JP2004059480A - ヒアルロン酸産生促進剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】ヒアルロン酸産生促進効果に優れ、かつ安全性及び安定性が高く、抗シワ剤、関節リウマチや関節炎等の治療薬、熱傷初期の治療薬等として人体に適用可能なヒアルロン酸産生促進剤を提供する。
【解決手段】キシロオリゴ糖分子中にウロン酸残基を有する酸性キシロオリゴ糖を有効成分とするヒアルロン酸産生促進剤。該キシロオリゴ糖は、キシロースの重合度が異なるオリゴ糖の混合組成物であり、平均重合度が２．０〜３．０が良い。ウロン酸はグルクロン酸もしくは４−Ｏ−メチル−グルクロン酸などである。
【選択図】 なし
【解決手段】キシロオリゴ糖分子中にウロン酸残基を有する酸性キシロオリゴ糖を有効成分とするヒアルロン酸産生促進剤。該キシロオリゴ糖は、キシロースの重合度が異なるオリゴ糖の混合組成物であり、平均重合度が２．０〜３．０が良い。ウロン酸はグルクロン酸もしくは４−Ｏ−メチル−グルクロン酸などである。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、化粧品、医薬部外品、医薬品及び食品分野に於いて使用される新規なヒアルロン酸産生促進剤に関する。より詳細には、優れた生理活性を有し、しかも安全性の高いヒアルロン酸産生促進剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒアルロン酸は、皮膚、靱帯、関節液、目の硝子体等、生体内に広く分布しており、プロテオグリカンと結合したゼリー状の細胞間マトリックスを形成して、細胞や組織の保持機能、及び機械的外力や細菌感染などに対する保護機能を果たしている。また、皮膚や関節に於ける細胞機能の低下によるヒアルロン酸の減少が、皮膚の乾燥、弾力性の減少及びシワ発生等の皮膚老化、あるいは関節の湿潤性悪化による関節痛等の原因の一つとされている。
【０００３】
老化した皮膚の改善剤として、ヒアルロン酸やコラーゲンを配合した化粧料が数多く提案されているが、これらは皮膚表面における保湿効果を発揮するだけであり、本質的に皮膚の乾燥、弾力性の減少及びシワ等を改善し得るものではない。また、皮膚細胞賦活剤として各種のビタミン類や生薬類を配合した化粧料も提案されているが、これらも老化した皮膚の改善、治療には至っていない。
【０００４】
一方、関節液中に含まれるヒアルロン酸は、関節軟骨の表面を覆い、関節機能の円滑な作動に役立っている。慢性関節リウマチの場合、関節液中のヒアルロン酸濃度が低下し、同時に関節液の粘度も低下する〔Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、ｖｏｌ．１０、Ｐ３５７（１９６７）〕。この疾患においては、ヒアルロン酸ナトリウムの関節注入療法による疼痛抑制等の症状改善が報告されている〔炎症、１１巻、Ｐ１６、（１９９１）〕。同様に、外傷性関節症、骨関節炎や変形性関節症においてもヒアルロン酸の関節注入療法による改善効果が報告されている〔結合組織と疾患（講談社）、Ｐ２４６、（１９８０）〕。しかしながら、上記疾患の治療は長期にわたり、医師の処方を必要とする為、日常生活の中で手軽に使用できるものではない。
【０００５】
また、熱傷受傷後の治癒過程で、壊死組織の下方から増生してくる肉芽組織の初期から組織全体が肉芽組織に置き換えられるまでの期間では、肉芽中にヒアルロン酸が著しく増加することが知られており〔結合組織と疾患（講談社）、Ｐ１５３、（１９８０）〕、熱傷の初期の治療薬として、ヒアルロン酸産生促進剤が期待されている。
【０００６】
ヒト細胞のヒアルロン酸産生を促進する薬剤として、インシュリン様成長因子−１や上皮細胞成長因子〔Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１０１４、Ｐ３０５（１９８９）〕及びインターロイキン−１〔「日本産科婦人科学会」雑誌、４１巻、Ｐ１９４３（１９８９）〕等のサイトカインが知られているが、いずれも化粧品、医薬部外品や医薬品として簡便かつ安心して使用できるものではない。
【０００７】
特許第３２１３１８９号公報には、酵母エキスを有効成分として含有するヒアルロン酸産生促進剤が、特開２００１−１１４６３７号公報にはドクダミまたはセイヨウノコギリの花の抽出物を含有するヒアルロン酸産生促進剤が記載され、特開２００１−１５８７２８号公報にはオウバク、レモン、ユズの抽出物を含有するヒアルロン酸産生促進剤が記載されているが、いずれも抽出物の安定性、効果の安定性は定かではない。
【０００８】
なお、酸性キシロオリゴ糖の生理効果に関しては、水耕栽培に於けるスギ挿穂の発根促進効果の記載（セルラーゼ研究会報第１６巻２００１年）、育毛剤（特願２００１−３８８８８１）、メラニン生成抑制剤（特願２００２−１７１３７）及び抗炎症剤（特願２００２−１９３７８）としての提案があるのみで、ヒアルロン酸産生促進剤に関する開示はなされていない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明に於いては、ヒアルロン酸産生促進効果に優れ、かつ安全性及び安定性が高く、抗シワ剤、関節リウマチや関節炎等の治療薬、熱傷初期の治療薬等として人体に適用可能なヒアルロン酸産生促進剤を提供することを目的とした。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決する為、培養ヒアルロン酸産生細胞に於けるヒアルロン酸産生を指標として、ヒアルロン酸産生促進剤のスクリーニングを行った。その結果、ウロン酸残基が付加した酸性キシロオリゴ糖組成物が優れたヒアルロン酸産生促進効果を有することを見出し、安全性及び安定性も優れることより、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は以下の構成を採用する。即ち、本発明の第１は、「キシロオリゴ糖分子中にウロン酸残基を有する酸性キシロオリゴ糖を有効成分とするヒアルロン酸産生促進剤」である。
【００１２】
本発明の第２は、前記第１発明において、該酸性キシロオリゴ糖はキシロースの重合度が異なるオリゴ糖の混合組成物であり、平均重合度が２．０〜３．０であることを特徴とするヒアルロン酸産生促進剤である。
【００１３】
本発明の第３は、前記第１または第２の発明において、前記酸性キシロオリゴ糖が、「リグノセルロース材料を酵素的及び／又は物理化学的に処理してキシロオリゴ糖成分とリグニン成分の複合体を得、次いで該複合体を酸加水分解処理してキシロオリゴ糖混合物を得、得られるキシロオリゴ糖混合物から、１分子中に少なくとも１つ以上のウロン酸残基を側鎖として有するキシロオリゴ糖を分解して得たもの」であることを特徴とするヒアルロン酸産生促進剤である。
【００１４】
本発明の第４は、前記第１〜第３の発明において、ウロン酸がグルクロン酸もしくは４−Ｏ−メチル−グルクロン酸であることを特徴とするヒアルロン酸産生促進剤である。
【００１５】
【発明実施の形態】
以下、本発明の構成について詳述する。キシロオリゴ糖とは、キシロースの２量体であるキシロビオース、３量体であるキシロトリオース、あるいは４量体〜２０量体程度のキシロースの重合体を言う。本発明で使用する酸性キシロオリゴ糖とは、キシロオリゴ糖１分子中に少なくとも１つ以上のウロン酸残基を有するものを言う。
また、キシロースの重合度が異なるオリゴ糖の混合組成物であっても良い。一般的には、天然物から製造するために、このような組成物として得られることが多く、以下、主として酸性キシロオリゴ糖組成物について説明する。
該組成物は、平均重合度で示す数値は正規分布をとる酸性キシロオリゴ糖のキシロース鎖長の平均値で、２．０〜１１．０が好ましく、２．０〜３．０がより好ましい。キシロース鎖長の上限と下限との差は１０以下が好ましく、２以下がより好ましい。ウロン酸は天然では、ペクチン、ペクチン酸、アルギン酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸等の種々の生理活性を持つ多糖の構成成分として知られている。本発明におけるウロン酸としては特に限定されないが、グルクロン酸もしくは４−Ｏ−メチル−グルクロン酸が好ましい。
【００１６】
上記のような酸性キシロオリゴ糖組成物を得ることが出来れば、その製法は特に限定されないが、（１）木材からキシランを抽出し、それを酵素的に分解する方法（セルラーゼ研究会発行、セルラーゼ研究会報第１６巻、２００１年６月１４日発行、Ｐ１７−２６）と、（２）リグノセルロース材料を酵素的及び／又は物理化学的に処理してキシロオリゴ糖成分とリグニン成分の複合体を得、次いで該複合体を酸加水分解処理してキシロオリゴ糖混合物を得、得られるキシロオリゴ糖混合物から、１分子中に少なくとも１つ以上のウロン酸残基を側鎖として有するキシロオリゴ糖を分離する方法が挙げられる。
特に、（２）の方法が５〜１０量体のように比較的高い重合度のものを大量に安価に製造することが可能である点で好ましく、以下にその概要を示す。
【００１７】
酸性オリゴ糖組成物は、化学パルプ由来のリグノセルロース材料を原料とし、加水分解工程、濃縮工程、希酸処理工程、精製工程を経て得ることができる。加水分解工程では、希酸処理、高温高圧の水蒸気（蒸煮・爆砕）処理もしくは、ヘミセルラーゼによってリグノセルロース中のキシランを選択的に加水分解し、キシロオリゴ糖とリグニンからなる高分子量の複合体を中間体として得る。濃縮工程では逆浸透膜等により、キシロオリゴ糖−リグニン様物質複合体が濃縮され、低重合度のオリゴ糖や低分子の夾雑物などを除去することができる。濃縮工程は逆浸透膜を用いることが好ましいが、限外濾過膜、塩析、透析などでも可能である。得られた濃縮液の希酸処理工程により、複合体からリグニン様物質が遊離し、酸性キシロオリゴ糖と中性キシロオリゴ糖を含む希酸処理液を得ることができる。この時、複合体から切り離されたリグニン様物質は酸性下で縮合し沈殿するのでセラミックフィルターや濾紙などを用いたろ過等により除去することができる。希酸処理工程では、酸による加水分解を用いることが好ましいが、リグニン分解酵素などを用いた酵素分解などでも可能である。
【００１８】
精製工程は、限外濾過工程、脱色工程、吸着工程からなる。一部のリグニン様物質は可溶性高分子として溶液中に残存するが、限外濾過工程で除去され、着色物質等の夾雑物は活性炭を用いた脱色工程によってそのほとんどが取り除かれる。限外濾過工程は限外濾過膜を用いることが好ましいが、逆浸透膜、塩析、透析などでも可能である。こうして得られた糖液中には酸性キシロオリゴ糖と中性キシロオリゴ糖が溶解している。イオン交換樹脂を用いた吸着工程により、この糖液から酸性キシロオリゴ糖のみを取り出すことができる。糖液をまず強陽イオン交換樹脂にて処理し、糖液中の金属イオンを除去する。ついで強陰イオン交換樹脂を用いて糖液中の硫酸イオンなどを除去する。この工程では、硫酸イオンの除去と同時に弱酸である有機酸の一部と着色成分の除去も同時に行っている。強陰イオン交換樹脂で処理された糖液はもう一度強陽イオン交換樹脂で処理し更に金属イオンを除去する。最後に弱陰イオン交換樹脂で処理し、酸性キシロオリゴ糖を樹脂に吸着させる。
【００１９】
樹脂に吸着した酸性オリゴ糖を、低濃度の塩（ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２など）によって溶出させることにより、夾雑物を含まない酸性キシロオリゴ糖溶液を得ることができる。この溶液を、例えば、スプレードライや凍結乾燥処理により、白色の酸性キシロオリゴ糖組成物の粉末を得ることができる。
【００２０】
化学パルプ由来のリグノセルロースを原料とし、キシロオリゴ糖とリグニンからなる高分子量の複合体を中間体とした酸性キシロオリゴ糖組成物の上記製造法のメリットは、経済性とキシロースの平均重合度の高い酸性キシロオリゴ糖組成物が容易に得られる点にある。平均重合度は、例えば、希酸処理条件を調節するか、再度ヘミセルラーゼで処理することによって変えることが可能である。また、弱陰イオン交換樹脂溶出時に用いる溶出液の塩濃度を変化させることによって、１分子あたりに結合するウロン酸残基の数が異なる酸性キシロオリゴ糖組成物を得ることもできる。さらに、適当なキシラナーゼ、ヘミセルラーゼを作用させることによってウロン酸結合部位が末端に限定された酸性キシロオリゴ糖組成物を得ることも可能である。
【００２１】
このようにして得られた酸性キシロオリゴ糖組成物は、エタノール、プロパノール及びイソプロパノール等の低級アルコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール及びグリセリン等の多価アルコール、希酸、希アルカリの水溶液等に溶解してヒアルロン酸産生促進剤に含有させる。或いは、アルコール、エステル等を含有する基材成分に直接添加、溶解して含有させることもできる。また、マイクロカプセル化やリポソームに内含させて添加してもよい。ヒアルロン酸産生促進剤に於ける酸性キロオリゴ糖または、酸性キシロオリゴ糖組成物の含有率としては、０．００１〜２０％（以下全て質量％）の範囲で使用することができるが、０．０１〜１０％がより好ましい。
【００２２】
本発明の酸性キシロオリゴ糖組成物を配合したヒアルロン酸産生促進剤は、ローション、乳剤、クリーム、軟膏等の形態をとることが出来る。また更に、柔軟性化粧水、収れん性化粧品、洗浄用化粧水等の化粧水類、エモリエントクリーム、モイスチュアクリーム、クレンジングクリーム、メイクアップクリーム等のクリーム類、エモリエント乳液、モイスチュア乳液、ナリシング乳液、クレンジング乳液等の乳液類、ゼリー状パック、ピールオフパック、洗い流しパック、粉末パック等のパック類、美容液及び洗顔料といった種々の製剤形態のヒアルロン酸産生促進剤としても配合することが出来る。
【００２３】
本発明に於いては、更に、他のヒアルロン酸産生促進成分や、保湿剤、抗炎症剤、紫外線吸収剤等、他の有効成分を配合することも出来、抗シワ用化粧料、皮膚保護用化粧料、肌荒れ改善用化粧料等の薬用化粧料、医薬部外品あるいは医薬品として提供することも出来る。
【００２４】
【実施例】
以下、本発明について実施例により詳説する。本発明はこれにより限定されるものではない。まず、各測定法の概要、本発明で有効成分として含有させた酸性キシロオリゴ糖組成物ＵＸ２の調製例１を示す。
〈測定法の概要〉
（１） 全糖量の定量：
全糖量は検量線をＤ−キシロース（和光純薬工業（株）製）を用いて作製し、フェノール硫酸法（還元糖の定量法、学会出版センター発行）にて定量した。
（２） 還元糖量の定量：
還元糖量は検量線をＤ−キシロース（和光純薬工業（株）製）を用いて作製、ソモジ−ネルソン法（還元糖の定量法、学会出版センター発行）にて定量した。
（３） ウロン酸量の定量：
ウロン酸は検量線をＤ−グルクロン酸（和光純薬工業（株）製）を用いて作製、カルバゾール硫酸法（還元糖の定量法、学会出版センター発行）にて定量した。
（４） 平均重合度の決定法：
サンプル糖液を５０℃に保ち１５０００ｒｐｍにて１５分遠心分離し不溶物を除去し上清液の全糖量を還元糖量（共にキシロース換算）で割って平均重合度を求めた。
（５） 酸性キシロオリゴ糖の分析方法：
オリゴ糖鎖の分布はイオンクロマトグラフ（ダイオネクス社製、分析用カラム：Ｃａｒｂｏ Ｐａｃ ＰＡ−１０）を用いて分析した。分離溶媒には１００ｍＭ ＮａＯＨ溶液を用い、溶出溶媒には前述の分離溶媒に酢酸ナトリウムを５００ｍＭとなるように添加し、溶液比で、分離溶媒：溶出溶媒＝１０：０〜４：６となるような直線勾配を組み分離した。得られたクロマトグラムより、キシロース鎖長の上限と下限との差を求めた。
（６） オリゴ糖１分子あたりのウロン酸残基数の決定法
サンプル糖液を５０℃に保ち１５０００ｒｐｍにて１５分遠心分離し不溶物を除去し上清液のウロン酸量（Ｄ−グルクロン酸換算）を還元糖量（キシロース換算）で割ってオリゴ糖１分子あたりのウロン酸残基数を求めた。
（７） 酵素力価の定義：
酵素として用いたキシラナーゼの活性測定にはカバキシラン（シグマ社製）を用いた。酵素力価の定義はキシラナーゼがキシランを分解することで得られる還元糖の還元力をＤＮＳ法（還元糖の定量法、学会出版センター発行）を用いて測定し、１分間に１マイクロモルのキシロースに相当する還元力を生成させる酵素量を１ユニットとした。
【００２５】
〈酸性キシロオリゴ糖組成物の調製例〉
〈調製例１〉
混合広葉樹チップ（国内産広葉樹７０％、ユーカリ３０％）を原料として、クラフト蒸解及び酸素脱リグニン工程により、酸素脱リグニンパルプスラリー（カッパー価９．６、パルプ粘度２５．１ｃｐｓ）を得た。スラリーからパルプを濾別、洗浄した後、パルプ濃度１０％、ｐＨ８に調製したパルプスラリーを用いて以下のキシラナーゼによる酵素処理を行った。
【００２６】
バチルスｓｐ．Ｓ−２１１３株（独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター、寄託菌株ＦＥＲＭ ＢＰ−５２６４）の生産するキシラナーゼを１単位／パルプｇとなるように添加した後、６０℃で１２０分間処理した。その後、ろ過によりパルプ残渣を除去し、酵素処理液１０５０Ｌを得た。
【００２７】
次に、得られた酵素処理液を濃縮工程、希酸処理工程、精製工程の順に供した。
濃縮工程では、逆浸透膜（日東電工（株）製、ＲＯ ＮＴＲ−７４１０）を用いて濃縮液（４０倍濃縮）を調製した。希酸処理工程では、得られた濃縮液のｐＨを３．５に調整した後、１２１℃で６０分間加熱処理し、リグニンなどの高分子夾雑物の沈殿を形成させた。さらに、この沈殿をセラミックフィルターろ過で取り除くことにより、希酸処理溶液を得た。
【００２８】
精製工程では、限外濾過・脱色工程、吸着工程の順に供した。限外濾過・脱色工程では、希酸処理溶液を限外濾過膜（オスモニクス社製、分画分子量８０００）を通過させた後、活性炭（和光純薬（株）製）７７０ｇの添加及びセラミックフィルターろ過により脱色処理液を得た。吸着工程では、脱色処理液を強陽イオン交換樹脂（三菱化学（株）製ＰＫ２１８）、強陰イオン交換樹脂（三菱化学（株）製ＰＡ４０８）、強陽イオン交換樹脂（三菱化学（株）製ＰＫ２１８）各１００ｋｇを充填したカラムに順次通過させた後、弱陰イオン交換樹脂（三菱化学（株）製ＷＡ３０）１００ｋｇを充填したカラムに供した。この弱陰イオン交換樹脂充填カラムから７５ｍＭ ＮａＣｌ溶液によって溶出した溶液をスプレードライ処理することによって、酸性キシロオリゴ糖組成物の粉末（全糖量３５３ｇ、回収率１３．１％）を得た。以下、この酸性キシロオリゴ糖組成物をＵＸ１０とする。前述の測定方法により、ＵＸ１０は平均重合度１０．３、キシロース鎖長の上限と下限との差は１０、酸性キシロオリゴ糖１分子あたりウロン酸残基を１つ含む糖組成化合物であった。
【００２９】
得られたＵＸ１０の１０％水溶液１００ｍｌに、スミチームＸ（新日本化学工業（株）製のキシラナーゼ）５０ｍｇを添加し、６０℃、２０時間反応後、弱アニオン交換樹脂（ＷＡ３０）１０ｇを充填したカラムに供した。カラムを水洗した後、７５ｍＭ ＮａＣｌ溶液によって溶出した溶液を凍結乾燥することによって、酸性キシロオリゴ糖組成物粉末（全糖量２．１ｇ、回収率２１％）を得た。以下、この酸性キシロオリゴ糖組成物をＵＸ２とする。前述の測定方法により、ＵＸ２は平均重合度２．３、キシロース鎖長の上限と下限との差は２、酸性キシロオリゴ糖１分子あたりウロン酸残基を１つ含む糖組成化合物であった。
【００３０】
次に、得られた酸性キシロオリゴ糖組成物を用いて行ったヒアルロン酸産生促進試験、細胞増殖阻害率測定試験、マウスを用いた安全性試験及び安定性試験の概要と結果を実施例１〜４に示す。また、酸性キシロオリゴ糖組成物を含有するヒアルロン酸産生促進剤（化粧水及び軟膏）の処方と製造法を実施例５及び実施例６に示す。
【００３１】
〈実施例１〉
ヒアルロン酸産生促進試験を、正常ヒト皮膚線維芽細胞（クラボウ：ＮＨＤＦ）を用いて実施した。以下にその概要を示す。まず、正常ヒト皮膚線維芽細胞を培地（ＦＢＳ（大日本製薬（株）製）１０％を含むＭＥＭダルベッコ培地（大日本製薬（株）製））５ｍｌを入れたフラスコに播種し、前培養（ＣＯ２濃度：５％、３７℃、以下培養と略す）した。６日後、常法に従い、トリプシン処理及び遠心分離により細胞を集めた。次に、得られた細胞を、１２ウエルマイクロプレートに２×１０４個／ウエルになるように播種した。４日間培養後、ＦＢＳを０．２５％含むＭＥＭダルベッコ培地（以下培地と略す）に交換後、組織培養用純水に溶解した酸性キシロオリゴ糖サンプルを培地に添加し、更に４日間培養した。培養後、培地を採取し、ヒアルロン酸の測定を行った。ヒアルロン酸の測定は、市販のヒアルロン酸測定キット（中外製薬（株）製）を用いて行った。また、プレート中の細胞は、常法に従い、トリプシン処理によってプレートから回収し、細胞数を測定した。ヒアルロン酸産生促進作用はヒアルロン酸産生促進率により評価した。下記の計算式によりヒアルロン酸産生促進率を算出した。なお、酸性キシロオリゴ糖サンプル無添加による培養系をコントロールとした。
【００３２】
ヒアルロン酸産生促進率（％）＝〔（ａ／ｂ）／（ｃ／ｄ）〕×１００
ａ：酸性キシロオリゴ糖サンプル添加培養におけるヒアルロン酸産生量
ｂ：酸性キシロオリゴ糖サンプル無添加培養におけるヒアルロン酸産生量
ｃ：酸性キシロオリゴ糖サンプル添加培養におけるプレート中の細胞数
ｄ：酸性キシロオリゴ糖サンプル無添加培養におけるプレート中の細胞数
【００３３】
酸性キシロオリゴ糖組成物ＵＸ２のヒアルロン酸産生促進試験の結果を表１に示す。
【表１】
【００３４】
ＵＸ２添加群では、コントロール群と比較して、正常ヒト皮膚線維芽細胞が産生するヒアルロン酸量が増加していることが認められた。
【００３５】
〈実施例２〉
ヒアルロン酸産生促進試験を、正常ヒト表皮角化細胞（クラボウ：ＮＨＥＫ）を用いて実施した。以下にその概要を示す。まず、正常ヒト表皮角化細胞を培地（増殖添加剤ＨＫＧＳ（クラボウ製）を含むＭｅｄｉｕｍ１５４Ｓ培地（クラボウ製）、以下培地と略す）５ｍｌを入れたフラスコに播種し、前培養（ＣＯ２濃度：５％、３７℃、以下培養と略す）した。６日後、常法に従い、トリプシン処理及び遠心分離により細胞を集めた。次に、得られた細胞を、１２ウエルマイクロプレートに２×１０４個／ウエルになるように播種した。５日間培養後、新鮮培地に交換後、組織培養用純水に溶解した酸性キシロオリゴ糖サンプルを培地に添加し、更に５日間培養した。培養後、培地を採取し、ヒアルロン酸の測定を行った。ヒアルロン酸の測定は、市販のヒアルロン酸測定キット（中外製薬（株）製）を用いて行った。また、プレート中の細胞は、常法に従い、トリプシン処理によってプレートから回収し、細胞数を測定した。ヒアルロン酸産生促進作用の評価は、実施例１と同様に、ヒアルロン酸産生促進率によって行った。
【００３６】
酸性キシロオリゴ糖組成物ＵＸ２のヒアルロン酸産生促進試験の結果を表２に示す。
【表２】
【００３７】
ＵＸ２添加群では、コントロール群と比較して、正常ヒト表皮角化細胞が産生するヒアルロン酸量が増加していることが認められた。
【００３８】
〈実施例３〉
実施例１及び実施例２に記載の方法で、それぞれ正常ヒト皮膚線維芽細胞および正常ヒト表皮角化細胞を培養し、培養終了後、アラマーブルー（旭テクノグラス（株）製）を用いた常法に従って、吸光度を測定（２波長測定：５７０ｎｍ−６００ｎｍ）し、下記の計算式により細胞増殖阻害率を算出した。なお、細胞増殖阻害率は細胞毒性に相当する。細胞増殖阻害率がマイナス（−）の場合は、細胞増殖亢進又は細胞賦活活性があることを示す。酸性キシロオリゴ糖サンプル無添加による培養系をコントロールとした。
【００３９】
細胞増殖阻害率（％）＝１００−１００×〔（ａ−ｂ）／（ｃ−ｂ）〕
ａ：酸性キシロオリゴ糖サンプル添加培養における吸光度
ｂ：ブランク（培地のみ）の吸光度
ｃ：酸性キシロオリゴ糖サンプル無添加培養における吸光度
【００４０】
酸性キシロオリゴ糖組成物ＵＸ２の細胞増殖阻害率測定試験の結果を表３に示す。
【表３】
【００４１】
表３より明らかなように、酸性キシロオリゴ糖組成物ＵＸ２は、何れの濃度でも細胞毒性を示さなかった。
【００４２】
〈実施例４〉
マウスを用いた安全性試験及び安定性試験は以下のように実施した。酸性キシロオリゴ糖組成物ＵＸ２の２％溶液（５０％エタノール）１００μｌをＣ３Ｈマウス（雄、６週齢、日本チャールズリバー（株）製）の背皮に約１ヶ月間連日塗布した結果、背皮の炎症等の副作用は観察されなかった。また、１ヶ月後の上記ＵＸ２溶液のイオンクロマトグラムに於ける変化は認められなかった。これらのことは、酸性キシロオリゴ糖組成物の高い安全性と安定性を示す。
【００４３】
〈実施例５〉
酸性キシロオリゴ糖組成物ＵＸ２を用いて、ヒアルロン酸産生促進作用を付与した下記組成の化粧水を常法にて製造した。
処方：（１）１，３−ブチレングリコール、３．０％ （２）ソルビトール、２．０％ （３）エタノール、１０．０％ （４）カルボキシビニルポリマー１％水溶液、１０．０％ （５）ＵＸ２、１．０％ （６）パラオキシ安息香酸メチル、０．１％ （７）香料、０．１％ （８）精製水、７３．８％
製造法：（６）（７）を（３）に溶解して（８）に加え、（１）（２）（５）を順次添加して混合した後、（４）を加え、混合し、均一化した。
【００４４】
〈実施例６〉
酸性キシロオリゴ糖組成物ＵＸ２を用いて、ヒアルロン酸産生促進作用を付与した下記組成の軟膏を常法にて製造した。
処方：（１）白色ワセリン、２５．０％ （２）ステアリルアルコール、１５．０％ （３）ラウリル硫酸ナトリウム、１．０％ （４）パラオキシ安息香酸ブチル、０．１％ （５）ＵＸ２、１．０％ （６）精製水、５７．９％
製造法：（１）〜（４）の油相成分を混合し、７５℃に加熱して、溶解、均一化する。７５℃に加熱した（６）に油相成分を添加して乳化し、冷却後４０℃にて（５）を順次添加、混合した後、均一化した。
【００４５】
【発明の効果】
本発明で得られる酸性キシロオリゴ糖組成物を含有したヒアルロン酸産生促進剤は、優れた薬理活性を有しており、ヒト皮膚の老化防止（シワの発生予防や弾力保持）、関節炎等の予防及び治療、熱傷の初期の治療に利用することができる。特に本発明のヒアルロン酸産生促進剤を化粧料、医薬部外品及び医薬品に配合することにより、細胞外マトリックスの一つであるヒアルロン酸産生を促進し、皮膚の水分保持能力や弾力性を保持してシワの発生を防ぐ抗シワ剤として有用である。また、工業的に大量に安価に製造することができ、同一の製品が安定して生産でき、保存性が良いという利点がある。
【発明の属する技術分野】
本発明は、化粧品、医薬部外品、医薬品及び食品分野に於いて使用される新規なヒアルロン酸産生促進剤に関する。より詳細には、優れた生理活性を有し、しかも安全性の高いヒアルロン酸産生促進剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒアルロン酸は、皮膚、靱帯、関節液、目の硝子体等、生体内に広く分布しており、プロテオグリカンと結合したゼリー状の細胞間マトリックスを形成して、細胞や組織の保持機能、及び機械的外力や細菌感染などに対する保護機能を果たしている。また、皮膚や関節に於ける細胞機能の低下によるヒアルロン酸の減少が、皮膚の乾燥、弾力性の減少及びシワ発生等の皮膚老化、あるいは関節の湿潤性悪化による関節痛等の原因の一つとされている。
【０００３】
老化した皮膚の改善剤として、ヒアルロン酸やコラーゲンを配合した化粧料が数多く提案されているが、これらは皮膚表面における保湿効果を発揮するだけであり、本質的に皮膚の乾燥、弾力性の減少及びシワ等を改善し得るものではない。また、皮膚細胞賦活剤として各種のビタミン類や生薬類を配合した化粧料も提案されているが、これらも老化した皮膚の改善、治療には至っていない。
【０００４】
一方、関節液中に含まれるヒアルロン酸は、関節軟骨の表面を覆い、関節機能の円滑な作動に役立っている。慢性関節リウマチの場合、関節液中のヒアルロン酸濃度が低下し、同時に関節液の粘度も低下する〔Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、ｖｏｌ．１０、Ｐ３５７（１９６７）〕。この疾患においては、ヒアルロン酸ナトリウムの関節注入療法による疼痛抑制等の症状改善が報告されている〔炎症、１１巻、Ｐ１６、（１９９１）〕。同様に、外傷性関節症、骨関節炎や変形性関節症においてもヒアルロン酸の関節注入療法による改善効果が報告されている〔結合組織と疾患（講談社）、Ｐ２４６、（１９８０）〕。しかしながら、上記疾患の治療は長期にわたり、医師の処方を必要とする為、日常生活の中で手軽に使用できるものではない。
【０００５】
また、熱傷受傷後の治癒過程で、壊死組織の下方から増生してくる肉芽組織の初期から組織全体が肉芽組織に置き換えられるまでの期間では、肉芽中にヒアルロン酸が著しく増加することが知られており〔結合組織と疾患（講談社）、Ｐ１５３、（１９８０）〕、熱傷の初期の治療薬として、ヒアルロン酸産生促進剤が期待されている。
【０００６】
ヒト細胞のヒアルロン酸産生を促進する薬剤として、インシュリン様成長因子−１や上皮細胞成長因子〔Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１０１４、Ｐ３０５（１９８９）〕及びインターロイキン−１〔「日本産科婦人科学会」雑誌、４１巻、Ｐ１９４３（１９８９）〕等のサイトカインが知られているが、いずれも化粧品、医薬部外品や医薬品として簡便かつ安心して使用できるものではない。
【０００７】
特許第３２１３１８９号公報には、酵母エキスを有効成分として含有するヒアルロン酸産生促進剤が、特開２００１−１１４６３７号公報にはドクダミまたはセイヨウノコギリの花の抽出物を含有するヒアルロン酸産生促進剤が記載され、特開２００１−１５８７２８号公報にはオウバク、レモン、ユズの抽出物を含有するヒアルロン酸産生促進剤が記載されているが、いずれも抽出物の安定性、効果の安定性は定かではない。
【０００８】
なお、酸性キシロオリゴ糖の生理効果に関しては、水耕栽培に於けるスギ挿穂の発根促進効果の記載（セルラーゼ研究会報第１６巻２００１年）、育毛剤（特願２００１−３８８８８１）、メラニン生成抑制剤（特願２００２−１７１３７）及び抗炎症剤（特願２００２−１９３７８）としての提案があるのみで、ヒアルロン酸産生促進剤に関する開示はなされていない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明に於いては、ヒアルロン酸産生促進効果に優れ、かつ安全性及び安定性が高く、抗シワ剤、関節リウマチや関節炎等の治療薬、熱傷初期の治療薬等として人体に適用可能なヒアルロン酸産生促進剤を提供することを目的とした。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決する為、培養ヒアルロン酸産生細胞に於けるヒアルロン酸産生を指標として、ヒアルロン酸産生促進剤のスクリーニングを行った。その結果、ウロン酸残基が付加した酸性キシロオリゴ糖組成物が優れたヒアルロン酸産生促進効果を有することを見出し、安全性及び安定性も優れることより、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は以下の構成を採用する。即ち、本発明の第１は、「キシロオリゴ糖分子中にウロン酸残基を有する酸性キシロオリゴ糖を有効成分とするヒアルロン酸産生促進剤」である。
【００１２】
本発明の第２は、前記第１発明において、該酸性キシロオリゴ糖はキシロースの重合度が異なるオリゴ糖の混合組成物であり、平均重合度が２．０〜３．０であることを特徴とするヒアルロン酸産生促進剤である。
【００１３】
本発明の第３は、前記第１または第２の発明において、前記酸性キシロオリゴ糖が、「リグノセルロース材料を酵素的及び／又は物理化学的に処理してキシロオリゴ糖成分とリグニン成分の複合体を得、次いで該複合体を酸加水分解処理してキシロオリゴ糖混合物を得、得られるキシロオリゴ糖混合物から、１分子中に少なくとも１つ以上のウロン酸残基を側鎖として有するキシロオリゴ糖を分解して得たもの」であることを特徴とするヒアルロン酸産生促進剤である。
【００１４】
本発明の第４は、前記第１〜第３の発明において、ウロン酸がグルクロン酸もしくは４−Ｏ−メチル−グルクロン酸であることを特徴とするヒアルロン酸産生促進剤である。
【００１５】
【発明実施の形態】
以下、本発明の構成について詳述する。キシロオリゴ糖とは、キシロースの２量体であるキシロビオース、３量体であるキシロトリオース、あるいは４量体〜２０量体程度のキシロースの重合体を言う。本発明で使用する酸性キシロオリゴ糖とは、キシロオリゴ糖１分子中に少なくとも１つ以上のウロン酸残基を有するものを言う。
また、キシロースの重合度が異なるオリゴ糖の混合組成物であっても良い。一般的には、天然物から製造するために、このような組成物として得られることが多く、以下、主として酸性キシロオリゴ糖組成物について説明する。
該組成物は、平均重合度で示す数値は正規分布をとる酸性キシロオリゴ糖のキシロース鎖長の平均値で、２．０〜１１．０が好ましく、２．０〜３．０がより好ましい。キシロース鎖長の上限と下限との差は１０以下が好ましく、２以下がより好ましい。ウロン酸は天然では、ペクチン、ペクチン酸、アルギン酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸等の種々の生理活性を持つ多糖の構成成分として知られている。本発明におけるウロン酸としては特に限定されないが、グルクロン酸もしくは４−Ｏ−メチル−グルクロン酸が好ましい。
【００１６】
上記のような酸性キシロオリゴ糖組成物を得ることが出来れば、その製法は特に限定されないが、（１）木材からキシランを抽出し、それを酵素的に分解する方法（セルラーゼ研究会発行、セルラーゼ研究会報第１６巻、２００１年６月１４日発行、Ｐ１７−２６）と、（２）リグノセルロース材料を酵素的及び／又は物理化学的に処理してキシロオリゴ糖成分とリグニン成分の複合体を得、次いで該複合体を酸加水分解処理してキシロオリゴ糖混合物を得、得られるキシロオリゴ糖混合物から、１分子中に少なくとも１つ以上のウロン酸残基を側鎖として有するキシロオリゴ糖を分離する方法が挙げられる。
特に、（２）の方法が５〜１０量体のように比較的高い重合度のものを大量に安価に製造することが可能である点で好ましく、以下にその概要を示す。
【００１７】
酸性オリゴ糖組成物は、化学パルプ由来のリグノセルロース材料を原料とし、加水分解工程、濃縮工程、希酸処理工程、精製工程を経て得ることができる。加水分解工程では、希酸処理、高温高圧の水蒸気（蒸煮・爆砕）処理もしくは、ヘミセルラーゼによってリグノセルロース中のキシランを選択的に加水分解し、キシロオリゴ糖とリグニンからなる高分子量の複合体を中間体として得る。濃縮工程では逆浸透膜等により、キシロオリゴ糖−リグニン様物質複合体が濃縮され、低重合度のオリゴ糖や低分子の夾雑物などを除去することができる。濃縮工程は逆浸透膜を用いることが好ましいが、限外濾過膜、塩析、透析などでも可能である。得られた濃縮液の希酸処理工程により、複合体からリグニン様物質が遊離し、酸性キシロオリゴ糖と中性キシロオリゴ糖を含む希酸処理液を得ることができる。この時、複合体から切り離されたリグニン様物質は酸性下で縮合し沈殿するのでセラミックフィルターや濾紙などを用いたろ過等により除去することができる。希酸処理工程では、酸による加水分解を用いることが好ましいが、リグニン分解酵素などを用いた酵素分解などでも可能である。
【００１８】
精製工程は、限外濾過工程、脱色工程、吸着工程からなる。一部のリグニン様物質は可溶性高分子として溶液中に残存するが、限外濾過工程で除去され、着色物質等の夾雑物は活性炭を用いた脱色工程によってそのほとんどが取り除かれる。限外濾過工程は限外濾過膜を用いることが好ましいが、逆浸透膜、塩析、透析などでも可能である。こうして得られた糖液中には酸性キシロオリゴ糖と中性キシロオリゴ糖が溶解している。イオン交換樹脂を用いた吸着工程により、この糖液から酸性キシロオリゴ糖のみを取り出すことができる。糖液をまず強陽イオン交換樹脂にて処理し、糖液中の金属イオンを除去する。ついで強陰イオン交換樹脂を用いて糖液中の硫酸イオンなどを除去する。この工程では、硫酸イオンの除去と同時に弱酸である有機酸の一部と着色成分の除去も同時に行っている。強陰イオン交換樹脂で処理された糖液はもう一度強陽イオン交換樹脂で処理し更に金属イオンを除去する。最後に弱陰イオン交換樹脂で処理し、酸性キシロオリゴ糖を樹脂に吸着させる。
【００１９】
樹脂に吸着した酸性オリゴ糖を、低濃度の塩（ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２など）によって溶出させることにより、夾雑物を含まない酸性キシロオリゴ糖溶液を得ることができる。この溶液を、例えば、スプレードライや凍結乾燥処理により、白色の酸性キシロオリゴ糖組成物の粉末を得ることができる。
【００２０】
化学パルプ由来のリグノセルロースを原料とし、キシロオリゴ糖とリグニンからなる高分子量の複合体を中間体とした酸性キシロオリゴ糖組成物の上記製造法のメリットは、経済性とキシロースの平均重合度の高い酸性キシロオリゴ糖組成物が容易に得られる点にある。平均重合度は、例えば、希酸処理条件を調節するか、再度ヘミセルラーゼで処理することによって変えることが可能である。また、弱陰イオン交換樹脂溶出時に用いる溶出液の塩濃度を変化させることによって、１分子あたりに結合するウロン酸残基の数が異なる酸性キシロオリゴ糖組成物を得ることもできる。さらに、適当なキシラナーゼ、ヘミセルラーゼを作用させることによってウロン酸結合部位が末端に限定された酸性キシロオリゴ糖組成物を得ることも可能である。
【００２１】
このようにして得られた酸性キシロオリゴ糖組成物は、エタノール、プロパノール及びイソプロパノール等の低級アルコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール及びグリセリン等の多価アルコール、希酸、希アルカリの水溶液等に溶解してヒアルロン酸産生促進剤に含有させる。或いは、アルコール、エステル等を含有する基材成分に直接添加、溶解して含有させることもできる。また、マイクロカプセル化やリポソームに内含させて添加してもよい。ヒアルロン酸産生促進剤に於ける酸性キロオリゴ糖または、酸性キシロオリゴ糖組成物の含有率としては、０．００１〜２０％（以下全て質量％）の範囲で使用することができるが、０．０１〜１０％がより好ましい。
【００２２】
本発明の酸性キシロオリゴ糖組成物を配合したヒアルロン酸産生促進剤は、ローション、乳剤、クリーム、軟膏等の形態をとることが出来る。また更に、柔軟性化粧水、収れん性化粧品、洗浄用化粧水等の化粧水類、エモリエントクリーム、モイスチュアクリーム、クレンジングクリーム、メイクアップクリーム等のクリーム類、エモリエント乳液、モイスチュア乳液、ナリシング乳液、クレンジング乳液等の乳液類、ゼリー状パック、ピールオフパック、洗い流しパック、粉末パック等のパック類、美容液及び洗顔料といった種々の製剤形態のヒアルロン酸産生促進剤としても配合することが出来る。
【００２３】
本発明に於いては、更に、他のヒアルロン酸産生促進成分や、保湿剤、抗炎症剤、紫外線吸収剤等、他の有効成分を配合することも出来、抗シワ用化粧料、皮膚保護用化粧料、肌荒れ改善用化粧料等の薬用化粧料、医薬部外品あるいは医薬品として提供することも出来る。
【００２４】
【実施例】
以下、本発明について実施例により詳説する。本発明はこれにより限定されるものではない。まず、各測定法の概要、本発明で有効成分として含有させた酸性キシロオリゴ糖組成物ＵＸ２の調製例１を示す。
〈測定法の概要〉
（１） 全糖量の定量：
全糖量は検量線をＤ−キシロース（和光純薬工業（株）製）を用いて作製し、フェノール硫酸法（還元糖の定量法、学会出版センター発行）にて定量した。
（２） 還元糖量の定量：
還元糖量は検量線をＤ−キシロース（和光純薬工業（株）製）を用いて作製、ソモジ−ネルソン法（還元糖の定量法、学会出版センター発行）にて定量した。
（３） ウロン酸量の定量：
ウロン酸は検量線をＤ−グルクロン酸（和光純薬工業（株）製）を用いて作製、カルバゾール硫酸法（還元糖の定量法、学会出版センター発行）にて定量した。
（４） 平均重合度の決定法：
サンプル糖液を５０℃に保ち１５０００ｒｐｍにて１５分遠心分離し不溶物を除去し上清液の全糖量を還元糖量（共にキシロース換算）で割って平均重合度を求めた。
（５） 酸性キシロオリゴ糖の分析方法：
オリゴ糖鎖の分布はイオンクロマトグラフ（ダイオネクス社製、分析用カラム：Ｃａｒｂｏ Ｐａｃ ＰＡ−１０）を用いて分析した。分離溶媒には１００ｍＭ ＮａＯＨ溶液を用い、溶出溶媒には前述の分離溶媒に酢酸ナトリウムを５００ｍＭとなるように添加し、溶液比で、分離溶媒：溶出溶媒＝１０：０〜４：６となるような直線勾配を組み分離した。得られたクロマトグラムより、キシロース鎖長の上限と下限との差を求めた。
（６） オリゴ糖１分子あたりのウロン酸残基数の決定法
サンプル糖液を５０℃に保ち１５０００ｒｐｍにて１５分遠心分離し不溶物を除去し上清液のウロン酸量（Ｄ−グルクロン酸換算）を還元糖量（キシロース換算）で割ってオリゴ糖１分子あたりのウロン酸残基数を求めた。
（７） 酵素力価の定義：
酵素として用いたキシラナーゼの活性測定にはカバキシラン（シグマ社製）を用いた。酵素力価の定義はキシラナーゼがキシランを分解することで得られる還元糖の還元力をＤＮＳ法（還元糖の定量法、学会出版センター発行）を用いて測定し、１分間に１マイクロモルのキシロースに相当する還元力を生成させる酵素量を１ユニットとした。
【００２５】
〈酸性キシロオリゴ糖組成物の調製例〉
〈調製例１〉
混合広葉樹チップ（国内産広葉樹７０％、ユーカリ３０％）を原料として、クラフト蒸解及び酸素脱リグニン工程により、酸素脱リグニンパルプスラリー（カッパー価９．６、パルプ粘度２５．１ｃｐｓ）を得た。スラリーからパルプを濾別、洗浄した後、パルプ濃度１０％、ｐＨ８に調製したパルプスラリーを用いて以下のキシラナーゼによる酵素処理を行った。
【００２６】
バチルスｓｐ．Ｓ−２１１３株（独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター、寄託菌株ＦＥＲＭ ＢＰ−５２６４）の生産するキシラナーゼを１単位／パルプｇとなるように添加した後、６０℃で１２０分間処理した。その後、ろ過によりパルプ残渣を除去し、酵素処理液１０５０Ｌを得た。
【００２７】
次に、得られた酵素処理液を濃縮工程、希酸処理工程、精製工程の順に供した。
濃縮工程では、逆浸透膜（日東電工（株）製、ＲＯ ＮＴＲ−７４１０）を用いて濃縮液（４０倍濃縮）を調製した。希酸処理工程では、得られた濃縮液のｐＨを３．５に調整した後、１２１℃で６０分間加熱処理し、リグニンなどの高分子夾雑物の沈殿を形成させた。さらに、この沈殿をセラミックフィルターろ過で取り除くことにより、希酸処理溶液を得た。
【００２８】
精製工程では、限外濾過・脱色工程、吸着工程の順に供した。限外濾過・脱色工程では、希酸処理溶液を限外濾過膜（オスモニクス社製、分画分子量８０００）を通過させた後、活性炭（和光純薬（株）製）７７０ｇの添加及びセラミックフィルターろ過により脱色処理液を得た。吸着工程では、脱色処理液を強陽イオン交換樹脂（三菱化学（株）製ＰＫ２１８）、強陰イオン交換樹脂（三菱化学（株）製ＰＡ４０８）、強陽イオン交換樹脂（三菱化学（株）製ＰＫ２１８）各１００ｋｇを充填したカラムに順次通過させた後、弱陰イオン交換樹脂（三菱化学（株）製ＷＡ３０）１００ｋｇを充填したカラムに供した。この弱陰イオン交換樹脂充填カラムから７５ｍＭ ＮａＣｌ溶液によって溶出した溶液をスプレードライ処理することによって、酸性キシロオリゴ糖組成物の粉末（全糖量３５３ｇ、回収率１３．１％）を得た。以下、この酸性キシロオリゴ糖組成物をＵＸ１０とする。前述の測定方法により、ＵＸ１０は平均重合度１０．３、キシロース鎖長の上限と下限との差は１０、酸性キシロオリゴ糖１分子あたりウロン酸残基を１つ含む糖組成化合物であった。
【００２９】
得られたＵＸ１０の１０％水溶液１００ｍｌに、スミチームＸ（新日本化学工業（株）製のキシラナーゼ）５０ｍｇを添加し、６０℃、２０時間反応後、弱アニオン交換樹脂（ＷＡ３０）１０ｇを充填したカラムに供した。カラムを水洗した後、７５ｍＭ ＮａＣｌ溶液によって溶出した溶液を凍結乾燥することによって、酸性キシロオリゴ糖組成物粉末（全糖量２．１ｇ、回収率２１％）を得た。以下、この酸性キシロオリゴ糖組成物をＵＸ２とする。前述の測定方法により、ＵＸ２は平均重合度２．３、キシロース鎖長の上限と下限との差は２、酸性キシロオリゴ糖１分子あたりウロン酸残基を１つ含む糖組成化合物であった。
【００３０】
次に、得られた酸性キシロオリゴ糖組成物を用いて行ったヒアルロン酸産生促進試験、細胞増殖阻害率測定試験、マウスを用いた安全性試験及び安定性試験の概要と結果を実施例１〜４に示す。また、酸性キシロオリゴ糖組成物を含有するヒアルロン酸産生促進剤（化粧水及び軟膏）の処方と製造法を実施例５及び実施例６に示す。
【００３１】
〈実施例１〉
ヒアルロン酸産生促進試験を、正常ヒト皮膚線維芽細胞（クラボウ：ＮＨＤＦ）を用いて実施した。以下にその概要を示す。まず、正常ヒト皮膚線維芽細胞を培地（ＦＢＳ（大日本製薬（株）製）１０％を含むＭＥＭダルベッコ培地（大日本製薬（株）製））５ｍｌを入れたフラスコに播種し、前培養（ＣＯ２濃度：５％、３７℃、以下培養と略す）した。６日後、常法に従い、トリプシン処理及び遠心分離により細胞を集めた。次に、得られた細胞を、１２ウエルマイクロプレートに２×１０４個／ウエルになるように播種した。４日間培養後、ＦＢＳを０．２５％含むＭＥＭダルベッコ培地（以下培地と略す）に交換後、組織培養用純水に溶解した酸性キシロオリゴ糖サンプルを培地に添加し、更に４日間培養した。培養後、培地を採取し、ヒアルロン酸の測定を行った。ヒアルロン酸の測定は、市販のヒアルロン酸測定キット（中外製薬（株）製）を用いて行った。また、プレート中の細胞は、常法に従い、トリプシン処理によってプレートから回収し、細胞数を測定した。ヒアルロン酸産生促進作用はヒアルロン酸産生促進率により評価した。下記の計算式によりヒアルロン酸産生促進率を算出した。なお、酸性キシロオリゴ糖サンプル無添加による培養系をコントロールとした。
【００３２】
ヒアルロン酸産生促進率（％）＝〔（ａ／ｂ）／（ｃ／ｄ）〕×１００
ａ：酸性キシロオリゴ糖サンプル添加培養におけるヒアルロン酸産生量
ｂ：酸性キシロオリゴ糖サンプル無添加培養におけるヒアルロン酸産生量
ｃ：酸性キシロオリゴ糖サンプル添加培養におけるプレート中の細胞数
ｄ：酸性キシロオリゴ糖サンプル無添加培養におけるプレート中の細胞数
【００３３】
酸性キシロオリゴ糖組成物ＵＸ２のヒアルロン酸産生促進試験の結果を表１に示す。
【表１】
ＵＸ２添加群では、コントロール群と比較して、正常ヒト皮膚線維芽細胞が産生するヒアルロン酸量が増加していることが認められた。
【００３５】
〈実施例２〉
ヒアルロン酸産生促進試験を、正常ヒト表皮角化細胞（クラボウ：ＮＨＥＫ）を用いて実施した。以下にその概要を示す。まず、正常ヒト表皮角化細胞を培地（増殖添加剤ＨＫＧＳ（クラボウ製）を含むＭｅｄｉｕｍ１５４Ｓ培地（クラボウ製）、以下培地と略す）５ｍｌを入れたフラスコに播種し、前培養（ＣＯ２濃度：５％、３７℃、以下培養と略す）した。６日後、常法に従い、トリプシン処理及び遠心分離により細胞を集めた。次に、得られた細胞を、１２ウエルマイクロプレートに２×１０４個／ウエルになるように播種した。５日間培養後、新鮮培地に交換後、組織培養用純水に溶解した酸性キシロオリゴ糖サンプルを培地に添加し、更に５日間培養した。培養後、培地を採取し、ヒアルロン酸の測定を行った。ヒアルロン酸の測定は、市販のヒアルロン酸測定キット（中外製薬（株）製）を用いて行った。また、プレート中の細胞は、常法に従い、トリプシン処理によってプレートから回収し、細胞数を測定した。ヒアルロン酸産生促進作用の評価は、実施例１と同様に、ヒアルロン酸産生促進率によって行った。
【００３６】
酸性キシロオリゴ糖組成物ＵＸ２のヒアルロン酸産生促進試験の結果を表２に示す。
【表２】
ＵＸ２添加群では、コントロール群と比較して、正常ヒト表皮角化細胞が産生するヒアルロン酸量が増加していることが認められた。
【００３８】
〈実施例３〉
実施例１及び実施例２に記載の方法で、それぞれ正常ヒト皮膚線維芽細胞および正常ヒト表皮角化細胞を培養し、培養終了後、アラマーブルー（旭テクノグラス（株）製）を用いた常法に従って、吸光度を測定（２波長測定：５７０ｎｍ−６００ｎｍ）し、下記の計算式により細胞増殖阻害率を算出した。なお、細胞増殖阻害率は細胞毒性に相当する。細胞増殖阻害率がマイナス（−）の場合は、細胞増殖亢進又は細胞賦活活性があることを示す。酸性キシロオリゴ糖サンプル無添加による培養系をコントロールとした。
【００３９】
細胞増殖阻害率（％）＝１００−１００×〔（ａ−ｂ）／（ｃ−ｂ）〕
ａ：酸性キシロオリゴ糖サンプル添加培養における吸光度
ｂ：ブランク（培地のみ）の吸光度
ｃ：酸性キシロオリゴ糖サンプル無添加培養における吸光度
【００４０】
酸性キシロオリゴ糖組成物ＵＸ２の細胞増殖阻害率測定試験の結果を表３に示す。
【表３】
表３より明らかなように、酸性キシロオリゴ糖組成物ＵＸ２は、何れの濃度でも細胞毒性を示さなかった。
【００４２】
〈実施例４〉
マウスを用いた安全性試験及び安定性試験は以下のように実施した。酸性キシロオリゴ糖組成物ＵＸ２の２％溶液（５０％エタノール）１００μｌをＣ３Ｈマウス（雄、６週齢、日本チャールズリバー（株）製）の背皮に約１ヶ月間連日塗布した結果、背皮の炎症等の副作用は観察されなかった。また、１ヶ月後の上記ＵＸ２溶液のイオンクロマトグラムに於ける変化は認められなかった。これらのことは、酸性キシロオリゴ糖組成物の高い安全性と安定性を示す。
【００４３】
〈実施例５〉
酸性キシロオリゴ糖組成物ＵＸ２を用いて、ヒアルロン酸産生促進作用を付与した下記組成の化粧水を常法にて製造した。
処方：（１）１，３−ブチレングリコール、３．０％ （２）ソルビトール、２．０％ （３）エタノール、１０．０％ （４）カルボキシビニルポリマー１％水溶液、１０．０％ （５）ＵＸ２、１．０％ （６）パラオキシ安息香酸メチル、０．１％ （７）香料、０．１％ （８）精製水、７３．８％
製造法：（６）（７）を（３）に溶解して（８）に加え、（１）（２）（５）を順次添加して混合した後、（４）を加え、混合し、均一化した。
【００４４】
〈実施例６〉
酸性キシロオリゴ糖組成物ＵＸ２を用いて、ヒアルロン酸産生促進作用を付与した下記組成の軟膏を常法にて製造した。
処方：（１）白色ワセリン、２５．０％ （２）ステアリルアルコール、１５．０％ （３）ラウリル硫酸ナトリウム、１．０％ （４）パラオキシ安息香酸ブチル、０．１％ （５）ＵＸ２、１．０％ （６）精製水、５７．９％
製造法：（１）〜（４）の油相成分を混合し、７５℃に加熱して、溶解、均一化する。７５℃に加熱した（６）に油相成分を添加して乳化し、冷却後４０℃にて（５）を順次添加、混合した後、均一化した。
【００４５】
【発明の効果】
本発明で得られる酸性キシロオリゴ糖組成物を含有したヒアルロン酸産生促進剤は、優れた薬理活性を有しており、ヒト皮膚の老化防止（シワの発生予防や弾力保持）、関節炎等の予防及び治療、熱傷の初期の治療に利用することができる。特に本発明のヒアルロン酸産生促進剤を化粧料、医薬部外品及び医薬品に配合することにより、細胞外マトリックスの一つであるヒアルロン酸産生を促進し、皮膚の水分保持能力や弾力性を保持してシワの発生を防ぐ抗シワ剤として有用である。また、工業的に大量に安価に製造することができ、同一の製品が安定して生産でき、保存性が良いという利点がある。
Claims (4)
- キシロオリゴ糖分子中にウロン酸残基を有する酸性キシロオリゴ糖を有効成分とするヒアルロン酸産生促進剤。
- 該酸性キシロオリゴ糖が、キシロースの重合度が異なるオリゴ糖の混合組成物であり、平均重合度が２．０〜３．０であることを特徴とする請求項１に記載のヒアルロン酸産生促進剤。
- 前記酸性キシロオリゴ糖が、「リグノセルロース材料を酵素的及び／又は物理化学的に処理してキシロオリゴ糖成分とリグニン成分の複合体を得、次いで該複合体を酸加水分解処理してキシロオリゴ糖混合物を得、得られるキシロオリゴ糖混合物から、１分子中に少なくとも１つ以上のウロン酸残基を側鎖として有するキシロオリゴ糖を分解して得たもの」であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のヒアルロン酸産生促進剤。
- ウロン酸がグルクロン酸もしくは４−Ｏ−メチル−グルクロン酸であることを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれかに記載のヒアルロン酸産生促進剤。
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