CN104606276A - 一种从柿叶中提取小分子柿叶黄酮的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药用活性成分的提取技术领域，特别涉及一种从柿叶中提取小分子柿叶黄酮的方法，该方法先将柿叶酶解，然后进行水提，再以体积比4:1:2:5的正己烷、乙酸乙酯、正丁醇、水作为两相溶剂体系在高速逆流色谱仪上进行液-液色谱分离纯化，制得小分子柿叶黄酮。本发明方法可制备纯度高的小分子柿叶黄酮，且工艺简单，制备成本较低。
Description
技术领域
本发明属于药用活性成分的提取技术领域，特别涉及一种从柿叶中提取小分子柿叶黄酮的方法。
背景技术
柿树在我国已有三千余年的栽培史。柿树全身是宝：果实是人们喜爱的水果；根、叶、花、果实、宿存花粤(柿蒂)等均可入药。据文献报道，柿叶中含有维生素C、黄酮类成分、胡萝卜素等。由于柿叶的营养、疗效作用，我国在十多年前就开发了柿叶茶，除在国内销售外，还出口日本。临床报道柿叶提取物用于止血，治疗血小板减少性紫癜，软化血管，防治动脉硬化、冠心病、心绞痛有明显的生理活性。据国外杂志报道柿叶中含有大量黄酮类化合物。黄酮类化合物具有抗过敏、降血压、抗炎、抗茴、抗肿瘤、保肝和降血脂等活性，在食品工业上可用作抗氣化剂、色素等，在医学上可治疗冠心病、脑血栓和消除自由基。
众多科研人员对于从柿叶中提取黄酮类物质的研究不计其数，如申请号为201110003597.1的中国发明专利公开了一种从柿叶提取含量为85～98％的柿叶黄酮的方法，它是将柿叶破碎，用2～10倍的PH＝10～14的水微波提取1～5次，每次提取10～60min，提取温度为30～60℃，合并提取液，调节PH＝5～7，加入絮凝澄清剂，搅匀，静置，过滤，滤液过超滤膜纯化和RO反渗透膜脱水，调节浓缩液PH＝4～5，将所得浓缩液用乙酸乙酯萃取2～6次，萃取液浓缩，干燥制得。虽然柿叶黄酮含量可达到85～98％，但是制备出来的柿叶黄酮为大分子物质，相比于小分子比较人体比较难吸收。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种从柿叶中提取小分子柿叶黄酮的方法，该方法既能够制备小分子柿叶黄酮，且制备得到的黄酮纯度高，工艺简单。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种从柿叶中提取小分子柿叶黄酮的方法，包括以下制备步骤：
(1)将柿叶除杂、洗净、破碎；
(2)加入柿叶重量4～7倍水，调节pH至3.5～5.0，升温至40～55℃，然后再加入柿叶重量0.1～0.5％的复合酶，所述复合酶为果胶酶和纤维素酶的混合物，酶解3～5小时，得到酶解液；
(3)再将酶解液过滤，加水，回流提取2～3次，每次60～120min，每次的提取温度都控制在90～100℃，合并提取液，蒸干，得到柿叶黄酮粗品；
(4)将正己烷、乙酸乙酯、正丁醇、水按体积比4:1:2:5混合，摇匀，静置分层，平衡分层后，溶液分为上下相，下相作为固定相，上相作为流动相；
(5)取步骤(3)得到的柿叶黄酮粗品溶解于15～25倍体积的流动相中，得到样品溶液；
(6)将固定相以25～30ml/min流速装满色谱分离柱，以600～680rpm转速开启逆流色谱仪主机，将流动相以4～6ml/min流速泵入色谱柱内，待流动相平衡后，取样品溶液通过进样阀进样，然后根据紫外色谱图，在580nm波长下，收集目的组分，分别减压蒸干，得到小分子柿叶黄酮。
本发明步骤(2)的果胶酶和纤维素酶的重量比为2:3。柿叶中一些有效成分被以纤维素为主的细胞壁所包围，并且这些细胞间还有果胶粘结，用果胶酶和纤维素酶复合酶充分破坏了以纤维素为主的细胞壁结构及其细胞间相连的果胶物质，将原料中的果胶完全分解成小分子物质，可制备得小分子目的成分，同时使提取传质阻力减小，使原料中有效物质充分地释放出来，既提高了提取率，也减少了提取时间。
本发明步骤(3)回流提取过程中，第一次加水量为酶解液重量的6～8倍，第二次加水量为酶解液重量的5～7倍，第三次加水量为酶解液重量的4～6倍。连续进行3次水提，可以最大限度提取柿叶中的黄酮，提高黄酮提取率。
本发明的有益效果在于：
1、先将原料粉碎再酶解，缩短酶解反应时间，提高生产效率，酶解可将大分子物质分解成小分子物质，可制备出小分子柿叶黄酮。
2、对酶解液进行水提三次，可以最大限度提取柿叶中的黄酮，提高提取率。
3、用高速逆流色谱法进行分离纯化，制备出的黄酮纯度高，性能可靠，分析成本低，易于操作，设备低廉。
4、本发明的方法工艺简单。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。
实施例1
(1)将柿叶除杂、洗净、破碎；
(2)加入柿叶重量4倍水，调节pH至3.5，升温至40℃，然后再加入柿叶重量0.1％的复合酶，所述复合酶为重量比为2:3的果胶酶和纤维素酶的混合物，酶解5小时，得到酶解液；
(3)再将酶解液过滤，加入酶解液重量的6倍水，回流提取，得到第一次提取液，再加入酶解液重量的5倍水，进行第二次回流提取，得到第二次提取液，加入酶解液重量的4倍水，进行第三次回流提取，得到第三次提取液，每次提取时间为60min，每次的提取温度都控制在90℃，合并提取液，蒸干，得到柿叶黄酮粗品；
(4)将正己烷、乙酸乙酯、正丁醇、水按体积比4:1:2:5混合，摇匀，静置分层，平衡分层后，溶液分为上下相，下相作为固定相，上相作为流动相；
(5)取步骤(3)得到的柿叶黄酮粗品溶解于25倍体积的流动相中，得到样品溶液；
(6)将固定相以25ml/min流速装满色谱分离柱，以600rpm转速开启逆流色谱仪主机，将流动相以4ml/min流速泵入色谱柱内，待流动相平衡后，取样品溶液通过进样阀进样，然后根据紫外色谱图，在580nm波长下，收集目的组分，分别减压蒸干，得到小分子柿叶黄酮。
经检测，产品纯度为99.8％。
实施例2
(1)将柿叶除杂、洗净、破碎；
(2)加入柿叶重量5倍水，调节pH至3.9，升温至44℃，然后再加入柿叶重量0.2％的复合酶，所述复合酶为重量比为2:3的果胶酶和纤维素酶的混合物，酶解4小时，得到酶解液；
(3)再将酶解液过滤，加入酶解液重量的7倍水，回流提取，得到第一次提取液，再加入酶解液重量的6倍水，进行第二次回流提取，得到第二次提取液，加入酶解液重量的5倍水，进行第三次回流提取，得到第三次提取液，每次提取时间为75min，每次的提取温度都控制在95℃，合并提取液，蒸干，得到柿叶黄酮粗品；
(4)将正己烷、乙酸乙酯、正丁醇、水按体积比4:1:2:5混合，摇匀，静置分层，平衡分层后，溶液分为上下相，下相作为固定相，上相作为流动相；
(5)取步骤(3)得到的柿叶黄酮粗品溶解于23倍体积的流动相中，得到样品溶液；
(6)将固定相以26ml/min流速装满色谱分离柱，以620rpm转速开启逆流色谱仪主机，将流动相以5ml/min流速泵入色谱柱内，待流动相平衡后，取样品溶液通过进样阀进样，然后根据紫外色谱图，在580nm波长下，收集目的组分，分别减压蒸干，得到小分子柿叶黄酮。
经检测，产品纯度为98.9％。
实施例3
(1)将柿叶除杂、洗净、破碎；
(2)加入柿叶重量6倍水，调节pH至4.3，升温至48℃，然后再加入柿叶重量0.3％的复合酶，所述复合酶为重量比为2:3的果胶酶和纤维素酶的混合物，酶解4小时，得到酶解液；
(3)再将酶解液过滤，加入酶解液重量的7倍水，回流提取，得到第一次提取液，再加入酶解液重量的6倍水，进行第二次回流提取，得到第二次提取液，加入酶解液重量的5倍水，进行第三次回流提取，得到第三次提取液，每次提取时间为90min，每次的提取温度都控制在95℃，合并提取液，蒸干，得到柿叶黄酮粗品；
(4)将正己烷、乙酸乙酯、正丁醇、水按体积比4:1:2:5混合，摇匀，静置分层，平衡分层后，溶液分为上下相，下相作为固定相，上相作为流动相；
(5)取步骤(3)得到的柿叶黄酮粗品溶解于20倍体积的流动相中，得到样品溶液；
(6)将固定相以28ml/min流速装满色谱分离柱，以640rpm转速开启逆流色谱仪主机，将流动相以5ml/min流速泵入色谱柱内，待流动相平衡后，取样品溶液通过进样阀进样，然后根据紫外色谱图，在580nm波长下，收集目的组分，分别减压蒸干，得到小分子柿叶黄酮。
经检测，产品纯度为99.9％。
实施例4
(1)将柿叶除杂、洗净、破碎；
(2)加入柿叶重量7倍水，调节pH至4.7，升温至52℃，然后再加入柿叶重量0.4％的复合酶，所述复合酶为重量比为2:3的果胶酶和纤维素酶的混合物，酶解5小时，得到酶解液；
(3)再将酶解液过滤，加入酶解液重量的8倍水，回流提取，得到第一次提取液，再加入酶解液重量的7倍水，进行第二次回流提取，得到第二次提取液，加入酶解液重量的6倍水，进行第三次回流提取，得到第三次提取液，每次提取时间为105min，每次的提取温度都控制在100℃，合并提取液，蒸干，得到柿叶黄酮粗品；
(4)将正己烷、乙酸乙酯、正丁醇、水按体积比4:1:2:5混合，摇匀，静置分层，平衡分层后，溶液分为上下相，下相作为固定相，上相作为流动相；
(5)取步骤(3)得到的柿叶黄酮粗品溶解于18倍体积的流动相中，得到样品溶液；
(6)将固定相以29ml/min流速装满色谱分离柱，以660rpm转速开启逆流色谱仪主机，将流动相以6ml/min流速泵入色谱柱内，待流动相平衡后，取样品溶液通过进样阀进样，然后根据紫外色谱图，在580nm波长下，收集目的组分，分别减压蒸干，得到小分子柿叶黄酮。
经检测，产品纯度为99.2％。
实施例5
(1)将柿叶除杂、洗净、破碎；
(2)加入柿叶重量5倍水，调节pH至5.0，升温至55℃，然后再加入柿叶重量0.5％的复合酶，所述复合酶为重量比为2:3的果胶酶和纤维素酶的混合物，酶解3小时，得到酶解液；
(3)再将酶解液过滤，加入酶解液重量的7倍水，回流提取，得到第一次提取液，再加入酶解液重量的5倍水，进行第二次回流提取，得到第二次提取液，加入酶解液重量的4倍水，进行第三次回流提取，得到第三次提取液，每次提取时间为120min，每次的提取温度都控制在90℃，合并提取液，蒸干，得到柿叶黄酮粗品；
(4)将正己烷、乙酸乙酯、正丁醇、水按体积比4:1:2:5混合，摇匀，静置分层，平衡分层后，溶液分为上下相，下相作为固定相，上相作为流动相；
(5)取步骤(3)得到的柿叶黄酮粗品溶解于15倍体积的流动相中，得到样品溶液；
(6)将固定相以30ml/min流速装满色谱分离柱，以680rpm转速开启逆流色谱仪主机，将流动相以5ml/min流速泵入色谱柱内，待流动相平衡后，取样品溶液通过进样阀进样，然后根据紫外色谱图，在580nm波长下，收集目的组分，分别减压蒸干，得到小分子柿叶黄酮。
经检测，产品纯度为99.1％。
Claims (3)
1.一种从柿叶中提取小分子柿叶黄酮的方法，其特征在于，包括以下制备步骤：
(1)将柿叶除杂、洗净、破碎；
(2)加入柿叶重量4～7倍水，调节pH至3.5～5.0，升温至40～55℃，然后再加入柿叶重量0.1～0.5％的复合酶，所述复合酶为果胶酶和纤维素酶的混合物，酶解3～5小时，得到酶解液；
(3)再将酶解液过滤，加水，回流提取3次，每次60～120min，每次的提取温度都控制在90～100℃，合并提取液，蒸干，得到柿叶黄酮粗品；
(4)将正己烷、乙酸乙酯、正丁醇、水按体积比4:1:2:5混合，摇匀，静置分层，平衡分层后，溶液分为上下相，下相作为固定相，上相作为流动相；
(5)取步骤(3)得到的柿叶黄酮粗品溶解于15～25倍体积的流动相中，得到样品溶液；
(6)将固定相以25～30ml/min流速装满色谱分离柱，以600～680rpm转速开启逆流色谱仪主机，将流动相以4～6ml/min流速泵入色谱柱内，待流动相平衡后，取样品溶液通过进样阀进样，然后根据紫外色谱图，在580nm波长下，收集目的组分，分别减压蒸干，得到小分子柿叶黄酮。
2.根据权利要求1所述的从柿叶中提取小分子柿叶黄酮的方法，其特征在于：步骤(2)中，果胶酶和纤维素酶的重量比为2:3。
3.根据权利要求1所述的从柿叶中提取小分子柿叶黄酮的方法，其特征在于：步骤(3)回流提取过程中，第一次加水量为酶解液重量的6～8倍，第二次加水量为酶解液重量的5～7倍，第三次加水量为酶解液重量的4～6倍。
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