直接应用在体外受精培养药剂中，其有效性通过发明人实验验证确定其有效性。
还需要说明的是，磷脂酰丝氨酸作为培养基的磷脂材料，用于体外受精卵孵育，能够相较于其他磷脂材料具有更好的功效。但发明人通过实验发现，磷脂酰丝氨酸在卵子受精过程中，能够对精子的顶体反应起效，辅助精子进行顶体反应中的膜融合，从而提高受精率。然而，该实施例中的洗精受精液是受精卵的整个孵育过程的培养基，过量的磷脂酰丝氨酸会对精子活力、受精过程以及囊胚形成造成明显抑制作用，与现有研究中所提供的参考量明显不同。
进一步地，本实施例还对基础物料进行限定，并依据该基础物料配置成产品进行试验验证。
其中，包括该基础物料的组合物和配比表具体如下：
试验设定
1.理化试验
检验PH值、渗透压、内毒素。
PH值：取50μL液体，滴入0.5mlEP管用血气分析仪检测，取3次测试的PH平均值为最终PH，在范围内即合格。
渗透压：取25μL液体滴入0.5mLEP管使用冰点渗透压仪探检测，取3次稳定后的渗透压数值平均值为最终渗透压值，在范围内合格。
细菌内毒素检测
采用中国药典的检测方法中的鲎试剂凝胶法进行内毒素检测，在1EU/mL范围内合格
2.受精卵囊胚形成试验
卵母细胞在冲洗完卵母卵丘细胞复合体之后核优选的精子同时转移至受精液中进行受精。
体外受精培养液A关键物料为连翘酯苷A，其余基础物料相同。
体外受精培养液B关键物料为磷脂酰丝氨酸，其余基础物料相同。
用基础物料，市场现有体外受精培养液作为对照组进行受精囊胚形成试验
2.1预实验(浓度范围确定试验)
预实验组别设置表
备注：+为添加该物料，－为不添加该物料。
2.2正试验(正常浓度试验)
预实验组别设置表
备注：+为添加该物料，－为不添加该物料。
试验结果
1.理化检测结果
名称 PH(室温) 渗透压 内毒素(LAL)
实施例1 7.3 281mosM ≤0.2EU/mL
实施例2 7.2 278mosM ≤0.2EU/mL
实施例3 7.3 281mosM ≤0.2EU/mL
实施例4 7.2 283mosM ≤0.2EU/mL
实施例5 7.3 280mosM ≤0.2EU/mL
2.受精卵囊胚形成试验
2.1预实验
受精卵囊胚形成预试验统计百分表
组别 精子活力(％) 受精率(％) 囊胚形成率(％)
阳性对照组 88.72±4.76 93±4.2 90
阴性对照组 74.03±3.21 74±4.3 75
A1 76.10±2.77 76±4.2 75
A2 79.10±2.54 82±4.2 80
A3 81.46±2.88 85±5.2 82
A4 83.77±3.59 88±6.2 84
A5 85.82±5.94 90±5.9 88
A6 82.22±4.18 85±2.9 83
A7 76.63±3.02 78±6.8 77
B1 76.47±2.83 75±3.2 76
B2 83.31±3.77 84±5.1 82
B3 86.57±6.14 92±4.9 87
B4 84.79±5.97 89±2.4 85
B5 81.63±4.76 86±6.2 81
B6 78.32±4.29 76±3.1 76
B7 65.32±5.97 69±7.8 70
预实验结论：与基础物料相比，在基础液物料中添加5-75mg/L连翘酯苷A对于精子活力，受精率和囊胚形成率有正向效果。添加50mg/L连翘酯苷A效果最优；
在基础液物料中5-50mg/L磷脂酰丝氨酸，对精子活力，受精率，囊胚形成率有正向效果。添加15mg/L磷脂酰丝氨酸最优。且磷脂酰丝氨酸在达到并超过100mg/L后，该培养基对精子活力，受精率，囊胚形成率有毒害作用。该实验结果也验证了过量的磷脂酰丝氨酸会间接通过蛋白激酶C调节激活产生过量的磷脂酶A2，导致精子发生自身顶体反应影响受精率。
在专利号为CN111479463A的改善配子活力和功能的组合物中就明确将磷脂酰丝氨酸2mg/mL用于体外受精培育过程中，该剂量明显高于上述结论数。通过实验验证后发现该剂量仅作为磷脂添加物进行考虑，并未发现其对顶体作用的相关影响，则不具有指导意义。
2.2正实验总计
受精卵囊胚形成正试验数据表
受精卵囊胚形成正试验百分表
试验结论：在基础液物料中添加50mg/L连翘酯苷A对精子活力，受精率，囊胚形成率有明显的正向效果；在基础液物料中添加15mg/L磷脂酰丝氨酸，对精子活力，受精率，囊胚形成率也有明显的正向效果。
两种物料共同使用与其单独使用相比，能够显著性提高精子活力，保障受精率，提高囊胚形成率，具有协同作用。
图1-9中，展示了受精卵孵育一天后图像，而图10-18则展示了受精卵孵育五天后图像，进行受精卵囊胚形成试验图像对比。
本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本发明的保护范围应当以权利要求书中界定的为准，并且说明书可以用于解释权利要求书。

Claims (5)

1.一种辅助生殖用洗精受精液，其特征在于：由基础培养物料以及特殊添加物料组成，基础培养物料用于搭建体外受精人工控制的体液环境；特殊添加物料由连翘酯苷A和磷脂酰丝氨酸组成；
其中，连翘酯苷A的添加量为基于培养液总体积的1-100mg/L，而磷脂酰丝氨酸的添加量为基于培养液总体积的1-75mg/L；
所述基础培养物料为氯化钠4000-8000mg/L、氯化钾300-600mg/L、氯化钙150-300mg/L、生物缓冲液300-600mg/L、氢氧化钠150-300mg/L、磷酸二氢钾20-80mg/L、葡萄糖300-700mg/L、牛磺酸10-40mg/L、氨基酸100-400mg/L、丙酮酸钠20-70mg/L、乙二胺四乙酸2-5mg/L和硫酸庆大霉素30-70mg/L。
2.根据权利要求1所述的一种辅助生殖用洗精受精液，其特征在于：所述连翘酯苷A的添加量为基于培养液总体积的25-75mg/L。
3.根据权利要求1所述的一种辅助生殖用洗精受精液，其特征在于：所述连翘酯苷A的添加量为基于培养液总体积的25、50或75mg/L。
4.根据权利要求1所述的一种辅助生殖用洗精受精液，其特征在于：所述磷脂酰丝氨酸的添加量为基于培养液总体积的5-30mg/L。
5.根据权利要求1所述的一种辅助生殖用洗精受精液，其特征在于：所述磷脂酰丝氨酸的添加量为基于培养液总体积的5、15或30mg/L。
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