CN104257701A

CN104257701A - 一种制备灵芝三萜类化合物的方法

Info

Publication number: CN104257701A
Application number: CN201410496698.0A
Authority: CN
Inventors: 王成忠; 袁亚光; 赵晓红; 周晓
Original assignee: Qilu University of Technology
Current assignee: Shandong Xiancao Biotechnology Co ltd
Priority date: 2014-09-25
Filing date: 2014-09-25
Publication date: 2015-01-07
Anticipated expiration: 2034-09-25
Also published as: CN104257701B

Abstract

本发明属于天然产物提取技术领域，特别公开了一种制备灵芝三萜类化合物的方法。本发明采用超高压联合固相萃取技术制备灵芝三萜类化合物，主要包括烘干粉碎、超高压处理、过滤收集、固相萃取、旋蒸、真空冷冻干燥等步骤。本发明相比传统浸提方法，节省90%以上的时间，且三萜提取率有所增加，提高了经济效益；溶剂回收利用，节省了溶剂用量，环保无污染；采用固相萃取，灵敏度高，节省大量的溶剂，可实现自动化批量处理。

Description

一种制备灵芝三萜类化合物的方法

（一）技术领域

本发明属于天然产物提取技术领域，特别涉及一种制备灵芝三萜类化合物的方法。

（二）背景技术

灵芝是一种担子菌纲多孔菌科灵芝属的真菌，其又有仙草、瑞草之称，自古就作为一种滋补强壮、扶正固本的名贵中药在亚洲国家被广泛使用。随着灵芝人工培育的成功，以及批量化生产的实现，灵芝的可食用性已被普遍接受。在2000年版的《中国药典》中首次承认了灵芝的药用价值。经科学证明，灵芝中含有多种有效成分，主要包括多糖类、三萜类、生物碱类、核苷类、呋喃类衍生物、多肽氨基酸类、甾醇类、油脂类、有机锗和无机离子等，其中，三萜类作为灵芝中的重要成分，也是鉴定灵芝相关商品质量及品质的重要指标和保证，其活性越来越受到人们的关注。灵芝三萜类化合物属于高度氧化的羊毛甾烷衍生物，有较高的脂溶性，且存在于灵芝的中性组分和酸性组分中。在灵芝三萜类化合物中，主要以四环三萜和五环三萜为主，分子量一般为400-600，结构中一般有羟基，且在紫外光谱中呈现多个波长的特征吸收。药理研究证明灵芝三萜具有抗肿瘤、增强免疫力、抗HIV-1型病毒、解毒、降血脂、降血糖、降低胆固醇、护肝和改善记忆力等功能。

随着灵芝三萜的开发研究，其提取方法亦越来越多，传统的方法主要有溶剂浸提法和回流提取。灵芝三萜类化合物结构特性，决定了其难溶于水、易溶于有机溶剂、性质不稳定的特点，因此一般常选用乙醇、氯仿等有机溶剂在常温或高温下进行粗提。但传统提取方法存在溶剂浪费、耗能耗时等缺点，已逐渐被新兴的超声波、微波等提取技术所代替。其中以超声波循环处理作为辅助手段，有效减少了各种溶剂的用量及提取时间，使灵芝三萜类物质的提取率有所提高。但这些方法都存在着周期长、提取率不高、有效成分破坏大等不足之处。超高压技术是近年来发展较快的一种新型的加工技术，起源于美国，且在食品灭菌、蛋白质改性等方面都得到了很好的应用。部分产品，如果酱、果汁已经得到上市，预示了超高压目前已经实现产业化。利用超高压技术提取灵芝中三萜，方法新颖简便，极大缩短了提取的时间，减小了有效成分的损失，在当今高速经济发展的社会是非常有必要的。另外固相萃取作为一种新型处理技术，既节省溶剂用量，又能快速将样品进行纯化富集，有着广泛的应用前景。

灵芝三萜作为灵芝中的活性成分，有着不菲的药用研究价值，但其含量非常低，提取耗时，原料需求量大，尚未投入到实际工业生产中。因此，合理利用有效资源，节省提取时间，实现灵芝三萜的工业化生产，具有十分重要的意义。

（三）发明内容

本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种提取步骤简单、提取时间短，生产能耗低的制备灵芝三萜类化合物的方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种制备灵芝三萜类化合物的方法，以灵芝子实体为原料，包括如下步骤：

（1）将灵芝子实体置于烘箱中烘干后粉碎，与水和乙酸乙酯混合，并装入塑料袋中真空封口；

（2）将塑料袋放入超高压设备中，调节压力为100-500MPa，在25-55℃下处理5-25min，卸压后收集乙酸乙酯层，得到灵芝浸提液；

（3）将灵芝浸提液过固相萃取柱，以乙腈-5%甲醇溶液作为洗脱剂进行纯化、富集，得到灵芝三萜；

（4）将灵芝三萜通过旋转蒸发仪挥干并回收溶剂，真空冷冻干燥处理，得到产品灵芝三萜提取物。

本发明采用超高压联合固相萃取技术制备灵芝三萜类化合物，主要包括烘干粉碎、超高压处理、过滤收集、固相萃取、旋蒸、真空冷冻干燥等步骤。

对比专利CN1560072中提取灵芝三萜需2-4小时，本发明有效地解决了所存在的严重耗时问题，时间缩短到5min；对比专利CN102772448A、CN10530436，本发明有效地简化了提取分离步骤，一次性将灵芝三萜和多糖分离提取；采用固相萃取技术，灵敏度高，节省了溶剂用量，减少了生产能耗，且得率显著提高，大约在3.2%左右。

最终制得的灵芝三萜含量的测定方法为：利用高氯酸-香草醛冰乙酸显色法。回收后的溶剂可循环用于灵芝三萜的提取，节省溶剂的用量。步骤（2）中将初次过滤后乙酸乙酯层为三萜提取液，而水层为灵芝多糖，一次将灵芝三萜和多糖提取，简化了步骤。

本发明的更优方案为：

步骤（1）中，将灵芝子实体置于烘干箱中，在40℃下烘干8小时，经中药粉碎机粉碎，过10目筛与水和乙酸乙酯混合，使灵芝粉与水和乙酸乙酯的料液比为1g：20mL：10mL。

步骤（2）中，超高压设备的压力为300MPa，在45℃下处理5min，得到灵芝浸提液。

步骤（3）中，灵芝浸提液通过固相萃取柱时，调节其pH为4，控制其流速为12mL/min先以体积比为1:9的乙腈-5%甲醇洗脱除杂，再以体积比为9:2的乙腈-5%甲醇进行洗脱，纯化富集灵芝三萜。

本发明的有益效果：

（1）使用超高压设备处理时，可同时将灵芝三萜和灵芝多糖提取，且时间仅用5min，相比传统浸提方法，节省90%以上的时间，且三萜提取率有所增加，提高了经济效益；

（2）溶剂回收利用，节省了溶剂用量，环保无污染；

（3）采用固相萃取，灵敏度高，节省大量的溶剂，可实现自动化批量处理。

（四）具体实施方式

下面结合实施例对本发明的方法作进一步说明，但不限于此。实施例中使用的灵芝子实体由山东广义灵芝养殖专业合作社提供，水分含量为10.3%，超高压处理设备由天津市华森淼淼生物工程技术有限公司购入。

实施例1：

（1）超高压处理前准备

将灵芝子实体置于烘干箱中40℃烘干8小时，经中药粉粹机粉碎过10目筛。取2g灵芝粉末，以加入水和乙酸乙酯，并装入塑封袋中真空封口。

（2）料液比的确定

分别按料液比1:10:10、1:20:10、1:10:20将灵芝粉末与水、乙酸乙酯混合于塑封袋中，放入超高压设备中，调节压力为300MPa,在室温下处理5min，分别测定灵芝浸提液中三萜的含量，得率分别为1.98%、2.12%、1.72%，多糖的得率分别为1.79%、1.97%、1.82%。实验结果表明，当料液比为1:20:10（原料：水：乙酸乙酯）时，灵芝三萜和多糖的得率最高。

（3）最佳压力的选择

将塑封袋放入超高压设备中，调节压力分别为100、200、300、400、500MPa,在室温下处理5min，分别测定灵芝浸提液中三萜的含量，得率分别为1.99%、2.09%、2.15 %、2.08 %、2.00 %，实验结果表明，当压力为300MPa时，灵芝三萜的得率最高。

（4）最佳保压时间的选择

将样品放于超高压设备中，设定压力为300MPa, 室温下分别处理样品5、10、15、20、25min，结果显示灵芝三萜得率分别为2.22%、2.20%、2.21%、2.19%、2.20%，因此选择保压时间为5min即可。

（5）最适提取温度的选择

将样品放于超高压设备中，设定压力为300MPa,分别在温度25、35、45、55℃下保压5min，测得灵芝三萜的得率分别为2.19%、2.23%、2.25%、2.21%，因此选择45℃为最优提取温度。

（6）固相萃取条件的选择

将超高压处理后的样品过滤，收集乙酸乙酯层三萜过固相C₁₈柱，分别以乙腈-5%甲醇9:2、4:1、7:3、1:9比例分别进行洗脱。测得灵芝三萜相对含量依次为85%、80%、65%、8%。因此，先用乙腈-5%甲醇以1:9洗脱除杂，再以乙腈-5%甲醇9:2进行洗脱，纯化富集灵芝三萜。同时，调节pH分别为2、4、6进行洗脱，测得相对含量分别为50%、80%、40%。因此最佳pH为4。控制流速为4、8、12、15mL/min，测定相对含量为80%、82%、84%、78%，因此选择流速为12mL/min即可。依次将得到的纯化液于旋转蒸发仪中挥干并回收溶剂，所得残渣进行真空冷冻干燥。测定灵芝三萜得率为3.25%。

实施例2：

（1）将灵芝子实体于40℃烘箱中烘干8小时，用中药粉碎机粉碎成粉末状后过10目筛；

（2）准确称取2g灵芝子实体粉末，以1：20：10的料液比加入水和乙酸乙酯，并装入塑封袋中真空封口，放置于超高压设备中；

（3）设定压力为295MPa, 温度为45℃，进行超高压处理5min；

（4）卸压后取出塑封袋，将超高压处理后的样品过滤，收集乙酸乙酯层三萜作为样品。先后用等柱体积的甲醇、乙腈、水淋洗固相柱使之活化，然后将样品与水混溶后取一倍柱体积过固相萃取C₁₈柱，调节pH为4，控制流速12mL/min, 先以乙腈-5%甲醇1:9洗脱，再换比例9:2洗脱，收集纯化液并转入旋转蒸发仪中挥干；

（5）以齐墩果酸标准品为对照，采用高氯酸-5%香草醛冰乙酸显色法测定灵芝中三萜化合物的吸光度，从而计算灵芝三萜的含量及得率为3.23%。

实施例3：

（1)将灵芝子实体于40℃烘箱中烘干8小时，用中药粉碎机粉碎成粉末状后过10目筛；

（2）准确称取2g灵芝子实体粉末，以1：18：10的料液比加入水和乙酸乙酯，并装入塑封袋中真空封口，放置于超高压设备中；

（3）设定压力为295MPa, 温度为45℃，进行超高压处理5min；

（4）卸压后取出塑封袋，将超高压处理后的样品过滤，收集乙酸乙酯层三萜作为样品。先后用等柱体积的甲醇、乙腈、水淋洗固相柱使之活化，然后将样品与水混溶后取一倍柱体积过固相萃取C₁₈柱，调节pH为4，控制流速12mL/min,,先以乙腈-5%甲醇1:9洗脱，再换比例9:2洗脱。收集纯化液并转入旋转蒸发仪中挥干；

（5）以齐墩果酸标准品为对照，采用高氯酸-5%香草醛冰乙酸显色法测定灵芝中三萜化合物的吸光度，从而计算灵芝三萜的含量及得率为3.16%。

Claims

1.一种制备灵芝三萜类化合物的方法，以灵芝子实体为原料，其特征为，包括如下步骤：（1）将灵芝子实体置于烘箱中烘干后粉碎，与水和乙酸乙酯混合，并装入塑料袋中真空封口；（2）将塑料袋放入超高压设备中，调节压力为100-500MPa，在25-55℃下处理5-25min，卸压后收集乙酸乙酯层，得到灵芝浸提液；（3）将灵芝浸提液通过固相萃取柱，以乙腈-5%甲醇溶液作为洗脱剂进行纯化、富集，得到灵芝三萜；（4）将灵芝三萜通过旋转蒸发仪挥干并回收溶剂，真空冷冻干燥处理，得到产品灵芝三萜提取物。

2.根据权利要求1所述的制备灵芝三萜类化合物的方法，其特征在于：步骤（1）中，将灵芝子实体置于烘干箱中，于40℃下烘干8小时，经中药粉碎机粉碎，过10目筛与水和乙酸乙酯混合，使灵芝粉与水和乙酸乙酯的料液比为1g：20mL：10mL。

3.根据权利要求1所述的制备灵芝三萜类化合物的方法，其特征在于：步骤（2）中，超高压设备的压力为300MPa，在45℃下处理5min，得到灵芝浸提液。

4.根据权利要求1所述的制备灵芝三萜类化合物的方法，其特征在于：步骤（3）中，灵芝浸提液过固相萃取柱时，调节其pH为4，控制其流速为12mL/min先以体积比为1:9的乙腈-5%甲醇洗脱除杂，再以体积比为9:2的乙腈-5%甲醇进行洗脱，纯化富集灵芝三萜。