CN102199202A - 灵芝属间的重组真菌免疫调节蛋白基因、该基因编码的蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

一种灵芝属间的重组真菌免疫调节蛋白基因、该基因编码的蛋白及其应用。一种基因工程技术领域的重组真菌免疫调节蛋白的基因、该基因编码的蛋白及其应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明进行真菌免疫调节蛋白的基因重组，重组后的基因表达于大肠杆菌获得目的蛋白，并且证明其仍然能具有很好的免疫调节活性，这对于FIP的大规模生产与作为药物或其他健康产品的应用提供了一种新的思路与探索途径。

Description

灵芝属间的重组真菌免疫调节蛋白基因、该基因编码的蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及的是一种基因工程技术领域的基因及其应用，具体是一种重组真菌免疫调节蛋白的基因、该基因编码的蛋白及其应用。

背景技术

真菌免疫调节蛋白是从高等真菌的子实体中提取的、与植物凝集素和免疫球蛋白的结构及免疫功能相似的一类小分子蛋白质。自1989年日本学者Kino等从赤灵芝(Ganoderma lucidium)子实体中分离提取出第一个真菌免疫调节蛋白(LZ-8)以来，已有LZ-8(FIP-glu)、FIP-gts、FIP-fve、FIP-vvo、FIP-gja、FIP-gmi和FIP-gsi等七种真菌免疫调节蛋白分别从松杉灵芝(G.tsugae)、金针菇(Flammulina velutipes)、草菇(Volvariella volvacea)、紫芝(G.japoncium)、小孢灵芝(G.microsporum)以及中国紫芝(G.sinense)中得到了分离。并且这七种真菌免疫调节蛋白形成了一个新的蛋白质家族——FIPs。林忠平等在《辽宁师范大学学报(自然科学版)》2006年第1期83-87页发表了题为《真菌免疫调节蛋白(FIP)结构与功能研究》一文，文中评述，真菌免疫调节蛋白家族成员的一级结构有着60％～70％的同源性，该家族蛋白也具有相似的免疫调节功能，如FIP能够促进人外周血淋巴细胞和小鼠脾细胞的有丝分裂；诱导脾淋巴细胞产生细胞因子；减少抗原诱导型抗体的形成以及抑制非胖糖尿病小鼠的自身免疫。但是，由于不同的真菌免疫调节蛋白的氨基酸序列不同，因此其免疫调节功能在体内外也有不同程度的表现。值得高兴的是，在真菌免疫调节蛋白进行重要的免疫调节功能的同时，并未表现出对机体的负面效应。因此，该蛋白家族在药物临床应用方面存在着巨大的潜在应用价值。可是，需要注意的是，天然的真菌免疫调节蛋白产量较低。如Kino，K.等在《Journal of Biological Chemistry》(生物化学杂志)1989年第1期472～478页发表了题为《Isolation and characterization of a new immunomodulatory protein，ling zhi-8(LZ-8)，from Ganoderma lucidium》(从赤芝中分离和描述了一种新的免疫调节蛋白lingzhi-8(LZ-8))一文，文中评述，340g灵芝菌丝体中仅分离纯化得到5～10mg的LZ-8；Ko，J.L.等在《European Journal of Biochemistry》(欧洲生化杂志)1995年第2期244～249页发表了题为《A new fungal immunomodulatory protein FIP-fve isolated from the edible mushroom，Flammulian velutlpes and its complete amino acid sequence》(从食用菌金针菇中分离了一种新的真菌免疫调节蛋白FIP-fve及其氨基酸序列)一文，文中评述，400g金针菇子实体中分离纯化得到35mg的FIP-fve；Hsu，H.C.等在《Journal of Biological Chemistry》(生物化学杂志)1997年第2期557～565页发表了题为《Fip-vvo，a new fungal immunomodulatory protein isolated from Volvariella volvacea》(Fip-vvo，从草菇中分离到的一种新的真菌免疫调节蛋白)一文，文中评述，3kg的新鲜草菇子实体中分离纯化出FIP-vvo为115mg。加之分离纯化工艺成本较高且费时，所以，应用基因工程思路改造真菌免疫调节蛋白基因，并采用可大规模生产化的工程菌有效表达，就具有着重要的研究意义和实际价值。目前，应用生物工程技术在微生物中高效表达FIP已有许多的报道。例如，白杰英等在《分子植物育种》2006年第5期645-649页发表了题为《灵芝LZ-8在烟草中的表达及产物特性的初步研究》一文，文中评述，LZ-8(FIP-glu)在大肠杆菌中的表达量约为36.46mg/L；张介驰等在《吉林农业大学学报》2007年第5期495-498页发表了题为《金针菇免疫调节蛋白基因克隆及其表达》一文，文中评述，FIP-fve在大肠杆菌中的表达率超过了22％。

此外，改造真菌免疫调节蛋白的基因，提高FIP在原核生物中的表达，以及提高FIP的生物学活性，是FIP应用于工业化生产的重要途径之一。DNA改组技术是一种非常有效的分子水平的体外定向进化技术。实际上是一种依赖于PCR的体外诱变技术，其过程是将单基因或相关基因家族的靶序列随机性的片段化之后，根据这些小片段之间一定程度的同源性，通过PCR技术将其合成为嵌合基因，然后进行高通量的筛选以期得到理想的突变体。与随机突变、盒式突变以及同源重组相比，以DNA重组技术为基础的DNA改组技术能够获得更加多样性的突变文库及更高的适应性。

目前尚未发现有利用DNA重组技术进行真菌免疫调节蛋白优化的报道。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种重组真菌免疫调节蛋白的基因、该基因编码的蛋白及其应用，对真菌免疫调节蛋白基因进行了重组，重组后的基因表达于大肠杆菌获得目的蛋白，并且证明其仍然能具有很好的免疫调节活性，这对于FIP的大规模生产与作为药物或其他健康产品的应用提供了一种新的思路与探索途径。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种重组真菌免疫调节蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具有与SEQ IDNO.1中从核苷酸第1-345位的核苷酸序列有至少85％的同源性；或能在中度严谨条件下与SEQID NO.1中从核苷酸第1-345位的核苷酸序列杂交。

所述的中度严谨条件是指：核苷酸序列之间能在2×SSC(0.3M柠檬酸钠，3M氯化钠，pH 7.0)和0.1％SDS的条件下。

本发明涉及一种重组真菌免疫调节蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明涉及上述重组真菌免疫调节蛋白在促血红细胞凝集、诱导细胞因子转录或表达中的应用，包括用于促小鼠血红细胞凝集以及用于诱导小鼠脾细胞转录或表达细胞因子。

本发明的重组真菌免疫调节蛋白基因所编码的重组真菌免疫调节蛋白在大肠杆菌中的表达量比同样在大肠杆菌中表达的赤芝真菌免疫调节蛋白、金针菇真菌免疫调节蛋白和草菇真菌免疫调节蛋白的表达量有所提高，提高到了143％～477％。并且重组真菌免疫调节蛋白基因表达载体构建容易，表达方法简单，只需添加少量IPTG即可实现大量稳定的表达。表达蛋白的分离纯化过程简单，制备得到的重组真菌免疫调节蛋白可以促小鼠血红细胞凝集以及诱导小鼠脾细胞细胞因子转录表达。本发明具有重要的实际应用价值。

本发明中所涉及的大肠杆菌M15已在《和生琦，丁国富，李斌，李军，罗平，董燕，张蓉，颜伟，周红；青霉素结合蛋白2a C-末端在大肠杆菌M15中的表达、纯化及鉴定，创伤外科杂志，2007，9(1)：28-31》中公开；

本发明中涉及的M15大肠杆菌菌株可通过公开市售的商业渠道取得，如北京博迈德科技发展有限公司，公司地址：北京市海淀区西四环中路甲59号。

附图说明

图1基因片段重组电泳图。

图2菌落杂交筛选图。

图3重组真菌免疫调节蛋白基因序列比对图。

图4重组真菌免疫调节蛋白氨基酸序列比对图。

图5重组真菌免疫调节蛋白电泳图。

图6重组真菌免疫调节蛋白Western Blot检测图。

图7重组真菌免疫调节蛋白血液凝集实验结果图。

图8重组真菌免疫调节蛋白诱导细胞因子电泳图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、真菌免疫调节蛋白的基因重组

1.片段合成

根据大肠杆菌偏爱密码子，在不改变其蛋白质序列的前提下，将赤芝真菌免疫调节蛋白基因(FIP-glu)、金针菇真菌免疫调节蛋白基因(FIP-fve)及草菇真菌免疫调节蛋白基因(FIP-vvo)重新编码。将按照大肠杆菌偏爱密码子重新编码的FIP-glu、FIP-fve及FIP-vvo基因按照各自DNA顺序分割成50～60bp长短的片段，每相邻的两个片段之间有约18bp的核苷酸重叠(SEQ ID NO.3至SEQ ID NO.28)，并且合成这些片段。

2.无引物PCR

将如SEQ ID NO.3至SEQ ID NO.28所示的寡聚核苷酸等量混合，利用KOD plus聚合酶(日本东洋纺)对基因片段进行PCR反应。反应体系中无引物。反应程序为：94℃预变性2min后，按照94℃，15s；55℃，15s；72℃，25s进行20个循环，最后72℃延伸7min。用小量DNA胶回收试剂盒(Bio Basic Inc)分别纯化PCR产物，得到产物I。

3.有引物PCR

A.引物合成

根据真菌免疫调节蛋白基因核苷酸序列比对结果，设计并合成如下引物：

SJ-L-F：GGCTCTAGAGCCGAGCTCGCGGGATCCATGAGCGATACCGCGCTGATTTTTCG(下划线为BamH I酶切位点)

SJ-L-R：CCGGAATTCCGGAACTGCAGAACCCCAAGCTTTTAGTTCCACTGCGCAATAATAAAATC(下划线为Hind III酶切位点)

SJ-F-F：GGCTCTAGAGCCGAGCTCGCGGGATCCATGAGCGCGACCAGCCTGACC(下划线为BamH I酶切位点)

SJ-F-R：CCGGAATTCCGGAACTGCAGAACCCCAAGCTTTTTTTTCCATTCCGCAATAATATATTC(下划线为Hind III酶切位点)

SJ-V-F：GGCTCTAGAGCCGAGCTCGCGGGATCCATGAGCACCGATCTGACCCAG(下划线为BamH I酶切位点)

SJ-V-R：CCGGAATTCCGGAACTGCAGAACCCCAAGCTTTTATTTCCACTGCGCAATCAG(下划线为HindIII酶切位点)

将上述六种引物等量混合，获得引物SJ。

B.基因重组

将实施例1.2中获得的产物I稀释10倍做为模板，实施例1.3中获得的引物SJ做为引物进行PCR扩增，反应程序为：94℃预变性2min后，按照94℃，30s；55℃，30s；72℃，40s进行10个循环，最后72℃延伸10min。将PCR扩增产物用小量DNA胶回收试剂盒(Bio Basic Inc)纯化，获得产物II，如图1所示。

实施例2、重组真菌免疫调节蛋白表达载体的构建及筛选

将实施例1.3中获得的产物II经限制性内切酶BamH I和Hind III酶切过夜，并且与经同样限制性内切酶酶切的表达载体pQE-30连接。将构建好的表达载体转化大肠杆菌M15宿主细胞，用含有100mg/mL的羧苄西林钠及50mg/mL的卡那霉素的LB平板筛选转化子。提取克隆质粒，即得到重组真菌免疫调节蛋白表达载体。所得到的转化子即为重组真菌免疫调节蛋白基因重组文库。将重组真菌免疫调节蛋白基因转化子进行筛选。待转化子菌落生长至直径为1mm时，将菌落在PVDF膜上做印记。之后将膜移至含有100mg/mL羧苄西林钠、50mg/mL卡那霉素以及1mM IPTG的LB平板上，克隆面朝上，与印记后的平板同时在37℃下培养4～6h。取出PVDF膜做Western blot检测。一抗使用真菌免疫调节蛋白抗体，稀释倍数为1∶10,000；二抗选用碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG，稀释倍数为1∶10,000。显色后，选择在PVDF膜上颜色较深的点所对应的克隆(图2)。重组真菌免疫调节蛋白基因转化子筛选得到的克隆中含有的表达载体，即为重组载体pQE30-FIP-SJ。将所选择的克隆送上海桑尼生物工程有限公司测序鉴定。测序结果表明，重组载体pQE30-FIP-SJ编码重组真菌免疫调节蛋白的核苷酸序列，其开放阅读框(ORF)为序列表中SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-345位的核苷酸序列(图3所示为重组真菌免疫调节蛋白的核苷酸序列与FIP-glu，FIP-fve和FIP-vvo基因序列比对图)，编码氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列(图4所示为重组真菌免疫调节蛋白的氨基酸序列与FIP-glu，FIP-fve和FIP-vvo氨基酸序列比对图)。提取克隆质粒，即得到重组表达载体pQE30-FIP-SJ。

实施例3、重组真菌免疫调节蛋白的诱导表达与纯化

1.重组真菌免疫调节蛋白的诱导表达及Western blot检测

将实施例2中获得的单克隆接种于含有100mg/mL的羧苄西林钠及50mg/mL的卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜。次日以2％接种量接种于较大体积培养液。37℃继续培养，至OD600达到0.5～0.7时，加入IPTG，使IPTG的终浓度达到1mM。培养6h后，将所取得菌液样品用5,000rpm离心20min以收集菌体。菌体用100μL 2×SDS-PAGE Sample buffer(100mM pH 6.8Tris-Cl，4％(W/V)SDS，0.2％(W/V)BPB，20％(W/V)glycerine，2％(W/V)β-ME)悬浮，并在95℃水浴锅中保温5min。之后分别用两块15％SDS-PAGE胶检测。一块用于考马斯亮蓝染色(图5)，另一块用于Western blot检测(图6)。图5所示为含有重组表达载体pQE30-FIP-SJ的大肠杆菌M15细胞经IPTG诱导蛋白表达电泳图。箭头所示即为重组真菌免疫调节蛋白。图6所示为重组真菌免疫调节蛋白Western Blot检测。经大肠杆菌发酵，重组真菌免疫调节蛋白的产量提高到了143％～477％。

2.重组真菌免疫调节蛋白的分离纯化

将经过IPTG诱导的菌液5,000rpm离心20min收集细胞，用1/10体积Lysis buffer(50mMNaH₂PO₄，300mM NaCl，10mM imidazole，pH 8.0)悬浮；将混合物于液氮冷冻，之后再于冰水中融化；将融化后的样品在冰水混合物中超声波破碎，200～300W超声6次，每次10s，期间间隔10s；超声处理过的菌液于4℃下用12,000rpm离心20～30min；取上清，使用Ni-NTA柱纯化(预先用10倍柱体积的Lysis buffer平衡)；用20倍柱体积的Wash buffer(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，20mM imidazole，pH 8.0)洗柱；目的蛋白由Elution buffer(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，250mM imidazole，pH 8.0)洗脱出来。

实施例4、重组真菌免疫调节蛋白促小鼠血红细胞凝集

昆明小鼠心脏取血，1,200rpm离心5min，并用PBS洗涤3次，每次1,200rpm离心5min收集血细胞，最后用PBS配制成1.5％(V/V)的血红细胞溶液。在96孔U型板内加入100μL 1.5％的血细胞，并按照倍比稀释法加入100μL重组真菌免疫调节蛋白溶液，使重组蛋白的终浓度从0.03μg/mL到50μg/mL。并以ConA蛋白作为阳性对照，PBS做为阴性对照，37℃培养。结果如图7所示为重组真菌免疫调节蛋白血液凝集实验。其中A表示重组真菌免疫调节蛋白凝血反应，B为阴性对照，C为阳性对照。

实施例5、重组真菌免疫调节蛋白对小鼠脾细胞细胞因子的转录表达

1.细胞培养

取雄性昆明小白鼠(4～8周龄)，采用颈部脱臼法处死，取出脾脏，在RPMI 1640培养基中研磨至碎，过滤网(200目)，4℃，1,500rpm离心3～5min；用红细胞裂解液(碧云天公司)轻轻悬浮沉淀，4℃，1,500rpm离心3～5min；RPMI 1640培养基洗涤沉淀两次，4℃，1,500rpm离心3～5min；RPMI 1640培养基轻轻悬浮细胞，血细胞计数板计数，确定细胞浓度。用RPMI 1640培养基将细胞浓度稀释至1×10⁷个/mL，分别与0μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL的重组真菌免疫调节蛋白于24孔细胞培养板中共同培养4h。

2.RT-PCR检测

A.RNA提取

采用柱离心式小量总RNA抽提试剂盒(华舜公司)，分别提取与不同浓度重组真菌免疫调节蛋白共培养的小鼠脾细胞的总RNA。

B.引物设计

根据文献中报道的细胞因子核苷酸序列，设计并合成如下引物：

IL-4F：ATGGGTCTCAACCCCCAGCTAGT

IL-4R：GCTCTTTAGGCTTTCCAGGAAGTC

IFN-γF：TGAACGCTACACACTGCATCTTGG

IFN-γR：CGACTCCTTTTCCGCTTCCTGAG

IL-2R F：ACTGTGAATGCAAGAGAGGTTTCCG

IL-2R R：AGCAGGACCTCTCTGTAGAGCCTTG

β-actin F：GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA

β-actin R：CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC

C.RT-PCR反应

采用TaKaRa One Step RNA PCR Kit(AMV)，对重组真菌免疫调节蛋白诱导小鼠脾细胞细胞因子的转录水平进行检测。

反应程序：

IL-4：50℃30min，RT反应；94℃2min，RNase失活；94℃变性30s；65℃退火30s；72℃延伸40s，共30个循环。

IFN-γ：50℃30min，RT反应；94℃2min，RNase失活；94℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸40s，共25个循环。

IL-2R：50℃30min，RT反应；94℃2min，RNase失活；94℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸40s，共30个循环。

结果如图8所示为重组真菌免疫调节蛋白诱导小鼠脾细胞产生细胞因子电泳图。从图中可以看出，重组真菌免疫调节蛋白能够诱导小鼠脾细胞产生细胞因子IFN-γ、IL-4及IL-2R。并且，重组蛋白的浓度与细胞因子的转录水平呈现一定的剂量关系。说明重组真菌免疫调节蛋白都具有一定的免疫调节作用。

Claims (3)

1.一种重组真菌免疫调节蛋白，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的重组真菌免疫调节蛋白，其特征是，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种根据上述权利要求中任一所述重组真菌免疫调节蛋白在促血红细胞凝集、诱导细胞因子转录或表达中的应用，其特征在于，包括用于促小鼠血红细胞凝集以及用于诱导小鼠脾细胞转录或表达细胞因子。

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