CN102441005A - 一种抗病毒药物及其制备方法和雄黄在制备抗病毒药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明一种抗病毒药物及其制备方法和雄黄在制备抗病毒药物中的应用，属中医药物技术领域。本发明公开了雄黄在制备治疗抗病毒药物中的应用，其中所述雄黄为雄黄纳米颗粒剂；所述病毒为腺病毒或呼吸道合胞病毒。一种用于治疗抗病毒药物的药物，其中所述药物为雄黄纳米微粒。该药物的制备方法包括：将雄黄原料药用高能球磨机研磨，双蒸水水飞处理，过0.8mm膜；超声10min，再过0.22mm微孔滤器除菌，即得雄黄纳米微粒。本发明公开了雄黄的抗病毒药性，拓宽了传统药物雄黄的药用范围；并为制备抗腺病毒(抗DNA病毒)和呼吸道合胞病毒药物(抗RNA病毒)提供了新的广谱抗病毒中药原料，阐明了雄黄抗病毒的作用机制。

Description

一种抗病毒药物及其制备方法和雄黄在制备抗病毒药物中的应用

技术领域

本发明属中医药物技术领域，具体涉及一种抗病毒药物及其制备方法和雄黄在制备抗病毒药物中的应用技术领域。

背景技术

雄黄，“生山之阳，是丹之雄”，其色从鲜黄到偏红都有，但以黄色居多，故名雄黄，又名黄金石、石黄、鸡冠石等。雄黄是一种天然矿物，常存在于温泉及火山附近，主要产于湖南、贵州、云南等地。

对于雄黄的药用价值，古人早已认识到。早在两千多年前的《神农本草经》中就提出雄黄“主寒热，鼠瘘，恶疮，疽痔，死肌，杀百虫毒”。那时就认识到雄黄具有解毒、杀虫的作用。而李时珍在《本草纲目》中又提出：“雄黄性味辛温有毒，具有解虫蛇毒，燥湿，杀虫，祛痰功效”，进一步认识到雄黄能解蛇虫之毒，且能燥湿祛痰。目前，认为雄黄功效和临床应用主要集中在以下几个方面：

一、避邪民间有饮雄黄酒或将雄黄粉末装入香袋随身佩戴的习俗，以此来驱瘟避邪，预防一些传染病和躲避蛇、蝎侵袭等。

二、解毒雄黄辛散有毒，能“以毒攻毒”“以毒克毒”，被李时珍称为“治疮杀毒要药”。雄黄用于治疗皮肤病，既包括风热湿毒壅遏所致的疮痈疔毒诸证，表现为皮肤的红肿热痛；又包括因感染癣菌而致的脚气、鹅掌风等，以皮肤瘙痒难忍为主证；亦可用于麻风、腋臭、银屑病等一些特殊的皮肤病。此外，雄黄也常常用于预防和治疗毒蛇及蜂、蜈蚣等虫毒咬伤，具有十分显著的疗效。雄黄用于解毒时多以外用为主，可将其研磨成粉，或单用，或调醋、调酒，或配伍其他清热解毒之药共同研末，涂敷于患处即可。但由于雄黄含砷等有毒物质，具有腐蚀作用，因此不宜大面积涂搽及长期持续使用，以防中毒。

三、祛痰雄黄具有显著的燥湿祛痰的功效，主要用于三个方面：一是温肺祛痰，治疗寒痰壅盛的咳嗽、哮喘等支气管疾病，甚至能够根治哮喘；二是祛痰定惊，治疗因痰浊蒙蔽心窍而致神志失常之癫痫者，常与朱砂等同用，等量研末，调水服；三是祛痰截疟，“治疟疾寒热”，但这一功效现在不太常用。

四、杀虫一般认为，雄黄可用于治疗蛔虫等肠道寄生虫引起的虫积腹痛。但由于驱虫药的普及，使用既方便又有效，目前已较少采用雄黄来驱杀肠道寄生虫。不过民间现在还常把雄黄粉末撒在蚊虫容易孳生和繁殖的地方，当作防虫害的药品，还有用作农药杀虫剂的。在《神农本草经》、《药性论》、《日华子本草》、《本草纲目》、《药性解》等17部古籍均有记载。即使在当代依然为常用中药，在中药复方中出现频率较高，《中国药典》收载含雄黄的中成药就有26种，约占药典成方总数的4.6％，我国现行4种国家药物标准中含雄黄的成方制剂数量就达193种。雄黄为矿物类中药，难溶于水，历代关于雄黄的炮制有多种方法，如《黄帝内经》记载用“水磨”法制备雄黄；《神农本草经》提出“炼”法；《肘后备急方》提出“醋制”；《雷公炮炙论》首次提出“水飞”法炮制雄黄；《备急千金要方》提出“油煮三日”；《新修本草》提出“煨制”；《外台秘要》提出“熬制”；《太平圣惠方》提出“干研”。在这些炮制方法中“水飞”法可以去除杂质，洁净药物，使药物质地细腻，便于内服和外用；同时也可以除去药物中可溶于水的毒性物质，如砷、汞等，因此，此法一直沿用至今。但用传统的水飞法来制备雄黄，耗时、毒性大而且颗粒大、吸收度小。

五、抗癌雄黄的主要成分是硫化砷类化合物，而砷是提炼砒霜的主要原料，因此具有较大的毒性。中医认为，癌症乃癌毒所成，对其治疗主张“以毒攻毒”“以毒克毒”，因而雄黄被认为是治疗癌症的理想药物，临症施治常以丸药的形式。现代药理学也证实了雄黄的抗癌作用。

呼吸道合胞病毒(RSV，简称合胞病毒，也属副粘病毒科)是一种RNA病毒，属副粘液病毒科，该病经空气飞沫和密切接触传播，是引起小儿病毒性肺炎最常见的病原，可引起间质性肺炎，及毛细支气管炎。多见于新生儿和6个月以内的婴儿。潜伏期3～7日。婴幼儿症状较重，可有高热、鼻炎、咽炎及喉炎，以后表现为细支气管炎及肺炎。少数病儿可并发中耳炎、胸膜炎及心肌炎等。成人和年长儿童感染后，主要表现为上呼吸道感染。在北京，48％的病毒性肺炎和58％的毛细支气管炎系由合胞病毒引起(1980～1984)；在广州，小儿肺炎及毛细支气管炎的31.4％由合胞病毒引起(1973～1986)；在美国，20％～25％的婴幼儿肺炎和50％～75％的毛细支气管炎由合胞病毒引起。

腺病毒属于双链DNA病毒，是儿童呼吸道感染的主要病原之一，受感染的主要是6个月至2岁的婴幼儿。人腺病毒通常有51个血清型，分为A～F6个亚属(种)。B种腺病毒又分为B1(Ad3、Ad7、Ad16、Ad21和Ad50)和B2(Ad11、Ad14、Ad34和Ad35)。在这些腺病毒中，容易引起婴幼儿肺炎的是3、7、11、14、21血清型，其中3型和7型，特别是7B型往往导致婴幼儿重症肺炎。腺病毒是儿童呼吸道感染常见的病原之一，可引起咽炎、结膜炎、肺炎、脑炎、肠炎等，个别型别的腺病毒还会致癌。腺病毒有较强的传染性，目前尚无抗腺病毒的特效药物。

发明内容

由于目前对雄黄的治病研究仅限于抗癌以及传统的解毒方面，因此限制了雄黄的功效应用，本发明公开了雄黄的一种新的药物用途即雄黄在制备治疗抗病毒药物中的应用。

本发明的另一个目的在于为了提高雄黄生物利用度，提供了一种用于抗病毒药物中的雄黄纳米微粒，“雄黄纳米”是指运用纳米技术制造的，将雄黄制成粒径小于100纳米的一种新型制剂。

本发明的技术方案如下：

雄黄在制备抗病毒药物中的应用。

上述技术方案中所述的雄黄在制备抗病毒药物中的应用，其中，所述抗病毒药物为诱导病毒感染细胞凋亡的药物；即该药物是通过诱导病毒感染细胞凋亡起到抗病毒的作用。

上述技术方案中所述的雄黄在制备治疗抗病毒药物中的应用，其中，所述雄黄为雄黄纳米颗粒剂；其中所述病毒优选为腺病毒或呼吸道合胞病毒；本技术方案中腺病毒属于DNA病毒，呼吸道合胞病毒属于RNA病毒。

上述技术方案中所述的雄黄在制备治疗抗病毒药物中的应用，其中，所述病毒为腺病毒或呼吸道合胞病毒；本技术方案中腺病毒属于DNA病毒，呼吸道合胞病毒属于RNA病毒。

一种抗病毒药物，其中，所述药物为雄黄纳米微粒。

上述技术方案中所述的抗病毒药物，其中，所述雄黄纳米微粒的粒径范围为40～60nm。

上述技术方案中所述的抗病毒药物的制备方法，包括下述步骤：将雄黄原料药用高能球磨机研磨，双蒸水水飞处理，过0.8mm膜；超声10min，再过0.22mm微孔滤器除菌，即得雄黄纳米微粒。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明公开了雄黄通过诱导病毒感染细胞凋亡起到抗病毒药性，拓宽了传统药物雄黄的药用范围；

2、本发明为制备抗腺病毒和呼吸道合胞病毒药物提供了新的广谱抗病毒中药原料；

3、本发明为制备抗DNA病毒和RNA病毒药物提供了新的广谱抗病毒中药原料。

附图说明：

1、图1为雄黄纳米微粒粒度图；

2、图2为腺病毒电泳鉴定结果；

3、图3为呼吸道合胞病毒电泳鉴定结果；

4、图4为正常Hep-2细胞组中Hep-2细胞形态(40×)；

5、图5为腺病毒对照组中Hep-2细胞形态(40×)；

6、图6为雄黄纳米微粒治疗腺病毒组中Hep-2细胞形态(40×)；

7、图7为利巴韦林组治疗腺病毒组Hep-2细胞形态(40×)；

8、图8为正常Hep-2细胞组中Hep-2细胞形态(40×)；

9、图9为呼吸道合胞病毒对照组中Hep-2细胞形态(40×)；

10、图10为雄黄纳米微粒治疗呼吸道合胞病毒组中Hep-2细胞形态(40×)；

11、图11为利巴韦林组治疗呼吸道合胞病毒组中Hep-2细胞形态(40×)；

12、图12为正常Hep-2细胞凋亡；

13、图13为腺病毒感染Hep-2细胞凋亡情况；

14、图14为雄黄纳米微粒大剂量组细胞凋亡情况；

15、图15为雄黄纳米微粒小剂量组细胞凋亡情况；

16、图16为β-actin凝胶电泳图；

17、图17为NF-kB p65凝胶电泳图；

18、图18为AKT凝胶电泳图；

19、图19为p-AKT凝胶电泳图。

具体实施方式：

为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。

实施例1：雄黄纳米微粒的制备及粒度测定：

(一)实验材料：

(1)、药物：雄黄为按《中国药典》2010年版的方法测定，As₄S₄含量91.4％，符合药典规定。

(2)、主要试剂：1mg/ml砷标液：把0.132g As₂O₃溶入25ml 20％的NaOH中，加少量水稀释，以2M HCl稍加酸化，定容至1000ml。钼酸盐试剂：(1)溶解1.0g钼酸铵于100ml 2MH₂SO₄中；(2)溶解0.10g硫酸联氨于100ml水中。临用前，将10ml溶液(1)与10ml溶液(2)混合，并以水稀释至100ml。溶液(1)和(2)都不能存放超过3～4天。

(3)、仪器：高速摆振球磨机(南京大学仪器厂，型号：QM-3A)；英国Malvern NanoSeries粒度测定仪。

(二)雄黄纳米微粒制备及测定方法：

将雄黄用高能球磨机研磨双蒸水水飞处理，过0.8μm膜；超声10min，再过0.22μm微孔滤器除菌，4℃密封保存。取少量制剂，用砷标液消化处理，加入25ml钼酸盐试剂，沸水浴加热10分钟。冷却定容，于800nm处测量其吸光度并在Nano Series粒度测定仪上测定粒度。

(三)、结果：雄黄混悬液的粒径分布及浓度测定

雄黄微粒主要分布在40～60nm，平均粒径(Z-Average)为115.7nm。砷钼蓝染色法测定雄黄纳米微粒浓度为73.4μg/mL，如图1所示。

以下通过本发明实施例制备所得的雄黄纳米微粒的抗病毒药效学试验来说明本发明所公开的雄黄所具有的抗病毒药效：

试验例1：雄黄纳米微粒对Hep-2细胞的毒性实验：

(一)实验材料：

(1)、细胞株：人喉癌细胞(Hep-2)，由中国疾病控制中心病毒病预防控制所提供。

(2)、药物：雄黄按《中国药典》2010年版的方法测定As₄S₄含量91.4％，符合药典规定。利巴韦林(Ribavirin)购于天津药业焦作有限公司，每支100mg/mL。

(3)、主要试剂：甲基噻唑蓝(MTT，美国Amresco公司，批号：0793-250)；二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma公司，批号：0231-100)。

(4)、仪器：CO₂培养箱(美国Thermo生产，型号：318879-15158)；恒温水浴箱(北京市长风仪器仪表公司生产，型号：HW.W21)；酶标仪(美国Thermo生产，型号：MK3)；倒置显微镜(日本Olympus生产，型号：TH4-200)。

(二)实验方法：

(1)、细胞培养：Hep-2细胞用含10％胎牛血清的生长液，37℃5％CO₂培养，3d传代。细胞生长液为MEM(购自美国Thermo，批号：NWA0364)，加10％胎牛血清(购自美国GIBCO，批号：8131650)，100ku·L^-1青霉素，100mg·L^-1链霉素。细胞维持液除需加2％的胎牛血清外，余同细胞生长液。

(2)、雄黄纳米微粒及利巴韦林对Hep-2细胞毒性实验步骤：

将对数生长期Hep-2细胞以2×10⁵个/mL浓度接种于96孔培养板，每孔100μL，37℃，5％CO₂培养24h至细胞长满单层，使用无血清的细胞维持液将73.4μg/mL雄黄纳米微粒稀释成1∶25浓度作为起始浓度开始2倍稀释，1∶25～1∶1600共7个浓度；将100mg/mL利巴韦林稀释成1∶25浓度作为起始浓度进行2倍稀释，稀释成1∶25～1∶1600稀释成7个浓度。每个浓度4个复孔，每孔100μL。同时设病毒对照和正常细胞对照孔，并换细胞维持液，37℃5％CO₂培养箱中培养，每24h在倒置显微镜下观察细胞形态，以病毒对照组+++～++++病变为终点，每孔加入MTT(终浓度为0.50mg/mL)染液20μL，置于37℃，5％CO₂培养箱继续培养4h，当细胞内形成甲赘结晶时，弃染色液，每孔加入150μL DMSO，振荡10min，直至甲赘全部溶解后，在酶标仪490nm波长下测吸光度(A)值，计算各药物浓度下的细胞抑制率，得出最大无毒剂量(TC₀)和半数中毒浓度(TC₅₀)。

(三)数据统计：用概率单位回归法(Probit)方法计算药物半数中毒浓度(TC₅₀)，数据处理用SPSS17.0统计软件完成。

(四)实验结果：雄黄纳米微粒及利巴韦林对Hep-2细胞毒性作用表现为Hep-2细胞变圆，壁厚，胞质中颗粒增加，折光性增强。采用Probit法计算出雄黄纳米微粒及利巴韦林对Hep-2细胞的最大无毒浓度(TC₀)和半数中毒浓度(TC₅₀)，结果见表1。

表1雄黄纳米微粒及利巴韦林对Hep 2细胞的毒性

试验例2：腺病毒和呼吸道合胞病毒的培养、鉴定与半数感染量的确定：

(一)实验材料

(1)、病毒和细胞株：腺病毒3型(HAdV-3)；呼吸道合胞病毒A型(RSV-A)人喉癌细胞(Hep-2)，二者均由中国疾病控制中心病毒病预防控制所提供。

(2)、主要试剂：试剂DNA提取试剂盒：QIAGEN公司；RNA提取试剂盒：Simply P TotalRNA Extraction Kit BioFlux北京博迈斯公司；Promega GoTaq qPCR Master Mix，Promega公司；TaKaRa One Step RNA PCR Kit(AMV)宝生物工程(大连)有限公司；引物和探针有上海生物工程技术公司合成；琼脂糖(Agarose)MEM，Promega公司。细胞生长液为MEM(购自美国Thermo，批号：NWA0364)，加10％胎牛血清(购自美国GIBCO，批号：8131650)，100ku/L青霉素，100mg/L链霉素。细胞维持液除需加2％的胎牛血清外，余同细胞生长液。

(3)、仪器：CO₂培养箱(美国Thermo生产，型号：318879-15158)；恒温水浴箱(北京市长风仪器仪表公司生产，型号：HW.W21)；高速冷冻离心机，日本TOMY公司，MRX-150型；II级生物安全柜，日本HITACHI公司，SCV1303EOII级B型；涡旋式混匀器，美国F isher公司，Genie2TM型；微波炉，日本SHARP公司，R-4V10型；4℃冰箱，日本SANYO公司，MBR-107D型；-70℃冰柜，日本SANYO公司，MDF-592型；倒置显微镜，日本Olympus公司，CK30型；加样器(0～10μL、2～20μL、20～200μL、200～1000μL)，德国Eppendorf公司；电动移液器，德国Eppendorf公司；Eppendorf管、PCR管，Axygen公司；石蜡封口膜，美国Parafilm公司；凝胶成像仪，美国Alpha Innotech公司，AlphaImagerTM2200型；PCR扩增仪，美国PE公司，9700型。96孔细胞培养板，美国FALCON。

(二)实验方法：

(1)、病毒培养：取200μL HAdV-3和200μL RSV病毒加至已换好细胞维持液的Hep-2细胞，37℃5％CO₂培养，当细胞出现病变(CPE)达+++后，收获病毒，-70℃冻存备用。

(2)、引物设计：

针对腺病毒的hexon基因的保守区序列，利用Applied Biosystems的Primerexpress3.0软件设计得到引物，并通过NCBI数据库进行Blast同源性对比验证。上游引物：GGAGCCACVGTGGGRTT；下游引物：CAGGACGCCTCGGRGTAYCTSAG；，扩增长度160bp。

针对呼吸道合胞病毒的F基因的保守区序列，利用Applied Biosystems的Primerexpress3.0软件设计得到引物，并通过NCBI数据库进行Blast同源性对比验证。上游引物：GTTAGTGTCTTAACCAGCAA；下游引物：GTTATAGGCATATCATTGA；，扩增长度247bp。

(3)、腺病毒DNA提取：分别取腺病毒感染的细胞培养物和正常细胞进行反复冻融三次，首先加20ul蛋白酶K到1.5ml的EP管中；其次，加入140ul样本到离心管中；再次，加入200ul Buffer AL到样本中，涡旋15s；56℃水浴10min；瞬离；加入200ul无水乙醇，涡旋15s，瞬离；小心将上一步的液体转移到QIAamp Mini spin column中8000rpm离心1min，弃接液管，更换新的接液管；小心打开离心柱盖子，加入500ul Buffer W18000rmp离心1min，弃接液管，更换新的接液管；小心打开离心柱的盖子，加入500ulBuffer W2，14000rpm离心3min；弃接液管，更换新的接液管，空离1min，14000rpm；将离心柱放入新的1.5ml EP管中，小心加入50ul Buffer AE，室温1min，8000rpm离心1min即得到腺病毒感染Hep-2细胞的总DNA。

(4)、呼吸道合胞病毒RNA提取：

①、将100ul病毒培养物(细胞悬液)加入1.5ml离心管中，加入100ul Solution R1，振荡30s，室温静置1min，进入下一步；

②、加入Slution R2 600ul，充分颠倒混匀，室温静置3-5min，(此步不可离心，取上清时尽量避免吸到悬浮杂质，以避免下步离心时堵塞离心柱；

③、将上清液吸入Spin column，Spin column要套上离心管，12000rpm离心30s；

④、弃去外套管中液体，向Spin column中加入600ul Wash Buffer，12000rpm离心10-30s，弃去接液管中的液体，重复洗涤一次，然后空柱于10000rpm离心1min后将离心柱转移到一个新1.5ml离心管；

⑤、将Spin column移入新的1.5ml离心管中，在膜中央加入Eultion Buffer20-50ul，室温静置1min，12000rpm离心30s，获总RNA.

(5)、腺病毒DNA PCR扩增：

使用Promega GoTaq qPCR Master Mix试剂建立如下反应体系：GoTaq 25μL，Primer 1 1μL，Primer2 1μL，dH₂O 20.5μL，DNA template 2.5μL。PCR管置于PCR扩增仪中进行扩增，反应条件：95℃3min；95℃30s，50℃30s，72℃30s共32个循环；72℃10min，4℃∞。

(6)、呼吸道合胞病毒RNA RT-PCR扩增：

使用TaKaRa One Step RNA PCR Kit试剂建立如下反应体系：H₂O 12.5μL，5 Buffer5μL，Mgcl₂ 2μL，dNTP 0.5μL，AMV 0.5μL，Primer1 0.5μL，Primer2 0.5μL，RNase0.5μL，TaqE 0.5μL，RNA template 2.5μL。反应条件：42℃45min，94℃5min；94℃45s，45℃45s，72℃1min共40个循环；72℃10min 4℃∞。

(7)、腺病毒和呼吸道合胞病毒滴定半数感染量的确定

①、制备细胞：取预先制备好的Hep-2单层细胞培养物，在倒置显微镜下观察，细胞生长状态良好，进行细胞传代。用PBS洗涤单层细胞、用胰酶消化后计数，配制2×10⁵/L的细胞悬液。96孔板标记好细胞接种日期、接种者及细胞类型，用微量加样器将细胞悬液加入微孔中，每孔0.1ml；

②、孵育细胞：将装有细胞悬液的96孔板置于CO₂孵箱中，37℃培养12-18h，使细胞生长成良好的薄单层。

③、接种病毒：用MEM维持液作为稀释液对HAdV-3和RSV分别进行连续10倍递次稀释，如10^-1，10^-2，10^-3～10^-8。从CO₂孵箱取出96孔细胞培养板，将96孔板中生长液全部吸弃，用预温的PBS洗涤细胞2次，0.2ml/孔；将稀释好的病毒依次加入各个微孔，每孔0.1ml，每个稀释度平行做8个复孔，细胞对照孔不加病毒，只加稀释液。

④、观察、记录结果：连续7天在倒置显微镜下观察细胞病变效应(CPE)，并记录病变程度和孔数，以正常细胞作为对照，病毒感染细胞病变达到50％及以上的细胞孔为病变孔，细胞病变小于50％的为非病变孔，HAdV-3按Reed-Muench法计算病毒的TCID₅₀(mediantisse culture infective dosage)；RSV按Karber公式计算病毒的TCID₅₀。

(四)结果：(1)、腺病毒和呼吸道合胞病毒鉴定：鉴定结果如图2和图3所示，Marker的6条参照片断均很清晰，电泳所得条带的分子量与引物分子量相一致，即为目的条带，说明腺病毒和呼吸道合胞病毒培养成功。

HAdV-3和RSV病毒CPE判断标准：“-”表示无细胞病变；“+”表示1/4(25％)以下的细胞有病变；“++”表示1/4-1/2(25％-50％)的细胞有病变；“+++”为1/2-3/4(50-75％)的细胞病变；“++++”表示3/4以上(75-100％)的细胞有病变。

表2Reed Munch法计算TCID₅₀滴度

由表2可见10^-5稀释度病变阳性百分率高于50％，而10^-6稀释度病变阳性百分率低于50％，故50％阳性率介于两者之间，可通过计算距离比例求得，距离比例公式为：距离比例＝(高于50％病变累积阳性率百分数-50)/(高于50％病变累积阳性率百分数-低于50％病变累积阳性率百分数)＝(80-50)/(80-20)＝0.5。高于50％病变累积阳性率百分数的病毒稀释度的对数，为lg10^-5＝5，TCID₅₀＝5.0+0.5＝5.5，故TCID₅₀为10^-5.5/0.1ml。

表3RSV病毒滴定

由表3根据Karber公式计算RSV的半数感染量：RSV logTCID₅₀＝-1-1×(1+1+1+0.75+0.5-0.5)＝-4.75

病毒滴度＝10^-4.75TCID₅₀/0.1ml。

试验例3、雄黄纳米微粒不同给药方式抑制腺病毒和呼吸道合胞病毒感染Hep-2细 胞增殖实验：

(一)、实验材料

(1)、病毒和细胞株：腺病毒3型(HAdv-3型)，呼吸道合胞病毒A型(RSV-A)；人喉癌细胞(Hep-2)。二者均由中国疾病控制中心病毒病预防控制所提供。

(2)、药物：雄黄为按《中国药典》2010年版的方法测定，As₄S₄含量91.4％，符合药典规定。利巴韦林(Ribavirin)购于天津药业焦作有限公司，每支100mg/mL，批号：10092411。

(3)、主要试剂：细胞生长液为MEM(美国Thermo，批号：NWA0364)，加10％胎牛血清(美国GIBCO，批号：8131650)，100ku/L青霉素，100mg/L链霉素。细胞维持液除需加2％的胎牛血清外，余同细胞生长液。

(4)、仪器：CO₂培养箱(美国Thermo，型号：318879-15158)；恒温水浴箱(北京市长风仪器仪表公司，型号：HW.W21)；倒置显微镜(日本Olympus，型号：TH4-200)。

(二)、实验方法

(1)、预防给药方式：将Hep-2细胞以2×10⁵个/mL浓度接种于96孔培养板，每孔100μl、37℃、5％CO₂培养24h至细胞长满单层，弃掉培养液，加入不同浓度的药物，雄黄纳米微粒和利巴韦林用无血清的细胞维持液分别自0.367μg/mL和50μg/mL最大无毒浓度起2倍稀释成0.367μg/mL、0.184μg/mL、0.092μg/mL、0.046μg/mL、0.023μg/mL和50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.13μg/mL各五个浓度，每浓度4孔，每孔100μl，37℃5％CO₂吸附1h，弃药液，加入100TCID₅₀HAdV-3和RSV病毒稀释液，每孔100μl，37℃5％CO₂吸附1h，随后弃病毒稀释液，更换细胞维持液，同时正常细胞对照组和病毒对照组换细胞维持液，37℃5％CO₂培养，每24h在倒置显微镜下观察细胞CPE变化并进行记录(25％以下记+，26％～50％记++，51％～75％记+++，76％～100％记++++)，当病毒对照CPE达75％以上，计算药物对HAdV-3和RSV感染Hep-2细胞的CPE抑制率。

(2)、治疗给药方式：将Hep-2细胞于96孔板培养至单层，弃掉培养液，加100TCID₅₀HAdV-3和RSV病毒稀释液，每孔100μl，37℃5％CO₂吸附1h，弃掉病毒液，加入不同浓度的药物(雄黄纳米微粒0.367μg/mL～0.023μg/mL和利巴韦林50μg/mL～3.13μg/mL)，每孔100μl，37℃5％CO₂吸附1h，随后弃药物，更换细胞维持液，同时设正常细胞对照组和病毒对照组，37℃5％CO₂培养，每24h在倒置显微镜下观察细胞CPE变化并进行记录(方法同预防给药组)，当病毒对照CPE达75％以上，计算药物对RSV感染Hep-2细胞的CPE抑制率。

(3)、直接灭活给药方式：将HAdV-3和RSV病毒稀释液与不同浓度的药物混合，同时设病毒对照组，上述混合液和病毒对照组分别于37℃5％CO₂作用1h后，加至已长满单层Hep-2细胞的96孔板中，每孔100μl，此时100μl的混合液含有100TCID₅₀RSV、100TCID₅₀HAdV-3病毒分别与不同浓度雄黄纳米微粒(0.367μg/mL～0.023μg/mL)和利巴韦林(50μg/mL～3.13μg/mL)相混合，37℃5％CO₂吸附1h，随后弃混合液，更换细胞维持液(包括病毒对照和细胞对照组)，37℃5％CO₂培养，每24h在倒置显微镜下观察细胞CPE变化并进行记录(方法同预防给药组)，当病毒对照CPE达75％以上，计算药物对HAdV-3和RSV感染Hep-2细胞的CPE抑制率。

(四)结果：

(1)、不同给药方式对HAdV-3病毒感染Hep-2细胞病变抑制作用量效关系

以药物剂量对数为横坐标，CPE抑制率为纵坐标，对雄黄纳米微粒及利巴韦林抑制HAdV-3感染Hep-2细胞病变程度进行量-效分析。雄黄纳米微粒和利巴韦林预防、治疗及直接灭活三种不同作用方式剂量对数与HAdV-3感染Hep-2细胞CPE抑制率均呈正相关由此可见，对HAdV-3病毒的抑制作用均存在明显的量效关系。同一剂量雄黄纳米微粒在直接灭活给药方式时对HAdV-3的CPE抑制率更高，说明雄黄纳米微粒对HAdV-3病毒有较好的直接灭活作用。雄黄纳米微粒及利巴韦林对HAdV-3感染Hep-2细胞CPE程度及CPE病毒抑制率影响，结果见表4。

表4不同给药方式下雄黄纳米微粒抑制腺病毒复制作用

(2)、雄黄纳米微粒及利巴韦林不同给药方式下对HAdV-3感染Hep-2细胞的IC₅₀和TI

表5不同给药方式下雄黄纳米微粒和利巴韦林抑制呼吸道合胞病毒的IC₅₀，TI

不同剂量雄黄纳米微粒及利巴韦林在预防、治疗及直接灭活给药方式下，对HAdV-3感染Hep-2细胞病变半数抑制浓度(IC₅₀)和治疗指数(TI)的结果见表5。治疗指数(TI)是衡量药物对病毒抑制的效力，指数大于1说明有效，指数越大，安全范围越大。本研究可以看出，雄黄纳米微粒三种给药方式的治疗指数均大于1，说明这三种方式均有抑制HAdV-3病毒的作用，其中直接灭活及预防给药方式的安全性较利巴韦林更高。

(3)、雄黄纳米微粒不同给药方式对RSV感染Hep-2细胞CPE抑制作用量效关系

以药物剂量对数为横坐标，CPE抑制率为纵坐标，对雄黄纳米微粒及利巴韦林进行量-效分析。雄黄纳米微粒及利巴韦林剂量对数按预防、治疗及直接灭活三种不同给药方式，对RSV感染Hep-2细胞病变的抑制作用均存在明显的量效关系。同一剂量雄黄纳米微粒在治疗给药方式时对RSV的CPE抑制率更高，说明雄黄纳米微粒对已进入Hep-2细胞的RSV有较好的抑制作用。结果见表6。

表6不同给药方式雄黄纳米微粒抑制呼吸道合胞病毒复制的作用

(4)、雄黄纳米微粒及利巴韦林不同给药方式下对RSV的IC₅₀和TI

不同剂量雄黄纳米微粒及利巴韦林在预防、治疗及直接灭活给药方式下，对RSV感染Hep-2细胞病变半数抑制浓度(IC₅₀)和治疗指数(TI)的结果见表7。本研究可以看出，雄黄纳米微粒三种给药方式的治疗指数均大于1，说明这三种方式均有抑制RSV病毒的作用，其中预防及直接灭活给药方式的安全性较利巴韦林更高。

表7不同给药方式雄黄纳米微粒和利巴韦林抑制呼吸道合胞病毒IC₅₀，TI

形态学观察

如图4～7所示，其中图4为正常Hep-2细胞贴壁生长，大小形态均匀；图5为HAdV-3病毒对照组细胞圆缩，出现核内包涵体聚集成串；图6雄黄纳米微粒及图7利巴韦林组病变程度较病毒对照组明显减轻。

如图8-图11所示，其中图8为正常Hep-2细胞贴壁生长，大小形态均匀；图9为呼吸道合胞病毒对照组细胞颗粒增多，细胞肿胀、变圆、融合、折光性减弱等典型的RSV感染Hep-2细胞的CPE表现；图10雄黄纳米微粒及图11利巴韦林组病变程度较病毒对照组明显减轻。

试验例4、荧光定量PCR和RT-PCR检测雄黄纳米微粒腺病毒DNA含量及呼吸道合胞 病毒RNA含量的影响

(一)、实验材料：

(1)、病毒和细胞株：病毒与细胞株：腺病毒3型(HAdV-3)；人喉癌细胞(Hep-2)。二者均由中国疾病控制中心病毒病预防控制所提供。

(2)、药物：雄黄按《中国药典》2010年版的方法测定，As₄S₄含量91.4％，符合药典规定。利巴韦林购于天津药业焦作有限公司，每支100mg·mL^-1，批号：10092411。

(3)、主要试剂与仪器：DNA提取试剂盒：QIAGEN公司；One Step PrimeScriptTM RT-PCRKit(Perfect Real Time)，TaKaRa公司；AB荧光定量试剂盒；引物和探针有上海生物工程技术公司合成。CO₂培养箱(美国Thermo生产，型号：318879-15158)；恒温水浴箱(北京市长风仪器仪表公司生产，型号：HW.W21)；荧光定量PCR仪(美国，ABI公司)。

(二)、方法：

(1)、分组及给药：将Hep-2细胞于细胞培养管中至单层，弃掉培养液，分为8组即：正常细胞2组，HAdV-3病毒对照组、RSV病毒对照组、HAdV-3加雄黄纳米颗粒组及HAdV-3加利巴韦林组、RSV加雄黄纳米颗粒组及RSV加利巴韦林组，每组平行做6个细胞培养管。

(2)、引物、探针及标准品：

针对腺病毒的hexon基因的保守区序列，利用Applied Biosystems的Primerexpress3.0软件设计得到引物，并通过NCBI数据库进行Blast同源性对比验证。探针5’端和3’端分别标记荧光基团ROX和淬灭基团BHQ 2，上游引物：GGAGCCACVGTGGGRTT；下游引物：CAGGACGCCTCGGRGTAYCTSAG；TaqMan探针：ROX-GGTGCAGTTTGCCCGC-BHQ，扩增长度160bp。提取已知冻存的腺病毒细胞分离物DNA作为模板，PCR扩增目的片段，构建T载体，转化DH5α感受态细胞，挑去单克隆菌落扩大培养重组大肠杆菌，提取重组质粒，测序，测序正确的质粒用于腺病毒荧光定量PCR标准品的制备，抽提重组质粒，纯化，检测Ct＝17左右的质粒用Easy Elution进行10倍稀释，作为标准品。

针对呼吸道合胞病毒的N基因的保守区序列，利用Applied Biosystems的Primerexpress3.0软件设计得到引物，并通过NCBI数据库进行Blast同源性对比验证。探针5’端和3’端分别标记荧光基团FAM和淬灭基团Allglo，上游引物：AAGGGATTTTTGCAGGAYTGTTT；下游引物：TCCCCACCGTAACATYACTTG；A-Pro-AllGlo：TGAATGCCTATGGTGCAGG，扩增长度65bp。提取已知冻存的呼吸道合胞病毒细胞分离物RNA作为模板，RT-PCR扩增目的片段，构建T载体，转化DH5α感受态细胞，挑去单克隆菌落扩大培养重组大肠杆菌，提取重组质粒，测序，测序正确的质粒用于呼吸道合胞病毒荧光定量PCR标准品的制备，抽提重组质粒，纯化，检测Ct＝17左右的质粒用Easy Elution进行10倍稀释，作为标准品。

(3)、腺病毒DNA提取：分别取正常细胞组，HAdV-3病毒对照组、HAdV-3加雄黄纳米颗粒组及HAdV-3加利巴韦林组的Hep-2细胞进行反复冻融三次，具体步骤同试验例2。

(4)、呼吸道合胞病毒RNA提取：分别取正常细胞组、RSV病毒对照组、RSV加雄黄纳米颗粒组及RSV加利巴韦林组的Hep-2细胞进行反复冻融三次，具体步骤同试验例2。

(5)、实时荧光定量PCR和RT-PCR：使用TaKaRa荧光定量试剂盒建立HAdV-3如下反应体系：2X one step RT-PCR Buffer  12.5ul，ExTaq HS 0.5ul，Primer1 0.5ul，Primer20.5ul，Probe 1ul，dH₂O 8ul，DNA 2ul。反应管置于ABI 7500荧光PCR检测仪中进行检测，荧光检测模式为ROX荧光，反应条件：95℃2min；95℃5s，60℃30s共40个循环。

使用AB荧光定量试剂盒建立RSV如下反应体系：Buffer 12.5ul，E 1 ul，Primer1 0.8ul，Primer2 0.8ul Probe 2ul，H₂O 2.9ul，RNA template 5ul。反应管置于ABI 7500荧光PCR检测仪中进行检测，荧光检测模式为FAM荧光，反应条件：45℃ 10min，95℃10min；95℃15s，60℃1min共40个循环。

(6)、建立标准曲线与腺病毒初始复制量的确定：以标准品起始模板数为X轴，Ct值为Y轴，得到标准曲线方程Y＝-3.50logX+46.01，r²＝0.985，待测样品的Ct值代入标准曲线方程得出该样品的腺病毒初始复制量。Ct值是PCR循环首先进入指数增长期的循环数，与腺病毒初始复制量成反比，Ct值越小，腺病毒初始复制量越大，腺病毒感染Hep-2细胞病毒含量越高；Ct值越大，腺病毒初始复制量越小，腺病毒感染Hep-2细胞病毒含量越低。

(7)、建立标准曲线与呼吸道合胞病毒初始复制量的确定：以标准品起始模板数为X轴，Ct值为Y轴，得到标准曲线方程Y＝-3.598logX+45.831，r²＝0.989，待测样品的Ct值代入标准曲线方程得出该样品的腺病毒初始复制量。

(8)、统计方法：所有数据以

表示，使用SPSS17.0统计软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，以P＜0.05表示有显著性差异。

(三)、结论：

(1)、各组Hep-2腺病毒初始复制量：与病毒对照组相比，利巴韦林组腺病毒初始复制量明显降低，有显著性差异(P＜0.05)，说明利巴韦林具有抑制腺病毒复制的作用，可作为阳性药物对照组，与病毒对照组相比，雄黄纳米颗粒组腺病毒初始复制量降低，有显著性差异(P＜0.05)，表明雄黄纳米颗粒具有较好的抑制腺病毒复制的作用，结果见表8。

表8各组Hep-2腺病毒初始复制量

注：与病毒组相比△P＜0.05

(2)、各组Hep-2呼吸道合胞病毒初始复制量：与呼吸道合胞病毒对照组相比，利巴韦林组呼吸道合胞病毒初始复制量明显降低，有显著性差异(P＜0.05)，说明利巴韦林具有抑制呼吸道合胞病毒复制的作用，可作为阳性药物对照组，与病毒对照组相比，雄黄纳米颗粒组呼吸道合胞病毒初始复制量降低，有显著性差异(P＜0.05)，表明雄黄纳米颗粒具有较好的抑制呼吸道合胞病毒复制的作用，结果见表9。

表9各组Hep-2呼吸道合胞病毒初始复制量

注：与病毒组相比△P＜0.05

试验例5：MTT法检测不同时间纳米雄黄对HAdV-3感染Hep-2细胞A值的影响

(一)、实验材料：

(1)、病毒和细胞株：病毒与细胞株：腺病毒3型(HAdV-3)；人喉癌细胞(Hep-2)。二者均由中国疾病控制中心病毒病预防控制所提供。

(2)、药物：雄黄按《中国药典》2010年版的方法测定，As₄S₄含量91.4％，符合药典规定。利巴韦林购于天津药业焦作有限公司，每支100mg·mL^-1，批号：10092411。

(3)、主要试剂：MTT[3-(4，6-二甲基噻唑-2-xl)-2，5-乙苯基-四唑溴盐](购自Amresco公司，批号：0793-250)；二甲基亚砜(DMSO)(购自Sigma公司，批号：0231-100)。

(4)、仪器：CO₂培养箱(Thermo，型号：318879-15158)；恒温水浴箱(北京市长风仪器仪表公司，型号：HW.W21)；酶标仪(Thermo，型号：MK3)；倒置显微镜(日本Olympus，型号：TH4-200)。

(二)、实验方法：置备2×10⁵/L的Hep-2细胞悬液，用微量加样器将细胞悬液加入预先标记好的96孔板各微孔中，每孔0.1ml；Hep-2细胞、孵育细胞在96孔板中成单层细胞；置于CO₂孵箱中，37℃培养24h待用。(2)18-24h后，从CO₂孵箱取出96孔细胞培养板，用预温的PBS洗涤细胞1次，0.2ml/孔；甩弃PBS，用100TCID₅₀的腺病毒0.1ml/孔于37℃吸附单层Hep-2细胞2h后，小心吸弃各孔病毒液，用预温的PBS洗涤细胞1次，0.2ml/孔；小心吸弃孔中PBS，然后加入下面稀释的药物。(3)用维持液作为稀释液，将雄黄稀释为最高无毒浓度，接着依此浓度作连续二倍；设利巴韦林(Rib)为阳性药物对照组，，同时设有正常细胞对照组和病毒对照组，每浓度8个复孔。

(4)在37℃，5％CO₂培养箱中分别继续培养24h、48h、72h和120h。于不同时间段，在倒置显微镜下观察CPE后，加入MTT 0.02ml/孔，继续孵育4h；加入DMSO每孔0.15ml，振荡5～15min，待结晶完全溶解，在波长490nm处测A值(OD490)。

(三)、结论：由表10可以看出，在HAdV-3感染Hep-2细胞给药后24h，纳米雄黄0.367μg/mL～0.046μg/mL剂量组，利巴韦林50μg/mL和25μg/mL剂量组A值较病毒对照组明显降低(P＜0.05)，考虑其原因可能与在HAdV-3感染早期纳米雄黄和利巴韦林通过诱导感染细胞凋亡而起到抗病毒的作用有关。给药后48h，纳米雄黄0.367μg/mL～0.046μg/mL剂量组，利巴韦林50μg/mL～12.5μg/mL剂量组，抗HAdV-3作用较明显，细胞活性明显好于病毒对照组(P＜0.05)。纳米雄黄0.367μg/mL和0.184μg/mL剂量组，利巴韦林50μg/mL～12.5μg/mL剂量组抗HAdV-3作用可持续至120h，与病毒对照相比有显著差异(P＜0.05)。

表10不同时间雄黄纳米微粒对HAdV-3感染Hep-2细胞A值的影响

注：△P与病毒组相比P＜0.05

试验例6：Annexin V/PI激光共聚焦显微镜观察纳米雄黄对腺病毒感染早期细胞凋 亡的影响

激光共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)是一种新型高精度的显微镜系统，它是在荧光成像基础上加装激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，使用紫外线或可见光激发荧光探针，对于组织和细胞内部微细胞结构、Ca2+、PH值、膜电位等生理信号和细胞形态变化的观察具有极大的优越性，已广泛应用于荧光定位定量测量、共聚焦图像分析、三维图像重建和活细胞动力学参数等方面。LSCM又称为“细胞CT”，图像的清晰度和分辨率比普通光学显微镜明显升高，在一定程度上推动了细胞生物学的研究进展，借助LSCM的高分辨率和三维重建分析功能，对凋亡细胞的形态学观察和分析提高到一个前所未有的新水平。与传统方法比较，Annexin v联合PI双染色法检测凋亡细胞不需要固定，灵敏性、特异性高，结果更为可靠。其最大特点是检测细胞膜尚未破裂的早期凋亡细胞，并可区别不同的细胞群体，以观察这些细胞群众有无细胞凋亡过程。

(一)、材料与方法

(1)、病毒和细胞株：病毒与细胞株：腺病毒3型(HAdV-3)；人喉癌细胞(Hep-2)。二者均由中国疾病控制中心病毒病预防控制所提供。

(2)、药物：雄黄按《中国药典》2010年版的方法测定，As₄S₄含量91.4％，符合药典规定。利巴韦林购于天津药业焦作有限公司，每支100mg·mL-1，批号：10092411。

(3)、主要试剂：凯基Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(凯基货号：KGA107)

(4)、主要仪器及设备：35mm激光扫描共聚焦显微镜专用培养皿：corning，美国；激光扫描共聚焦显微镜：TCS SP2AOBS，LEICA，德国。

(二)、实验方法：将经Annexin V/PI双染的各组细胞于共聚焦显微镜下检测，以40×荧光显微镜初选视野后，进行动态激光扫描，激发波长为488nm，发射波长为530nm，选择扫描模式为XYt，图像分辨率为512×512像素，进行图像采集。

(1)、将1×10⁵的细胞悬液500μl分别接种于4个Peri皿中，经过24h后将其中三个Peri皿用100TCID₅₀的HAdV-3作用1h后，弃病毒液，用PBS洗2遍；

(2)、分组：正常Hep-2细胞、腺病毒对照组、雄黄纳米微粒大剂量组及雄黄纳米微粒小剂量组。分别用的雄黄纳米微粒大剂量组0.367μg/mL和雄黄纳米微粒小剂量组0.023μg/mL加入步骤1制备好的Peri皿中，作用1h后，用PBS洗2遍，换MEM维持液1ml，置37℃CO₂孵箱培养24h；

(3)、用PBS洗涤细胞2次；在500μl Binding Buffer中加入5ul AnnexinV-FITC，5ul Propidium Iodide混匀；

(4)、将步骤3中的混合液加至Peri皿培养的细胞表面；

(5)、避光，室温反应5min，上激光共聚焦显微镜进行细胞凋亡观察；

(三)、结果：磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserinc，PS)在正常细胞中只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡早期，细胞膜内外的不同的磷脂基团重新分布，PS外翻。Annexin V是分子量为35-36kD的Ca依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS高亲和力特异性结合，它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此，Annexin V能区分PS暴露和未暴露的细胞，而不能区分凋亡细胞和坏死细胞。PI是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜与细胞核结合呈现红色。将AnnexinV与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞，区分开来。本实验采用FITC-Annexin V/PI双染法激光共聚焦显微镜观察正常细胞Annexin V和PI均低染，局部视野细胞膜呈绿色荧光，说明存在早期凋亡；病毒对照组部分视野细胞膜Annexin V高染，少许细胞核PI高染，细胞凋亡范围较少，主要是细胞凋亡早期；与正常细胞对照组相比无明显差异；雄黄纳米颗粒大剂量组和雄黄纳米颗粒小剂量组均呈现Annexin V和PI均高染，细胞膜呈绿色荧光，细胞核呈红色荧光，两组药物均主要是中、晚期细胞凋亡，其中雄黄纳米颗粒大剂量较雄黄纳米颗粒小剂量细胞凋亡更为明显。如图12～15所示，其中图12为正常Hep-2细胞，图13为腺病毒对照组，图14为雄黄纳米微粒大剂量组，图15为雄黄纳米微粒小剂量组。

试验例7：Western-blot法检测雄黄纳米微粒对腺病毒感染Hep-2细胞PI3-K通路 的影响

(一)、实验材料：

(1)、病毒和细胞株：病毒与细胞株：腺病毒3型(HAdV-3)；人喉癌细胞(Hep-2)。二者均由中国疾病控制中心病毒病预防控制所提供。

(2)、药物：雄黄按《中国药典》2010年版的方法测定，As₄S₄含量91.4％，符合药典规定。利巴韦林购于天津药业焦作有限公司，每支100mg·mL^-1，批号：10092411。

(3)主要试剂：丙烯酰胺，双丙烯酰胺，丽春红，十二烷基硫酸钠，β-巯基乙醇，蛋白质分子量Marker，硝酸纤维素膜、感光胶片等。一抗AKT、p-AKT和NF-kB p65均为兔单克隆抗体(美国CST公司)。二抗为辣根酶标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥公司)。

(4)、主要实验仪器：

稳压稳流电泳仪(美国Bio-Rad)；垂直电泳槽(美国Bio-Rad)；半干转电转印仪(美国Bio-Rad)；数码凝胶成像系统(BINTA公司)；计算机图像分析仪(Image-Pro PlusAnalysis Soft ware)；4℃低温高速离心机(美国Thermo)、常温高速离心机(德国eppendorf)；电子天平(德国Sartouris)；紫外分光光度计(德国Biophotometer)；微量加样器(德国eppendorf)；恒温水浴箱(上海)；液氮及便携式标本贮藏罐(四川)

(二)、实验方法

将Hep-2细胞于细胞培养管中至单层，弃掉培养液，分为4组即：正常Hep-2细胞、腺病毒对照组、雄黄纳米微粒大剂量组及雄黄纳米微粒小剂量组。分别用的雄黄纳米微粒大剂量组0.367μg/mL和雄黄纳米微粒小剂量组0.023μg/mL进行处理。

(1)、Western-blot所需试剂

(1)、蛋白裂解缓冲液：50mmol/L Tris.cl(pH8.0)，150mmol/L NaCl，0.025％NaN3(叠氮钠)，0.1％SDS，100μg/ml PMSF(苯甲基磺酰氟)，1μg/ml Aprotinin，0.5％去氧胆酸钠，0.1％NP-40。

(2)、A液(30％丙烯酰胺贮存液)：称取丙烯酰胺29.0克，N，N-亚甲双丙烯酰胺1克，加H2O至100ml，储于棕色瓶中，4℃避光保存，注意PH不得小于7.0。

B液(浓缩胶缓冲液)：称取6g Tris溶于40ml H2O中，用1mol/L HCl(约48ml)调至pH 6.8，再加水稀释到100ml的终体积，即成PH 6.8、0.5mol/L Tris-HCl缓冲液。过滤后于4℃保存。

C液(分离胶缓冲液)：称取36.6克的Tris和48ml 1mol/L HCl混合，加水稀释至100ml的终体积。即成pH 8.8、3mol/L Tris-HCl缓冲液。过滤后于4℃保存。

D液(电极缓冲液储液)：称取30.3g Tris，144g甘氨酸，10g SDS，用蒸馏水溶解至100ml，即成0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸电泳缓冲储液。临用前稀释10倍。

E液：1克SDS溶于10mlH2O中，即成10％SDS溶液。

F液：10％过硫酸铵(AP)，宜当天配制，最多不超过一周。

G液：TEMED原溶液。

H液(样品缓冲液)：按下方配制：①B液8ml；②甘油6.4ml；③E液12.8ml；④二巯基乙醇3.2ml；⑤0.05％溴酚蓝1.6ml；⑥蒸馏水32.0ml，混匀备用。

I液(10％SDS-PAGE分离胶)：30％丙烯酰胺贮存液6.65ml，分离胶缓冲液5ml，去离子水8.25ml，10％过硫酸铵溶液150μl，TEMED 20μl，总体积约20ml，混匀后立即使用。

J液(5％浓缩胶)：丙烯酰胺贮存液2.10ml，浓缩胶缓冲液3.76ml，去离子水9.0ml，10％过硫酸铵溶液45μl，TEMED 15μl，总体积约15ml，混匀后立即使用。

(3)、0.45μm硝酸纤维素膜：美国Millipore公司

(4)、转移缓冲液：3g Tris碱、1g SDS和14.4g甘氨酸，再加200ml甲醇，补充蒸馏水定容至1L。

(5)、考马斯亮蓝G250液(固定染色液)：考马斯亮蓝G2501.25克，230ml甲醇，230ml蒸馏水，40ml冰乙酸，混合使用。

(6)、脱色液：230ml甲醇，230ml蒸馏水，40ml冰乙酸，混合使用。

(7)、封闭缓冲液：含5％脱脂奶粉、0.01％防沫剂，0.025％NaN3溶于TBS-T缓冲液。

(8)、5×TBS缓冲液：12.1g Tris碱，40g NaCL溶于双蒸水中，用浓HCL调PH值至7.6后，用双蒸水定容至1L。

(9)、TBS-T漂洗液：含0.1％Tween-20的TBS。

(10)、蛋白质Marker：美国MBI公司

(11)、显影液、定影液：保定乐凯照相化学有限公司。

(2)、Western-blot测定方法

①、细胞蛋白提取及蛋白定量

倒掉培养瓶中的细胞培养液，用冷的PBS清洗细胞，重复3次，每瓶细胞加入200ul细胞裂解液，冰上放2min，然后用细胞刮刀将培养瓶中细胞刮下，用移液器吸取裂解的蛋白，放入离心管中，冰上放10min，然后4℃，10000r/min离心10min，将上清移至另一预冷的EP管中，沉淀弃之，Bradford法测定蛋白含量后，将剩余蛋白样品加入等体积的2×SDS上样缓冲液，沸水中煮5min。

②、制胶及上样

配制10％SDS-PAGE分离胶溶液，混匀后立即将其注入边条厚度为2mm的垂直放置后倾掉去离子水层，用吸水纸吸净胶上的残存水。插入加样梳，缓缓加入5％浓缩胶，室温下静置。待凝胶完全凝结后撤去其下方的边条，将制备好的凝胶玻璃板垂直固定于凝胶电泳仪上，电泳仪的上下两槽分别加入电泳缓冲液使其没过凝胶水平。小心拔去加样梳，以电泳缓冲液冲洗加样孔数次。分别取40μg蛋白量的组织总蛋白样品及蛋白质分子量Marker，按1∶4体积比加入5×样品缓冲液，以1×样品缓冲液配平上样体积后，于沸水浴中煮5min使蛋白变性。将处理好的样品按按照预定的顺序加入浓缩胶的上样孔内。

③、电泳

接通凝胶电泳仪的电源，初始电压80V。溴酚蓝染料的前缘进入分离胶上缘后提高电压至100V，继续电泳直至溴酚蓝泳出分离胶的下缘。

④、蛋白质的电转移和膜封闭

剪6张与电泳凝胶大小一致的Whatman 3mm滤纸和一张PVDF膜，用转移缓冲液浸泡15min。采用半干电转移仪进行蛋白质的电转移。恒流30mA，电转90min。转移结束后，PVDF膜取出标记膜的方向。用5％TBS-T脱脂奶粉封闭，室温振荡60min。

⑤、抗原抗体反应及显影

封闭结束后，用TBS-T漂洗液洗膜10min×3次，将膜移入杂交袋中，加入用适当漂洗液稀释的抗体(AKT、p-AKT和NF-kB p65的一抗稀释度为分别为1∶2000、1∶1000和1∶2000)，封口，4℃孵育过夜；再用大量TBS-T漂洗液洗膜10min×3次，然后将PVDF膜移入另一新的杂交袋，加入漂洗液稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗(AKT、p-AKT和NF-kB p65的二抗稀释度均为1∶2000)，37℃振荡60min，大量TBS-T漂洗液洗膜10min×3次；将PVDF膜置ECL混合液中于室温下振荡温育5分钟，每平方厘米膜片至少使用0.125mlECL混合液以覆盖全膜片，用平头镊钳住膜片，垂直置于吸水纸以吸去过量试剂，置膜片于两层保鲜膜之间，小心赶尽气泡。将膜片吸附蛋白面朝上，置于X光片盒中，于暗室中压上X光片，感光数分钟，将已暴光的胶片放入显影液中显影，直至出现清晰影像，然后将胶片转入清水中漂洗片刻，立即将胶片放入定影液中定影。最后清水冲洗，晾干保存。

(三)实验结果

PI3-K由一个分子量为110kDa的催化亚基和一个分子量为85kDa的接头亚基组成。当一些生长因子，例如胰岛素、胰岛素样生长因子-1、成纤维细胞生长因子-2等结合到细胞膜受体上时，p85亚基就会作用到受体的碳端部分(细胞内)，然后与P110亚基结合，激活PI3-K激酶。PI3-K的下游是PKB/Akt和PLCγ，它们能够刺激细胞的增殖。实验结果表明雄黄纳米微粒大剂量组和小剂量组能够明显促进腺病毒感染早期细胞凋亡，说明PI3-K/Akt信号级联反应参与了诱导腺病毒感染细胞凋亡的过程。核因子κB(nuclearfactor-κB，NF-κB)是广泛存在于胞浆中的一种快反应转录因子，通常以p65-p50二聚体的形式存在，与抑制物IκB(inhibitor of NF-κB，IκB)结合而呈非活性状态。NF-κB信号转导途径能被TNF-α、IL-1、神经生长因子等多种因素激活。激活后，IκB发生磷酸化和泛化，接着被蛋白酶降解。IκB的降解使得NF-κB能够进入核内，与DNA上的特异位点(κB位点)结合，调节包括生长因子、转录因子、细胞素、趋化因子、抗凋亡蛋白等在内的基因转录。研究表明，NF-κB信号转导途径参与了炎症、细胞凋亡、免疫反应以及肿瘤等的病理过程。在本实验雄黄纳米微粒亦能通过抑制核因子NF-κB p65蛋白的表达而起到抗病毒的作用。结果如图16～19所示，其中图16为β-actin，图17为NF-kB p65，图18为AKT，图19为p-AKT。

试验例8：荧光定量RT-PCR法检测雄黄纳米微粒对腺病毒感染Hep-2细胞FasL、P53、 Bcl-2、Bax基因表达的影响：

(一)实验材料

(1)、病毒和细胞株：病毒与细胞株：腺病毒3型(HAdV-3)；人喉癌细胞(Hep-2)。二者均由中国疾病控制中心病毒病预防控制所提供。

(2)、药物：雄黄按《中国药典》2010年版的方法测定，As₄8₄含量91.4％，符合药典规定。利巴韦林购于天津药业焦作有限公司，每支100mg·mL^-1，批号：10092411。

(3)、主要试剂：Trizol试剂盒：购自Invitrogen公司；M-MLV反转录试剂盒：购自Takara公司；Real-time PCR扩增试剂盒：购自北京中原公司；Agarose：购自Promega公司；DEPC：购Sigma公司；100bp DNA Ladder：购自北京全式金生物技术有限公司

PCR引物：生工生物工程(上海)有限公司

(4)、主要仪器：Real-Time PCR仪(美国ABI 7500)；稳压稳流电泳仪(美国Bio-Rad)；数码凝胶成像系统(BINTA公司)；计算机图像分析仪(Image-Pro Plus Analysis Software)；4℃低温高速离心机(美国Thermo)；电子天平：BS224S(德国Sartouris)；核酸紫外分光光度计(德国Biophotometer)；液氮及便携式标本贮藏罐

(二)、实验方法

将Hep-2细胞于细胞培养管中至单层，弃掉培养液，分为4组即：正常Hep-2细胞、腺病毒对照组、雄黄纳米微粒大剂量组及雄黄纳米微粒小剂量组。分别用的雄黄纳米微粒大剂量组0.367μg/mL和雄黄纳米微粒小剂量组0.023μg/mL进行处理。

(1)、细胞总RNA提取物的获取：

取出细胞，用预冷的PBS洗3次，吸干PBS，加入1ml TRIzol，放入离心管。

a.以0.2ml/ml Trizol的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒，待充分乳化溶液呈乳白状，室温放置2-3min。

b.4℃12000xg离心15min。离心后溶液分为三层，由下至上为：淡粉的酚仿层、中间白色蛋白层和澄清的水相，RNA在水相中，约500μl。

c.取上层水相于一新的离心管，按0.5ml/ml Trizol的比例加入异丙醇，室温放置20min。

d.4℃12000g离心10分钟。RNA沉淀后呈胶状片层。

e.弃上清，按1ml/ml Trizol液加入75％乙醇(DEPC水配制)。

f.轻轻上下翻转，4℃7500xg离心5min。

g.小心弃上清，室温干燥3min。

h.将RNA溶于30-50ul DEPC水中。

i.核酸紫外分光光度计测定经稀释的RNA提取物的OD值和浓度，判断RNA纯度，计算RNA浓度。

j.RNA样品长期保存于-80℃冰箱。

(2)、RNA的体外反转与Real-Time PCR

①、将下列反转录体系加入0.5ml的离心管中。

反转录体系：

RNA                      3μl

Oligo(dT)                1μl

dd H2O(DEPC处理)         9.5μl

以上首先70℃孵育5min，然后迅速放在冰上。

②、以上42℃孵育60min，然后70℃10min。

③、将所得的cDNA与下列Real-Time PCR体系加入0.2ml的离心管中混匀，Real-Time PCR体系：

Real-Time PCR程序设置：首先94℃预变性15min；94℃15s，60℃34s，72℃15s，40个循环；72℃10min。

(三)实验结果

P53，FasL，bax为促凋亡蛋白，bcl-2为抑制凋亡蛋白，从上表可以看出雄黄可以在基因水平通过作用于PI3-K通路使促凋亡蛋白P53，FasL，bax升高，抑制凋亡蛋白bcl-2降低，诱导腺病毒早期感染细胞凋亡，而起到抗病毒的作用。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (8)

1.雄黄在制备抗病毒药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的雄黄在制备抗病毒药物中的应用，其特征在于：所述抗病毒药物为诱导病毒感染细胞凋亡的药物。

3.根据权利要求1或2所述的雄黄在制备治疗抗病毒药物中的应用，其特征在于：所述雄黄为雄黄纳米颗粒剂。

4.根据权利要求3所述的雄黄在制备治疗抗病毒药物中的应用，其特征在于：所述病毒为腺病毒或呼吸道合胞病毒。

5.根据权利要求1或2所述的雄黄在制备治疗抗病毒药物中的应用，其特征在于：所述病毒为腺病毒或呼吸道合胞病毒。

6.一种抗病毒药物，其特征在于：所述药物为雄黄纳米微粒。

7.根据权利要求6所述的抗病毒药物，其特征在于：所述雄黄纳米微粒的粒径范围为40～60nm。

8.权利要求6或7所述的抗病毒药物的制备方法，包括下述步骤：将雄黄原料药用高能球磨机研磨，双蒸水水飞处理，过0.8mm膜；超声10min，再过0.22mm微孔滤器除菌，即得雄黄纳米微粒。

Images