WO1999024447A1 - Medicaments, aliments ou boissons renfermant des substances physiologiquement activees derivees d'algues - Google Patents

Medicaments, aliments ou boissons renfermant des substances physiologiquement activees derivees d'algues Download PDF

Info

Publication number
WO1999024447A1
WO1999024447A1 PCT/JP1998/005065 JP9805065W WO9924447A1 WO 1999024447 A1 WO1999024447 A1 WO 1999024447A1 JP 9805065 W JP9805065 W JP 9805065W WO 9924447 A1 WO9924447 A1 WO 9924447A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
compound
group
compound selected
agarobiose
aldehyde
Prior art date
Application number
PCT/JP1998/005065
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Tatsuji Enoki
Hiroaki Sagawa
Takanari Tominaga
Eiji Nishiyama
Nobuto Koyama
Takeshi Sakai
Fu-Gong Yu
Katsushige Ikai
Ikunoshin Kato
Original Assignee
Takara Shuzo Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to KR1020007004993A priority Critical patent/KR100544856B1/ko
Priority to EP98953005A priority patent/EP1038879B1/en
Priority to EA200000512A priority patent/EA004148B1/ru
Priority to CA002309691A priority patent/CA2309691A1/en
Priority to JP2000520455A priority patent/JP4007760B2/ja
Priority to US09/554,235 priority patent/US6475990B1/en
Application filed by Takara Shuzo Co., Ltd. filed Critical Takara Shuzo Co., Ltd.
Priority to AU10517/99A priority patent/AU753435B2/en
Priority to DE69840706T priority patent/DE69840706D1/de
Publication of WO1999024447A1 publication Critical patent/WO1999024447A1/ja
Priority to US10/228,195 priority patent/US6911432B2/en
Priority to US11/034,243 priority patent/US7417031B2/en
Priority to US12/222,492 priority patent/US20100137228A2/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/02—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • A01N43/04—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L3/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
    • A23L3/34—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals
    • A23L3/3454—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
    • A23L3/3463—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A23L3/3472—Compounds of undetermined constitution obtained from animals or plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L3/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
    • A23L3/34—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals
    • A23L3/3454—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
    • A23L3/3463—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A23L3/3544—Organic compounds containing hetero rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L3/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
    • A23L3/34—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals
    • A23L3/3454—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
    • A23L3/3463—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A23L3/3562—Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/34—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide
    • A61K31/341—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide not condensed with another ring, e.g. ranitidine, furosemide, bufetolol, muscarine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/60—Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/10—Laxatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/22—Anxiolytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/02—Non-specific cardiovascular stimulants, e.g. drugs for syncope, antihypotensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Definitions

  • the present invention relates to the use of a bioactive substance derived from algae, and more particularly to a medicament, an antioxidant, a freshness preserving agent, a cosmetic containing the bioactive substance as an active ingredient, and a functionality containing the bioactive composition. It relates to foods or beverages, and sugars for expressing functions. Background of the Invention
  • apoptosis also referred to as apoptosis; self-destruction or self-destruction of cells
  • apoptosis has attracted attention for the death of cell tissues.
  • This apoptosis unlike necrosis, which is pathological cell death, is death that is integrated into the cell's own genes from the beginning. In other words, some external or internal factors trigger the activation of the gene that programs apoptosis, resulting in the biosynthesis of the programmed death protein and, in some cases, the intracellular form of the inactive form. Is activated. It is thought that the activated programmed death protein thus generated degrades the cells themselves, leading to death.
  • Oligosaccharides derived from algae such as agar are expected to be developed as food materials (Food Chemical, 1988--2, 40-44; Food Chemical I, 4,
  • the object of the present invention is to develop a highly safe substance having a physiological function such as an apoptosis-inducing action derived from a natural product, and to provide a disease which is sensitive to the compound, such as an apoptosis-inducing agent containing the substance as an active ingredient. It is intended to provide a pharmaceutical product for use, a functional food or drink containing the substance as a constituent.
  • a second aspect of the present invention is a compound selected from 3,6-anhydrogalactopyranose represented by the formula 1, an aldehyde thereof, a hydrate thereof, and a 2-O-methylated product thereof, and the compound And at least one compound selected from the group consisting of soluble saccharide compounds having a reducing end at the reducing end, for improving symptoms of a disease susceptible to these compounds or for preventing the disease. is there.
  • a third embodiment of the present invention relates to a compound selected from 3,6-anhydrogalacttopyranose represented by the formula 1, an aldehyde thereof, a hydrate thereof, and a 2-methylated product thereof, and the compound.
  • An antioxidant comprising, as an active ingredient, at least one compound selected from the group consisting of soluble sugar compounds containing
  • a fourth aspect of the present invention is a food or drink comprising the antioxidant of the third aspect of the present invention.
  • a fifth aspect of the present invention provides a compound selected from 3,6-anhydrogalactopyranose represented by the formula 1, an aldehyde thereof, a hydrate thereof, and a 2-O-methylated product thereof, and the compound Is an antioxidant saccharide selected from the group consisting of soluble saccharide compounds containing
  • a sixth aspect of the present invention relates to a compound selected from 3,6-anhydrogalactopyranose represented by the formula 1, an aldehyde thereof, a hydrate thereof, and a 2-O-methylated product thereof, and the compound A freshness preserving agent comprising as an active ingredient at least one compound selected from the group consisting of soluble sugar compounds containing
  • a seventh aspect of the present invention is a process for preparing agarobiobiose, agarotetraose, agaguchihexaose, agarocotaose, kappa-force raviose and; 3-D-galactobilanosyl-3,6-anhydro-12-O —
  • a cosmetic comprising at least one sugar compound selected from the group consisting of methyl-L-galactose as an active ingredient.
  • An eighth aspect of the present invention relates to a compound selected from 3,6-anhydrogalactopyranose represented by the formula 1, an aldehyde thereof, a hydrate thereof, and a 2-methylated product thereof, and the compound
  • An acidic food or drink comprising at least one compound selected from the group consisting of soluble sugar compounds containing
  • a further embodiment of the present invention provides a compound selected from 3,6-anhydrogalactobilanose represented by the formula 1, an aldehyde thereof, a hydrate thereof, a 2-methylated product thereof, and a compound containing the compound.
  • At least one pharmaceutical composition selected from the group consisting of soluble saccharide compounds, foods and drinks, antioxidants, freshness preservatives, and cosmetics.
  • FIG. 1 is a diagram showing an elution diagram of gel filtration of 0. 1 2 N hydrochloric acid decomposition products of agar
  • FIG. 2 is a diagram showing an elution diagram of gel filtration of a 1N hydrochloric acid hydrolyzate of agar.
  • FIG. 3 is a view showing a size-exclusion HP LC chromatogram of an acid digest of agar.
  • FIG. 4 is a diagram showing a mass spectrum of apoptosis-inducing and anticancer substances.
  • FIG. 5 is a diagram showing a 1 H-NMR spectrum of an apoptosis-inducing and carcinostatic substance (hydrate).
  • FIG. 3 is a view showing an NMR spectrum.
  • FIG. 7 is a graph showing the elution patterns of normal-phase HPLC of agarobiose, agarotetraose, and agaguchihexaose.
  • FIG. 8 is a diagram showing the mass spectrum of the peak at 66.7 minutes.
  • FIG. 9 is a diagram showing the mass spectrum of the peak at 78.5 minutes.
  • FIG. 10 is a diagram showing the mass spectrum of the peak at 85.5 minutes.
  • Figure 11 is a diagram showing the mass spectrum of 3,6-anhydro-L-galactose.
  • FIG. 13 is a diagram showing a 1 H-NMR spectrum of 3,6-anhydro L-galactose (an aldehyde form).
  • FIG. 14 shows the culture time and the number of viable cells when HL-60 cells were cultured with the addition of oligosaccharides at a final concentration of 250 // M.
  • FIG. 15 is a diagram showing the culture time and the number of viable cells when HL-60 cells were cultured with the addition of oligosaccharide having a final concentration of 125.
  • FIG. 16 is a view showing the elution pattern of normal-phase HPLC of agar subjected to heat treatment in 0.5 M phosphoric acid.
  • FIG. 17 is a diagram showing a calibration curve of agarobiose.
  • FIG. 18 is a diagram showing the relationship between the heating time and the production amount of agar-mouth bioose in a 0.1 M HC1 solution of 0.2% agar.
  • FIG. 19 is a graph showing the relationship between the heating time and the amount of agarobiose produced in a 0.1 M solution of citric acid in 0.2% agar.
  • FIG. 20 shows the formation of agarooligosaccharides at 500 mM citrate at 80 ° C.
  • FIG. 21 is a diagram showing agarooligosaccharide production at 500 mM citrate at 95 ° C.
  • FIG. 22 is a diagram showing agarooligosaccharide production at 1200 mM lactic acid and 80 ° C.
  • FIG. 23 is a diagram showing agarooligosaccharide production at 1,200 mM lactic acid and 95 ° C.
  • FIG. 2 is a view showing agarooligosaccharide production in C.
  • FIG. 25 lOOOmM malic acid, 95.
  • FIG. 2 is a view showing agarooligosaccharide production in C.
  • FIG. 2 is a view showing agarooligosaccharide production in C.
  • FIG. 27 is a diagram showing a normal-phase HP LC chromatogram of a ⁇ -strength lagenanic acid degradation product.
  • FIG. 28 is a diagram showing a mass spectrum of apoptosis-inducing and anticancer substances.
  • FIG. 29 is a diagram showing a 1 H-NMR spectrum of an apoptosis-inducing and anticancer substance.
  • FIG. 30 is a view showing the result of gel filtration using Cell mouth Fine GC L-25.
  • FIG. 31 is a diagram showing the results of gel filtration using a Sephadex LH-20 column.
  • FIG. 32 shows the mass spectrum of / 3-D-galactobyranosyl (1 ⁇ 4) -13,6-anhydro-2-O-methyl-l-galactose.
  • Figure 33 shows that] 3—D—galactoviranosyl (1 ⁇ 4) 1–3, 6—anhydride
  • FIG. 2 is a view showing a 1 H—NMR spectrum of mouth 2-O—methyl-1-L-galactose.
  • -FIG. 34 is a graph showing the relationship between agarobiose concentration and 3 H-thymidine incorporation in lymphocyte blastogenesis by ConA.
  • FIG. 35 is a graph showing the relationship between agarobiose concentration and 3 H-thymidine uptake in a mixed lymphocyte reaction.
  • FIG. 36 is a diagram showing the NO 2 concentration in the medium when agarobiose was added and cultured under each culture condition.
  • FIG. 37 is a diagram showing the concentration of N 2 O in the culture medium when neoagarobiose was added and cultured under each culture condition.
  • FIG. 38 is a diagram showing the NO 2 _ concentration in the medium when cultivation was performed by adding an agar hydrochloride decomposition solution and an agar quenchate decomposition solution.
  • Fig. 39 is a diagram showing the NO 2 -concentration in the medium when culturing was performed with the addition of 3,6-anhydro D-galactose and galactose.
  • FIG. 40 is a diagram showing the NO 2 ⁇ concentration in the medium when cultured under each culture condition.
  • FIG. 41 is a diagram showing the anticancer activity of the oligosaccharide of the present invention.
  • FIG. 42 is a diagram showing the inhibition of the PCA reaction of the oligosaccharide of the present invention. Detailed description of the invention
  • 3,6-anhydrogalactopyranose represented by the formula 1 in the present invention (hereinafter, simply referred to as 3,6-anhydrogalactopyranose) is represented by the formula 2:
  • the hydrate is of formula 6: It is a compound represented by these.
  • the soluble saccharide compound of the present invention is not particularly limited, a compound selected from 3,6-anhydrogalactopyranose, an aldehyde form thereof, a hydrate thereof, and a 2- ⁇ -methylated form thereof (hereinafter, referred to as a compound).
  • a compound selected from 3,6-anhydrogalactopyranose, an aldehyde form thereof, a hydrate thereof, and a 2- ⁇ -methylated form thereof
  • a compound soluble saccharide compounds containing at least one of the compounds of formulas 1 to 6
  • substances containing at least one of the compounds of formulas 1 to 6 hereinafter simply referred to as raw materials.
  • the soluble sugar compound of the present invention is not particularly limited as long as it does not solidify or semi-solidify (gel) when used. Therefore, a saccharide compound containing at least one compound selected from the compounds of formulas 1 to 6 that is converted into a sol during use is included in the soluble saccharide compound of the present invention.
  • the soluble saccharide compound suitably used in the present invention is, for example, a saccharide compound whose non-reducing end is a saccharide other than L-galactose-6-sulfuric acid, for example, agarobiose, agarotetra Includes sugar compounds such as aose, aga mouth hexaose, agarocotaose, kappa ryabiose and i3-D-galactobilanosyl-3,6-anhydro-1-2-methyl-1-L-galactose .
  • the raw materials used to obtain the soluble sugar compound are not particularly limited, and include, for example, agarose, agaropectin, funolane, vorfiran, Mucinous polysaccharides of red algae such as Genan, Flucellaran, Hypnean, etc. [published by Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., Polysaccharide Biochemistry 1 Ichigaku I, 1st pp. 314 (1969)] are exemplified.
  • the content of these polysaccharides is also included in the raw material.
  • raw materials for agarose and agaropectin there are maxa, onidasa, oobusa, hirabusa, woakakusa, yuikiri, etc. of the family Tendaceae, etc.
  • Red algae is used, and usually several kinds of algae are blended to make a raw material.
  • the raw material algae those dried and dried on the sun are usually used.
  • raw algae and dried algae can be used. It is also possible to use so-called bleached original algae that have been bleached while spraying water during drying.
  • Soraten After extracting the raw algae with hot water and then cooling it, “Soraten” is obtained.
  • Agar is obtained by removing the water from the soroten by freeze dehydration or compression dehydration and drying it.
  • the agar can be used in various forms such as a rod, a band, a plate, a thread, a powder, etc., regardless of the algae from which the agar is derived.
  • agar contains about 70% agarose and about 30% agarose, but it is possible to purify the agarose to further purify it. Purified agarose can be used in various agarose contents from low to high purity.
  • the raw material includes the algae, agar, agar, purified agarose, purified agaropectin, and intermediate products or by-products obtained in the production process of the agar.
  • Agarose is a polysaccharide whose main structure is D-galactose and 3,6-anhydrol-L-galactose, which are linked alternately, and the first position of D-galactose and 3,6-anhydrol-L —The 4-position of galactose is a] 3-glycoside bond, and the 1,6-position of 1,6-anhydro-1-L-galactose and the 3-position of D-galactose are linked by an ⁇ -glycoside bond. .
  • the hi-3 bond is mildly hydrolyzed by dilute acid or hydrolyzed by ⁇ -agarase [Carbohydr. Res., Vol. 66, pp. 20 7 (19778)].
  • kake-lagenan is a polysaccharide contained in red algae such as cedar family, myrinaceae, and ibarnaceae, and kappa-kage lagenan, ⁇ -kage lagenan, and ⁇ -kage lagenan are known.
  • ⁇ Power lagenan is composed of D3-galactose-4—sulfate at position 1 and 3,6-anhydro-1D—galactose at position 4 with a j3-glycosidic bond, and 3,6-anhydrodraw D— It has a basic structure in which position 1 of galactose and position 3 of D-galactose-14-sulfate are alternately repeated with ⁇ -glycosidic bonds.
  • Echiriki lagenan is a 1/3 position of D-galactose and the 4th position of D-galactose-1,2,6-disulfate is a 3 / 3-glycosidic bond, and the D-galactose-1,2,6-disulfate is It has a basic structure in which position 1 and position 3 of D-galactose are alternately repeated with ⁇ -glycosidic bonds.
  • Power lagenan is used as a gelling agent in foods.
  • the raw materials in the present invention also include those obtained by partially decomposing the above raw materials by a chemical, physical and / or enzymatic method.
  • Examples of chemical decomposition methods include hydrolysis from acidic to neutral, examples of physical decomposition methods include irradiation of electromagnetic waves and ultrasonic waves, and examples of enzymatic decomposition methods include carohydrolases, such as , Agarase, carrageenase and the like.
  • the acidic to neutral decomposition conditions of the raw material include anti-oxidant or immunomodulatory activities such as apoptosis-inducing, carcinogenic, active oxygen production inhibitory activities, and nitric oxide (hereinafter referred to as NO) production inhibitory effects.
  • anti-oxidant or immunomodulatory activities such as apoptosis-inducing, carcinogenic, active oxygen production inhibitory activities, and nitric oxide (hereinafter referred to as NO) production inhibitory effects.
  • a soluble sugar compound containing at least one of these compounds for example, agarobiose, agarotetraose, agaguchihexaose, agarocotaose, ⁇
  • a sugar compound such as one-strength raviose (hereinafter, simply referred to as thorough raviose) and / 3-D-galactobilanosyl-3,6-anhydro-12-O-methyl-L-galactose, and the non-reducing end is L —Galactose-6—There is no particular limitation as long as a saccharide compound having a reducing terminal, which is a saccharide other than sulfuric acid, is selected from the compounds of formulas 1 to 6.
  • a soluble sugar compound containing at least 1-species is produced. Further, by heating during the reaction, the reaction time required for producing a compound selected from the compounds of the formulas 1 to 6 and a soluble saccharide compound containing at least one of these compounds is reduced.
  • Raw material for example, agarose Agarose-containing material is not particularly limited to the type of acid to be dissolved or suspended, but inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, etc., citric acid, formic acid, acetic acid, lactic acid Organic acids such as ascorbic acid, and solid acids such as cation exchange resins, cation exchange fibers, and cation exchange membranes can be used.
  • inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, etc., citric acid, formic acid, acetic acid, lactic acid Organic acids such as ascorbic acid, and solid acids such as cation exchange resins, cation exchange fibers, and cation exchange membranes can be used.
  • the concentration of the acid is also not particularly limited, but is preferably 0.001 to 5N, preferably 0.0.
  • the reaction temperature is not particularly limited, but may be set at 0 to 200 ° C., preferably at 20 to 130 ° C.
  • the reaction time is not particularly limited, but may be set to several seconds to several days.
  • the type and concentration of the acid, the reaction temperature and the reaction time are determined by the type and purpose of the material containing at least one compound selected from the compounds of formulas 1 to 6, such as agarose and carrageenan. Selected from the compounds of formulas 1 to 6, the amount of the sugar compound containing those compounds, and the polymerization of the soluble sugar compound having the desired compound selected from the compounds of formulas 1 to 6 at the reducing end It may be appropriately selected depending on the degree.
  • the acid decomposition reaction proceeds quickly by selecting a stronger acid than a weak acid, a higher concentration of an acid than a lower concentration of acid, and a higher temperature than a lower temperature.
  • a strong cation exchange resin generally has higher decomposition reaction efficiency than a weak cation exchange resin.
  • the larger the amount used per raw material and the higher the working temperature the faster the acid decomposition reaction proceeds.
  • a sugar compound solution used in the present invention obtained by suspending agar at 10% by weight in 0.1 N hydrochloric acid, heating and dissolving at 100 ° C. for 13 minutes, and removing insolubles is as follows: Even when cooled, it no longer gels at its freezing point. When the saccharides contained in this solution were analyzed by a method such as gel filtration HPLC or normal phase HPLC, almost no high molecular weight saccharides were found, and most of them were decomposed into soluble saccharide compounds of 10 or less.
  • the commercially available strong cation exchange resin Na type 1 After making the H-type with 1 N hydrochloric acid, put in 79 parts by weight of demineralized water, add 10 parts by weight of agar, suspend, and heat at 95 ° C for 180 minutes. Even when cooled, the sugar compound solution of the invention no longer gels at its freezing point. When the saccharides contained in this solution were analyzed by gel filtration HPLC, normal phase HPLC, etc., almost no high molecular weight saccharides were found, and most of them were decomposed into soluble saccharides of 10 sugars or less. .
  • a soluble saccharide compound having a compound selected from the compounds of formulas 1 to 6 at the reducing end used in the present invention an organic acid such as citric acid, lactic acid, malic acid or the like is used.
  • Oligosaccharides having biological activity can be obtained by appropriately selecting the concentration from several 10 111 ⁇ [ ⁇ number ?, the heating temperature from 70 to 95 ° C, and the heating time from the range from several 10 minutes to 24 hours.
  • antioxidant oligosaccharides are produced in large quantities.
  • the physiologically active oligosaccharide thus produced exhibits long-term storage stability by maintaining acidity and not under alkaline conditions.
  • soluble sugar compounds containing at least one of these compounds for example, agarobiose, agarotetraose, agaguchihexaose, agaroose
  • sugar compounds such as octaose, kappa ryabiose and] 3-D-galactobyranosyl-1,3,6-anhydro-2-O-methyl-l-galactose
  • the raw material decomposition products Alternatively, it may be used after being neutralized, but may be used after further purification.
  • a compound selected from the compounds of formulas 1 to 6 soluble sugar compounds having the compound at the reducing end, for example, agarobiose, agarotetraose, agaguchihexaose, agarooctaose, kappa-rabbitose and Oligosaccharides such as
  • 3-D-galactobyranosyl-3,6-anhydro-12-O-methyl-L-galactose can be purified, for example, using apoptosis-inducing activity or anticancer activity as an index.
  • Any known purification method such as a chemical method or a physical method may be used as a purification method, such as a gel filtration method, a fractionation method using a molecular weight fractionation membrane, a solvent extraction method, and various types of chromatography using an ion exchange resin.
  • a compound selected from the compounds of formulas 1 to 6, which are target apoptosis-inducing substances formed in the acid digest, by combining known purification methods such as A soluble sugar compound containing at least one kind can be purified.
  • the structure of the compound thus obtained can be analyzed by known methods such as mass spectrometry, nuclear magnetic resonance, measurement of ultraviolet absorption spectrum, and measurement of infrared absorption spectrum.
  • Agaropios an example of the active ingredient of the present invention, is a disaccharide in which the first position of D-galactose and the fourth position of 3,6-anhydro-1 L-galactose are linked by a / 3-glycosidic bond. . Since the 1-position of 3,6-anhydro-1 L-galactose is an anomeric carbon, there are ⁇ -type and type, both of which are included in the agarobiose used in the present invention.
  • the sugar compound having a compound selected from the compounds of formulas 1 to 6 at the reducing end used as the active ingredient in the present invention refers to a hydroxyl group other than the 1-position of the compound selected from the compounds of formulas 1 to 6.
  • an antioxidant activity such as an apoptosis-inducing activity, an anti-cancer activity, an active oxygen production inhibitory activity, an NO production inhibitory activity, and Z or immunomodulatory activity.
  • degradation products of raw materials for example, acid degradation products of agarose and ⁇ -agagarase decomposition products such as agaropios, agarotetraose, aga mouth hexaose, agaroquat taose, agarodecaose,] 3-D-galactose Topiranosyl-1,6-anhydro-12-O-methyl-1-L-galactose.
  • acid decomposed products of carrageenan and carrageenase decomposed products for example, carabinerose are mentioned.
  • hexoses such as gnorecose, mannose, and galactose; pentoses such as xylose, arabinose and ribose; And one or more sugars selected from sialic acids such as N-acetyl neuraminic acid, dexoxy sugars such as fucose, esters, amides and lactones thereof, selected from compounds of formulas 1 to 6.
  • sialic acids such as N-acetyl neuraminic acid
  • dexoxy sugars such as fucose, esters, amides and lactones thereof, selected from compounds of formulas 1 to 6.
  • the compound bound to the hydroxyl group other than the 1-position of the compound is also included in the sugar compound having a compound selected from the compounds of formulas 1 to 6 at the reducing end of the present invention.
  • sugar compounds having a compound selected from these compounds of formulas 1 to 6 at the reducing end such as agarobiose, agarotetraose, agaguchihexaose, agarooctaose, ⁇ -calabiose and / 3—D—galactopyranosyl-1,6—anhydro 2—O -Methyl- L-galactose or other saccharide compounds to which pyruvate and Z or sulfate groups are bonded, and those in which the hydroxyl groups of the saccharide compounds are methylated are also obtained from the compounds of formulas 1 to 6 of the present invention. It is included in the sugar compound having the selected compound at the reducing end. As described above, in the present invention, the sugar compound having a compound selected from the compounds of formulas 1 to 6 at the reducing end is preferably a sugar whose non-reducing end is other than L-galactose-16-sulfate. It is.
  • the sugar compound having the compound at the reducing end Since the 1st position of the compound at the reducing end of the sugar compound having 3,6-anhydrogalactopyranose or its 2-methylated product at the reducing end is an anomeric carbon, the sugar compound having the compound at the reducing end has ⁇ .
  • the molecular weight is particularly limited as long as it has an antioxidant activity such as apoptosis-inducing activity, an anticancer activity, an active oxygen production inhibitory activity, an NO production inhibitory activity, and a physiological activity such as Z or immunomodulatory activity. There is no.
  • a compound selected from the compounds of formulas 1 to 6 used in the present invention, and a sugar compound having the compound at the reducing end are apoptosis-inducing activity, antitumor activity, active oxygen production inhibitory activity, and peroxidation. It has an antioxidant activity such as a lipid radical production inhibitory activity, an NO production inhibitory activity, an immunomodulatory activity, and an anti-allergic activity.
  • a compound selected from the compounds of formulas 1 to 6 and For the treatment or prevention of diseases susceptible to at least one of these compounds, containing as an active ingredient at least one compound selected from the group consisting of soluble sugar compounds having a compound at the reducing end. For example, a therapeutic or prophylactic agent for those diseases.
  • Diseases that are sensitive to these compounds include, for example, diseases that require apoptosis induction, cancerous diseases, diseases that require suppression of active oxygen production, and lipid peroxides.
  • a disease requiring suppression of dical production, a disease requiring suppression of NO production, or a disease requiring immunoregulation, for example, an allergic disease, etc., and the therapeutic or prophylactic pharmaceutical composition of the present invention is an apoptosis-inducing agent , Anticancer agents, active oxygen production inhibitors, lipid peroxide radical production inhibitors, antioxidants such as nitric oxide production inhibitors, anti-inflammatory agents, immunomodulators, antiallergic agents, etc. .
  • the apoptosis-inducing agent of the present invention is effective for eliminating autoreactive lymphocytes, cancer cells, virus-infected cells, etc. in patients with autoimmune diseases, and expresses apoptosis in desired tissues and cells. By doing so, unnecessary or harmful cells can be naturally eliminated from the living body.
  • diseases for which the apoptosis-inducing agent of the present invention is effective include autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus, immune-mediated glomerulonephritis, multiple sclerosis, collagen disease, and rheumatism.
  • the apoptosis-inducing agent of the present invention can be used in an apoptosis-inducing method, and the method is useful for elucidation of an apoptosis-inducing mechanism, screening for an apoptosis-inducing agent, an apoptosis-inducing inhibitor, and the like.
  • the apoptosis-inducing effect of the apoptosis-inducing agent of the present invention can be attributed to a Caspase inhibitor, for example, IL-1] 3 converting enzyme inhibitor V [Z-Va1-A1a-DL-A sp (OM e) —fluoromethyl ketone: manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.], and is considered to be cell death by apoptosis dependent on Caspase.
  • a Caspase inhibitor for example, IL-1] 3 converting enzyme inhibitor V [Z-Va1-A1a-DL-A sp (OM e) —fluoromethyl ketone: manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.
  • the compound used in the present invention is useful for suppressing the production of oxidizing substances, for example, active oxygen. It is useful for the treatment or prevention of diseases caused by
  • Active oxygen can be broadly classified into radical and non-radical active oxygen.
  • Radical active oxygen includes hydroxy radical, hydroxyperoxy radical, peroxy radical, alkoxy radical, nitrogen dioxide
  • non-radical reactive oxygen includes singlet oxygen, hydrogen peroxide, lipid hydroperoxide, hypochlorous acid, ozone, and peroxynitrite. All are involved in many pathologies, ie, various inflammatory diseases, diabetes, cancer, arteriosclerosis, neurological diseases, ischemia-reperfusion injury, and the like.
  • the organism will be oxidatively damaged. Will receive. Such a state is called oxidation stress.
  • oxidation stress is associated with various diseases, and living organisms are constantly exposed to diseases caused by oxidative stress or conditions that lead to exacerbation of diseases. Therefore, the antioxidant of the present invention, for example, an active oxygen production inhibitor is also useful for preventing, treating or preventing the deterioration caused by such oxidative stress.
  • the resulting 4-hydroxy-2-nonenal (HNE) is a toxic aldehyde that specifically targets daltathione and proteins.
  • the reaction product of HNE and protein has been detected in various pathological tissues, and is thought to be a factor that induces disease states involving oxidative stress. Therefore, the antioxidant containing an antioxidant used in the present invention, which can suppress the production of a peroxide radical, is useful for the prevention and treatment of lifestyle-related diseases caused by oxidative stress.
  • NO is the main body of endothelial cell-derived vascular smooth muscle relaxing factor (EDRF) [Nature, Vol. 327, pp. 524-526 (1987)].
  • EDRF vascular smooth muscle relaxing factor
  • diseases requiring suppression of NO production are not particularly limited, and include, for example, systemic blood pressure lowering, blood pressure response lowering due to toxic shock or treatment with a certain site force-in, and the like.
  • Autoimmune disease inflammation, arthritis, rheumatoid arthritis, diabetes, inflammatory bowel disease, vascular dysfunction, pathogenic vasodilation, tissue damage, cardiovascular ischemia, hyperalgesia, cerebral ischemia, angiogenesis
  • NO synthase that produces L-citrulline and NO from L-arginine and oxygen (NOS)-includes cNOS which is always expressed and iNOS which is inducible.
  • iNOS is induced by the stimulation of cytotoxins or cytotoxic proteins (LPS, INF- ⁇ , etc.) and produces NO.
  • LPS cytotoxic proteins
  • INF- ⁇ cytotoxic proteins
  • the present inventors have found that a compound selected from the compounds of formulas 1 to 6 and a soluble saccharide compound having the compound at the reducing end, for example, agarobiose, agarotetraose, and agaguchihexaose suppress the expression of iNOS. ⁇ was confirmed at the protein level by estane blotting and at the messenger RNA level by RT-PCR.
  • the compound used in the present invention is effective for the treatment and prevention of diseases requiring NO production suppression by suppressing the expression of iNOS, which is overexpressed by various factors and produces excessive N ⁇ . is there.
  • the compound of the present invention suppresses macrophage NO production and is useful for treatment and prevention of diseases, inflammation, cancer, etc. caused by macrophage NO production.
  • NO production of the sugar compound used in the present invention can be suppressed by LPS or INF-! Is not a competitive inhibition.
  • the saccharide compound used in the present invention By preliminarily adding the saccharide compound used in the present invention, the NO production suppressing effect is enhanced, and the compound of the present invention is extremely useful as a prophylactic agent for suppressing the production of antioxidants.
  • the NO production inhibitor of the present invention is useful for studying the mechanism of NO production and the mechanism of NO action, and can also be used for screening substances involved in the mechanism of NO production.
  • vascular endothelial growth factor / vascular permeability factor plays an important role in this process.
  • VEGF is induced by N ⁇ in various cancer cells.
  • the NO production inhibitor of the present invention also suppresses VEGF production in cancer cells by suppressing NO production, and as a result, angiogenesis around cancer tissues is inhibited.
  • NO production inhibitor of the present invention is administered to mice in which cancer cells have been implanted subcutaneously to form solid tumors, Insufficient formation of blood vessels around the tissue causes cancer to fall off.
  • 'Nitrosamine is a group of compounds in which a ditroso group is added to a secondary amamine, and several hundred are known.
  • the carcinogenesis of a high-risk group can be particularly prevented by preventing the increase in NO production by administering the NO production inhibitor of the present invention.
  • the NO production inhibitor of the present invention exhibits a carcinostatic action in two stages: suppression of carcinogenesis and inhibition of angiogenesis in cancer tissues.
  • NO also induces edema, a characteristic of inflammatory lesions, ie, a vascular hyperpermeability effect [Madea et al., Japanese 'Journal' of Canada, Lisaite (Japanese Journal of Cancer). Research), Vol. 85, pp. 331-334 (1994)], and enhances the biosynthesis of prostaglandins, which are inflammatory mediators [Salvemini et al., Proceedings National Academy of Sciences, USA (Proceedngs of National Academy of Sciences, USA), Vol. 90, pp. 7240-7244 (1993)].
  • NO a et al., Japanese 'Journal' of Canada, Lisaite (Japanese Journal of Cancer). Research), Vol. 85, pp. 331-334 (1994)]
  • prostaglandins which are inflammatory mediators [Salvemini et al., Proceedings National Academy of Sciences, USA (Proceedngs of National Academy of Sciences, USA), Vol. 90, pp. 7240-7244
  • N ⁇ production When activated immune cells enter the organs and release cytokines, N ⁇ production is induced.
  • Insulin-dependent diabetes mellitus is a disease caused by the specific destruction of [islet] 3 cells, and is said to be destruction by NO.
  • the synovial fluid in the affected area of a patient with rheumatoid arthritis, rheumatoid arthritis, gouty arthritis, or arthritis associated with Behcet's disease is higher than that of the normal joint of the patient or the joint of a healthy person. Concentration of NO is included.
  • NO production inhibitor of the present invention During cerebral ischemia and after reperfusion, NO production increases, with concomitant damage to brain tissue.
  • NO production inhibitor of the present invention By administering the NO production inhibitor of the present invention to a patient during cerebral ischemia, damage to brain tissue is reduced, and the prognosis is improved.
  • the immunomodulator of the present invention has an immunomodulatory effect such as an inhibitory effect on lymphocyte blastogenesis and a mixed lymphocyte reaction. It is useful as a therapeutic or preventive agent for certain diseases.
  • the lymphocyte blastogenesis reaction is a reaction in which mitojiun binds to a receptor on the surface of a lymphocyte, activates the lymphocyte, and promotes its division and proliferation.
  • the mixed lymphocyte reaction is a mixed culture of lymphocytes obtained from allogeneic animals, which induces lymphocyte activation due to inconsistency in major histocompatibility antigens and promotes lymphocyte division and proliferation. This is the reaction that takes place.
  • the immunomodulator of the present invention suppresses these reactions and causes autoimmune diseases caused by abnormally elevated lymphocytes, for example, chronic nephritis, ulcerative colitis, type I diabetes, chronic rheumatoid arthritis, etc. It is particularly useful for treating or preventing a disease, and also for suppressing transplant rejection.
  • Mast cells sensitized with the IgE antibody are induced to degranulate by binding of the antigen, and the chemical mediator is released.
  • This type I or immediate allergic reaction, plays a major role in allergic diseases typified by asthmatic diabetic dermatitis, and substances that suppress the release of chemical mediators from mast cells are those allergic diseases. It is considered to be extremely effective in the treatment and prevention of
  • PCA passive cutaneous anaphylaxis
  • the compound selected from the compounds of formulas 1 to 6 and the soluble saccharide compound having the compound at the reducing end have a PCA inhibitory action, and according to the present invention, are selected from the compounds of formulas 1 to 6
  • an antiallergic agent comprising as an active ingredient at least one compound selected from the group consisting of a compound and a soluble sugar compound having the compound at the reducing end.
  • This anti-allergic agent is a disease that can be treated by suppressing type I allergic reaction, such as bronchial asthma, atopic dermatitis, allergic rhinitis, hay fever, measles, contact dermatitis, allergic conjunctivitis, etc. It is extremely useful in the treatment and prevention of
  • an apoptosis-inducing agent is selected from the group consisting of a compound selected from the compounds of formulas 1 to 6 and a soluble sugar compound having the compound at the reducing terminal.
  • the compound can be produced by combining at least one compound obtained as an active ingredient with a known pharmaceutical carrier and formulating a combination.
  • these compounds are formulated with a pharmaceutically acceptable liquid or solid carrier and, if necessary, solvents, dispersants, emulsifiers, buffers, stabilizers, excipients, binders, By adding disintegrants, lubricants and the like, solid preparations such as tablets, granules, powders, powders, capsules, etc., and liquid preparations such as ordinary liquid preparations, suspensions and emulsions can be prepared. In addition, it can be made into a dried product which can be made into a liquid form by adding an appropriate carrier before use.
  • the apoptosis-inducing agent of the present invention can be administered as an oral agent or a parenteral agent such as an injection or an infusion.
  • Pharmaceutical carriers can be selected according to the above-mentioned administration forms and dosage forms.
  • oral preparations for example, starch, lactose, sucrose, mannitol, carboxymethyl cellulose, corn starch, inorganic salts, etc. Is used.
  • a binder, a disintegrant, a surfactant, a lubricant, a fluidity promoter, a flavoring agent, a coloring agent, a flavor, and the like can be further blended.
  • a sugar compound having an apoptosis-inducing property which is an active ingredient of the present invention, is added as a diluent to distilled water for injection, physiological saline, Dissolve or suspend in aqueous glucose solution, vegetable oil for injection, sesame oil, laccase oil, soybean oil, corn oil, propylene glycol, polyethylene glycol, etc., disinfectant, stabilizer, tonicity agent, soothing if necessary It is prepared by adding agents.
  • the apoptosis-inducing agent of the present invention is administered by an appropriate administration route according to the formulation.
  • the administration method can be used internally, externally, or by injection.
  • the injection can be administered, for example, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intradermally, etc., and external preparations include suppositories and the like.
  • the dose of the apoptosis-inducing agent of the present invention is appropriately set depending on the form of the formulation, the administration method, the purpose of use, and the age, weight, and symptoms of the patient to which it is applied, and is not fixed.
  • the amount of active ingredient contained is from 10 g to 200 mg / kg per adult per day.
  • the dose varies depending on various conditions, so that a lower dose than the above-mentioned dose may be sufficient, or may be necessary beyond the range.
  • the medicament of the present invention can be administered orally as it is, or can be added to any food or drink for daily ingestion.
  • the anticancer agent of the present invention comprises at least one compound selected from the group consisting of a compound selected from the compounds of formulas 1 to 6 and a soluble sugar compound having the compound at the reducing end as an active ingredient. It can be produced by combining this with a known pharmaceutical carrier to form a formulation.
  • the anticancer agent can be produced according to the method for producing the apoptosis-inducing agent described above.
  • the anticancer drug is administered by an appropriate route depending on the formulation.
  • the administration method is also not particularly limited, and can be internal, external, or by injection.
  • injectables can be administered, for example, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intradermally, etc., and external preparations also include suppositories and the like.
  • the dosage as an anticancer drug is appropriately determined depending on the formulation, administration method, purpose of use, and the age, weight, and symptoms of the patient to which it is applied, and is not fixed, but is generally included in the formulation
  • the amount of active ingredient used is between 1 ⁇ g and 200 mg Z kg per adult per day. Of course, the dose varies depending on various conditions, so a lower dose than the above-mentioned dose may be sufficient, or may exceed the range. Sometimes it is necessary.
  • the agent of the present invention is orally administered as it is: it can be added to any food or drink and taken daily.
  • the antioxidant, the active oxygen production inhibitor, the lipid peroxide radical production inhibitor, the N ⁇ production inhibitor, the immunomodulator, and the antiallergic agent of the present invention can be produced according to the above-mentioned apoptosis inducer.
  • the usage may be in accordance with the apoptosis-inducing agent described above.
  • the antioxidant, the active oxygen production inhibitor, the lipid peroxide radical production inhibitor, the NO production inhibitor, the immunomodulator or the antiallergic agent are administered by an appropriate route depending on the formulation.
  • the administration method is also not particularly limited, and may be internal use, external use or injection.
  • the injection can be administered, for example, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intradermally, etc., and external preparations also include suppositories and the like.
  • the dosage as an antioxidant, an active oxygen production inhibitor, a lipid peroxide radical production inhibitor, a NO production inhibitor, an immunomodulator or an antiallergic agent depends on the formulation form, administration method, purpose of use, and It is set as appropriate according to the age, weight, and symptoms of the patient to which the drug is applied, and the amount of the active ingredient contained in the drug product is not constant, but is generally 10) U g to 200 mg Z kg per adult per day . Of course, the dose varies depending on various conditions, so that a lower dose than the above-mentioned dose may be sufficient, or may be necessary beyond the range.
  • the drug of the present invention can be orally administered as it is, or can be added to any food or drink to be taken on a daily basis.
  • the food or drink of the present invention comprises a compound selected from the compounds of formulas 1 to 6 and at least one compound selected from soluble saccharide compounds containing the compound, for example, Agarobiose, agarotetraose, agaguchihexaose, agarooctaose, ⁇ -force raviose and
  • Diseases that are sensitive to at least one of the selected compound and a soluble sugar compound containing the compound for example, a disease requiring induction of apoptosis, a cancerous disease, a disease requiring suppression of active oxygen production It is extremely useful for ameliorating and preventing symptoms that require suppression of NO production, diseases that require immunomodulation, and allergic diseases.
  • the method for producing the food or beverage of the present invention is not particularly limited, but can be a cooking, processing, and generally used method for producing a food or beverage.
  • At least one compound selected from the group consisting of a compound selected from a compound and a soluble saccharide compound containing the compound at the reducing end for example, acid decomposition of a raw material under an acidity of less than pH 7 and Or agarobobiose, agarotetraose, agaguchihexaose, agarocotaose, kappa-labiose and 3-D-galactobilanosyl-3,6-anhydro-1-2-O-methyl-L produced by enzymatic decomposition It is sufficient that at least one compound selected from one galactose or the like is contained as an active ingredient.
  • processed cereals e.g., processed flour, processed starches, premix processed products, varieties, malononi, breads, bean jams
  • Buckwheat, fu, rice noodles, harusame, wrapped rice cake etc.
  • processed fats and oils eg, plastic fats, tempura oil, salad oil, mayonnaise, dressings, etc.
  • processed soybeans eg, tofu, miso, natto, etc.
  • Processed meat products eg, ham, bacon, pressed ham, sausage, etc.
  • fishery products eg, frozen surimi, kamaboko, chikuwa, hampan, sweetfish fried, tsumire, line, fish ham, sausage, bonito, fish egg
  • dairy products eg, raw milk, cream, yogurt, butter, cheese, condensed milk, powdered milk, ice cream
  • the food or drink of the present invention includes at least one compound selected from the group consisting of a compound selected from the compounds of formulas 1 to 6 and a soluble saccharide compound containing the compound at the reducing end, for example, , Agarobiose, agarotetraose, agaguchihexaose, agarocutaose, ⁇ -force labiose, and agarobobiose, agarotetraose, agarohexaose, produced by acid and / or enzymatic decomposition of the raw materials under an acidity of less than pH 7.
  • a compound selected from the compounds of formulas 1 to 6 and a soluble saccharide compound containing the compound at the reducing end
  • Agarobiose agarotetraose
  • agaguchihexaose agaguchihexaose
  • agarocutaose ⁇ -force labiose
  • agarobobiose
  • —Galata topyranosyl_3, 6-Anhydro-12-O-methyl-1-L- Contains at least one compound selected from sugar compounds such as galactose and contains, is added and / or diluted,
  • the form is not particularly limited as long as it contains a necessary amount for exhibiting the function, and includes an orally ingestible form such as a tablet, a granule, and a capsule.
  • 3,6-Anhydrogalactopyranose or its 2-0-methylated form and a sugar compound having the compound at the reducing end are susceptible to hemiacetal ring opening and aldehyde formation at the end.
  • the aldehyde and the aldehyde of the aldehyde form of 3,6-anhydrogalactopyranose are easily reacted with a nucleophilic substance such as an amino acid-reactive compound, for example, an amino acid.
  • a saccharide compound, for example, an oligosaccharide is in a state where a compound selected from the compounds of formulas 1 to 6 at the reducing end is eliminated.
  • the compounds selected from the compounds of the formulas 1 to 6 are selected. It is possible to provide foods or beverages high in these compounds without substantially reducing compounds selected from the group consisting of oligosaccharides having the compound and a reducing end.
  • the compound selected from the compounds of formulas 1 to 6 and the compound selected from the compound of formulas 1 to 6 at the reducing end of the sugar compound having the compound at the reducing end may be stable under acidic conditions.
  • a compound selected from the compounds of formulas 1 to 6 by performing the entire process under acidic conditions in the method for producing a food or beverage of the present invention and making the resulting food or beverage an acidic food or acidic beverage.
  • the kind of acid that decomposes the raw material there is no particular limitation on the kind of acid that decomposes the raw material, and any of organic and inorganic acids can be used.
  • a decomposition product is more preferable, and an acidic decomposition product having a novel flavor can be obtained by using an organic acid.
  • the organic acid may be selected according to the purpose, and it may be used alone or in combination of two or more.
  • As the organic acid for example, acetic acid, citric acid, malic acid, lactic acid, tartaric acid, succinic acid, fumaric acid and the like are preferable.
  • the decomposition conditions are not particularly limited, when using, for example, citric acid as the organic acid, the acid decomposition of the raw material, for example, agar is performed at 60 to 130 ° C., preferably By conducting the reaction at 90 to 105 ° C for 3 to 300 minutes, preferably for 30 to 200 minutes, the acidity of the organic acid changes, and the taste is well-balanced, the tongue feels smooth and smooth. It becomes a composition with a sour taste.
  • the amount of the organic acid is 0.05 to 30% by weight, preferably 0.2 to 10% by weight.
  • a content of at least one compound selected from the group consisting of a compound selected from the group consisting of a compound represented by the formula (1) and a soluble sugar compound having the compound at the reducing end from 1 to 20% by weight, preferably from 5 to
  • a heat-treated product having a content of 115% by weight is a preferred sour acidulant.
  • the resulting acidulant is extremely useful for the production of soft drinks, acidic seasonings, acidic foods and the like.
  • the acidic food or acidic beverage of the present invention comprises at least one compound selected from the group consisting of a compound selected from the compounds of formulas 1 to 6 having physiological activity and a soluble sugar compound containing the compound, for example, produced by acid decomposition and Z or enzymatic degradation under acidic conditions below P H 7 of the raw material, Agarobiosu, ⁇ Gallo maltotetraose, Kisaosu to ⁇ gas port, ⁇ Gallo O Kuta Orth, .kappa.
  • the acidic food or acidic beverage of the present invention exhibits sensitivity to at least one compound selected from the group consisting of a compound selected from the compounds of formulas 1 to 6 and a soluble sugar compound containing the compound. It is a health food or beverage that has a symptom ameliorating or preventive action for diseases, and is particularly useful for maintaining gastrointestinal health.
  • At least one compound selected from the group consisting of a compound selected from the compounds of formulas 1 to 6 and a soluble saccharide compound containing the compound of the present invention for example, a pH of the raw material of less than 7 Agarobiose, agarotetraose, agaguchihexaose, agarooctaose, kappa_rabiose, and j3-D-galactobilanosyl, produced by acidolysis under acidic conditions and Z or enzymatic decomposition of Saccharide compounds such as 6,6-anhydro-12-methyl-1-L-galactose have antioxidant activities such as active oxygen production inhibitory activity and lipid peroxide radical production inhibitory activity, and are used in antioxidant foods.
  • a pH of the raw material of less than 7 Agarobiose, agarotetraose, agaguchihexaose, agarooctaose, kappa_rabios
  • antioxidant foods or antioxidant beverages as oxidants or antioxidants for antioxidant beverages, such as active oxygen production inhibitors, lipid peroxide radical production inhibitors, NO production inhibitors, etc. It is used Monkey -* That is, according to the present invention, an antioxidant containing as an active ingredient at least one compound selected from the group consisting of a compound selected from the compounds of formulas 1 to 6 and a soluble sugar compound containing the compound In particular, an antioxidant for food and drink is provided.
  • the dosage form of the antioxidant of the present invention is not particularly limited, and can be made into an appropriate dosage form such as a powder, a paste, or an emulsion according to a conventional method depending on the type of food or drink to be added.
  • An antioxidant food or drink containing a compound selected from the compound and the saccharide compound used in the present invention as an active ingredient can be easily produced by using the antioxidant of the present invention.
  • an antioxidant saccharide selected from the group consisting of a compound selected from the compounds of formulas 1 to 6 and a soluble saccharide compound containing the compound.
  • the antibody oxidizing sugars can be obtained as the acid degradation product and / or enzymatic degradation product under acidic conditions below P H 7 of the raw material.
  • a purified product, a partially purified product, and the like can be used.
  • a raw material derived from red algae for example, agar, agarose, ligagenan, or the like can be used alone or in combination of two or more.
  • soluble sugar compounds containing compounds selected from the compounds of formulas 1 to 6 as typical antioxidant sugars for example, agarobiose, agarotetraose, agarohexaose, and a Antioxidant sugars such as galoktaose, kappa rabiose, and] 3-D-galactopyranosyl-13,6-anhydro-12-0-methyl-1-L-galactose are exemplified.
  • the antioxidant sugar of the present invention is useful for removing or suppressing the production of oxidizing substances in the living body, for example, active oxygen.
  • the antioxidant sugar improves or prevents the symptoms of diseases caused by the production or excess of active oxygen.
  • the active oxygen generation system when the active oxygen generation system is superior to the scavenging system in the living body, the oxidative stress caused by the living body undergoing oxidative damage is associated with various diseases, and the living body is always affected by the oxidative stress. You are exposed to a disease or condition that leads to worsening of the disease. Therefore, such oxides It is advisable to take moderate amounts of antioxidants daily to prevent, treat or prevent the illness caused by tress. In order to ingest a moderate amount every day, it is desirable to ingest from foods and drinks, and the food or drink containing, diluted or added with the antioxidant sugar of the present invention is an antioxidant food or an antioxidant drink. It is extremely useful as an antioxidant stress food or an antioxidant stress beverage.
  • the compounds selected from the compounds and sugar compounds used in the present invention also have water retention properties, and use at least one of these compounds as an active ingredient to produce anti-constipation agents, anti-constipation foods, and anti-constipation beverages can do.
  • a soluble sugar compound containing a compound selected from the compounds of formulas 1 to 6 at the reducing end for example, agarobiose, agarotetraose, agaguchihexaose, agarocotaose, /
  • the present invention provides a cosmetic composition comprising oligosaccharides such as Ichiriki Raviose and] 3-D-galactopyranosyl-13,6-anhydro-12-O-methyl-l-galactose as active ingredients.
  • the saccharified compound can be obtained, for example, as an acid decomposed product and / or an enzymatic decomposed product of the raw material under an acidity of less than pH 7.
  • a purified product or a partially purified product can also be used.
  • a raw material derived from red algae for example, agar, agarose, ligagenan, or the like can be used alone or in combination of two or more.
  • the above compounds are used as active ingredients and formulated into basic cosmetics such as creams, emulsions, lotions, facial cleansers, packs, etc., makeup cosmetics such as lipsticks, foundations, etc., body soaps, stone stones, etc. can do. It is also effective for hair, such as hair products such as hair tonic, hair liquid, hair set lotion, hair blowing agent, hair cream, and hair coat, and toiletries for hair such as shampoo, rinse, and hair treatment. It can be in the form of a hair care product.
  • the amount to be added to the cosmetic may be appropriately determined according to its whitening action, moisturizing action, antioxidant action and the like.
  • those usually blended in the cosmetic can be used.
  • the whitening action and the moisturizing action may be measured by a conventional method, and for example, can be measured by the method described in JP-A-8-310937.
  • the cosmetic of the present invention has a skin whitening action, a moisturizing action, an antioxidant action, an active oxygen production inhibitory action, an antioxidant stress action, a hair moisturizing action, an antioxidant action, an active oxygen inhibitory action, It has excellent properties due to its antioxidant stress action.
  • At least one compound selected from the group consisting of a compound selected from the compounds of formulas 1 to 6 and a soluble sugar compound containing the compound at the reducing end for example, agarobiose, a Oligosaccharides such as gallotetraose, agaguchihexaose, agarocotaose, K-Ichirabiose and / 3-D-galactopyranosyl-13,6-anhydro-12-O-methyl-1L-galactose
  • a freshness preserving agent is provided as an active ingredient.
  • the compound can be obtained, for example, as an acid decomposed product and / or an enzymatic decomposed product of the raw material under an acidity of less than pH 7. Further, a purified product or a partially purified product can also be used.
  • a raw material for example, a substance containing a compound selected from the compounds of formulas 1 to 6 derived from red algae, for example, agar, agarose, and power lagenan, alone or in combination of two or more kinds Can be used.
  • At least one compound selected from the group consisting of a compound selected from the compounds of formulas 1 to 6 and a soluble sugar compound containing the compound at the reducing end for example, agarobiose, agarotetraose, aga Sugar compounds such as oral hexaose, agarooctaose, ⁇ -Ichirabiose, and jS-D-galactopyranosyl-1,3,6-anhydro_2-O-methyl-L-galactose have antioxidant effects, freshness-retaining effects, It has a tyrosinase activity inhibitory activity and can be used as an active ingredient to produce a food freshness preserving agent that can effectively prevent food discoloration, spoilage, oxidation and the like by a known formulation method.
  • agarobiose agarotetraose
  • aga Sugar compounds such as oral hexaose, agarooctaose, ⁇ -Ichirabios
  • the freshness preserving agent of the present invention is extremely useful for maintaining the taste and freshness of various foods, fresh foods, processed foods and the like.
  • Compounds selected from the group consisting of compounds selected from the compounds of formulas 1 to 6 and soluble saccharide compounds containing the compounds used in the present invention are all
  • Human promyelocytic leukemia cells HL_60 (cultured at 37 ° C in RPMI 1640 medium (Gibcone earth) containing 10% fetal bovine serum (manufactured by JRH Biosciences) at 30 ° C for 30 minutes) ATCC CCL-240) was suspended in the same medium at a concentration of 2500 Z90 ⁇ 1.
  • the number of viable cells was significantly reduced in the medium to which the above-mentioned acid-decomposed solution and its 10-fold diluted solution were added, as compared with those to which water was added.
  • apoptotic bodies were observed in dead cells.
  • Agar powder 40 Omg was suspended in 1 N hydrochloric acid (2 Om1) and dissolved by heating in a microwave to prepare an acid decomposition solution. After cooling the lysate, add 2 mM 1 of 50 mM citrate buffer pH3, adjust the pH to 6.5 with sodium hydroxide, filter through a 0.2 Mm (Kojung Co.) filter, and filter the acid digestion solution. Obtained.
  • the acid-decomposed solution and a 10-fold dilution of this acid-decomposed solution were measured for HL-60 cell growth inhibitory activity and apoptosis-inducing activity in the same manner as in Example 11 (1). As a result, this acid-decomposed solution also exhibited almost the same cancer cell growth inhibitory activity and apoptosis-inducing activity as the acid-decomposed solution described in Example 11 (1).
  • Agar powder (40 Omg) was suspended in 1 N hydrochloric acid (4 Om1) and dissolved in a boiling water bath to obtain a solution. This solution is divided into eight equal parts, kept on a boiling water bath for 0, 30, 60, 90, 120, 180 and 210 minutes, cooled, and adjusted to pH 6.5 with 2N sodium hydroxide. Was adjusted.
  • Each of the treatment solutions was measured for the activity of inhibiting the proliferation of HL-60 cells and the activity of inducing apoptosis in the same manner as in Example 1- (1).
  • the treatment solution for 0 minutes and 30 minutes showed the same activity as the acid decomposition solution described in Example 11 (1), but the treatment solution for 60 minutes or more did not show both activities.
  • each of the treatment solutions was measured for the activity of inhibiting the proliferation of HL-60 cells and the activity of inducing apoptosis in the same manner as in Example 1- (1).
  • the hydrochloric acid-treated solution of 0.063N (pH 1.3) showed the same activity as the acid-decomposed solution described in Example 11- (1).
  • the activity decreased as the hydrochloric acid concentration decreased, but both activities were detected in the hydrochloric acid-treated solution of 0.0078 N.
  • agar powder 400 mg was added to 4 Om 1 of 1 N hydrochloric acid and 0.12 N hydrochloric acid, and the mixture was kept on a boiling water bath for 10 minutes to prepare a solution.
  • the solution was neutralized to pH 6.5 with 2 N sodium hydroxide, and then subjected to gel filtration using 0.2 M NaC1 containing 10% ethanol as an eluate using Cell GC Fine GCL-125.
  • the growth inhibitory activity and apoptosis-inducing activity of HL-160 cells were measured in the same manner as in Example 1-1 (1). Note that The growth inhibitory activity was measured as a relative activity as follows.
  • Figure 1 shows the elution diagram of gel filtration of 0.12N hydrochloric acid hydrolyzate of agar.
  • the vertical axis shows the sugar content (absorbance 480 nm: open circles) or relative activity (black circles) in the eluate measured by the Fuunol sulfuric acid method, and the horizontal axis shows the fraction number (1 fraction 12m 1). Show.
  • Figure 2 shows the elution diagram of the gel filtration of 1 N hydrochloric acid hydrolyzate of agar.
  • the vertical axis shows the sugar content (absorbance 480 nm: open circles) or the relative activity (black circles) in the eluate measured by the phenol sulfate method, and the horizontal axis shows the fraction number (1 fraction 12 ml) Is shown.
  • the acid digest of agar showed cancer cell growth inhibitory activity, and apoptotic bodies were observed in dead cells.
  • the eluates of fraction numbers 51 to 64 and the eluates of fraction numbers 65 to 84 in FIG. 1 were respectively combined to prepare a sugar compound for inducing apoptosis and / or for controlling cancer.
  • the eluates of fraction numbers 60 to 78 and the eluates of fraction numbers 79 to 95 in FIG. 2 were combined to prepare a sugar compound for inducing apoptosis and / or for controlling cancer.
  • TSK guard column ODS- 80Ts (20mm X 50mm, manufactured by Tosoh Corporation)
  • Mobile phase 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) aqueous solution
  • Each eluted peak was collected, dried under reduced pressure, and dissolved in 300 ⁇ l of water. Each fraction was sterilized by filtration and placed in a 96-well microtiter plate at 10 / ⁇ 1 each. Add 90 ⁇ l of RPMI 1640 medium (Nissi) containing 5,000 HL-60 cells (ATCC CCL-240) and 10% fetal serum (Gibco) and 5% The cells were cultured at 37 ° C. for 48 hours in the presence of carbon dioxide.
  • Example 2 The fraction 1001 from the 8.26 minute peak described in (1) was separated by the following size exclusion HP LC chromatography.
  • TSK guard column a (6mm X40ram, manufactured by Tosoh Corporation)
  • FIG. 3 shows the separation diagram obtained by size exclusion HPLC. That is, FIG. 3 is a diagram showing a size-exclusion HPLC chromatogram of the acid decomposition product of agar. The horizontal axis shows the elution time (minute), and the vertical axis shows the output of the differential refractometer. Each separated peak was separated and dried under reduced pressure. Each fraction was dissolved in water so as to have a concentration of 1 OmgZml, sterilized by filtration, and then the apoptosis-inducing activity and the cancer cell growth-inhibiting activity were measured by the method described in Example 2- (1) above. As a result, peaks at elution times of 8.87 minutes and 9.40 minutes had both activities.
  • the substances with an elution time of 8.87 minutes and 9.40 minutes were dissolved in phosphate buffered saline, left at 37 ° C for 1 hour, and analyzed by the same size exclusion HP LC. As a result, peaks with elution times of 8.87 minutes and 940 minutes were observed in both samples, and the ratios of the peak areas were almost equal. Therefore, it was clarified that the substance with an elution time of 8.87 min and the substance with a 940 min equilibrium state were in a phosphate buffer aqueous solution state.
  • Example 2 Mass spectrometry of the apoptosis-inducing cancer drug described in (2) was performed using a DX302 mass spectrometer (manufactured by JEOL Ltd.). Measurements were made in negative ion mode using glycerol as the matrix.
  • FIG. 4 is a diagram showing the mass spectra of apoptosis-inducing and anticancer substances.
  • the horizontal axis represents the m / z value, and the vertical axis represents the relative strength (%).
  • Example 2 The nuclear magnetic resonance spectrum of the apoptosis-inducing and anticancer substance obtained in (2) was measured.
  • the nuclear magnetic resonance apparatus used was J NM-A500 (manufactured by JEOL Ltd.).
  • the sample was dissolved in heavy water, and the chemical shift value of HOD was shown as 4.65 ppm.
  • the sample was dissolved in heavy water, and the chemical shift value of dioxane was shown as 67.4 ppm.
  • Figure 5 shows the 1 H-NMR spectrum of apoptosis-inducing and anticancer substances.
  • the horizontal axis represents the chemical shift value (ppm), and the vertical axis represents the signal intensity.
  • the sample was dissolved in deuterated dimethyl sulfoxide, and the NMR spectrum was measured.
  • Figure 6 shows the 1 H-NMR spectrum of apoptosis-inducing and anticancer substances in heavy dimethyl sulfoxide solvent.
  • the horizontal axis represents the chemical shift value (ppm), and the vertical axis represents the signal intensity.
  • the described apoptosis-inducing and anti-cancer substance was identified as agarobiose. It was shown by 1 H-NMR in a heavy dimethyl sulfoxide solvent that 3,6-anhydrogalactose at the reducing end of agarobiose exists mainly as a ring-opened aldehyde in a nonaqueous solvent. In addition, 1 H-NMR using a heavy water solvent showed that the compound was present as an hydrate of an aldehyde in an aqueous solution.
  • Example 2- (2) was agaguchi biose.
  • Example 2 Apoptosis-inducing and anticancer substances obtained in (2), That is, agar-mouthed biose was dissolved in ice to a concentration of 0.78 mg / m 1, and 10 ⁇ l was placed in a well of a 96-well microtiter plate, and apoptosis was performed by the method described in Example 2- (1) above. Induced activity and cancer cell growth inhibitory activity were measured. As a result, apoptotic bodies were observed by light microscopic observation, and cell growth was suppressed by about 86% in the agarobiose-added section as compared with the control section to which water was added. That is, agarobiose induced apoptosis in HL-60 cells at 78 ⁇ g Zm1 and suppressed cell proliferation.
  • Solvent A 90% acetonitrile aqueous solution
  • Solvent B 50% aqueous acetonitrile solution
  • FIGS. shows the elution patterns of normal-phase HP LC of agaropioose, agarotetraose and aga- mouth hexaose, with the horizontal axis representing the retention time (min) and the vertical axis representing the absorbance at 195 nm.
  • Figure 8 shows the mass spectrum of the peak at 66.7 minutes, with the horizontal axis Indicates mZz value-, and the vertical axis indicates relative intensity (%).
  • Figure 9 shows the mass spectrum of the peak at 78.5 minutes, where the horizontal axis shows the mZz value and the vertical axis shows the relative intensity (%).
  • Figure 10 is a diagram showing the mass spectrum of the peak at 85.5 minutes, where the horizontal axis indicates the m / z value and the vertical axis indicates the relative intensity (%).
  • Example 3-(1) Agarobiobiose obtained in Example 3-(1) was added to 50 ⁇ l of a 10 OmM aqueous solution of 450 ⁇ l of a 10 times concentration of phosphate buffered saline (Takara Shuzo Co., Ltd., 900). 50 ⁇ l of a 3 / 3-galactosidase (Sigma, G5635) phosphate buffered saline solution was added, mixed, and reacted at 37 ° C. for 1 hour.
  • FIGS. show the mass spectrum of 3,6-anhydro-L-galactose, where the horizontal axis shows the m / z value and the vertical axis shows the relative intensity (%).
  • Fig. 11 shows the mass spectrum of 3,6-anhydro-L-galactose, where the horizontal axis shows the m / z value and the vertical axis shows the relative intensity (%).
  • 1 2, 3, 6-Anhi mud one L- galactose in heavy water solvent
  • FIG. 1 3 is a diagram showing the 1 H- NMR spectra in deuterated dimethyl sulfoxide solvent, the horizontal axis represents The chemical shift value (ppm) is shown, and the vertical axis shows the signal intensity.
  • Example 3 A 2 OmM aqueous solution of 3,6-anhydro-1L-galactose obtained in Example 3 was diluted 2-fold, 4-fold and 8-fold with sterile water, and the method described in Example 2- (1) was used. The apoptosis-inducing activity and the cancer cell growth-inhibiting activity were measured by the method. As a result, apoptotic bodies were observed in the 2-fold dilution of 3,6-anhydro L-galactose (final concentration: lmM), and the absorbance at 590 nm was two-half that of the control water-added section. 1 or less.
  • Example 2 Filtrate and sterilize a 5 OmM aqueous solution of agarobiose, agarotetraose and agaguchihexaose obtained in Example 3_ (1), and sterilize with 2, 4, 4, 8, and 16 times with sterile water. Diluted 1:32, 64 and 128 times.
  • Example 2 The proliferation inhibitory activity of these diluted solutions on various cells was measured by the method described in (1). Tables 1 and 2 show the cells and medium used.
  • Human HL-60 (ATCC CCL 240) RPMI 1640 medium (Nissi) containing human promyelocytic leukemia cells 10% fetal serum (Gibco) Same as human peripheral lymphocytes
  • RPMI 1778 (ATCC CCL 156) Mouse monocyte 10% DMEM medium containing 10% fetal serum
  • RPMI 1640 medium containing 10% human gastric cancer cells and fetal serum MKN45 (RIKEN G RCB1001)
  • DMEM medium containing 10% human liver cancer cells and 10% human fetal serum
  • H-mark G2 (ATCC HB 8065) Human colon adenocarcinoma cells McCOY'S medium containing 10% fetal calf serum HT-29 (ATCC HTB38) (Bio-Wita)
  • HCT1 16 (ATCC CCL-247) Fibrosarcoma D-MEN medium containing 10% fetal serum
  • HT-1080 (ATCC CCL-121) (Bio-Wita) Table 2 Cell culture medium Glioblasts D-MEN medium containing 10% fetal calf serum
  • A-172 Human breast cancer cells DMEM medium containing 10% fetal serum
  • MCF7 Human breast cancer cells 10% RPM RPMI 1640 medium containing fetal serum serum T-47D (ATCC HTB-133) Human bladder cancer cells 10% ⁇ McCOY'S medium T24 containing fetal serum serum T24 (ATCC HTB-4) DMEM medium containing human ⁇ cervical cancer cells 10% ⁇ fetal serum
  • A549 Human colon adenocarcinoma cells RPMI 1640 medium containing 10% fetal bovine serum WiDr (ATCC CCL-218)
  • agarobiose was eluted in the 5% and 7.5% aqueous ethanol eluted fractions, and agarotetraose, 22.5% and 25% aqueous ethanol eluted in the 15% and 17.5% aqueous ethanol eluted fractions.
  • the fraction contained high purity agaose oxaose, and the fractions eluted with 27.5% and 30% aqueous ethanol contained agaroquatose in high purity.
  • agaro-oligosaccharides 2.5 mM and 1.25 mM of agarobiose, agarotetraose, aga-hexaose and aga-mouth kutaose obtained in Example 5 (hereinafter, these oligosaccharides may be referred to as agaro-oligosaccharides) were used.
  • agaro-oligosaccharides were used.
  • the HL- 60 cells 2. suspended in 5 X 1 0 5 or Roh 4. I urchin 1 0% ⁇ shea fetal serum-containing RPMI1640 medium becomes 5 m l, 5 with the addition of each Origo aqueous saccharide solution 0.
  • the cells were cultured at 37 ° C for 24 hours and 48 hours in the presence of% carbon dioxide. A portion of the cell culture was taken, trypan blue was added, and the cells were observed under a microscope to determine the number of viable cells. As a result, the number of viable cells was reduced in each group compared to the water-added group (control), and apoptotic bodies were observed.
  • FIG. 14 shows the culture time and the number of viable cells when HL-60 cells were cultured with the addition of oligosaccharides at a final concentration of 250 M.
  • Fig. 15 shows the oligosaccharides at a final concentration of 125 ⁇ ⁇ .
  • FIG. 4 is a graph showing the culture time and the number of viable cells when HL-60 cells were cultured with the addition of HL-60. 14 and FIG.
  • the horizontal axis incubation time (hours) vertical axis represents the living cell number (X 1 0 5/5 ml)
  • the black circle (Qin) is added water (control)
  • the mark ( ⁇ ) is Agaro
  • the addition of biose indicates the addition of agarotetraose
  • the triangle ( ⁇ ) indicates the addition of xaose to the agar mouth
  • the square (mouth) indicates the addition of agarooctaose.
  • Example 2 Cell proliferation on HL-60 cells by the method of 1 (1) The inhibitory activity was measured. As a result, 1.5-fold, 2.25-fold and 3.38-fold dilutions were added to the ⁇ -strength heated product, and 1.5-fold and 2.25-fold diluted solutions were added to the heated-strength lagenan heated product. In the added section, the absorbance at 590 nm was less than half that of the control water-added section, and apoptotic bodies were observed.
  • the cell growth inhibitory activity on HL-60 cells was measured by the method of (1).
  • the agar and agarose acid decomposed products were added in 2 to 8 times diluent and the rod agar acid decomposed products were added in 2 and 4 times dilutions. It was 1 or less, and apoptotic bodies were observed.
  • the acid digests were analyzed by normal phase HPLC, agarooligosaccharides and other agarooligosaccharides were detected in all of the digests.
  • 0.5M, 1M or 2M citrate 0.1M, 0.5M, 1M or 2M nitric acid; 0.1M or 0.5M sulfuric acid; 0.1M, 0.5M or 1M phosphoric acid; 0.1M hydrochloric acid .
  • Example 2- (1) Heat these agar suspensions until dissolved in the microwave, then neutralize with NaOH, After diluting 2: 4, 8, 16 or 32 times with distilled water, the apoptosis-inducing activity on HL-60 cells and the cancer cell growth inhibitory activity on HL-60 cells were measured by the method described in Example 2- (1).
  • Table 5 shows the results.
  • the numbers in Table 5 indicate the dilution ratio of the diluent whose absorbance at 590 nm was less than half that of the control with water.
  • the numbers in parentheses indicate the absorbance at 590 nm when the maximum concentration of the acid used in this example was neutralized with NaOH, diluted with distilled water, and added without adding agar. This shows the dilution ratio of the diluted solution that is less than half that of the control.
  • Example 8 The acid-heat-treated product of the agar obtained in (1) was analyzed by the following normal phase HPLC.
  • Solvent A 90% aqueous solution of acetonitrile
  • Solvent B 50% acetonitrile aqueous solution
  • Samples heat-treated in 0.1 M hydrochloric acid contained agarooligosaccharides and other agarooligosaccharides.
  • Figure 16 shows the typical results. That is, Fig. 16 shows the elution pattern of normal phase HP LC of agar heat-treated in 0.5 M phosphoric acid. The horizontal axis shows the retention time (min), and the vertical axis shows the retention time at 195 nm. Shows absorbance.
  • each sample contained agaro-oligosaccharides such as agarobiose, agarotetraose, and agaguchihexaose.
  • the content of agarooligosaccharide increased in the 2 OmM citrate-treated product until heating for 350 minutes, and became almost constant thereafter.
  • the content of agarooligosaccharide in the 5 OmM citrate-treated product increased until heating for 200 minutes, and became almost constant thereafter.
  • the content of agarooligosaccharide increased in the 10 OmM citrate-treated product until heating for 160 minutes, and became almost constant thereafter.
  • Example 8 (2) When each sample was analyzed by the same normal phase HP LC as in Example 8 (2), the same results as in thin layer chromatography were obtained. However, the lO OmM citrate-treated product contained more impurities than the 5 OmM citrate-treated product, and the impurities increased with the heating time.
  • Example 3 Agarobiose prepared in (1) was added to 0.05 mM
  • the cells were dissolved to 1 mM, 0.2 mM, 0.4 mM, 0.6 mM, 0.8 mM, and ImM.
  • Black port Holm each sample 1 mu 1 was spotted on silica gel 60 sheet
  • F 254: methanol: acetic acid 7: 2: expanded three times with 2 solvent and developed with Orsi Nord monosulfate method.
  • the colored sheet is captured as image data by FOTODYNE FOTO / Analyst Archiver Ecripse (sold by Central Science Trading Co., Ltd.), and this image data is processed by image analysis software 1-D Basic (manufactured by Advanced Biotechnology, Inc.).
  • a calibration curve was prepared by quantifying the intensity of agarobiose spot at each concentration.
  • FIG. 17 is a diagram showing a calibration curve of agarobiose, in which the intensity of the spot for each concentration of agarobiose is plotted, the horizontal axis indicates the concentration of agarobiose (), and the vertical axis indicates the intensity of the spot.
  • the calculation formula in Fig. 17 shows the relationship between the spot intensity (y) and the agarobiose concentration (X), and the spot intensity is obtained for a sample whose agarobiose concentration is unknown. Thus, the concentration of agarobiose is calculated from the formula.
  • Figures 18 and 19 show the relationship between the heating time and the amount of agarobiose produced in 0.2% agar 0.1M HC1 solution and 0.2% agar 0.1M citrate solution. That is, Fig. 18 shows the relationship between the heating time of 0.2% agar in a 0.1 M HC1 solution and the amount of agarobiose produced, and Fig. 19 shows the relationship between 0.2% agar and 0.2% agar.
  • FIG. 3 is a graph showing the relationship between the heating time and the amount of agarobiose produced in a 1M citrate solution. In Fig. 18 and Fig. 19, the horizontal axis shows the heating time (hour), and the vertical axis shows the concentration of agarobiose ().
  • the concentration of agarobiose reached the maximum in 1 hour, and thereafter decreased.
  • the concentration of agarobiose gradually increased up to 8 hours, and decreased at 21 hours.
  • the concentration of agarobiose was detected in the sample heated for 5 minutes in a 0.1M HC1 solution containing 0.2% agar and in the sample heated for 5, 10 and 20 minutes in a solution containing 0.2% agar and 0.1M citrate. It was below the limit.
  • agarobiose showed high values in 24 hours, while agarotetraose, aga mouth hexaose, and agarooctaose showed high values in 4 to 8 hours.
  • agarobiose showed high values at 24 hours, while agaro tetraose, aga mouth hexaose, and agarooctaose showed high values at 4 to 8 hours.
  • the agar was dissolved in 50 OmM citrate, the formation of some agarooligosaccharides was observed at 65 ° C in 4 to 24 hours.
  • agarobiose showed high values in 2 to 24 hours, and agarotetraose and agaguchi hexose showed high values in 1 to 6 hours.
  • Agarocotaose showed high values in 1-2 hours.
  • agarobiose showed high values for 1 to 24 hours, and agarotetraose showed high values for 1 to 2 hours.
  • the values of agarose and agarocotaose showed high values from 30 minutes to 1 hour.
  • FIG. 20 is a diagram showing the production of agarooligosaccharides at 50 OmM citrate at 80 ° C.
  • the vertical axis represents the amount of agarooligosaccharide production (circles: agarobiose, triangles: agarotetraose, squares) : Aga mouth hexose, X mark: Agarocotaose), the horizontal axis indicates time.
  • FIG. 21 is a graph showing agaro-oligosaccharide production at 50 OmM citrate and 95 ° C.
  • the vertical axis represents the amount of agaro-oligosaccharide production (circles: agarobiose, triangles agarotetraose, squares: Aga mouth Hexaose, X mark: Agarocotaose), the horizontal axis shows time.
  • agarobiose shows a high value in 24 hours, while agarotetraose and aga Saos and agarocotaose were produced slightly in 8 hours.
  • agarobiose showed high values at 8 hours, while agarotetraose, agaguchi hexoses and agarocutaose also showed high values at 8 hours.
  • agarobiose showed high values in 4 to 8 hours, and agarotetraose and agaguchi hexose showed high values in 2 to 6 hours.
  • agar is dissolved in 120 OmM lactic acid, at 80 ° C, agarobiose shows a high value in 4 to 24 hours, and agarotetraose and agaguchi hexose show a high value in 2 to 6 hours. showed that.
  • Agarocotaose showed high values at 2 hours.
  • agarobiose showed high values in 2 to 8 hours, and agarotetraose and agaguchi hexose showed high values in 1 to 2 hours.
  • FIG. 22 is a diagram showing the production of agarooligosaccharides at 120 OmM lactic acid and 80 ° C.
  • the vertical axis represents the amount of agarooligosaccharide production (circles: agarobiose, triangles: agarotetraose; Square mark: Aga mouth hexose, X mark: Agaroktaose), the horizontal axis indicates time.
  • FIG. 23 is a graph showing the production of agarooligosaccharides at 120 OmM lactic acid at 95 ° C.
  • the vertical axis represents the production amount of agarooligosaccharides (circles: agarobiose, triangles: agarotetraose, squares: Aga mouth hexaose, X mark: agarocotaose), the horizontal axis indicates time.
  • FIG. 24 is a diagram showing the production of agaro-oligosaccharides at 100 OmM malic acid at 80 ° C.
  • the vertical axis represents the amount of agaro-oligosaccharide production (circles: agarobiose, triangles: agarotetraose, squares). Mark: aga mouth hexaose, X mark: agarocotaose), the horizontal axis shows time.
  • FIG. 25 is a graph showing the production of agarooligosaccharides at 1,000 mM malic acid and 95 ° C.
  • the vertical axis represents the amount of agarooligosaccharide production (circles: agarobiose, triangles: agarotetraose, squares: agarose). Hexaose, X mark: agarocotaose), the horizontal axis shows time.
  • FIG. 26 shows 100 OmM malic acid, 70. It is a figure which shows the production
  • the acids used for the production of agarooligosaccharides were citric acid, lactic acid, malic acid, the concentration of the acid was several tens mM to several M, and the heating temperature was 7 M.
  • the heating time is preferably from 0 to 95 ° C and from several tens of minutes to 24 hours.
  • the quantification was performed according to the kit usage method, but the reaction of / 3-galactosidase was
  • the temperature was changed to 37 ° C for 1 hour.
  • a calibration curve was prepared using lactose, the molar concentration (mM) in terms of ratatose was calculated, and then converted to the agarobiose concentration (mg Zm 1).
  • agarotetraose Using the agarobiose, agarotetraose, agaguchihexaose, and agarocotaose prepared in the above examples, quantification was attempted by the above method. As a result, the calculated and measured values of agarobiose agreed. On the other hand, agarotetraose, agaguchihexaose, and agarocotaose were not substantially detected by the above method.
  • Example 8 The filtrate prepared by normal phase HP LC as in (2) was analyzed, and the main components were agarooliose, agarotetraose, agaguchihexaose, and agarooctaose as the agaro-oligosaccharides. It was confirmed that it was generated as.
  • the filtrate had a pH of 2.4, an acidity of 1.7, a Brix of 9.4%, and the amount of agaropios measured using the F-kit lactose / galactose described in Example 10- (8) above was 7. 4%.
  • H-type strong cation exchange resin (Diaion SK104H) was added to 100 g of deionized water, and the mixture was stirred at 95 ° C.
  • the agar (Ina agar type S-7) was added at 10 minute intervals, 10 g each, 5 times, then 15 g each, 2 times, and 20 g each, 3 times more. And finally 30 g was added. After the total amount of agar added was 185 g, the mixture was stirred at 95 ° C for 150 minutes, and then cooled to room temperature. After separating the resin and the solution by decantation, the separated solution was filtered with activated carbon 3% W / W and Celite 545 (manufactured by Celite) 0.5% W / W body feed to prepare a filtrate. .
  • Example 8 A filtrate prepared by the same normal phase HP LC as in (2) was analyzed, and agaro-oligosaccharide, agarobiose, agarotetraose, aga-mouth hexaose, and agaro-octaose were formed as main components. I confirmed that.
  • the filtrate had a pH of 1.2, an acidity of 11.9, a Brix of 64%, and an agarobiose content of 24.4% measured using the F-kit lactose / galactose described in Example 10- (8) above. Met.
  • Agar liquefaction was performed in the same manner as for phosphoric acid using 1 liter of deionized water with 1% W / V citrate concentration.
  • Liquefaction means a state in which no gelation occurs even at the freezing point, and the time to reach that state (liquefaction time) was measured.
  • the amount of agarobiose produced during liquefaction and thereafter was measured using the F-kit lactose Z galactose described in Example 10_ (8) above.
  • Tables 6 and 7 show the results.
  • Table 6 Phosphoric acid concentration Liquefaction time 95 ° C Agarobiose
  • Example 8 A filtrate prepared by the same normal phase HP LC as in (2) was analyzed, and agarobobiose, agarotetraose, agaguchioxaxaose, and aagaguchitautaose were formed as main components as sugar compounds. Was confirmed.
  • the filtrate had a pH of about 2.6, an acidity of 0.92, a brix of 9.2%, and an amount of agarobiose produced by the method described in Example 10- (8) of 43.1 mM. .
  • Example 1 The filtrate (agar-decomposed oligosaccharide solution) prepared in (1) was diluted 20-fold, and an acidulant, a sweetener, and a flavor were added thereto. Agarobiose 2.25 mM soft drink was manufactured.
  • the composition tables are shown in Tables 8 and 9.
  • Table 8 is a composition table of the gray plum root taste soft drink
  • Table 9 is a composition table of the perilla taste soft drink.
  • the ingredients shown in each table were added to water and dissolved to prepare a soft drink, which was dispensed into 200 ml empty cans.
  • the soft drink having the composition shown in Table 5 was a carbonated drink having a gas pressure of 0.8 kg / cm 2 (20 ° C).
  • Vitamin C 0 2 g Cuenoic acid 0 2 g Manole toast 25 g Grapefruit flavor
  • Table 10 shows the average sensory evaluation for grapefruit taste
  • Table 11 shows the average sensory evaluation for perilla.
  • Each of the products of the present invention was evaluated as having a better balance of taste of the beverage, a smoother tongue feeling, and a smoother feeling than the control, resulting in a novel taste beverage.
  • the soft drinks before carbonation were also drinks of the present invention having novel tastes similar to those described above.
  • (3) Ethanol 6% VV or 8% V / V was added to the soft drinks listed in Tables 8 and 9 above to prepare a beverage, and dispensed into 2 Q Om 1 empty cans. .
  • the alcoholic beverage was carbonized to produce a refreshing carbonated alcoholic beverage of the present invention having a gas pressure of 0.8 kg / cm 2 (20 ° C).
  • the refreshing carbonated alcoholic beverage of the present invention has a novel taste based on the evaluation that the beverage has a better balance of taste, a smoother tongue feeling, and a smoother feeling compared to the control containing no agar-decomposed oligosaccharide solution. Became a soft carbonated alcoholic beverage.
  • a beverage containing the agar decomposed product of citrate was prepared as follows.
  • the composition table is shown in Table 12. That is, the product 1 of the present invention in Table 12 was prepared by using the filtrate (agar oligosaccharide solution) prepared in Example 11-1 (1) in 0.1% WZV and agar (Ultra agar AX-30: manufactured by Ina Food Industry Co., Ltd.). ) 0.25% WZV, citric acid 0. oyo / oWZv were used.
  • Product 2 of the present invention did not contain an agar oligosaccharide solution, but used agar 0.25% W / V and citric acid 0.08% W / V.
  • Products 1 and 2 of the present invention are prepared by dissolving agar in warm water and mixing with other materials, and then in an acidic condition at 93 ° C for 10 seconds, less than 93 ° C to 80 ° C for 20 minutes, and further 80 ° C Heating was carried out at a temperature of less than 75 ° C. for 15 minutes to produce a beverage containing citrate hydrolyzate of agar.
  • the control had the same composition as the product 2 of the present invention, but was performed under heating conditions of 93 ° C. and 10 seconds.
  • 10 panelists performed a five-point (5 good, 1 bad) sensory evaluation. Table 13 shows the average values of the sensory evaluation.
  • Table 1 2 the thickened agar-kuninic acid hydrolyzate-containing beverages
  • Agar oligosaccharide solution (m 1) 1 0 0
  • Example 1 2 Ethyl alcohol was added to the drinks of the present invention 1, the present invention 2 and the control described in (1) so that ethyl alcohol 2% VZV or 4% VV was obtained.
  • An alcoholic beverage was prepared by reducing residual demineralized water.
  • the alcoholic beverages corresponding to the present invention product 1 and the present invention product 2, respectively, have a better balance of the taste of the beverage and a moderately thicker taste than the control alcoholic beverage, and have a smooth, smooth tongue feeling.
  • the finished beverage was evaluated as a new taste beverage.
  • the frozen product of the alcoholic beverage of the present invention exhibited a good sorbet-like texture.
  • agar (Agar Noble) was suspended in 0.1 N hydrochloric acid to a concentration of 1% and treated at 37 ° C for 5, 16 or 48 hours. This treatment solution was diluted 10-fold with distilled water and analyzed by the thin-layer chromatography described in Example 9.As a result, a little generation of agarooligosaccharide was observed after 5 hours treatment, and 5 hours after 16 hours treatment. It increased more than the treatment, and further increased by the 48-hour treatment.
  • Agar (Agar Noble) was suspended in 0.1 N HC1 to a concentration of 10% and heated at 100 ° C for 19 minutes. Apply 10 ml of the above sample to a TYOOPEARL HW40 C (Tosoichi) column (4.4 cm x 85 cm) equilibrated with water, and apply water at a flow rate of 1.4 ml per minute. Gel filtration chromatography was performed as the mobile phase. The eluted substance was detected with a differential refractometer and fractionated in 7 ml increments.
  • Example 8 Analysis of each sample by the same normal phase HP LC as in (2) yielded results similar to those of thin layer chromatography.
  • Example 14 Put each reaction sample 101 prepared in (1) into a well of a 96-well microtiter plate, and grow cancer cells against HL-60 by the method described in Example 2 (1). The inhibitory activity was measured.
  • Solvent B 50% aqueous acetonitrile solution
  • FIG. 27 shows the separation diagram for normal phase HP LC. That is, FIG. 27 is a diagram showing a normal phase HP LC chromatogram of the ⁇ -force lagenate degradation product, in which the horizontal axis represents the retention time (minutes) and the vertical axis represents the absorbance at 21.5 nm.
  • Example 15 Mass spectrometry of the apoptosis-inducing and carcinogenic substances described in 5- (1) was performed using a DK302 mass spectrometer (manufactured by JEOL Ltd.). The measurement was performed in negative ion mode using dalycerol as a matrix.
  • F AB- S Mass spectrometry of the apoptosis-inducing and carcinogenic substances described in 5- (1) was performed using a DK302 mass spectrometer (manufactured by JEOL Ltd.). The measurement was performed in negative ion mode using dalycerol as a matrix.
  • Figure 28 shows the mass spectra of apoptosis-inducing and anticancer substances.
  • the horizontal axis is the mZz value, and the vertical axis is the phase. Indicates strength versus strength.
  • Example 15 The nuclear magnetic resonance spectrum of the apoptosis-inducing and anticancer substance obtained in 5- (1) was measured.
  • the nuclear magnetic resonance apparatus used was J NM-A500 (manufactured by Nippon Denshi).
  • Figure 29 shows the 1 H-NMR spectrum of the apoptosis-inducing and carcinogenic substances.
  • the horizontal axis represents the chemical shift value (ppm), and the vertical axis represents the signal intensity.
  • Example 15 From the results of mass spectrometry and —NMR analysis, the apoptosis-inducing and anticancer substances described in Example 15— (1) were identified as ⁇ -force raviose [j3—D—galactobiranosyl-1-sulfate-1 (1 ⁇ 4) —3, 6—Anhydro D
  • Example 15_ (1) was ⁇ -force raviose.
  • Example 15 5 Dissolve the ⁇ -Ichirabiose obtained in (1) in water to a concentration of 1.56 mM, and add 10 ⁇ l to a well of a 96-well microtiter plate.
  • Apoptosis-inducing activity and cancer cell growth-inhibiting activity were measured by the method described.
  • apoptotic bodies were observed by light microscopy, and cell proliferation was suppressed by about 70% in the section with added ⁇ -Ichirababiose as compared with the control section with water.
  • Ichiroku Raviose induced apoptosis in ⁇ L-60 cells and suppressed cell proliferation.
  • the partitioned aqueous phase was evaporated to dryness using an evaporator, and again dissolved in 15 Om1 of water. Insoluble matters at the time of dissolution were removed by centrifugation to obtain a supernatant.
  • the ethyl acetate phase is The residue was dried in a filter, dissolved in 10 Om 1 of ion-exchanged water, and adjusted to pH 6.5 with 1 N sodium hydroxide.
  • the ethyl acetate phase and the aqueous phase were sterilized by filtration with a filter having a pore size of 0.2 ⁇ (manufactured by Koingen Co., Ltd.), and then diluted with water by a factor of 10, 20, and 30.
  • the growth inhibitory activity on HL-60 cells was measured in the same manner as in (1). As a result, the growth inhibition activity was observed in the aqueous phase, but the growth inhibition activity was not observed in the ethyl acetate phase.
  • the prepared aqueous phase solution (5 Om1) was added to the cell mouth fine GC L-25 column (41 X).
  • FIG. 30 is a diagram showing the results of gel filtration using cellulofine GCL-25.
  • the vertical axis represents the sugar content in the eluate measured by the phenol-sulfuric acid method (absorbance 490 nm: black circle), and the horizontal axis. The axis indicates the fraction number (10 m 1 per fraction).
  • fractions 86 to 90 showed the strongest growth inhibitory activity.
  • FIG. 31 shows the elution diagram.
  • Fig. 31 shows the results of gel filtration using a Sephadex LH-20 column.
  • the vertical axis represents the sugar content in the eluate measured by the phenol sulfuric acid method. (Absorbance 4-90 nm: black circle), and the horizontal axis shows the fraction number (1 fraction 10 m 1) '.
  • Each eluted fraction was analyzed using a silica gel sheet as described above.
  • fraction numbers 30 to 35, 36 to 40, 41 to 44, 45 to 48, and 49 to 53 were roughly classified into five groups: fraction numbers 30 to 35, 36 to 40, 41 to 44, 45 to 48, and 49 to 53. 125 ⁇ l of each fraction number was collected into the above group, dried to dryness by an evaporator, dissolved in 500 ⁇ l of ion-exchanged water, and measured for its growth inhibitory activity on HL-60 cells.
  • Each group was dried by an evaporator, dissolved in 5 ml of ion-exchanged water, and filtered through a 0.45 / zm filter (manufactured by IWAKI). The growth inhibitory activity of each of the obtained solutions on HL-60 was measured. As a result,
  • Groups 4 and 5 were confirmed to be agarobiose by TLC analysis and mass spectrometry.
  • FIG. 32 shows the mass spectrum of j3—D—galactosylanosyl (1 ⁇ 4) —3,6-anhydro-1—0—methyl—L—galactose, with the horizontal axis representing the m / z value and The vertical axis indicates the relative intensity (%). Also, Fig. 33 shows that] —D—galata topyranosyl (1 ⁇ 4) —3, FIG. 6 is a diagram showing 1 H-NMR spectrum of 6-anbyone 2-0-methyl-1 L-1 galactose, in which the horizontal axis represents the chemical shift value (ppm), and the vertical axis represents the signal intensity. Show.
  • Example 3 The agar-derived saccharide obtained in Example 3 was measured for its lipid peroxide radical production inhibitory activity as follows.
  • Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus) 3 A (National 'Collection of Ob' type. Culture, NCTC 831 9) with 5 ml Brain Heart Infusion Medium (Difco, 0037—17-8) And cultured at 37 ° C for 1 ⁇ . The cells were collected by centrifugation, washed 3 times with-phosphate buffered saline, and suspended in phosphate-buffered saline to be 1 X 1 0 7 colony forming units Zm 1. 100 1 of the above bacterial suspension, 100 ⁇
  • Table 14 shows the results.
  • “+” indicates a sample in which the fungus grew, and “1” indicates a sample in which no fungus grew.
  • the concentration shown in the top row of the table is the concentration of the sample in the reaction mixture obtained by reacting tert-butyl hydroperoxide and cells at 37 ° C for 30 minutes.
  • agarobiobiose and agarotetraose showed strong inhibitory activity on lipid peroxide radical production.
  • Raviose and 3,6-anhydro 2 - ⁇ methyl-1-L-galactose also showed similar activities.
  • FIG. 3 4 is a diagram showing a Agarobiosu concentrations in lymphocytes young rejuvenation reaction by C on A, the relationship between the 3 H- thymidine uptake, the horizontal axis Agarobiosu concentration, and the vertical axis 3 H- thymidine incorporation Indicates the amount (cpm).
  • the white bar graph shows no stimulation, and the hatched bar graph shows C on
  • 3A shows the uptake of 3 H-thymidine when stimulated with A.
  • agarobiose showed a dose-dependent inhibitory effect on mitogen-stimulated mouse lymphocyte proliferation, with 100 / Z g / m1 almost completely suppressing lymphocyte proliferation. An inhibitory effect on activation was observed.
  • 3,6-anhydrogalata tovilanose, agarotetraoose, aga-mouth hexaose, agarocotaose, dynamite, and 3,6-anhydro 2-O-methyl-1-L-galactose have similar activities. Admitted.
  • Spleens were excised from BAL BZc mice (Japan SLC; os, 6 weeks old) and C57B LZ6 mice (Japan SLC; oss, 6 weeks old), and spleen lymphocytes were obtained by the above method.
  • the concentration of each cell suspension was adjusted to 2 ⁇ 10 6 cells / ml, and 100 ⁇ l of each was mixed and seeded on a 96-well microtiter plate. Add agarobiose at each concentration to each cell except the control group, and culture with carbon dioxide. 3 ⁇ in a bowl. ⁇ : Cultured for 4 days. After the culture, 1 ⁇ Ci of 3 H-thymidine was added to each well, and the cells were further cultured for one day, and the uptake into the cells was measured using a liquid scintillation counter.
  • FIG. 35 is a diagram showing the relationship between agarobiose concentration and 3 H-thymidine uptake in the mixed lymphocyte reaction, where the horizontal axis represents the agarobiose concentration and the vertical axis represents the 3 H-thymidine uptake (c pm). Show.
  • the white bar graph shows the amount of 3 H-thymidine incorporation when cells from either line are used alone, and the hatched bar graph shows the amount when cells from both lines are mixed. As is evident from Fig.
  • agaropios showed a dose-dependent inhibitory effect on lymphocytes activated by aroantigen stimulation, and almost completely suppressed at 10 ⁇ g / m1, An inhibitory effect on sphere activation was observed. Also included are 3,6-anhydroglucolactopyranose, agarotetraose, agaguchihexaose, agarocotaose, lababiose and 3,6-anhydro-2-O-methyl-1-L-galactose. Similar activity was observed.
  • the cells were added at 5,000 each and cultured at 37 ° C. for 12 hours in the presence of 5% carbon dioxide. 10 ⁇ l of 25 ⁇ g / m 1 lipopolysaccharide (LPS, Sigma, L-2012) and ⁇ ⁇ ⁇ of 5000, 1500, 500, 150 in each well or is 5 0 ⁇ Agarobiosu or neoagarobiose (sigma, G 44 1 0) aqueous solution was added, further 12 hours after incubation, NO is generated by being acid I spoon in a medium N0 2 -The concentration was measured. As controls, a category without LPS and a category without agagabiose or neoagarobiose were set.
  • FIG. 36 is a diagram showing the NO 2 — concentration in the medium when agarobiose was added and cultured under each culture condition.
  • FIG. 37 is a diagram showing the NO 2 _ concentration in the culture medium when neoagarobiose was added and cultured under each culture condition.
  • the horizontal axis represents the culture conditions, and the vertical axis represents the N 2 -concentration ( ⁇ ).
  • Example 1-1 (2) 5 g of commercially available agar (Ina agar type S-7, manufactured by Ina Food Industry Co., Ltd.) was suspended in 45 ml of ⁇ .INHC1, and treated at 95 ° C. for 13 minutes. After cooling to room temperature, the mixture was neutralized with NaOH and filtered through a 0.22 ⁇ MI LLEX-GP filter (Silicon, SLGPR25LS). Using this sample (agar-hydrochloride decomposition solution) and the agar-decomposition oligosaccharide solution (agar citrate decomposition solution) obtained in Example 1-1 (1), the NO-inhibiting activity was determined by the method described in Example 20- (1). It was measured. That is, RAW2 previously cultured in a 48-well microtiter plate
  • FIG. 38 is a diagram showing the concentration of N 2 — in the medium when cultivation was performed by adding an agar hydrochloride decomposition solution and an agar quenchate decomposition solution.
  • the horizontal axis shows the culture conditions
  • the vertical axis shows the N ⁇ 2 -concentration ( ⁇ ).
  • Example 20 In the same manner as in (2), l O OmM galactose (Nacalai Tesque, code 165—11), 10 OmM 3, 6—anhydro D— The NO production inhibitory activity was evaluated using an aqueous solution of galactose (Funakoshi, code GO002).
  • FIG. 39 is 3, 6-Anhi mud one D- galactose, N_ ⁇ 2 in the medium when cultured with the addition of galactose - is a graph showing the concentration.
  • the horizontal axis represents the culture conditions in FIG. 39, the vertical axis represents N_ ⁇ 2 - indicates the concentration ( ⁇ ).
  • Example 20 RAW 2 was added to the Dulbecco's modified Eagle medium described in (1).
  • 64.7 cells were suspended to 3 ⁇ 10 5 cells Zml, added to a well of a 48-well microtiter plate at 500 ⁇ l / well, and cultured at 37 ° C. for 10 hours in the presence of 5% carbon dioxide. Then, 10 ⁇ l of a 5,000 pagarobiose aqueous solution was added, and the cells were cultured for 1, 2, 4, and 6 hours, respectively.
  • the culture supernatant was removed, and 500 ⁇ l of the above Dulbecco's modified Eagle's medium was newly added to each gel, and ⁇ ⁇ ⁇ of 2.5 / g / ml LPS and 800 U, ml of interferon- ⁇ (IFN- ⁇ , Cosmo Bio, GZM-MG-IFN) aqueous solution was added and cultured for 1 hour. Thereafter, the culture supernatant is removed, 500 ⁇ l of the above-mentioned Dulbecco's modified Eagle medium is added to each well, and after culturing for another 16 hours, NO is oxidized in the medium. measurement of ⁇ 2 one concentration was carried out in the real ⁇ 20- (1), wherein the method. As controls, a category without LPS and IFN- aqueous solution and a category without agarobiose were set. All measurements were performed in duplicate.
  • FIG. 40 is a diagram showing the concentration of N 2 — in the medium when cultured under each culture condition.
  • the horizontal axis indicates the culture conditions
  • the vertical axis indicates the NO 2 _ concentration.
  • mice Four-week-old male nude mice (SPFZVA FBa1b / c AnNCrj-nu) were purchased from Nippon Chars Riba Co., Ltd. and preliminarily reared for one week.
  • Human colon cancer cell line HCT116 (ATCC CCL-247) was added to this mouse.
  • Subcutaneous transplantation was performed to obtain 1.5 ⁇ 10 6 cell mice.
  • FIG. 41 is a graph showing the anticancer activity of the oligosaccharide of the present invention, in which the vertical axis represents the solid tumor weight (g), the horizontal axis represents the control group, and the oligosaccharide administration group.
  • Example 11 Using the agar oligosaccharide solution described in (1), an anticancer test for Ehrlich's ascites cancer was performed.
  • mice per group control group
  • 3 groups 3.3-fold dilution group and 16.7-fold dilution group of agar-decomposed oligosaccharide solution described in Example 1 (1) did. That is, respective water dilutions of the agar-degraded oligosaccharide solution prepared in Example 11 (1) were prepared, and the drinking water was freely taken from three days before the administration of the cancer cells.
  • the daily intake of the diluted solution was 5 m 1 Z-day mice.
  • the daily intake of the 16.7-fold dilution of the agar-degraded oligosaccharide solution was 6 m 1 / day in the mice.
  • the control group consumed 7 m 1 / mouse of water per day.
  • the control group had an average survival time of 11.8 days, whereas the group that received the 3.3-fold diluted agar-degraded oligosaccharide solution and the 16.7-fold diluted agar-degraded oligosaccharide solution
  • the average survival days of the liquid intake group were 19.8 days and 14.4 days, respectively, and the survival rates were 168% and 122%, respectively, indicating significant survival effects.
  • Passive sensitization was carried out by subcutaneously administering anti-OA antibody ⁇ ⁇ ⁇ 1 to the shaved back of Wistar rats (7-week-old, about 200 g in weight; Japan S.L.C.). Forty-eight hours after the sensitization, the agar-decomposed oligosaccharide solution described in Example 11- (1) or 2 ml of a 10-fold water dilution thereof was administered to the peritoneal cavity of four rats in each group. Rats in the control group received 2 ml of water intraperitoneally.
  • PCA was induced by injecting saline lm1 containing 0.1% OA and 0.5% Evans blue (Nacalai Tesque) from the tail vein. Thirty minutes after antigen induction, the rats were decapitated, exsanguinated, and the area on the back where the pigment was leaked was examined. It was excised and collected.
  • the collected skin was immersed in 1 ml of 1 N KC 1 (Nacalai Tesque), left for 1 hour, and then 9 ml of an acetone solution (Nacalai Tesque) containing 0.6 N H 3 P ( 4 (Menorek) was added.
  • the dye was extracted, and the absorbance at 620 nm was measured using an ELISA reader.
  • the amount of pigment leaked from the skin was determined from an Evans blue calibration curve. The results are shown in FIG. That is, FIG.
  • FIG. 42 is a graph showing the inhibition of PCA by the oligosaccharide of the present invention, in which the vertical axis represents the amount of dye leakage (/ igZ site), and the horizontal axis represents the agar-decomposed oligosaccharide solution used.
  • the medium was removed by suction and dissolved in a 20 mM EDTA solution.
  • 10 OmM Tris-monohydrochloride buffer (pH 7.8) containing 1 ⁇ g / m 1 of Protein K (manufactured by Sigma), 0.1% Triton X and 1 OmM EDTA was added to 10 6 so that the total amount of the solution became 200/1, and after incubating at 37 ° C for 16 hours, the absorbance at 400 nm was measured.
  • Table 15 The results are shown in Table 15. As shown in Table 15, at a concentration of agarobiose 50 and 100 ⁇ g / m 1, melanin production inhibitory activity was observed, and the whitening effect of agarobiose was confirmed. A similar effect was observed for agarotetraose, agaguchihexaose, agarocotaose, and raviose 3,6-anhydro 2-O-methyl-1-L-galactose. Table 1 5 Agarobiose 400 nm absorbance
  • an apoptosis-inducing agent 10 0.521 0.256 Control 0.487 + 0.038 Note) Measurements were performed in triplicate, and 100 ⁇ l of medium was added as a control.
  • an apoptosis-inducing agent an anticancer agent, an active oxygen production inhibitor, a lipid peroxide radical production inhibitor, a NO production inhibitor, etc.
  • Saccharide compounds for example, agarobiose, agarotetraose, agarohexaose, agarooctaose, agaroboxose, power rabbiose, which are produced by acid degradation and acid or enzymatic degradation under acidic conditions of pH less than 7 Functional materials such as 3,6-anhydro-1-O-methyl-L-galactose are provided.
  • antioxidant drugs such as drugs for inducing apoptosis, drugs for controlling cancer, drugs for suppressing active oxygen production, and drugs for suppressing NO production.
  • foods or beverages containing, added to, or diluted with sugar compounds selected from these sugar compounds produce apoptosis-inducing action, carcinostatic action, active oxygen production inhibitory action, NO production inhibition It is useful as a functional food or beverage that has antioxidant, immunomodulatory, and antiallergic effects, and induces apoptosis in diseased cells of cancer patients and viral disease patients to prevent these diseases. Foods or beverages that are effective in improving symptoms will be provided.
  • cancer cells can undergo apoptosis by ingesting the above-mentioned compound of the present invention orally as a food or beverage.
  • Foods and beverages have excellent effects in preventing gastrointestinal cancer and improving symptoms.
  • the above-mentioned foods or beverages are also excellent as antioxidant stress foods or beverages due to their antioxidant effects such as active oxygen production suppression effect.
  • the functional substance of the present invention is useful as an antioxidant sugar for suppressing the production of active oxygen. It is useful as a food or beverage for ameliorating the symptoms of diseases caused by biooxidants. Furthermore, the food or beverage of the present invention comprises a compound selected from 3,6_anhydrogalactobiranose or its aldehyde or its 20-methylated product, which is the active ingredient thereof, and a compound or compound thereof. It is effective in improving or preventing constipation by the action of the sugar compound contained.
  • the antioxidant sugar provided by the present invention is useful as a novel functional sugar compound that imparts antioxidant properties such as an active oxygen production inhibitory action to foods or beverages. -Further, the functional substance of the present invention has a freshness preserving effect, and is extremely useful for preserving the freshness of foods and fresh foods.
  • cosmetics containing the sugar compound of the present invention are useful as whitening and moisturizing cosmetics.
  • an acidic food or acidic beverage containing, diluted and / or added with the functional substance is also provided. Factors affecting the content have been substantially removed, and a highly useful food or beverage with high functional substances can be obtained. Furthermore, acidulants produced in the presence of organic acids are also useful as novel acidulants having excellent taste and functionality.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)

Description

― 明 細 書 藻類由来の生理活性物質を利用した医薬、 食品または飲料 発明の分野
本発明は、 藻類由来の生理活性物質の利用に関し、 さらに詳しくは該生理 活性物質を有効成分とする医薬、 抗酸化剤、 鮮度保持剤、 化粧料、 該生理活 性組成物を含有する機能性食品または飲料、 さらには機能性発現用糖に関す る。 発明の背景
近年、 細胞組織の死に関し、 アポト一シス （apoptosis 、 ァポプトーシス ともいう ； 自爆死あるいは細胞自滅） という様式が注目されている。
このアポトーシスは、 病理的細胞死である壊死と異なり、 細胞自身の遺伝 子に最初から組込まれている死である。 すなわち、 何らかの外部的または内 部的要因が引き金となってアポト一シスをプログラムする遺伝子が活性化さ れることにより、 プログラム死タンパク質が生合成され、 また、 ある場合に は不活性型として細胞内に存在するプログラム死タンパク質が活性化される。 こうして生成した活性型プログラム死タンパク質により細胞自体が分解され、 死に至ると考えられている。
このようなアポトーシスを所望の組織、 細胞で発現せしめることができれ ば、 不要もしくは有害な細胞を自然の形で生体から排除することが可能とな り、 極めて意義深いものである。 発明の目的
寒天等の藻類由来のオリゴ糖は食品素材としての開発が期待されているが (フードケミカル， 1 9 8 8— 2， 4 0— 4 4 ；別冊フードケミカル一 4，
1 9 9 0年 1 2月， 1 2 7— 1 3 1 ;特開平 6— 3 8 6 9 1号） 、 アポトー シス誘発作用等の生理機能は不明である。 本発明の 的は、 天然物由来のアポトーシス誘発作用等の生理機能を有す る安全性の高い物質を開発し、 該物質を有効成分とするアポトーシス誘発剤 等の、 該化合物に感受性を示す疾患用の医薬品、 該物質を構成成分とする機 能性飲食品等を提供することにある。 発明の概要
本発明を概説すれば、 本発明の第 1の態様は、 式 1 ：
Figure imgf000004_0001
で表される 3 , 6—アンヒドロガラク トピラノース、 そのアルデヒ ド体、 そ の抱水体およびそれらの 2— O—メチル化体より選択される化合物ならびに 該化合物を還元末端に有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される化 合物の少なくとも 1種を有効成分として含有する、 該化合物に感受性を示す 疾患の治療または予防用医薬組成物である。
本発明の第 2の態様は、 式 1で表される 3， 6—アンヒ ドロガラク トピラ ノース、 そのアルデヒ ド体、 その抱水体およびそれらの 2— O—メチル化体 より選択される化合物ならびに該化合物を還元末端に有する可溶性の糖化合 物からなる群より選択される化合物の少なくとも 1種を含んでなる、 これら の化合物に感受性を示す疾患の症状改善用飲食品または該疾患の予防用飲食 品である。
本発明の第 3の態様は、 式 1で表される 3， 6 —アンヒ ドロガラク トピラ ノース、 そのアルデヒ ド体、 その抱水体およびそれらの 2—〇一メチル化体 より選択される化合物ならびに該化合物を含有する可溶性の糖化合物からな る群より選択される化合物の少なくとも 1種を有効成分として含有すること を特徴とする抗酸化剤である。 本発明の第 4の態様は、 本発明の第 3の態様の抗酸化剤を含有することを 特徴とする飲食品である。
本発明の第 5の態様は、 式 1で表される 3， 6—アンヒ ドロガラク トピラ ノース、 そのアルデヒ ド体、 その抱水体およびそれらの 2— O—メチル化体 より選択される化合物ならびに該化合物を含有する可溶性の糖化合物からな る群より選択される抗酸化用糖である。
本発明の第 6の態様は、 式 1で表される 3， 6—アンヒ ドロガラク トピラ ノース、 そのアルデヒ ド体、 その抱水体およびそれらの 2— O—メチル化体 より選択される化合物ならびに該化合物を含有する可溶性の糖化合物からな る群より選択される少なくとも 1種の化合物を有効成分として含有すること を特徴とする鮮度保持剤である。
本発明の第 7の態様は、 ァガロビオース、 ァガロテトラオース、 ァガ口へ キサオース、 ァガロォクタオース、 κ一力ラビオースおよび ;3— D—ガラク トビラノシルー 3， 6—アンヒ ドロ一 2— O—メチル一 L一ガラク ト一スか らなる群より選択される少なくとも 1種の糖化合物を有効成分とする化粧料 である。
本発明の第 8の態様は、 式 1で表される 3， 6—アンヒ ドロガラク トピラ ノース、 そのアルデヒ ド体、 その抱水体およびそれらの 2—〇一メチル化体 より選択される化合物ならびに該化合物を含有する可溶性の糖化合物からな る群より選択される少なくとも 1種の化合物を含んでなる酸性飲食品である。 本発明のさらなる態様は、 式 1で表される 3， 6—アンヒ ドロガラク トビ ラノース、 そのアルデヒ ド体、 その抱水体およびそれらの 2 _〇一メチル化 体より選択される化合物ならびに該化合物を含有する可溶性の糖化合物から なる群より選択される少なくとも 1種の医薬組成物、 飲食品、 抗酸化剤、 鮮 度保持剤または化粧料の製造における使用である。
以下、 添付の図面を参照して、 本発明を詳細に説明する。 図面の簡単な説明
図 1は、 寒天の 0 . 1 2 N塩酸分解物のゲルろ過の溶出図を示す図である c 図 2は、 —寒天の 1 N塩酸分解物のゲルろ過の溶出図を示す図である。
図 3は、 寒天の酸分解物のサイズ排除 HP LCクロマトグラムを示す図で ある。
図 4は、 アポトーシス誘発性および制がん性物質のマススぺク トルを示す 図である。
図 5は、 アポトーシス誘発性および制がん性物質 （抱水体） の1 H— NMR スぺク トルを示す図である。
図 6は、 アポト一シス誘発性および制がん性物質 （アルデヒ ド体） の1 H—
NMRスぺク トルを示す図である。
図 7は、 ァガロビオース、 ァガロテトラオースおよぴァガ口へキサオース の順相 H P L Cの溶出パターンを示す図である。
図 8は、 66. 7分のピークのマススペク トルを示す図である。
図 9は、 78. 5分のピークのマススペク トルを示す図である。
図 1 0は、 85. 5分のピークのマススペク トルを示す図である。
図 1 1は、 3， 6—アンヒ ドロ一L— ガラク トースのマススペク トルを示 す図である。
図 1 2は、 3， 6—アンヒ ドロ一L—ガラク トース （抱水体） の1 H— NM Rスぺク トルを示す図である。
図 1 3は、 3， 6—アンヒ ドロー L—ガラク トース （アルデヒ ド体） の1 H 一 NMRスぺク トルを示す図である。
図 14は、 終濃度 250 //Mのオリゴ糖を添加して HL— 60細胞を培養 したときの培養時間と生細胞数を示す図である。
図 1 5は、 終濃度 1 25 のオリゴ糖を添加して HL— 60細胞を培養 したときの培養時間と生細胞数を示す図である。
図 1 6は、 0. 5Mリン酸中で加熱処理を行った寒天の順相 H P L Cの溶 出パターンを示す図である。
図 1 7は、 ァガロビオースの検量線を示す図である。
図 1 8は、 0. 2%寒天の0. 1M HC 1溶液における加熱時間とァガ 口ビオースの生成量との関係を示す図である。 図 1 9は、 0. 2%寒天の0. 1Mクェン酸溶液における加熱時間とァガ ロビオースの生成量との関係を示す図である。 - 図 20は、 500mMクェン酸、 80°Cにおけるァガロオリゴ糖生成を示 す図である。
図 21は、 500mMクェン酸、 95 °Cにおけるァガロオリゴ糖生成を示 す図である。
図 22は、 1 200mM乳酸、 80 °Cにおけるァガロオリゴ糖生成を示す 図である。
図 23は、 1 200mM乳酸、 95 °Cにおけるァガロオリゴ糖生成を示す 図である。
図 24は、 l O O OmMリンゴ酸、 80。Cにおけるァガロオリゴ糖生成を 示す図である。
図 25は、 l O O OmMリンゴ酸、 95。Cにおけるァガロオリゴ糖生成を 示す図である。
図 26は、 l O O OmMリンゴ酸、 70。Cにおけるァガロオリゴ糖生成を 示す図である。
図 27は、 κ一力ラゲナン酸分解物の順相 HP LCクロマトグラムを示す 図である。
図 28は、 アポトーシス誘発性および制がん性物質のマススぺク トルを示 す図である。
図 29は、 アポト一シス誘発性および制がん性物質の1 H— NMRスぺク ト ルを示す図である。
図 30は、 セル口ファイン GC L— 25によるゲルろ過の結果を示す図で ある。
図 31は、 セフアデックス LH— 20カラムによるゲルろ過の結果を示す 図である。
図 32は、 /3—D—ガラク トビラノシルー （1→4) 一 3， 6—アンヒ ド ロー 2— O—メチル一L一ガラク トースのマススぺク トルを示す図である。 図 33は、 ]3— D—ガラク トビラノシルー （1→4) 一 3， 6—アンヒ ド 口一 2— O—メチル一L—ガラク トースの1 H— NM Rスぺク トルを示す図で ある。 - 図 3 4は、 C o n Aによるリンパ球幼若化反応においてァガロビオース濃 度と3 H—チミジン取込み量の関係を示す図である。
図 3 5は、 混合リンパ球反応においてァガロビオース濃度と3 H—チミジン 取込み量の関係を示す図である。
図 3 6は、 ァガロビオースを添加して、 各培養条件で培養した時の、 培地 中の N O 2一濃度を示す図である。
図 3 7は、 ネオアガロビオースを添加して、 各培養条件で培養した時の培 地中の N O 一濃度を示す図である。
図 3 8は、 寒天塩酸分解溶液、 寒天クェン酸分解溶液を添加して培養した 時の培地中の N O 2 _濃度を示す図である。
図 3 9は、 3， 6—アンヒ ドロー D—ガラク トース、 ガラク トースを添加 して培養した時の培地中の N O 2—濃度を示す図である。
図 4 0は、 各培養条件で培養したときの培地中の N O 2 -濃度を示す図であ る。
図 4 1は、 本発明のオリゴ糖の制がん活性を示す図である。
図 4 2は、 本発明のオリゴ糖の P C A反応抑制を示す図である。 発明の詳細な説明
本発明における式 1で表される 3， 6—アンヒドロガラク トピラノース (以下、 単に 3， 6—アンヒ ドロカラク トピラノースと称する） のアルデヒ ド体は、 式 2 ：
Figure imgf000008_0001
で表される化合物である。 その抱水体は、 式 3
Figure imgf000009_0001
で表される化合物である。 また、 3， 6—アンヒ ドロガラク トピラノースの 2— 0—メチル化体は、 式 4 ：
Figure imgf000009_0002
で表される化合物である。 さらに、 該メチル化体のアルデヒ ド体は、 式 5
Figure imgf000009_0003
で表される化合物である。 その抱水体は、 式 6 ：
Figure imgf000010_0001
で表される化合物である。
本明細書における式 1〜6の構造は、 他の表現形で表わすことも可能であ るが、 それらも含め、 また、 可能なそれらの互変異性体も含めて、 式
1〜6で表すものとする。 また、 式 1〜6における立体配置は、 所望の活性 が得られる限り、 特に限定するものではなく、 D—型、 L—型またはそれら の混合物であってよい。
本発明の可溶性糖化合物は、 特に限定するものではないが、 3， 6—アン ヒ ドロガラク トピラノース、 そのアルデヒ ド体、 その抱水体およびそれらの 2—〇—メチル化体より選択される化合物 （以下、 これらを「式 1〜6の化合 物」として総称する） の少なくとも 1種を含有する可溶性の糖化合物で、 式 1 〜6の化合物の少なくとも 1種を含有する物質 （以下、 単に原料物質とい う） を、 pH 7未満の酸性下で、 酸分解および/または酵素分解して得ること ができ、 また、 化学合成法によっても得ることができる。 本発明の可溶性の 糖化合物は、 用時、 固化または半固化 （ゲル化） することが無い化合物であ れば特に限定するものではない。 したがって、 用時においてゾル化する式 1 〜 6の化合物より選択される少なくとも 1種の化合物を含有する糖化合物は、 本発明の可溶性の糖化合物に包含される。 なお、 本発明において好適に使用 される該可溶性の糖化合物には、 例えば、 その非還元末端が Lーガラク ト一 スー 6—硫酸以外の糖である糖化合物であり、 例えば、 ァガロビオース、 ァ ガロテトラオース、 ァガ口へキサオース、 ァガロォクタオース、 κ一力ラビ オースおよび i3—D—ガラク トビラノシルー 3， 6—アンヒ ドロ一 2—〇一 メチルー L—ガラク トース等の糖化合物が包含される。
該可溶性糖化合物を得るのに用いる原料物質は、 特に限定するものではな く、 例えば、 ァガロース、 ァガロぺクチン、 フノラン、 ボルフイラン、 カラ ゲナン、 フルセララン、 ヒプネアン等の紅藻の粘質多糖 [共立出版 （株） 発 行、 多糖生化学 1 一化学編一、 第 3 1 4頁 （ 1 9 6 9 ) ] が例示される。
また、 これらの多糖の含有物も、 原料物質に包含される。 例えば、 ァガロ ース、 ァガロぺクチンの原料としてはテンダサ科のマクサ、 ォニダサ、 ォォ ブサ、 ヒラクサ、 ォバクサ、 ユイキリ等、 ォゴノリ科のォゴノリ、 ォォォゴ ノリ等、 ィギス科のィギス、 エゴノリ等、 その他の紅藻類が用いられ、 通常、 数種類の藻類を配合して原料とする。 原料藻類は、 通常、 天日に干して乾燥 させたものを用いるが、 本発明においては生の藻類および乾燥した藻類が使 用できる。 また、 乾燥時に散水しながら漂白した、 いわゆるさらし原藻も使 用できる。
原料藻類を熱水抽出の後、 冷却することによって「ところてん」が得られる。 この「ところてん」から凍結脱水または圧搾脱水によって水分を除き、 乾燥さ せることによって寒天が得られる。 寒天はその起源となる藻類を問わず、 ま た、 棒状、 帯状、 板状、 糸状、 粉末状等の種々の形態のものを使用できる。 通常、 寒天は約 7 0 %のァガロースと約 3 0 %のァガロぺクチンを含んでい るが、 精製を進めてさらに高純度のァガロースを調製することが可能である。 精製ァガロースは精製度の低いものから高いものまで、 様々なァガロース含 量のものを使用できる。
原料物質には、 上記の寒天の原料藻類、 ところてん、 寒天、 精製ァガ口一 ス、 精製ァガロぺクチン、 これらの製造工程で得られる中間産物あるいは副 産物が包含される。
ァガロースは、 交互に結合した D—ガラク ト一スと 3， 6—アンヒ ドロ一 L—ガラク トースを主構造とする多糖であり、 D—ガラク トースの 1位と 3， 6一アンヒ ドロ一 L—ガラク トースの 4位が ]3—グリコシド結合で、 また、 3， 6 _アンヒ ドロ一 L—ガラク トースの 1位と D—ガラク ト一スの 3位が α—グリコシド結合で結合している。 ひー 3結合は希酸による温和な加 水分解や、 α—ァガラーゼ [カーボハイ ドレート · リサーチ （Carbohydr. Res. ) 、 第 6 6卷、 第 2 0 7頁 （ 1 9 7 8 ) ] によって加水分解され、 また、 β - 1 , 4結合は /3—ァガラーゼによって選択的に加水分解される。 また、 力ラゲナンはスギノリ科、 ミリン科、 イバラノリ科等の紅藻類に含 まれる多糖であり、 κ—力ラゲナン、 λ—力ラゲナン、 η—力ラゲナンが知 られている。
Κ —力ラゲナンは、 D—ガラク トースー 4—硫酸の 1位と 3， 6—アンヒ ドロ一 D—ガラク トースの 4位が j3—グリ コシド結合で、 また、 3， 6—ァ ンヒ ドロー D—ガラク トースの 1位と D—ガラク トース一 4—硫酸の 3位が α—グリコシド結合で交互に繰り返された基本構造を持つ。 え一力ラゲナン は D—ガラク トースの 1位と D—ガラク トース一 2 , 6—二硫酸の 4位が /3 —グリ コシド結合で、 また、 D—ガラク トース一 2， 6—二硫酸の 1位と D 一ガラク トースの 3位が α—グリコシド結合で交互に繰り返された基本構造 を持つ。 力ラゲナンは食品のゲル化剤として利用されている。
上記の原料物質を化学的、 物理的および または酵素的方法で部分分解し たものも、 本発明における原料物質に包含される。
化学的分解方法の例としては、 酸性から中性での加水分解、 物理的分解方 法の例としては、 電磁波や超音波の照射、 酵素的分解方法の例としては、 カロ 水分解酵素、 例えば、 ァガラーゼ、 カラギナーゼ等による加水分解が挙げら れる。
原料物質の酸性から中性での分解条件は、 アポトーシス誘発性、 制がん性、 活性酸素産生抑制活性、 一酸化窒素 （以下、 N Oと称する） 産生抑制作用等 の抗酸化活性または免疫調節活性等を有する式 1〜6の化合物、 これらの化 合物の少なくとも 1種を含有する可溶性の糖化合物、 例えば、 ァガロビオー ス、 ァガロテトラオース、 ァガ口へキサオース、 ァガロォクタオース、 κ一 力ラビオース （以下、 単に力ラビオースと称す） および /3— D—ガラク トビ ラノシルー 3， 6—アンヒ ドロ一 2— O—メチルー L—ガラク トース等の糖 化合物、 また、 その非還元末端が L—ガラク トースー 6—硫酸以外の糖であ る、 式 1〜6の化合物より選択される化合物を還元末端に有する糖化合物が 生成する条件であれば、 特に限定はない。
例えば、 原料物質を酸に溶解または懸濁し、 反応させることにより、 本発 明で使用する式 1〜 6の化合物より選択される化合物、 これらの化合物の少 なくとも 1 -種を含有する可溶性の糖化合物が生成する。 また、 反応時に加熱 することにより、 式 1〜 6の化合物より選択される化合物およびこれらの化 合物の少なくとも 1種を含有する可溶性の糖化合物の生成に必要な反応時間 は短縮される。
原料物質、 例えば、 ァガロースゃァガロースを含有する物質を、 溶解また は懸濁する酸の種類に特に限定するものではないが、 塩酸、 硫酸、 硝酸等の 無機酸、 クェン酸、 ギ酸、 酢酸、 乳酸、 ァスコルビン酸等の有機酸、 また陽 イオン交換樹脂、 陽イオン交換繊維、 陽イオン交換膜等の固体酸が使用可能 である。
酸の濃度も特に限定はないが、 0 . 0 0 0 1〜 5規定、 好ましくは 0 . 0
0 1〜 1規定の濃度で使用可能である。 また、 反応温度も特に限定はないが、 0〜 2 0 0 °C、 好ましくは 2 0〜 1 3 0 °Cに設定すればよい。 また、 反応時 間も特に限定するものではないが、 数秒〜数日に設定すればよい。 酸の種類 と濃度、 反応温度およぴ反応時間は原料となる式 1〜 6の化合物より選択さ れる少なくとも 1種の化合物を含有する物質、 例えば、 ァガロース、 力ラゲ ーナン等の種類および目的とする式 1〜6の化合物より選択される化合物、 それらの化合物を含有する糖化合物の生成量、 目的とする式 1〜6の化合物 より選択される化合物を還元末端に有する可溶性の糖化合物の重合度により 適宜選択すればよい。 一般に、 弱酸よりも強酸、 低濃度の酸よりも高濃度の 酸、 低温よりも高温を選択することにより酸分解反応は速やかに進行する。 また、 固体酸を使用する場合は、 一般に強陽イオン交換樹脂が、 弱陽ィォ ン交換樹脂より、 分解反応の効率が良い。 また、 原料物質当たりの使用量が 多い程、 また作用温度が高いほど、 酸分解反応が速やかに進行する。
例えば、 寒天を 0 . 1 N塩酸に 1 0重量％に懸濁し、 1 0 0 °Cで 1 3分間 加熱溶解し、 不溶物を除去して得られる本発明に使用される糖化合物溶液は、 冷却しても、 その氷結点において、 もはやゲル化しなくなる。 この液に含ま れる糖類をゲルろ過 H P L C、 順相 H P L C等の方法で分析すると高分子の 糖類はほとんど見られず、 大部分が可溶性の 1 0糖以下の糖化合物に分解さ れている。 同様に、 固定酸の場合、 市販の強陽イオン交換樹脂の N a型の 1 重量部を 1 N塩酸で H型とした後、 7 9重量部の脱塩水中に入れ、 さらに寒 天を 1 0重量部入れ懸濁し、 9 5 °Cで 1 8 0分間加熱し得られる本発明の糖 化合物溶液は、 冷却しても、 その氷結点において、 もはやゲル化しなくなる。 この液に含まれる糖類をゲルろ過 H P L C、 順相 H P L C等の方法で分析す ると高分子の糖類はほとんど見られず、 大部分が可溶性の 1 0糖以下の糖化 合物に分解されている。
また、 本発明に使用する式 1〜 6の化合物より選択される化合物を還元末 端に有する可溶性の糖化合物の製造に際しては、 クェン酸、 乳酸、 リンゴ酸 等の有機酸を使用し、 酸の濃度は数 1 0 111^ [〜数? 、 加熱温度は 7 0〜 9 5 °C、 加熱時間は数 1 0分〜 2 4時間の範囲から適宜選択することにより、 生理活性を有するオリゴ糖、 例えば、 抗酸化用オリゴ糖が多量に生成する。 また、 加水分解後において、 酸性を維持し、 アルカリ条件下としないことに より、 生成した該生理活性オリゴ糖は長期間の保存安定性を示す。
本発明において使用する式 1〜 6の化合物より選択される化合物、 これら の化合物の少なくとも 1種を含有する可溶性の糖化合物、 例えば、 ァガロビ オース、 ァガロテトラオース、 ァガ口へキサオース、 ァガロォクタオース、 κ一力ラビオースおよび ]3—D—ガラク トビラノシル一 3， 6—アンヒ ドロ — 2— O—メチル一 L—ガラク トース等の糖化合物としては、 原料物質の分 解物をそのまま、 もしくは中和して使用しても良いが、 さらに精製して用い ても良い。 式 1〜6の化合物より選択される化合物、 該化合物を還元末端に 有する可溶性の糖化合物、 例えば、 ァガロビオース、 ァガロテトラオース、 ァガ口へキサオース、 ァガロォクタオース、 κ—力ラビオースおよび |3— D —ガラク トビラノシルー 3， 6—アンヒ ドロ一 2—O—メチルー L—ガラク トース等のオリゴ糖は、 例えば、 アポトーシス誘発活性または制がん活性を 指標として精製することができる。 精製手段としては化学的方法、 物理的方 法等の公知の精製手段を用いればよく、 ゲルろ過法、 分子量分画膜による分 画法、 溶媒抽出法、 イオン交換樹脂等を用いた各種クロマトグラフィー法等 の従来公知の精製方法を組合せ、 酸分解物中に生成した目的のアポトーシス 誘発性物質である式 1〜 6の化合物より選択される化合物、 該化合物の少な くとも 1種を含有する可溶性の糖化合物を精製することができる。 ' こうして得られた化合物の構造は質量分析法、 核磁気共鳴法、 紫外吸収ス ぺク トルの測定、 赤外吸収スぺク トルの測定等の公知の方法で解析できる。 本発明の有効成分の 1例であるァガロピオ一スは、 D—ガラク トースの 1 位と 3， 6—アンヒ ドロ一 L—ガラク トースの 4位が /3—グリコシド結合で 結合した 2糖である。 3， 6—アンヒ ドロ一 L—ガラク トースの 1位はァノ マー炭素であるので α型と 型が存在するが、 どちらも本発明で使用するァ ガロビオースに包含される。
また、 本発明で有効成分として使用する式 1〜6の化合物より選択される 化合物を還元末端に有する糖化合物とは、 該式 1〜6の化合物より選択され る化合物の 1位以外の水酸基に糖が結合したもので、 アポトーシス誘発活性、 制がん活性、 活性酸素産生抑制活性、 N O産生抑制活性等の抗酸化活性およ び Zまたは免疫調節活性を持つものであれば特に限定はない。 例えば、 原料 物質の分解物、 例えば、 ァガロースの酸分解物や α—ァガラーゼ分解物であ るァガロピオ一ス、 ァガロテトラオース、 ァガ口へキサオース、 ァガロォク タオース、 ァガロデカオース、 ]3— D—ガラク トピラノシル一 3， 6—アン ヒ ドロ一 2— O—メチル一 L—ガラク トース等が挙げられる。 また、 力ラゲ ナンの酸分解物やカラギナーゼ分解物、 例えば、 力ラビオースが挙げられる。 さらに、 グノレコース、 マンノース、 ガラク ト一ス等のへキソース、 キシロー ス、 ァラビノース、 リボース等のペントース、 グルクロン酸、 ガラクッロン 酸、 マンヌロン酸、 グルロン酸等のゥロン酸、 ダルコサミン、 ガラク トサミ ン等のアミノ糖、 N—ァセチルノイラミン酸等のシアル酸、 フコース等のデ ォキシ糖、 これらのエステル、 アミ ドおよびラク トンより選択される糖が 1 個または複数個、 式 1〜 6の化合物より選択される化合物の 1位以外の水酸 基に結合したものも本発明の、 式 1〜 6の化合物より選択される化合物を還 元末端に有する糖化合物に含まれる。 さらに、 これらの式 1〜6の化合物よ り選択される化合物を還元末端に有する糖化合物、 例えば、 ァガロビオース、 ァガロテトラオース、 ァガ口へキサオース、 ァガロォクタオース、 κ—カラ ビオースおよび /3—D—ガラク トピラノシル一 3， 6—アンヒ ドロー 2— O —メチル— L—ガラク トース等の糖化合物にピルビン酸および Zま は硫酸 基を結合したもの、 また該糖化合物の水酸基がメチル化されたものも、 本発 明の式 1〜 6の化合物より選択される化合物を還元末端に有する糖化合物に 包含される。 なお、 上記のごとく、 本発明において式 1〜6の化合物より選 択される化合物を還元末端に有する糖化合物とは、 好適にはその非還元末端 が L—ガラク トース一 6—硫酸以外の糖である。
3， 6—アンヒ ドロガラク トピラノースまたはその 2—〇一メチル化体を 還元末端に有する糖化合物の還元末端の化合物の 1位はァノマー炭素である ので、 該化合物を還元末端に有する糖化合物には α型と 0型が存在するが、 どちらも 3， 6 _アンヒ ドロガラク トピラノースまたはその 2—〇一メチル 化体を還元末端に有する糖化合物として本発明で使用できる。
また、 アポト一シス誘発活性、 制がん活性、 活性酸素産生抑制活性、 N O 産生抑制活性等の抗酸化活性および Zまたは免疫調節活性等の生理活性を持 つていれば、 分子量には特に限定はない。
本発明で使用する式 1〜6の化合物より選択される化合物、 該化合物を還 元末端に有する糖化合物の還元末端の化合物としては、 当然、 α型、 /3型、 アルデヒ ド型、 抱水型の混合物および D—型、 L一型の混合物等も使用でき る。
かく して、 本発明で使用する式 1〜6の化合物より選択される化合物、 該 化合物を還元末端に有する糖化合物はアポト一シス誘発活性、 制がん活性、 活性酸素産生抑制活性、 過酸化脂質ラジカル産生抑制活性、 N O産生抑制活 性等の抗酸化活性、 免疫調節活性、 抗アレルギ一活性を有し、 本発明によれ ば、 まず、 式 1〜6の化合物より選択される化合物および該化合物を還元末 端に有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される少なくとも 1種の化 合物を有効成分とし含有する、 これらの化合物の少なくとも 1種に感受性を 示す疾患の治療用または予防用の医薬組成物、 例えば、 それら疾患の治療剤 または予防剤が提供される。
これらの化合物に感受性を示す疾患としては、 例えば、 アポトーシス誘発 を要する疾患、 がん性疾患、 活性酸素産生抑制を要する疾患、 過酸化脂質ラ ジカル産生抑制を要する疾患、 N O産生抑制を要する疾患、 または免疫調節 を要する疾患、 例えば、 アレルギー性疾患等が包含され、 本発明の ½療用ま たは予防用医薬組成物は、 アポトーシス誘発剤、 制がん剤、 活性酸素産生抑 制剤、 過酸化脂質ラジカル産生抑制剤、 一酸化窒素産生抑制剤等の抗酸化剤、 抗炎症剤、 免疫調節剤、 抗アレルギー剤等とすることができる。
例えば、 本発明のアポトーシス誘発剤は、 自己免疫疾患患者の自己反応性 リンパ球、 がん細胞、 ウィルス感染細胞等を排除するのに有効であり、 アポ ト一シスを所望の組織、 細胞で発現させることにより、 不要もしくは有害な 細胞を自然の形で生体から排除することができる。 本発明のアポトーシス誘 発剤が有効な疾患としては、 例えば、 全身性エリテマトーデス、 免疫介在性 糸球体腎炎、 多発性硬化症、 膠原病等の自己免疫疾患、 リウマチ等が挙げら れる。
本発明のアポトーシス誘発剤は、 アポトーシス誘発方法に使用することが でき、 該方法はアポトーシス誘発機構の解明、 アポト一シス誘発剤、 アポト —シス誘発阻害剤のスクリーニング等に有用である。
なお、 本発明のアポト一シス誘発剤によるアポトーシス誘発作用は、 Caspaseの阻害剤、 例えば、 I L— 1 ]3コンバーティング ·ェンザィム ·イン ヒビター V [ Z - V a 1 - A 1 a— D L— A s p ( OM e ) —フルォロメチ ルケトン：宝酒造社製] により阻害されるので、 Caspaseに依存するアポトー シスによる細胞死と考えられる。
この Caspaseは、 種々の細胞死の際に先行して上昇すること、 その過剰発現 により、 細胞死が誘導されること、 ペプチド阻害剤や阻害タンパク質である C r mA、 p 3 5によりアポトーシスが抑制されること、 Caspase— 1、 Caspase- 3のノックァゥトマウスでは正常に見られるアポトーシスの一部が 抑制されることから、 アポトーシスの重要なメディエーターとして機能して いることが明らかにされている [生化学、 第 7 0卷、 第 1 4〜 2 1頁 （1 9 9 8 ) ] 。 すなわち、 アポト一シスの過程ではシスティンプロテアーゼであ る Caspaseが活性化され、 核や細胞質のタンパク質を分解する。 Caspaseは、 まず前駆体として合成され、 スプライシングにより活性化型となる。 この Caspaseの活性化に至る制御が細胞の生死を決める。 哺乳類では 1 0'種類以上 の Caspaseが存在し、 上位の Caspaseが下位の Caspaseをスプライシ グするこ とで細胞内タンパク質分解活性は雪崩式に増幅される [細胞工学、 第 1 7卷、 第 8 7 5〜8 8 0頁 （ 1 9 9 8 ) ] 。 反対に、 システィンプロテアーゼであ る Caspaseの阻害剤でそのスプライシング活性を阻害すれば、 Caspase依存型 のアポトーシスによる細胞死を止めることができる。
また、 本発明に使用する化合物は酸化物質、 例えば、 活性酸素の産生抑制 に有用であり、 該化合物を有効成分とする活性酸素産生抑制剤等の抗酸化剤 は活性酸素の産生および Zまたは過剰が起因となる疾病の治療または予防に 有用である。
活性酸素は、 大きくラジカルと非ラジカルの活性酸素に分類することがで きる。 ラジカル系活性酸素には、 ヒ ドロキシラジカル、 ヒ ドロキシペルォキ シラジカル、 ペルォキシラジカル、 アルコキシラジカル、 二酸化窒素
(N 0 2) 、 N O、 チイルラジカル、 スーパーォキシドがある。 一方、 非ラジ カル系活性酸素には、 一重項酸素、 過酸化水素、 脂質ヒ ドロペルォキシド、 次亜塩素酸、 オゾン、 ペルォキシ亜硝酸がある。 いずれも多くの病態、 すな わち、 各種の炎症性疾患、 糖尿病、 がん、 動脈硬化、 神経疾患、 虚血再灌流 障害などと関わりがある。
生体内では絶えずいくつかの経路で低濃度の活性酸素が生成している。 こ れは生理的にミ トコンドリアなどの電子伝達系から漏出するスーパーォキシ ドゃ、 過酸化水素、 銅や鉄などの遷移金属が触媒することによるヒ ドロキシ ラジカル、 好中球や単球などによって生成される感染防御のための次亜塩素 酸、 アルギニンの分解により生成する N Oなど、 いずれも避けることのでき ないものである。 これらの活性酸素生成に対して、 生体は活性酸素消去系と しての酵素、 低分子化合物をもち、 生成と消去のバランスを保っている。 し かし、 これらの経路がなんらかの原因で活性化されたり、 逆に消去系が不活 性化されて、 活性酸素生成系が消去系に対して優位に立った場合、 生体は酸 化的障害を受けることになる。 このような状態を酸化ス トレスという。 さら に、 生体内のバランスがずれた場合だけでなく、 大気や食品などの生体外の ものからも—、 生体は常に酸化ストレスにさらされており、 日常生活 Ir送る上 で酸化ス トレスは避けることができない。 - すなわち、 酸化ストレスは上記したように、 様々な疾患と関わりがあり、 生体は、 常に酸化ス トレスによる疾患、 あるいは、 疾病の悪化につながる状 況に曝されている。 したがって、 このような酸化ス トレスが引き起こす疾病 の予防、 治療あるいは悪化防止にも、 本発明の抗酸化剤、 例えば、 活性酸素 産生抑制剤は有用である。
また、 酸化ス トレスに必ずつきまとうのが脂質過酸化反応であり、 この反 応は過酸化脂質ラジカルができると一挙に進む反応である。 そこで生成され る 4ーヒ ドロキシー 2—ノネナール （HNE) はダルタチオンやタンパク質 を特異的な標的とする毒性アルデヒ ドである。 その HNEとタンパク質との 反応生成物が、 様々な病態組織において検出されており、 酸化ストレスの関 わる疾患病態の誘発因子ではないかと考えられている。 そのため、 過酸化脂 質ラジカルの生成を抑えることのできる本発明に使用される抗酸化物質を含 有する抗酸化剤は、 酸化ストレスによる生活習慣病疾患の予防および治療に 有用である。
NOは、 内皮細胞由来血管平滑筋弛緩因子 （EDRF) の本体である [ネ —チヤ一 （Nature) 、 第 327卷、 第 524〜 526頁 （1 987) ] 。 本 発明により、 NO産生の抑制を必要とする疾病治療剤または予防剤が提供さ れる。
本発明において、 NO産生の抑制を必要とする疾病とは、 特に限定するも のではないが、 例えば、 毒性ショックやある種のサイ ト力インによる治療等 による全身性血圧低下、 血圧応答低下、 自己免疫疾患、 炎症、 関節炎、 リウ マチ性関節炎、 糖尿病、 炎症性腸疾患、 血管機能不全、 病因性血管拡張、 組 織損傷、 心臓血管系虚血、 痛感過敏症、 脳虚血、 血管新生を伴う疾病、 がん 等があり、 特表平 9一 504524号、 特表平 9一 505288号、 特表平 8— 50 1 069号、 特表平 8— 5 1 23 1 8号、 特表平 6— 508849 号の各公報に記載の疾病を含むものである。
L一アルギニンと酸素から Lーシトルリンと NOを生産する NO合成酵素 (NOS) -には、 常に発現している c NOSと誘導型の i NOSがある。 マ クロファージ等において、 i NOSは、 細胞毒素やサイ ト力イン （LP S、 I NF— γ等） の刺激により誘導され、 NOを生産する。 i NOS自体は生 体系の維持においてなくてはならない存在である。 しかし、 一方で、 種々の 要因により必要以上に過剰発現し過剰な NOを産生することにより、 種々の 疾病を引き起こすことも明らかになつている。
本発明者らは、 式 1〜 6の化合物より選択される化合物および該化合物を 還元末端に有する可溶性の糖化合物、 例えば、 ァガロビオース、 ァガロテト ラオース、 ァガ口へキサオースがこの i NOSの発現を抑制することを、 ゥ エスタンブロティングによりタンパク質レベルで、 RT—PCRによりメッ センジャー RNAレベルで確認した。 つまり、 本発明で使用する化合物は、 種々の要因により過剰に発現し過剰な N〇を生産する i NOSの発現を抑制 することにより、 N O産生抑制を必要とする疾病の治療および予防に有効で ある。
本発明の化合物は、 マクロファージの NO産生を抑制し、 マクロファージ の NO産生に起因する疾病、 炎症、 がん等の治療、 予防に有用である。 また、 本発明に使用する糖化合物の NO産生抑制は NO産生誘起物質である LP S や、 I NF—！ に対する拮抗阻害ではない。 本発明に使用する糖化合物を予 め加えておくことによって、 NO産生抑制効果の増強が見られ、 本発明の化 合物は抗酸化物質の産生抑制の予防剤として極めて有用である。
本発明の NO産生抑制剤は、 NO産生機構研究、 NO作用機作研究に有用 であり、 また、 NO産生機構に関与する物質のスクリーニングに使用するこ ともできる。
固形がんの増大に血管新生は必須であるが、 血管内皮増殖因子/血管透過 性亢進因子 （VEGF) はこの過程に重要な役割を演じている。 様々ながん 細胞において V E G Fが N〇によつて誘導される。 本発明の N O産生抑制剤 は NO産生を抑制することによってがん細胞の VEGF産生も抑制し、 その 結果、 がん組織周辺での血管新生が阻害される。 がん細胞を皮下に移植して 固形腫瘍を形成させたマウスに本発明の NO産生抑制剤を投与するとがん組 織の周辺の血管の形成が不十分となり、 がんは脱落する。 ' 二トロソァミンは 2級ァミンに二トロソ基が付加した一群の化合物で数百 種類が知られており、 その多くが DN Aに損傷を加えることにより動物に対 して発がん性を示す。 ニトロソアミンはヒ トの発がんにも深く関わっている とされており、 通常、 胃の中で亜硝酸塩とァミンが反応することによって生 成する。 NOは pH中性の生理的条件下でもァミンと反応して二トロソァミン を生成する。 また、 疫学的にがんとの関係が高い肝吸虫感染患者や肝硬変患 者において N〇産生は亢進している。 したがって、 本発明の NO産生抑制剤 を投与して N O産生の亢進を防ぐことによつて特にハイリスクグループの発 がんを予防することができる。 以上のように、 本発明の NO産生抑制剤は発 がんの抑制とがん組織における血管新生阻害という 2段階で制がん作用を示 す。
NOはまた、 炎症性病変に特徴的に認められる浮腫、 すなわち、 血管透過 性亢進作用を誘発し [マエダ （Madea)ら、 ジャパニーズ 'ジャーナル 'ォ ブ ·カンサ一 · リサ一テ (Japanese Journal of Cancer Research)、 第 85 卷、 第 33 1〜 334頁 （1 994) ] 、 また、 炎症性メデイエ一ターであ るプロスタグランジン類の生合成を亢進させる [サルベミニ （Salvemini) ら、 プロシーディングス ·ォブ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイエンシー ズ ·ォブ ·ケ · U s A (Proceedngs of National Academy of Sciences, USA) 、 第 90卷、 第 7240〜 7244頁 （1 993) ]。 一方、 NOはス
—パーォキシドラジカルと速やかに反応してペルォキシ亜硝酸ィオンを生じ、 ペルォキシ亜硝酸イオンが炎症性の細胞、 組織障害を引き起こすとも考えら れている。
活性化された免疫細胞が臓器に入り込み、 サイ トカインを放出すると N〇 の産生が誘導される。 ィンスリン依存型糖尿病は瞵島 ]3細胞が特異的に破壊 されることによって引き起こされる疾患であり、 NOによる破壊であるとさ れている。 また、 慢性関節性リウマチ、 変形性関節リウマチ、 痛風性関節炎、 ベーチエツト病に伴う関節炎の患者の病変部の関節液には同患者の正常な関 節や健常人の関節の関節液に比べて高濃度の NOが含まれている。 これらの 患者に本発明の N O産生抑制剤を投与すると病変部における N O産生を抑制 し、 症状が改善する。
脳虚血中および再灌流後には N O産生が増大し、 それに伴って脳組織が損 傷を受ける。 脳虚血時に患者に本発明の N O産生抑制剤を投与することによ り脳組織の損傷が軽減され、 予後が改善される。
本発明の免疫調節剤は、 リンパ球幼若化反応抑制作用、 混合リンパ球反応 抑制等の免疫調節作用を有し、 本発明の免疫調節剤はこれらの免疫系、 免疫 因子の異常が起因となる疾病の治療剤または予防剤として有用である。
ここに、 リンパ球幼若化反応とは、 マイ トジユンがリンパ球表面の受容体 に結合し、 リンパ球を活性化させ、 その分裂、 増殖を促す反応である。 混合 リンパ球反応とは、 同種異系の動物より得られたリンパ球を混合培養するこ とにより、 主要組織適合抗原の不一致によるリンパ球の活性化が誘導され、 リンパ球の分裂、 増殖が促進される反応である。 本発明の免疫調節剤はこれ らの反応を抑制し、 リンパ球の異常亢進が起因となる自己免疫性疾患、 例え ば慢性腎炎、 潰瘍性大腸炎、 I型糖尿病、 慢性関節リウマチ等の慢性の疾患 の治療または予防に特に有用であり、 また移植片拒絶反応の抑制においても 有用である。
I g E抗体で感作されたマスト細胞は抗原の結合により脱顆粒が誘導され ケミカルメデイエターが放出される。 この I型、 すなわち、 即時型アレルギ —反応は喘息ゃァトピー性皮膚炎に代表されるアレルギー疾患において大き な役割を果たし、 マスト細胞からのケミカルメデイエターの放出を抑制する 物質はこれらのァレルギ一疾患の治療および予防に極めて有効であると考え られる。
I型アレルギー反応のモデルであるラット受動皮膚アナフィラキシー反応 ( P C A) はマス ト細胞の脱顆粒に始まり、 つぎに顆粒中に含まれるヒスタ ミン、 セロ トニン等のケミカルメデイエターが放出されて血管透過性の亢進 を惹起し、 最後には、 皮膚局所に色素漏出を生じさせる反応である。 本モデ ルは、 現在イン ' ビボの抗アレルギー剤の評価モデルとして最も繁用されて いる。 式 1〜 6の化合物より選択される化合物および該化合物を還元末端に有す る可溶性の糖化合物は、 P C A抑制作用を有し、 本発明によれば、 式 1〜6 の化合物より選択される化合物および該化合物を還元末端に有する可溶性の 糖化合物からなる群より選択される少なくとも 1種の化合物を有効成分とす る抗アレルギー剤も提供される。
この抗ァレルギ一剤は I型ァレルギ一反応抑制によつて治療しうる疾患、 例えば、 気管支喘息、 アトピー性皮膚炎、 アレルギー性鼻炎、 花粉症、 奪麻 疹、 接触性皮膚炎、 アレルギー性結膜炎等の治療、 予防において極めて有用 である。
上記した本発明の治療用または予防用医薬組成物、 例えば、 アポトーシス 誘発剤は、 式 1〜6の化合物より選択される化合物および該化合物を還元末 端に有する可溶性の糖化合物からなる群から選択される少なくとも 1種の化 合物を有効成分とし、 これを公知の医薬用担体と組合せ製剤化することによ り製造できる。
一般的には、 これらの化合物を薬学的に許容できる液状または固体状の担 体と配合し、 かつ必要に応じて溶剤、 分散剤、 乳化剤、 緩衝剤、 安定剤、 賦 形剤、 結合剤、 崩壊剤、 滑沢剤等を加えて、 錠剤、 顆粒剤、 散剤、 粉末剤、 カプセル剤等の固形剤、 通常液剤、 懸濁剤、 乳剤等の液剤とすることができ る。 またこれを使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品と することができる。
本発明のアポト一シス誘発剤は、 経口剤や、 注射剤、 点滴用剤等の非経口 剤のいずれによっても投与することができる。
医薬用担体は、 上記投与形態および剤型に応じて選択することができ、 経 口剤の場合は、 例えば、 デンプン、 乳糖、 白糖、 マンニット、 カルボキシメ チルセル口一ス、 コーンスターチ、 無機塩等が利用される。 また、 経口剤の 調製に当っては、 さらに結合剤、 崩壊剤、 界面活性剤、 潤沢剤、 流動性促進 剤、 矯味剤、 着色剤、 香料等を配合することもできる。
—方、 非経口剤の場合は、 常法に従い、 本発明の有効成分であるアポトー シス誘発性を有する糖化合物を、 希釈剤としての注射用蒸留水、 生理食塩水、 ブドウ糖水溶液、 注射用植物油、 ゴマ油、 ラッカセィ油、 ダイズ油、' トウモ ロコシ油、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコール等に溶解ないし 懸濁させ、 必要に応じ、 殺菌剤、 安定剤、 等張化剤、 無痛化剤等を加えるこ とにより調製される。
本発明のアポトーシス誘発剤は、 製剤形態に応じた適当な投与経路で投与 される。 投与方法も特に限定はなく、 内用、 外用および注射によることがで きる。 注射剤は、 例えば、 静脈内、 筋肉内、 皮下、 皮内等に投与することが でき、 外用剤には座剤等も包含される。
本発明のアポト一シス誘発剤の投与量は、 その製剤形態、 投与方法、 使用 目的およびこれに適用される患者の年齢、 体重、 症状によって適宜設定され、 一定ではないが、 一般には製剤中に含有される有効成分の量が成人 1 日当り 1 0 g〜2 0 0 m g / k gである。 もちろん、 投与量は、 種々の条件によ つて変動するので、 上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、 あるい は範囲を超えて必要な場合もある。 本発明の薬剤はそのまま経口投与するほ か、 任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。
本発明の制がん剤は、 式 1〜 6の化合物より選択される化合物および該化 合物を還元末端に有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される少なく とも 1種の化合物を有効成分とし、 これを公知の医薬用担体と組合せ、 製剤 化すれば製造することができる。 制がん剤の製造は上記アポトーシス誘発剤 の製造方法に準じ行うことができる。
制がん剤としては、 製剤形態に応じた適当な投与経路で投与される。 投与 方法も特に限定はなく、 内用、 外用および注射によることができる。 注射剤 は、 例えば、 静脈内、 筋肉内、 皮下、 皮内等に投与することができ、 外用剤 には座剤等も包含される。
制がん剤としての投与量は、 その製剤形態、 投与方法、 使用目的およびこ れに適用される患者の年齢、 体重、 症状によって適宜設定され、 一定ではな いが一般には、 製剤中に含有される有効成分の量が成人 1 日当り 1 Ο μ g〜 2 0 0 m g Z k gである。 もちろん、 投与量は、 種々の条件によって変動す るので、 上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、 あるいは範囲を超 えて必要な場合もある。 本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか： 任意の 飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。
また、 本発明の抗酸化剤、 活性酸素産生抑制剤、 過酸化脂質ラジカル産生 抑制剤、 N〇産生抑制剤、 免疫調節剤、 抗アレルギー剤は上記アポトーシス 誘発剤に準じ製造することができ、 用量、 用法は上記アポトーシス誘発剤に 準じて、 使用すれば良い。
すなわち、 抗酸化剤、 活性酸素産生抑制剤、 過酸化脂質ラジカル産生抑制 剤、 N O産生抑制剤、 免疫調節剤または抗アレルギー剤としては、 製剤形態 に応じた適当な投与経路で投与される。 投与方法も特に限定はなく、 内用、 外用および注射によることができる。 注射剤は、 例えば、 静脈内、 筋肉內、 皮下、 皮内等に投与することができ、 外用剤には座剤等も包含される。
抗酸化剤、 活性酸素産生抑制剤、 過酸化脂質ラジカル産生抑制剤、 N O産 生抑制剤、 免疫調節剤または抗アレルギー剤としての投与量は、 その製剤形 態、 投与方法、 使用目的およびこれに適用される患者の年齢、 体重、 症状に よって適宜設定され、 一定ではないが一般には製剤中に含有される有効成分 の量が成人 1 日当り 1 0 )U g〜2 0 0 m g Z k gである。 もちろん、 投与量 は、 種々の条件によって変動するので、 上記投与量より少ない量で十分な場 合もあるし、 あるいは範囲を超えて必要な場合もある。 本発明の薬剤はその まま経口投与するほか、 任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることも できる。
つぎに、 本発明の飲食品は、 式 1〜6の化合物より選択される化合物およ び該化合物を含有する可溶性の糖化合物より選択される少なくとも 1種の化 合物、 例えば、 原料物質の pH 7未満の酸性下での酸分解物および/または酵 素分解物より生成する、 ァガロビオース、 ァガロテトラオース、 ァガ口へキ サオース、 ァガロォクタオース、 κ—力ラビオースおよび |3 _ D—ガラク ト ビラノシル一 3， 6—アンヒ ドロ一 2—〇一メチルー L—ガラク トース等の 糖化合物からなる群より選択される少なくとも 1種の化合物を含有、 添加お よびノまたは希釈してなる食品または飲料であり、 そのアポトーシス誘発作 用、 制がん作用、 抗酸化作用、 免疫調節作用等により、 式 1〜 6の化合物よ り選択される化合物および該化合物を含有する可溶性の糖化合物の少なくと も 1種に感受性を示す疾患、 例えば、 アポトーシス誘発を要する疾,寄、、 がん 性疾患、 活性酸素産生抑制を要する疾患、 N O産生抑制を要する疾患、 免疫 調節を要する疾患、 アレルギー性疾患等の症状改善、 予防に極めて有用であ る。
本発明の食品または飲料の製造方法は、 特に限定はないが、 調理、 加工お よび一般に用いられている食品または飲料の製造方法を採用でき、 製造され た食品または飲料に、 式 1〜 6の化合物より選択される化合物および該化合 物を還元末端に含有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される少なく とも 1種の化合物、 例えば、 原料物質の pH 7未満の酸性下での酸分解および または酵素分解により生成する、 ァガロビオース、 ァガロテトラオース、 ァガ口へキサオース、 ァガロォクタオース、 κ—力ラビオースおよび 3—D 一ガラク トビラノシルー 3， 6—アンヒ ドロ一 2— O—メチルー L一ガラク トース等から選ばれる少なくとも 1種の化合物が有効成分として含有されて いれば良い。
本発明の飲食品は、 特に限定するものではないが、 例えば、 穀物加工品 (例、 小麦粉加工品、 デンプン類加工品、 プレミックス加工品、 麵類、 マ力 ロニ類、 パン類、 あん類、 そば類、 麩、 ビーフン、 はるさめ、 包装餅等） 、 油脂加工品 （例、 可塑性油脂、 てんぷら油、 サラダ油、 マヨネーズ類、 ドレ ッシング等） 、 大豆加工品 （例、 豆腐類、 味噌、 納豆等） 、 食肉加工品 （例、 ハム、 ベーコン、 プレスハム、 ソーセージ等） 、 水産製品 （例、 冷凍すりみ、 かまぼこ、 ちくわ、 はんぺん、 さつま揚げ、 つみれ、 すじ、 魚肉ハム、 ソー セージ、 かつお節、 魚卵加工品、 水産缶詰、 つくだ煮等） 、 乳製品 （例、 原 料乳、 クリーム、 ヨーグルト、 バター、 チーズ、 練乳、 粉乳、 アイスタリ一 ム等） 、 野菜 ·果実加工品 （例、 ペースト類、 ジャム類、 漬け物類、 果実飲 料、 野菜飲料、 ミックス飲料等） 、 菓子類 （例、 チョコレート、 ビスケッ ト 類、 菓子パン類、 ケーキ、 餅菓子、 米菓類等） 、 アルコール飲料 （例、 日本 酒、 中国酒、 ワイン、 ウィスキー、 焼酎、 ウォッカ、 ブランデー、 ジン、 ラ ム酒、 ビール、 清涼アルコール飲料、 果実酒、 リキュール等） 、 嗜好飲料 (例、 緑茶、 紅茶、 ウーロン茶、 コーヒー、 清涼飲料、 乳酸飲料等)'、 調味 料 （例、 しょうゆ、 ソース、 酢、 みりん等） 、 缶詰 ·瓶詰め ·袋詰め食品
(例、 牛飯、 釜飯、 赤飯、 カレー、 その他の各種調理済み食品） 、 半乾燥ま たは濃縮食品 （例、 レバーペースト、 その他のスプレッド、 そば ' うどんの 汁、 濃縮スープ類） 、 乾燥食品 （例、 即席麵類、 即席カレー、 インスタント コーヒー、 粉末ジュース、 粉末スープ、 即席味噌汁、 調理済み食品、 調理済 み飲料、 調理済みスープ等） 、 冷凍食品 （例、 すき焼き、 茶碗蒸し、 うなぎ かば焼き、 ハンバーグステーキ、 シユウマイ、 餃子、 各種スティック、 フル —ッカクテル等） 、 固形食品、 液体食品 （例、 スープ等） 、 香辛料類等の農 産 ·林産加工品、 畜産加工品、 水産加工品等が挙げられる。
本発明の飲食品には、 式 1〜 6の化合物より選択される化合物および該化 合物を還元末端に含有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される少な くとも 1種の化合物、 例えば、 原料物質の pH 7未満の酸性下での酸分解およ び または酵素分解により生成する、 ァガロビオース、 ァガロテトラオース、 ァガ口へキサォ一ス、 ァガロォクタオース、 κ—力ラビオースおよび j3—D
—ガラタ トピラノシル _ 3， 6—アンヒ ドロ一 2—O—メチル一 L—ガラク トース等の糖化合物から選択される少なくとも 1種以上の化合物が含有、 添 加および/または希釈されており、 その生理機能を発現するための必要量が 含有されていれば、 特に、 その形状に限定は無く、 タブレット状、 顆粒状、 カプセル状等の形状の経口的に摂取可能な形状物も包含する。
3 , 6—アンヒ ドロガラク トピラノースまたはその 2—0—メチル化体お よび該化合物を還元末端にもつ糖化合物は、 へミアセタール環が開環しやす く、 末端にアルデヒ ドができやすい。 このアルデヒ ドおよび 3， 6—アンヒ ドロガラク トピラノースのアルデヒ ド体のアルデヒ ドは、 アルデヒ ドに反応 性を有する化合物、 例えば、 アミノ酸等のごとき求核性物質と反応しやすく、 反応した式 1〜 6の化合物または糖化合物、 例えば、 オリゴ糖は、 還元末端 の式 1〜6の化合物より選択される化合物を無くした状態になる。 そのため、 式 1〜 6の化合物より選択される化合物およびそれらの化合物を還元末端に もつオリゴ糖が有する様々な生理活性が失なわれてしまう。 すなわち、 飲料 あるいは貪品中で式 1〜6の化合物より選択される化合物およびそれらの化 合物を還元末端に有する糖化合物からなる群より選択される化合物を安定よ く保持するには、 これらのアルデヒ ドのモル濃度より、 これらのアルデヒ ド に対して反応性を示す化合物のモル濃度を、 低い状態に保つ必要がある。
そこで、 本発明の食品または飲料の製造においては、 従来制御されていな かった、 これらのアルデヒ ドに反応性を示す化合物量の制御を行うことによ り、 式 1〜 6の化合物より選択される化合物およぴ該化合物を還元末端にも つオリゴ糖からなる群より選択される化合物を実質的に減少させることなく、 これらの化合物の高含有食品または飲料を提供することが可能となる。
また、 式 1〜6の化合物より選択される化合物および該化合物を還元末端 にもつ糖化合物の還元末端における当該式 1〜 6の化合物より選択される化 合物は酸性下において安定であることが見出され、 本発明の食品または飲料 の製造方法においてその全行程を酸性下で行い、 得られる食品または飲料を 酸性食品または酸性飲料とすることにより、 式 1〜6の化合物より選択され る化合物および該化合物を還元末端にもつ可溶性の糖化合物からなる群より 選択される少なくとも 1種の化合物を高含有する酸性食品または酸性飲料の 提供が可能となる。
本発明の酸性食品または酸性飲料の製造において、 原料物質を酸分解する 酸の種類に特に限定はなく、 有機、 無機いずれの酸も使用できるが、 得られ る寒天酸分解物の風味は有機酸分解物の方が好ましく、 好適には有機酸を使 用することにより、 新規な風味の酸性分解物を得ることができる。 有機酸と しては、 目的に応じ選択すれば良く、 単独でも、 2種以上を併用しても良レ、。 有機酸としては、 例えば、 酢酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 乳酸、 酒石酸、 コハ ク酸、 フマール酸等が好適である。 分解条件としては特に限定されるもので はないが、 有機酸として、 例えば、 クェン酸を使用する場合、 原料物質、 例 えば、 寒天の酸分解を 6 0〜 1 3 0 °C、 好適には 9 0〜 1 0 5 °Cで、 3〜3 0 0分、 好適には 3 0〜 2 0 0分行うことにより、 有機酸の酸味が変化し、 味のバランスの良い、 舌ざわりがまろやか、 なめらかな酸味の組成物となる。 有機酸量として 0 . 0 5〜3 0重量％、 好適には 0 . 2〜1 0重量％、 式 1 〜 6の化合物より選択される化合物および該化合物を還元末端に有する可溶 性の糖化合物からなる群より選択される少なくとも 1種の化合物の含有物量 として 1〜2 0重量％、 好適には 5〜 1 5重量％含有量となる加熱処理物が 好ましい酸味の酸味料となる。 得られる酸味料は清涼飲料、 酸性調味料、 酸 性食品等の製造に極めて有用である。
本発明の酸性食品または酸性飲料は、 生理活性を有する式 1〜 6の化合物 より選択される化合物および該化合物を含有する可溶性の糖化合物からなる 群より選択される少なくとも 1種の化合物、 例えば、 原料物質の PH 7未満の 酸性下での酸分解および Zまたは酵素分解により生成する、 ァガロビオース、 ァガロテトラオース、 ァガ口へキサオース、 ァガロォクタオース、 κ—カラ ビオースおよび j3—D—ガラク トビラノシルー 3， 6—アンヒ ドロー 2— O —メチル一 L—ガラク トース等の糖化合物を多量に含有し、 これらが有する アポトーシス誘発作用、 制がん作用等の生理機能によって、 これらを摂取す ることにより発がん予防、 がん抑制効果等の効果を有する食品または飲料で ある。 すなわち、 本発明の酸性食品または酸性飲料は、 式 1〜6の化合物よ り選択される化合物および該化合物を含有する可溶性の糖化合物からなる群 より選択される少なくとも 1種の化合物に感受性を示す疾患の症状改善作用 または予防作用を示す健康食品または飲料であり、 特に胃腸健康保持に有用 な食品または飲料である。
また、 本発明の、 式 1〜6の化合物より選択される化合物および該化合物 を含有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される少なくとも 1種の化 合物、 例えば、 原料物質の pH 7未満の酸性下での酸分解および Zまたは酵素 分解により生成する、 ァガロビオース、 ァガロテトラオース、 ァガ口へキサ オース、 ァガロォクタオース、 κ _力ラビオースおよび j3—D—ガラク トビ ラノシル一 3， 6—アンヒドロ一 2—〇一メチル一 L—ガラク トース等の糖 化合物は、 活性酸素産生抑制作用、 過酸化脂質ラジカル産生抑制作用等の抗 酸化活性を有し、 抗酸化用食品用の抗酸化剤または抗酸化用飲料用の抗酸化 剤、 例えば活性酸素産生抑制剤、 過酸化脂質ラジカル産生抑制剤、 N O産生 抑制剤等として抗酸化用食品または抗酸化用飲料の製造に使用することがで さる。 ― * すなわち、 本発明により、 式 1〜6の化合物より選択される化合物および 該化合物を含有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される少なくとも 1種の化合物を有効成分として含有する抗酸化剤、 特に飲食品用の抗酸化剤 が提供される。
本発明の抗酸化剤の剤型は特に限定されるものではなく、 添加対象となる 飲食品の種類によって常法に従って、 粉末状、 ペースト状、 乳化物等の適宜 な剤型にすることができ、 本発明に使用する化合物および糖化合物から選択 される化合物を有効成分として含有する抗酸化用飲食品は、 本発明の抗酸化 剤を使用することにより簡便に製造することができる。
本発明によれば、 また、 式 1〜 6の化合物より選択される化合物および該 化合物を含有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される抗酸化用糖が 提供される。 例えば、 該抗酸化用糖は、 原料物質の PH 7未満の酸性下での酸 分解物および/または酵素分解物として得ることができる。 また、 その精製 物、 部分精製物等を使用することができる。 原料物質としては、 例えば、 紅 藻類由来の原料物質、 例えば、 寒天、 ァガロース、 力ラゲナン等が単独で、 または 2種以上を併用して使用できる。 特に限定するものではないが、 代表 的な抗酸化用糖として、 式 1〜6の化合物より選択される化合物を含有する 可溶性の糖化合物、 例えば、 ァガロビオース、 ァガロテトラオース、 ァガロ へキサオース、 ァガロォクタオース、 κ一力ラビオースおよび ]3—D—ガラ ク トピラノシル一 3， 6—アンヒ ドロ一 2—0—メチル一L—ガラク ト一ス 等の抗酸化用糖が例示される。
本発明の抗酸化用糖は生体内の酸化物質、 例えば、 活性酸素の除去や産生 抑制に有用であり、 該抗酸化用糖は活性酸素の産生や過剰が起因となる疾病 の症状改善または予防に有用である。
上記したように、 生体内において活性酸素生成系が消去系に対して優位に 立つた場合、 生体は酸化的障害を受けることにより生じる酸化ストレスは 様々な疾患と関わり、 生体は、 常に酸化ストレスによる疾患、 あるいは、 疾 病の悪化につながる状況にさらされている。 したがって、 このような酸化ス トレスが引き起こす疾病の予防、 治療あるいは悪化防止には、 毎日、'適度の 抗酸化物質を摂取することが望ましい。 毎日適度の量を摂取するには、 飲食 品から摂取するのが望ましく、 本発明の抗酸化用糖を含有、 希釈および ま たは添加してなる飲食品は抗酸化用食品または抗酸化用飲料として、 また抗 酸化ス トレス食品または抗酸化ス トレス飲料として極めて有用である。
本発明に使用する化合物およぴ糖化合物より選択される化合物は保水性も 合せ持ち、 これらの少なくとも 1種の化合物を有効成分とし抗便秘剤、 抗便 秘用食品、 抗便秘用飲料を製造することができる。
本発明によれば、 さらに、 式 1〜6の化合物より選択される化合物を還元 末端に含有する可溶性の糖化合物、 例えば、 ァガロビオース、 ァガロテトラ オース、 ァガ口へキサオース、 ァガロォクタオース、 / 一力ラビオースおよ び ]3— D—ガラク トピラノシル一 3 , 6—アンヒ ドロ一 2— O—メチル一L 一ガラク トース等のオリゴ糖を有効成分とする化粧料が提供される。 該糖化 合物は、 例えば、 原料物質の pH 7未満の酸性下での酸分解物および/または 酵素分解物として得ることができる。 また、 その精製物、 部分精製物を使用 することもできる。 原料物質としては、 例えば、 紅藻類由来の原料物質、 例 えば、 寒天、 ァガロース、 力ラゲナン等を単独で、 または 2種以上を併用し て使用できる。
化粧料としては、 上記化合物を有効成分とし、 クリーム、 乳液、 ローショ ン、 洗顔料、 パック等の基礎化粧料、 口紅、 ファンデーション等のメイクァ ップ化粧料、 ボディソープ、 石験等の形態に調製することができる。 また、 頭髪に対しても有効であり、 ヘアートニック、 ヘアーリキッド、 ヘア一セッ トローション、 ヘアーブロー剤、 ヘアークリーム、 ヘアーコート等のヘアー 製品やシャンプー、 リンス、 ヘアートリートメント等の頭髮用トイレタリー 等のヘアーケア製品の形態にすることができる。 化粧料への配合量はその美 白作用、 保湿作用、 抗酸化作用等により、 適宜決定すればよい。 化粧料の他 の成分は通常化粧料に配合されるものが使用できる。 なお、 美白作用、 保湿 作用は常法にて測定すれば良く、 例えば、 特開平 8— 3 1 0 9 3 7号公報記 載の方法で測定することができる。 本発明の化粧料は皮膚への美白作用、 保湿作用、 抗酸化作用、 活性酸素産 生抑制作用、 抗酸化ス トレス作用、 毛髪への保湿作用、 抗酸化作用、.活性酸 素産生抑制作用、 抗酸化ス トレス作用等により優れた性質を示す。
さらに、 本発明によれば、 式 1〜6の化合物より選択される化合物および 該化合物を還元末端に含有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される 少なくとも 1種の化合物、 例えば、 ァガロビオース、 ァガロテトラオース、 ァガ口へキサオース、 ァガロォクタオース、 K一力ラビオースおよび /3— D —ガラク トピラノシル一 3， 6—アンヒドロ一 2— O—メチル一L一ガラク トース等のオリゴ糖を有効成分とする鮮度保持剤が提供される。 該化合物と しては、 例えば、 原料物質の pH 7未満の酸性下での酸分解物および/または 酵素分解物として得ることができる。 また、 その精製物、 部分精製物を使用 することもできる。 原料物質としては、 例えば、 紅藻類由来の式 1〜 6の化 合物より選択される化合物を含有する物質、 例えば、 寒天、 ァガロース、 力 ラゲナン等を単独で、 または 2種以上を併用して使用できる。
式 1〜 6の化合物より選択される化合物およぴ該化合物を還元末端に含有 する可溶性の糖化合物からなる群より選択される少なくとも 1種の化合物、 例えば、 ァガロビオース、 ァガロテトラオース、 ァガ口へキサオース、 ァガ ロォクタオース、 κ一力ラビオースおよび jS— D—ガラク トピラノシル一 3， 6—アンヒ ドロ _ 2— O—メチル—L—ガラク トース等の糖化合物は抗酸化 作用、 鮮度保持作用、 チロシナーゼ活性阻害作用を有し、 これらを有効成分 として、 公知の製剤化方法により、 食品の変色、 腐敗、 酸化等を効果的に防 止する食品の鮮度保持剤を製造することができる。 本発明の鮮度保持剤は 種々の食品、 生鮮食品、 加工食品等の味や鮮度の保持に極めて有用である。 本発明に使用する式 1〜 6の化合物より選択される化合物および該化合物 を含有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される化合物は、 いずれも、
1 g / k gの投与量でマウスに経口または腹腔内投与しても急性毒性は認め られない。 以下、 実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明はこれ P TJP 5 5
31 らの実施例に限定されるものではない。
実施例 1
(1) 市販の寒天粉末 （和光純薬社製） 40 Omgを 1 Nの塩酸 2 Om 1 に懸濁し、 電子レンジで加熱溶解した。 溶解液を冷却し、 水酸化ナトリウム で pHを 4とし、 384mgのクェン酸を添加し、 水酸化ナトリウムで pHを
3に調整した。 この水溶液に水を加えて 4 Om 1 とし、 1 20°Cで 4時間処 理した。 この酸分解液を水酸化ナトリウムにより pH 6. 5とし、 0. 2 μπι (コ一二ング社製） のフィルターでろ過した。
56°C、 30分間処理した牛胎児血清 （ J RHバイオサイエンス社製） を 1 0%含む RPMI 1 640培地 （ギブコネ土製） にて 37°Cで培養したヒ ト 前骨髄性白血病細胞 HL_ 60 (ATCC CCL- 240) を同培地で 2 500個 Z90 μ 1 となるように懸濁した。 この懸濁液を 96穴プレート (ファルコン社製） に 90 μ 1ずつ分注し、 それぞれの懸濁液に対して、 上 記の酸分解液、 上記の酸分解液の 1 0倍希釈物、 および水をそれぞれ 10 μ 1ずつ添加し、 37 °C、 5 %炭酸ガス存在下で培養し、 培養開始後 24時間 および 48時間に光学顕微鏡で細胞の形態を観察した後、 「アポトーシス実 験プロ トコ一ル」 [秀潤社、 田沼靖ー監修、 第 1 56頁 （1 994) ] に従 つた MTT法により、 5mgZm lの 3— （4， 5—ジメチルチアゾール一 2—ィル） 一 2， 5—ジフエ二ルテトラゾリゥムブロミ ド （シグマ社製） リ ン酸緩衝食塩水溶液 ΙΟμΙ を加えてさらに 4時間培養を続け、 0. 04 Ν塩 酸含有 2—プロパノール 100 μ 1を加えてよく撹拌し、 590 nmにおけ る吸光度を測定し、 測定した吸光度から計算される生細胞数を比較した。 この結果、 上記酸分解液およびその 1 0倍希釈液を添加した培地において は、 水を添加したものに比べ著しく生細胞数が減少した。 また、 死細胞にお いてアポトーシス小体が観察された。
(2) 寒天粉末 40 Omgを 1 Nの塩酸 2 Om 1に懸濁し、 電子レンジで 加熱溶解し、 酸分解液を調製した。 溶解液を冷却後、 50mMのクェン酸緩 衝液 pH3を 2 Om 1添加し、 水酸化ナトリウムで pHを 6. 5とし、 0. 2 Mm (コーユング社製） のフィルターでろ過し、 酸分解液を得た。 この酸分解液およびこの酸分解液を 1 0倍に希釈したものを上記実施例 1 一 （1) と同じ方法により HL— 60細胞の増殖抑制活性およびアポト一シ ス誘発活性を測定した。 その結果この酸分解液も実施例 1一 （1) 記載の酸 分解液とほぼ同等のがん細胞増殖抑制活性およびアポトーシス誘発活性を示 した。
(3) 寒天粉末 40 Omgを 1 Nの塩酸 4 Om 1に懸濁し、 沸騰湯浴上で 溶解し、 溶解液を得た。 この溶解液を八等分し、 沸騰湯浴上でそれぞれ 0、 30、 60、 90、 1 20、 1 80、 210分間保持した後，、 冷却し、 2N の水酸化ナトリウムで pHを 6. 5に調整した。
それぞれの処理液を実施例 1— (1) と同じ方法により HL— 60細胞の 増殖抑制活性およびアポトーシス誘発活性を測定した。 その結果、 0分およ ぴ 30分処理液に関しては実施例 1一 （1) 記載の酸分解液と同等の活性を 示したが、 60分以上の処理液は両活性を示さなかった。
(4) 30m lの 1、 0. 5、 0. 25、 0. 1 3、 0. 063、 0. 0 31、 0. 01 6、 0. 0078Nの塩酸にそれぞれ 30 Omgの寒天粉末 を懸濁し、 沸騰湯浴上で 10分間保持し、 溶解液を調製した。 この溶解液を 冷却後、 2 Nの水酸化ナトリウムで pHを 6. 5に調整した。
それぞれの処理液を実施例 1— (1) と同じ方法により HL— 60細胞の 増殖抑制活性およびアポトーシス誘発活性を測定した。 その結果、 I N (p H0. 05) から、 0. 063N (pH 1. 3) の塩酸処理液に関しては実施 例 1一 （1) 記載の酸分解液と同等の活性を示した。 0. 063N未満の塩 酸濃度では塩酸濃度が低下するにつれて活性は減少したが、 0. 0078 N の塩酸処理液においても両活性は検出された。
(5) 4 Om 1の 1 N塩酸および 0. 1 2 N塩酸にそれぞれ 400 m gの 寒天粉末を添加し、 沸騰湯浴上で 10分間保持し、 溶解液を調製した。 この 溶解液を 2 Nの水酸化ナトリウムで pH 6. 5に中和後、 セル口ファイン GC L一 25を用い溶出液 1 0%エタノール含有の 0. 2MN a C 1でゲルろ過 を行った。 それぞれの溶出液につき、 実施例 1一 （1) と同じ方法により H L一 60細胞の増殖抑制活性およびアポトーシス誘発活性を測定した。 なお 増殖抑制活性は相対活性として下記の様に測定した。
それぞれの溶出液を添加して 3日間培養した H L— 60細胞に関して実施 例 1一 （1) 記載の MTT法により 590 nmの吸光度を求める （Ab s
T) 。
溶出液の代りにゲルろ過用溶出液を添加して培養した HL— 60細胞に関 して実施例 1— (1) 記載の MTT法により 590 nmの吸光度を求める (Ab s C) 。
相対活性： Ab s C_Ab s T
図 1に寒天の 0. 1 2 N塩酸分解物のゲルろ過の溶出図を示す。 図中縦軸 はフユノール硫酸法により測定した溶出液中の糖含量 （吸光度 480 nm： 白丸印） または相対活性 （黒丸印） を示し、 横軸は分画番号 （1分画 1 2m 1 ) を示す。
図 2に寒天の 1 N塩酸分解物のゲルろ過の溶出図を示す。 図中縦軸はフエ ノール硫酸法により測定した溶出液中の糖含量 （吸光度 480 nm： 白丸 印） または相対活性 （黒丸印） を示し、 横軸は分画番号 （1分画 1 2m l ) を示す。
図 1、 図 2に示すように寒天の酸分解物はがん細胞増殖抑制活性を示し、 また死細胞にはアポトーシス小体が観察された。
図 1の分画番号 5 1〜64の溶出液、 および分画番号 65〜84の溶出液 をそれぞれ合せ、 アポトーシス誘発用および/または制がん用の糖化合物を 調製した。
図 2の分画番号 60〜78の溶出液、 および分画番号 79〜95の溶出液 をそれぞれ合せ、 アポトーシス誘発用および または制がん用の糖化合物を 調製した。
実施例 2
(1) 市販の寒天 （ァガー ノーブル （Agar Noble) 、 ディフコ社製） 1 gを 1 00m lの 0. 1 N塩酸に懸濁し、 沸騰するまで電子レンジで加熱し て溶解した。 室温まで冷却して pH 6に調整した後、 コスモナイスフィルタ一 (ナカライテスク社製） でろ過し、 そのろ液 2m l を以下の逆相 HP LCで 分離した。
カラム ： TSK- gel ODS 80Ts (20議 X 250mm, 東ソ一社製）
TSK guard column ODS- 80Ts (20mm X 50mm 、 東ソ一社製） 移動相： 0. 1%トリフルォロ酢酸 （TFA) 水溶液
流速： 9 m 1ノ分
検出： 21 5 nm における吸光度
各溶出ピークを分取し、 減圧下乾固した後、 300 μ 1の水に溶解した。 各画分をろ過滅菌し、 1 0 /Ζ 1ずつ 96穴マイクロタイタープレートに入れ た。 そこに 5, 000個の HL— 60細胞 （ATCC CCL— 240) を含 む 1 0%ゥシ胎児血清 （ギブコ社製） 含有 RPMI 1640培地 （二ッスィ 社製） 90 μ 1を加え、 5%炭酸ガス存在下、 37 °Cで 48時間培養した。 光 学顕微鏡で細胞の形態を観察した後、 SmgZm lの 3— (4， 5—ジメチ ルチアゾール— 2—ィル） —2, 5—ジフエニルテトラゾリ ゥムブロミ ド リン酸緩衝食塩水溶液 1 0// 1を加えてさらに 4時間培養を続け、 0. 04 N塩酸含有 2—プロパノール 1 00 μ 1を加えてよく撹拌し、 590 nmに おける吸光度を測定して、 これを細胞増殖度とした。
その結果 8. 26分のピーク由来の画分を添加した区分において、 アポト 一シス小体が観察され、 対照の水添加区分に比べて 590 nmにおける吸光 度が低く、 細胞増殖が阻害されていた。
(2) 実施例 2— （1) 記載の 8. 26分のピーク由来の画分 1 00 1 を以下のサイズ排除 HP LCクロマトグラフィ一で分離した。
カラム ： TSK- gel α-2500 (7.8mm X 300mm 、 東ソ一社製）
TSK guard column a (6mm X40ram、 東ソ一社製)
移動相： 0. 01 % T F A水溶液
流速： 0. 8m l 分
検出：示差屈折計
サイズ排除 H PLCクロマトグラフィ一での分離図を図 3に示す。 すなわ ち、 図 3は寒天の酸分解物のサイズ排除 HPLCクロマトグラムを示す図であり、 横軸は溶出時間 （分） 、 縦軸は示差屈折計の出力を示す。 分離された各ピークを分取して減圧下乾固した。 各画分を 1 OmgZm l となるように水に溶解し、 ろ過滅菌した後、 上記実施例 2— (1) 記載の方 法でアポトーシス誘発活性とがん細胞増殖抑制活性を測定した。 その結果、 溶出時間 8. 87分と 9. 40分のピークが両活性を有していた。
溶出時間 8. 87分の物質と 9. 40分の物質をリン酸緩衝食塩水に溶解 し、 37 °Cで 1時間放置した後、 同様のサイズ排除 HP LCで分析した。 そ の結果、 どちらの試料でも溶出時間 8. 87分と 9. 40分のピークが見ら れ、 ピークの面積の比がほぼ等しかった。 よって、 リン酸緩衝水溶液状態で 溶出時間 8. 87分の物質と 9. 40分の物質は平衡状態にあることが明ら かとなつた。
溶出時間 8. 87分と 9. 40分のピーク由来の画分を合せ減圧下乾固し、 アポトーシス誘発性および制がん性物質を得た。
(3) 実施例 2— (2) 記載のアポトーシス誘発性おょぴ制がん性物質の 質量分析を DX 302質量分析計 （日本電子社製） を用いて行った。 グリセ ロールをマトリックスとして用い、 ネガティブイオンモードで測定した。
F AB-MS
m/z 323 [M -H] -
415 [M+グリセロール— H] 一
507 [M+2グリセロール— H] ―
その結果を図 4に示す。 すなわち、 図 4はアポトーシス誘発性および制が ん性物質のマススペク トルを示す図であり、 横軸は m/z値、 縦軸は相対強 度（％) を示す。
実施例 2— (2) で得たアポトーシス誘発性および制がん性物質の核磁気 共鳴スぺク トルを測定した。 核磁気共鳴装置は J NM— A 500 (日本電子 社製） を用いた。
^-NMR
S3.36 (1H, dd, J=8.0, 10.0Hz)、 3.51 (1H, dd, J=3.0， 10.0Hz)、 3.56 (1H, m)、 3.58 (1H, m)、 3.63 (1H， m)、 3.67 (1H, m)、 3.70 (1H, dd, J=3.0, 10.0Hz)、 3.77 (1H, d, J=3.0Hz) 、 3.83 (1H, dd, J=4.5, 10.0Hz)、 3.93 (1H,— dd, J=5.0, 3.5Hz) 、 4.23 (1H, m)、 4.25 (1H， m)、 4.41 (1H, d, J=8.0Hz) 、 4.85 (1H, d， J=6.0Hz)
試料は重水に溶解し、 HODの化学シフト値を 4. 65 p pmとして示し た。
13C-NMR
δ 61.9, 69.4 、 71.5、 73.37 、 73.42 、 73.8、 76.0、 76.1、 83.7、 86.5、 90.7、 103.3
試料は重水に溶解し、 ジォキサンの化学シフト値を 67. 4 p pmとして 示した。
図 5にアポトーシス誘発性および制がん性物質の1 H— NMRスぺク トルを 示す。 図 5において、 横軸は化学シフト値 （p pm)を、 縦軸はシグナルの強 度を示す。
また、 試料を重ジメチルスルホキシドに溶解し、 — NMRスペク トルを 測定した。
^-NMR
69.60 (1H， アルデヒ ドの H)
図 6にアポトーシス誘発性および制がん制物質の重ジメチルスルホキシド 溶媒での1 H— NMRスペク トルを示す。 図 6において、 横軸は化学シフト値 (p pm) を、 縦軸はシグナル強度を示す。
これらの質量分析、 — NMR、 13C— NMRの解析結果より、 実施例 2
- (2) 記載のアポトーシス誘発性および制がん性物質はァガロビオースと 同定された。 なお、 ァガロビオースの還元末端の 3， 6—アンヒ ドロガラク トースは、 非水溶媒中では主として開環したアルデヒ ド体として存在してい ることが重ジメチルスルホキシド溶媒での1 H— NMRにより示された。 また、 水溶液中ではアルデヒ ド体の抱水体として存在していることが、 重水溶媒で の1 H— NMRにより示された。
以上の結果より実施例 2— （2) で得たアポトーシス誘発性および制がん 性物質はァガ口ビオースであることが明らかになつた。
(4) 実施例 2— (2) で得たアポトーシス誘発性および制がん性物質、 すなわち、—ァガ口ビオースを 0.78mg/m 1 となるように氷に溶解し、 1 0 μ 1 を 96穴マイクロタイタープレートのゥエルに入れ、 上記実施例 2— ( 1 ) 記載の方法でアポトーシス誘発活性とがん細胞増殖抑制活性を測定し た。 その結果、 光学顕微鏡観察においてアポトーシス小体が見られ、 対照の 水添加区分に比べ、 ァガロビオース添加区分では細胞増殖が約 86%抑制さ れていた。 すなわち、 ァガロビオースは 78 μ gZm 1で HL— 60細胞に アポトーシスを誘発し、 細胞増殖を抑制した。
実施例 3
(1) 市販の寒天 （Agar Noble) 2. 5 gを 50m lの 0. I N HC 1 に懸濁し、 1 00°Cで 1 3分間加熱して溶解した。 室温まで冷却して N a〇
Hで PH中性付近まで中和した後、 コスモナイスフィルターでろ過し、 以下の 順相 HP LCで分離した。
カラム ： TSK_gel Amide- 80 (21.5mm X 300mm, 東ソ一社製）
溶媒 A： 90 %ァセトニトリル水溶液
溶媒 B ： 50 %ァセトニトリル水溶液
流速 : 5m l Z分
溶出：溶媒 Aから溶媒 Bへの直線濃度勾配 （80分間） —溶媒 B (20分 間）
検出： 1 95 nmにおける吸光度
試料アプライ量： 2m l
保持時間 66. 7分、 78. 5分および 85. 5分のピークを分取して質 量分析を行ったところ、 これらの物質は、 各々、 ァガロビオース、 ァガロテ トラオースおよびァガ口へキサオースであった。 上記の HP LCによる分離 を 8回繰り返して減圧下に乾固し、 1 22mgのァガロビオース、 1 1 1 m gのァガロテトラオースおよび 55mgのァガ口へキサオースを得た。
その結果を図 7〜図 1 0に示す。 すなわち、 図 7はァガロピオ一ス、 ァガ ロテトラオースおよびァガ口へキサオースの順相 HP LCの溶出パターンを 示す図であり、 横軸は保持時間 （分） を、 縦軸は 1 95 nmにおける吸光度 を示す。 図 8は 66. 7分のピークのマススペク トルを示す図であり、 横軸 は mZz値-を、 縦軸は相対強度 （％) を示す。 図 9は 78. 5分のピークの マススペク トルを示す図であり、 横軸は mZz値を、 縦軸は相対強度 （％) を示す。 図 1 0は 85. 5分のピークのマススペク トルを示す図であり、 横 軸は m/z値を、 縦軸は相対強度 （％) を示す。
(2) 実施例 3— (1) で得たァガロビオースの 1 0 OmM水溶液 450 μ 1に 1 0倍濃度のリン酸緩衝食塩水 （宝酒造社製、 Τ900) 50 μ 1 と 1 0単位 / 1の /3—ガラク トシダーゼ （シグマ社製、 G 5635) リン酸 緩衝食塩水溶液 50 μ 1を加えて混合し、 37°Cで 1時間反応させた。
この反応液に 5m 1の 1—ブタノール：エタノール = 1 ： 1混合液を加え た後、 遠心によって不溶物を除いた。 この液をカラムクロマトグラフィー用 シリカゲル BW— 300 S P (3 X 50 cm、 富士シリシァ化学社製） にァ プライし、 1ーブタノール：エタノール：水 = 5 ： 5 ： 1を溶離液としてコ ンプレッサーで 0. 3 k gZcm2に加圧し、 分離を行った。 1画分当り 7m 1になるようにフラクシヨネーシヨンを行い、 各画分の一部をとつて薄層ク 口マトグラフィ一で分析したところ、 14番から 1 7番までの画分に高純度 の 3， 6—アンヒ ドロ一 L一ガラク トースが含まれていた。 これらの画分を 集めて減圧下に乾固して 3. 8mgの 3， 6—アンヒ ドロー L—ガラク トー スを得た。 本物質の構造は質量分析法および核磁気共鳴法によつて確認した。 その結果を図 11〜図 1 3に示す。 すなわち、 図 1 1は 3， 6—アンヒ ドロ — L—ガラク トースのマススぺク トルを示す図であり、 横軸は m/z値を、 縦軸は相対強度 （％) を示す。 図 1 2は、 3， 6—アンヒ ドロ一 L—ガラク トースの重水溶媒での、 また図 1 3は重ジメチルスルホキシド溶媒での1 H— NMRスぺク トルを示す図であり、 横軸は化学シフト値 （p pm) を、 縦軸 はシグナルの強度を示す。
3， 6—アンヒ ドロ一 L—ガラク トースにおいても、 重ジメチルスルホキ シド溶媒での 'H— NMRスぺクトノレ力 S 9. 60 p pmにアルデヒ ドの水素の シグナルを示すことから、 非水溶媒中では開環したアルデヒ ド体として存在 し、 また重水での1 H— NMRスペク トルから、 水溶液中では、 そのアルデヒ ド体の抱水体として存在していることが示された。 実施例 4—
(1) 実施例 3で得た 3, 6—アンヒ ドロ一 L—ガラク トースの 2 OmM 水溶液を滅菌水で 2倍、 4倍および 8倍希釈し、 実施例 2— (1) 記載の方 法でアポトーシス誘発活性とがん細胞増殖抑制活性を測定した。 その結果、 3， 6—アンヒ ドロー L—ガラク トースの 2倍希釈液添加区分 （終濃度 l m M) でアポト一シス小体が観察され、 590 nmにおける吸光度が対照の水 添加区分の 2分の 1以下となつた。
(2) 実施例 3_ (1) で得たァガロビオース、 ァガロテトラオースおよ びァガ口へキサオースの 5 OmM水溶液をろ過滅菌し、 滅菌水で 2倍、 4倍、 8倍、 1 6倍、 32倍、 64倍および 1 28倍希釈した。 実施例 2— (1) 記載の方法でこれらの希釈液の各種細胞に対する増殖抑制活性を測定した。 用いた細胞および培地を表 1、 表 2に示す。
細胞 培地
ヒ ト前骨髄性白血病細胞 10%ゥシ胎児血清 （ギブコ社製） 含有 HL-60 (ATCC CCL 240) RPMI 1640培地 （二ッスィ社製） ヒ ト末梢リンパ球 同上
RPMI 1778 (ATCC CCL 156) マウス単球 10%ゥシ胎児血清含有 DMEM培地
RAW264. 7 (ATCC TIB 71) (二ッスィ社製）
ヒ ト胃がん細胞 10%ゥシ胎児血清含有 RPMI 1640培地 MKN45 (理研ジー RCB1001) ヒ ト肝がん細胞 10%ゥシ胎児血清含有 DMEM培地
H印 G2 (ATCC HB 8065) ヒ ト結腸腺がん細胞 10%ゥシ胎児血清含有 McCOY' S 培地 HT-29 (ATCC HTB38 ) (バイオウイタカ社製）
ヒ ト結腸腺がん細胞 同上
HCT1 16 (ATCC CCL -247 ) 繊維肉腫 10%ゥシ胎児血清含有 D-MEN培地
HT-1080 (ATCC CCL 一 121 ) (バイオウイタカ社製） 表 2 細胞 培地 グリア芽細胞 10%ゥシ胎児血清含有 D- MEN 培地
A-172 (ATCC CRL1620 ) ヒ ト乳がん細胞 10%ゥシ胎児血清含有 DMEM培地
MCF7 (ATCC HTB-22 ) ヒ ト乳がん細胞 10%ゥシ胎児血清含有 RPMI 1640培地 T-47D (ATCC HTB-133) ヒ ト膀胱がん細胞 10%ゥシ胎児血清含有 McCOY' S 培地 T24 (ATCC HTB-4) ヒ ト子宫頸部がん細胞 10%ゥシ胎児血清含有 DMEM培地
HeLa S3 (ATCC CCL-22 ) ヒ ト肺がん細胞 同上
A549 (ATCC CCL-185) ヒ ト結腸腺がん細胞 10%ゥシ胎児血清含有 RPMI 1640培地 WiDr (ATCC CCL-218)
この結果、 ァガロビオース、 ァガロテトラオースおよびァガ口へキサォ- スはこれらの細胞に対して増殖抑制活性を示した。 その結果を表 3に示す c なお、 表 3中の数字は 590 nmにおける吸光度が水添加の対照に ή:ベて 2 分の 1以下となった区分に添加した希釈液の希釈倍率を表し、 1倍希釈は細 胞培養液中の濃度 5 mMに相当する。 つぎにァガロビオース、 ァガロテトラ オースおよびァガ口へキサオースにおいて、 590 nmにおける吸光度の変 化をもとに、 50%の増殖抑制率を示す濃度 （I C5。） を算出し、 表 4に示 す。 表 3 細胞 ァガロビオース ァガロテトラオース ァガ口へキサオース
HL- 60 32 64 64
R PM 1 1 788 64 28 1 28 RAW 264. 7 1 6 32 32
MKN45 8 16 16
H e p G 2 8 8 1 6
HT— 29 8 16 32
HCT 1 1 6 1 6 32 32
HT— 1 080 8 1 6 1 6
A- 1 72 1 6 1 6 1 6
MC F 7 16 1 6 1 6
T一 47 D 1 6 16 1 6
T 24 8 8 8
H e L a S 3 8 8 1 6
A 549 8 8 1 6
W i D r 8 8 1 6 表 4
I C 50 (μ Μ) 細胞 ァガロビオース ァガロテトラオース ァガ口へキサオース
HL- 60 1 70 97 78
R ΡΜ I 1 788 44 28 22 RAW 264.7 1 79 1 33 1 09
MKN 45 344 1 96 1 66
H e p G 2 652 41 3 430
HT- 29 622 208 144
HCT 1 1 6 244 1 58 1 36
HT— 1080 31 7 21 6 185
A- 1 72 289 1 85 1 5 1
MC F 7 274 276 238
T- 47 D 21 0 183 1 58
T 24 352 399 365
H e L a S 3 353 400 334
A 549 570 494 279
W i D r 405 399 334
実施例 5
市販の寒天 5 gを 50m 1の 0. I N HC 1に懸濁し、 1 00°Cで 1 3 分間加熱して溶解した。 室温まで冷却した後、 N a OHで pH中性付近まで中 和した本加熱処理液 2 m 1を、 水で洗浄した活性炭素 （ 60— 1 50メッシ ュ、 ナカライテスク社製、 079 - 2 1) を充てんしたカラム （1 0 X 25 5 mm) にアプライした。 200m lの水で洗浄後、 2. 5%、 5%、 7. 5%、 1 0—%、 1 2. 5%、 1 5%、 1 7. 5%、 20%、 22. 5%、 2 5%、 27. 5%、 30%、 35%、 40%、 45 %および 50 %エタノー ル水溶液それぞれ 200m lでこの順に溶出した。
各溶出画分を減圧下 1 0倍濃縮してシリカゲルシート 60 F 254 (メルク社 製） にスポットし、 1—ブタノール：エタノール：水 = 5 ： 5 ： 1で展開し た後、 オルシノール試薬 [40 Omgのオルシン一水和物 （ナカライテスタ 社製） を 22. 8 m 1の硫酸に溶解し、 水を加えて 20 Om 1 としたもの] を噴霧してスポットを観察した。
その結果、 5 %および 7. 5 %エタノール水溶液溶出画分にはァガロビォ —ス、 1 5%および 1 7. 5%エタノール水溶液溶出画分にはァガロテトラ オース、 22. 5%および 25%エタノール水溶液溶出画分にはァガ口へキ サオース、 27. 5%および 30%エタノール水溶液溶出画分にはァガロォ クタオースがそれぞれ高純度で含まれていた。
実施例 6
実施例 5で得たァガロビオース、 ァガロテトラオース、 ァガ口へキサォ一 スおよびァガ口才クタオース （以下、 これらのオリゴ糖をァガロオリゴ糖と 称する場合がある） を 2. 5mMおよび 1. 25 mMになるように水に溶解 し、 ろ過滅菌した。 HL— 60細胞を 2. 5 X 1 05個ノ 4. 5m lになるよ うに 1 0 %ゥシ胎児血清含有 RPMI1640培地に懸濁し、 上記各ォリゴ糖水溶液 0. 5m 1を添加して 5%炭酸ガス存在下、 37 °Cで 24時間および 48時 間培養した。 細胞培養液の一部を取り、 トリパンブルーを加えて顕鏡し、 生 細胞数を測定した。 その結果、 各区分において水添加区分 （対照） に比べて 生細胞数が減少しており、 アポト一シス小体が観察された。
その結果を図 14、 図 1 5に示す。 すなわち、 図 14は終濃度 250 M のオリゴ糖を添加して H L— 60細胞を培養したときの培養時間と生細胞数 を示す図であり、 図 1 5は終濃度 1 25 μ Μのォリゴ糖を添加して H L— 6 0細胞を培養したときの培養時間と生細胞数を示す図である。 図 14および 図 1 5において、 横軸は培養時間 （時間） を、 縦軸は生細胞数 （X 1 05/5 m l ) を示し、 黒丸印 （秦） は水添加 （対照） を、 ひし形印 （◊) はァガロ ビオース添加を、 白丸印 （〇） はァガロテトラオース添加を、 三角印 （△) はァガ口へキサオース添加を、 四角印 （口） はァガロォクタオース添加を示 す。
実施例 7
(1) κ—力ラゲナン （シグマ社製、 C- 1 263) またはえ一カラゲナ ン （和光純薬社製、 038— 14252) 0. 2 gを 20m lの 0. 1 N HC 1に懸濁し、 95°Cで 10分間加熱した。 I N Na OHで中和した後、 水で 1. 5倍、 2. 25倍、 3. 38倍および 5. 06倍希釈して実施例 2 一 (1) の方法で HL— 60細胞に対する細胞増殖阻害活性を測定した。 そ の結果、 κ—力ラゲナン加熱物の 1. 5倍、 2. 25倍および 3. 38倍希 釈液添加区分とえ一力ラゲナン加熱物の 1. 5倍および 2. 25倍希釈液添 加区分において 590 nmにおける吸光度が対照の水添加区分の 2分の 1以 下となり、 またアポトーシス小体が見られた。
(2) 市販の寒天 （ァガー ノーブル） 、 ァガロース L 03 (宝酒造社 製） 、 および市販の棒寒天をそれぞれ 1%となるように 0. I N HC 1に 懸濁し、 1 00°Cで 1 5分間加熱した。 この加熱液を冷却後、 I N N a O Hで中和した後、 水で 2倍、 4倍、 8倍および 16倍希釈して実施例 2—
(1) の方法で HL— 60細胞に対する細胞増殖抑制活性を測定した。 その 結果寒天およびァガロースの酸分解物の 2〜 8倍希釈液添加区分と棒寒天酸 分解物の 2倍、 4倍希釈液添加区分において 590 nmにおける吸光度が対 照の水添加区分の 2分の 1以下となり、 またアポトーシス小体が見られた。 上記酸分解物をそれぞれ順相 H P L Cで分析したところ、 いずれの分解物 においてもァガロピオ一スをはじめとするァガロオリゴ糖が検出された。 実施例 8
(1) 市販の寒天を以下の酸の水溶液に 1 %濃度になるように懸濁した。
0. 5M、 1Mまたは 2M クェン酸； 0. 1M、 0. 5M、 1Mまたは 2 M 硝酸； 0. 1Mまたは 0. 5M硫酸； 0. 1M、 0. 5Mまたは 1M リン酸； 0. 1 M 塩酸。
これらの寒天懸濁液を電子レンジで溶解するまで加熱後 N a OHで中和し、 蒸留水で 2: 4、 8、 1 6または 32倍に希釈して実施例 2— (1) 記載の 方法で HL— 60細胞に対するアポトーシス誘発活性とがん細胞増殖抑制活 性を測定した。
この結果、 上記の各種酸加熱処理を行った寒天は HL— 60に対してアポ トーシスを誘発し、 細胞増殖を抑制した。 その結果を表 5に示す。 なお、 表 5中の数字は 590 nmにおける吸光度が水添加の対照に比べて 2分の 1以 下となった希釈液の希釈倍率を示す。 また、 括弧内の数字は寒天を加えずに 本実施例で使用した最大濃度の酸を N a OHで中和後、 蒸留水で希釈して添 加した場合の、 590 nmにおける吸光度が水添加の対照に比べて 2分の 1 以下となった希釈液の希釈倍率を示す。 表 5
0. 1 M 0. 5M M 2M クェン酸 4 8 1 6 (8) 硝酸 8 1 6 6 (2)
硫酸 8 1 6 (2)
リン酸 4 8 6 (1)
6
(2) 実施例 8— (1) で得た寒天の酸加熱処理物を以下の順相 HP L C で分析した。
カラム ： PALP AK t y p e S (4. 6 X 25 Omm, 宝酒造社 製、 CA 8300)
溶媒 A： 90%ァセトニトリル水溶液
溶媒 B ： 50%ァセトニトリル水溶液
流速 : 1m l Z分
溶出：溶媒 A (1 0分間） →溶媒 Aから溶媒 Bの直線濃度勾配 （40 分間） →溶媒 B (1 0分間）
検出： 1 95 nmにおける吸光度
カラム温度： 40°C
この結果、 0. 5M、 1M、 2M クェン酸、 0. 1M、 0. 5M、 1 M、 2M 硝酸、 0. 1M、 0. 5M硫酸、 0. 1 M、 0. 5M、 1 M リン酸、
0. 1M 塩酸中で加熱処理を行った試料にァガロビオースをはじめとする ァガロオリゴ糖が含まれていた。
その代表的な結果を図 1 6に示す。 すなわち、 図 1 6は 0. 5M リン酸 中で加熱処理を行った寒天の順相 HP LCの溶出パターンを示す図であり、 横軸は保持時間 （分） を、 縦軸は 1 95 nmにおける吸光度を示す。
実施例 9
市販の寒天 （伊那寒天タイプ S— 7、 伊那食品工業社製） 5 gを 20、 5 0または l O OmM クェン酸 45m lに懸濁し、 95 °Cで加熱し、 下記 時間加熱後に一部をサンプリングした。
2 OmM クェン酸処理物は 3 10分、 350分、 380分、 440分お よび 530分、 5 OmM クェン酸処理物は 1 00分、 1 20分、 140分、 1 60分、 1 80分、 200分、 220分、 240分、 260分、 290分 および 320分、 1 0 OmM クェン酸処理物は 60分、 70分、 80分、 90分、 1 00分、 1 20分、 140分、 1 60分、 1 80分、 200分、 220分および 240分。
各試料の 1 0倍希釈液 1 μ 1をシリカゲル 60シート F 254 (メノレク社製） にスポットして 1—ブタノール：エタノール：水 = 5 ： 5 ： 1で展開し、 ォ ルシノール一硫酸法で検出した。
この結果、 各試料にァガロビオース、 ァガロテトラオース、 ァガ口へキサ オース等のァガロオリゴ糖が含まれていた。
2 OmM クェン酸処理物は 350分加熱までァガロオリゴ糖の含量が増 加し、 それ以後はほぼ一定になった。
5 OmM クェン酸処理物は 200分加熱までァガロオリゴ糖の含量が増 加し、 それ以後はほぼ一定になった。 1 0 OmM クェン酸処理物は 1 60分加熱までァガロオリゴ糖の含量が 増加し、 それ以後はほぼ一定になった。
高濃度のクェン酸で処理した試料ほど最終的なァガ口才リゴ糖の含量は高 かった。
実施例 8— (2) と同様の順相 HP LCで各試料を分析したところ、 薄層 クロマトグラフィーと同様の結果が得られた。 ただし、 l O OmM クェン 酸処理物には 5 OmM クェン酸処理物よりも多量の不純物が含まれており、 加熱時間と共に不純物は増加した。
実施例 1 0
(1) 実施例 3— (1) で調製したァガロビオースを 0. 05mM、 0.
1 mM、 0. 2mM、 0. 4mM、 0. 6 mM、 0. 8 mM、 ImMとなる ように溶解した。 各試料 1 μ 1をシリカゲル 60シート F 254にスポットして クロ口ホルム： メタノール：酢酸 = 7 : 2 : 2の溶媒で 3回展開し、 オルシ ノール一硫酸法で発色させた。 発色させたシートは FOTODYNE FOTO/Analyst Archiver Ecripse (セントラル科学貿易社販売） により画像データとして取 込み、 この画像データを画像解析ソフト 1- D Basic (ァドバンスド ァメ リ カン バイオテクノロジー社製） により画像処理を行い、 各濃度のァガロビ オースのスポッ トの強度を数値化して検量線を作製した。
検量線のグラフを図 1 7に示す。 すなわち、 図 1 7はァガロビオースの検 量線を示す図であり、 各濃度のァガロビオースに対するスポッ トの強度をグ ラフとし、 横軸はァガロビオースの濃度 （ ） 、 縦軸はスポットの強度を示 す。 また、 図 1 7中の計算式はスポッ トの強度 （y) とァガロビオースの濃 度 （X) の関係を表したものであり、 ァガロビオースの濃度が未知の試料に おいて、 スポットの強度を得ることにより計算式からァガロビオースの濃度 が算出される。
また、 同様にして実施例 5で得たァガロテトラオース、 ァガ口へキサォ一 ス、 ァガロォクタオースの検量線を作成した。
(2) 市販の寒天 （ァガ一 ノーブル） 0. 2 gを 9 Om 1の水に懸濁し、 電子レンジで加熱溶解し室温付近まで冷却した。 ここに 1M HC 1あるい は 1M クェン酸を 1 Om 1加え、 それぞれ 0. 2%寒天 0. 1 M HC 1 溶液および 0. 2%寒天0. 1M クェン酸溶液を調製した。 この溶液を 9 0°Cで加熱し、 5分、 1 0分、 20分、 30分、 1時間、 2時間、 4時間、 8時間、 21時間の各時間でサンプリングした。 各試料は実施例 10— (1) に記載の方法で薄層クロマトグラフィーを行い、 スポッ トの強度を求 めてァガロビオースの濃度を算出した。 なお、 各試料はァガロビオースの濃 度が 0. 05mMから 1 mMの範囲に収まるように適宜希釈した。
図 1 8、 図 1 9に 0. 2%寒天0. 1M HC 1溶液および 0. 2 %寒天 0. 1M クェン酸溶液における加熱時間とァガロビオースの生成量との関 係を示す。 すなわち、 図 1 8は、 0. 2%寒天の 0. 1M HC 1溶液にお ける加熱時間とァガロビオースの生成量との関係を示す図であり、 図 1 9は 0. 2%寒天の0. 1M クェン酸溶液における加熱時間とァガロビオース の生成量との関係を示す図である。 図 1 8、 図 1 9において、 横軸は加熱時 間 （時間） 、 縦軸はァガロビオースの濃度 （ ） を示す。
図 1 8に示されるように、 0. 2%寒天の 0. 1M HC 1溶液では、 1 時間でァガロビオースの濃度は最高に達し、 それ以降減少が認められた。 ま た、 図 1 9に示されるように、 0. 2%寒天の 0. 1M クェン酸溶液では、 8時間までァガロビオースの濃度は徐々に増加し、 21時間目で減少が認め られた。 なお、 0. 2%寒天の0. 1M HC 1溶液における 5分加熱試料 および 0. 2%寒天の 0. 1M クェン酸溶液における 5、 1 0、 20分加 熱試料においてはァガロビオースの濃度は検出限界以下であった。
(3) 5、 50、 50 OmMのクェン酸に 10%になるようにァガ一 ノ 一ブルを懸濁し、 65、 80、 95 °Cで加熱し、 加熱後、 30分、 1、 2、 4、 8、 24時間でサンプリングし、 ァガロオリゴ糖の生成量を実施例 1 0 一 （1) 記載の方法で測定した。
その結果、 ァガーを 5 mMクェン酸に溶解した場合は、 80°Cで若干のァ ガロオリゴ糖の生成が見られたが、 65 °Cではァガロオリゴ糖はほとんど生 成されなかった。 95°Cではァガロビオースは 8〜 24時間で高い値を示し、 ァガロテトラオースも 8〜24時間で高い値を示した。 ァガーを 5 OmMク ェン酸に溶解した場合は、 65°Cではァガロオリゴ糖はほとんど生成されな かった。 80°Cではァガロビオースは 24時間で高い値を示し、 ァガロテト ラオース、 ァガ口へキサオース、 ァガロォクタオースは 4〜 8時間で高い値 を示した。 95°Cでは、 ァガロビオースは 24時間で高い値を示し、 ァガロ テトラオース、 ァガ口へキサオース、 ァガロォクタオースは 4〜8時間で高 い直を示した。 ァガーを 50 OmMクェン酸に溶解した場合は、 65°Cでは 4〜24時間で若干のァガロオリゴ糖の生成が見られた。 80°Cではァガロ ビオースは 2〜 24時間で高い値を示し、 ァガロテトラオース、 ァガ口へキ サオースは 1〜 6時間で高い値を示した。 ァガロォクタオースは 1〜 2時間 で高い値を示した。 95°Cでは、 ァガロビオースは 1〜24時間で高い値を 示し、 ァガロテトラオースは 1〜2時間で高い値を示した。 ァガ口へキサォ ース、 ァガロォクタオースは 30分から 1時間で高い値を示した。
50 OmMクェン酸による加水分解の例を図 20およぴ図 21に示す。 す なわち、 図 20は 50 OmMクェン酸、 80°Cにおけるァガロオリゴ糖生成 を示す図であり、 図中縦軸はァガロオリゴ糖生成量 （丸印：ァガロビオース、 三角印：ァガロテトラオース、 四角印：ァガ口へキサオース、 X印：ァガロ ォクタオース） 、 横軸は時間を示す。 また、 図 2 1は 50 OmMクェン酸、 95°Cにおけるァガロオリゴ糖生成を示す図であり、 図中縦軸はァガロオリ ゴ糖生成量 （丸印：ァガロビオース、 三角印ァガロテトラオース、 四角印： ァガ口へキサオース、 X印：ァガロォクタオース） 、 横軸は時間を示す。
(4) 50、 500、 100 OmMの酢酸を使用し、 実施例 1 0— (3) と同様の方法で、 ァガロオリゴ糖の生成を測定した。
その結果、 ァガーを 5 OmM酢酸に溶解した場合は、 80°Cで若干のァガ 口オリゴ糖の生成が見られたが、 65°Cではァガロオリゴ糖はほとんど生成 されなかった。 ァガーを 50 OmM酢酸に溶解した場合は、 65°Cではァガ 口オリゴ糖はほとんど生成されなかった。 80°Cおよび 95°Cでは若干のァ ガロオリゴ糖の生成が見られた。 ァガーを 100 OmM酢酸に溶解した場合 は、 65°Cではァガロオリゴ糖はほとんど生成されなかった。 80°Cではァ ガロビオースは 24時間で高い値を示し、 ァガロテトラオース、 ァガ口へキ サオース、 ァガロォクタオースは 8時間で若干生成されていた。 95°Cでは、 ァガロビオースは 8時間で高い値を示し、 ァガロテトラオース、 ァガ口へキ サォ一ス、 ァガロォクタオースも 8時間で高い値を示した。
(5) 60、 600、 1 20 OmMの乳酸を使用し、 実施例 1 0— （3) と同様の方法で、 ァガロオリゴ糖の生成を測定した。
その結果、 ァガーを 6 OmM乳酸に溶解した場合は、 95°Cで若干のァガ 口オリゴ糖の生成が見られたが、 65、 80°Cでは、 ァガロオリゴ糖はほと んど生成されなかった。 ァガーを 60 OmM乳酸に溶解した場合は、 80°C ではァガロビオースは 8〜 24時間で高い値を示し、 ァガロテトラオース、 ァガ口へキサオースは 4〜8時間で高い値を示した。 ァガロォクタオースは
4時間で高い値を示した。 95°Cでは、 ァガロビオースは 4〜8時間で高い 値を示し、 ァガロテトラオース、 ァガ口へキサオースは 2〜6時間で高い値 を示した。 ァガーを 1 20 OmM乳酸に溶解した場合は、 80°Cではァガロ ビオースは 4〜24時間で高い値を示し、 ァガロテトラオース、 ァガ口へキ サォ一スは 2〜6時間で高い値を示した。 ァガロォクタオースは 2時間で高 い値を示した。 95°Cでは、 ァガロビオースは 2〜8時間で高い値を示し、 ァガロテトラオース、 ァガ口へキサオースは 1〜 2時間で高い値を示した。
1 20 OmM乳酸による加水分解の例を図 22および図 23に示す。 すな わち、 図 22は 1 20 OmM乳酸、 80 °Cにおけるァガロオリゴ糖生成を示 す図であり、 図中縦軸はァガロオリゴ糖生成量 （丸印：ァガロビオース、 三 角印ァガロテトラオース、 四角印：ァガ口へキサオース、 X印：ァガロォク タオース） 、 横軸は時間を示す。 また、 図 23は 1 20 OmM乳酸、 95 °C におけるァガロオリゴ糖生成を示す図であり、 図中縦軸はァガロオリゴ糖生 成量 （丸印：ァガロビオース、 三角印：ァガロテトラオース、 四角印：ァガ 口へキサオース、 X印：ァガロォクタオース） 、 横軸は時間を示す。
(6) 20、 200、 100 OmMのリンゴ酸を使用し、 実施例 10— (3) と同様の方法で、 ァガロオリゴ糖の生成を測定した。
その結果、 ァガーを 2 OmMリンゴ酸に溶解した場合は、 95°Cで若干の ァガロオリゴ糖の生成が見られたが、 65、 80。Cでは、 ァガロオリゴ糖は P TJP9 05
52 ほとんど生成されなかった。 ァガーを 20 OmMリ ンゴ酸に溶解した場合は、 65。Cでは 24時間で若干のァガロオリゴ糖の生成が見られた。 80°Cでは ァガロビオースは 8〜 24時間で高い値を示し、 ァガロテトラオースは 4〜 8時間で高い値を示した。 ァガ口へキサオースは 4時間で高レ、値を示した。 ァガロォクタオースは 4時間で高い値を示した。 95。Cでは、 ァガロビオー スは 4〜 8時間で高い値を示し、 ァガロテトラオースは 4時間で高い値を示 した。 ァガーを 100 OmMリンゴ酸に溶解した場合は、 65°Cでは 24時 間で若干のァガロオリゴ糖の生成が見られた。 80°Cではァガロビオースは 2〜24時間で高い値を示し、 ァガロテトラオースは 2〜 6時間で高い値を 示した。 ァガ口へキサオース、 ァガロォクタオースは 2時間で高い値を示し た。 95°Cでは、 ァガロビオースは 1〜8時間で高いい値を示し、 ァガロテ トラオースは 1〜2時間で高い値を示した。 ァガ口へキサオース、 ァガロォ クタオースは 1時間で高い値を示した。
1 00 OmMリンゴ酸によるァガーの加水分解の例を図 24および図 25 に示す。 すなわち、 図 24は 1 00 OmMリンゴ酸、 80°Cにおけるァガロ オリゴ糖生成を示す図であり、 図中縦軸はァガロオリゴ糖生成量 （丸印：ァ ガロビオース、 三角印：ァガロテトラオース、 四角印：ァガ口へキサオース、 X印：ァガロォクタオース） 、 横軸は時間を示す。 また図 25は 1 000m Mリンゴ酸、 95 °Cにおけるァガロオリゴ糖生成を示す図であり、 図中縦軸 はァガロオリゴ糖生成量 （丸印：ァガロビオース、 三角印ァガロテトラオ一 ス、 四角印：ァガ口へキサオース、 X印：ァガロォクタオース） 、 横軸は時 間を示す。
(7) 1 00、 200、 300、 400、 500、 600、 700、 80 0、 900、 1 00 OmMのリンゴ酸に、 1 0 %になるようにノーブルァガ —を懸濁し、 70、 80、 90°Cで加熱した。 加熱後、 30分、 1、 2、 3、
4、 8、 24時間でサンプリングし、 ァガロォリゴ糖の生成を実施例 1 0― (3) と同様の方法で測定した。
30 OmM以上のリンゴ酸濃度では、 70°Cでも、 8時間以上で高いァガ 口オリゴ糖の生成が見られた。 1 00 OmM、 70°Cでの加水分解の例を図 2 6に示す。 すなわち、 図 2 6は、 1 0 0 O mMリンゴ酸、 7 0。Cにおける ァガロオリゴ糖の生成を示す図であり、 図中、 縦軸はァガロオリゴ糖生成量
(丸印： ァガ口ビオース、 三角印：ァガロテトラオース） 、 横軸は時間を示 す。
上記実施例 1 0— ( 3 ) 〜 （7 ) の結果より、 ァガロオリゴ糖の製造に用 いる酸としてはクェン酸、 乳酸、 リンゴ酸、 酸の濃度は数十 mMから数 M、 加熱温度は 7 0〜9 5 °C、 加熱時間は数十分から 2 4時間が好ましい。
( 8 ) F 一キット乳糖 Zガラク トース （ベーリ ンガーマンハイム株式会社 製コード 1 7 6 3 0 3 ) を用い、 ァガロビオースに ]3—ガラク トシダーゼを 作用させ、 生成されるガラク トースの濃度を測定する方法でァガロビオース の定量を行った。
キッ 卜の使用方法に従い定量を行ったが、 /3—ガラク トシダーゼの反応は、
3 7 °C、 1時間に変更した。 検量線はラク ト一スを用いて作製し、 ラタ ト一 ス換算のモル濃度 （mM) を算出した後、 ァガロビオース濃度 （m g Zm 1 ) に変換した。
上記実施例で調製したァガロビオース、 ァガロテトラオース、 ァガ口へキ サオース、 ァガロォクタオースを用い、 上記方法で定量を試みた。 その結果、 ァガロビオースは、 計算値と実測値が一致した。 その一方で、 ァガロテトラ オース、 ァガ口へキサオース、 ァガロォクタオースは、 上記方法では実質的 に検出されなかった。 つまり、 ァガロビオース以外のァガロオリゴ糖は、 上 記検出方法では実質的に検出されないことが明らかとなり、 上記方法を用い ることにより、 ァガロオリゴ糖中のァガロビオースの濃度測定を行うことが できることが明らかになった。
( 9 ) 市販の寒天 （伊那寒天タイプ S— 7 ：伊那食品工業社製） 1 0 0 g および H型の強陽イオン交換樹脂 （ダイヤイオン S K 1 0 4 H ：三菱化成 製） 1 0 gを 9 5 °Cの脱塩水 9 0 0 g中で混合し、 9 5 °Cで撹拌しつつ 1 8 0分間、 寒天の酸分解を行った。 ついで、 室温まで冷却し、 活性炭 1 %W/ W、 およびセライ ト 5 4 5 (セライ ト社製） 0 . 5 %W/Wボディフィード でろ過し、 ろ液を調製した。 実施例 8-— （2) と同様の順相 HP LCで調製したろ液を分析し、' ァガロ オリゴ糖としてァガロビオース、 ァガロテトラオース、 ァガ口へキサオース、 ァガロォクタオースが主成分として生成していることを確認した。
該ろ液は、 pH2. 4、 酸度 1. 7、 ブリックス 9. 4%、 上記実施例 1 0 一 (8) 記載の F—キット乳糖/ガラク トースを用いて測定したァガロピオ 一ス量は 7. 4%であった。
(1 0) 脱塩水 100 g中へ、 H型の強陽イオン交換樹脂 （ダイヤイオン SK104H) を 1 8. 5 g入れ、 95 °Cで撹拌した。 寒天 （伊那寒天タイ プ S— 7) は以下、 10分間隔で、 各 10 gを 5回添加し、 ついで、 各 1 5 gを 2回添加し、 さらに、 各 20 gを 3回添カ卩し、 最後に 30 gを添加した。 寒天の合計添加量を 1 85 gとした後、 95°Cで 1 50分撹拌し、 ついで、 室温まで冷却した。 デカンテーシヨンにより樹脂と液を分けた後、 分離液へ 活性炭 3 % W/W、 およびセライ ト 545 (セライ ト社製） 0. 5 %W/W ボディフィードでろ過し、 ろ液を調製した。
実施例 8— (2) と同様の順相 HP LCで調製したろ液を分析し、 ァガロ オリゴ糖としてァガロビオース、 ァガロテトラオース、 ァガ口へキサオース、 ァガロォクタオースが主成分として生成していることを確認した。
該ろ液は pH 1. 2、 酸度 1 1. 9、 ブリックス 64 %、 上記実施例 1 0― (8) 記載の F—キット乳糖/ガラク トースを用いて測定したァガロビオー ス量は 24. 4%であった。
(1 1) 市販の寒天 （伊那寒天タイプ S— 7) 1 00 gを用い、 種々のリ ン酸濃度の脱イオン水で 1 リットルにあわせ、 95°Cで撹拌しつつ寒天液化 を行った。
また、 1 %W/Vクェン酸濃度の脱イオン水 1 リットルに合わせたものを 用いリン酸と同様にして寒天液化を行った。 液化とはその氷結点においても ゲル化しない状態を意味し、 その状態になる時間 （液化時間） を測定した。 また、 液化時およびその後のァガロビオース生成量を上記実施例 10 _ (8) 記載の F—キット乳糖 Zガラク トースを用いて測定した。
その結果を表 6、 表 7に示す。 表 6 リン酸濃度 液化時間 95 °C ァガロビオース
(分） 保持時間 (g/リ ッ 卜ノレ）
(分）
0. 2 50 1 50 2. 57
1 80 3. 80 300 7. 97
0. 3 20 1 20 4. 88
1 80 7. 04 300 3. 90
0. 5 0 1 1 0 6 09
1 80 8 48 300 2 1 40
0 90 90 7 58
1 20 8 80
表 7 クェン酸濃度 液化時間 95 °C ァガロビオース
(分） 保持時間 ( g /リ ッ 卜ノレ）
(分）
1. 0 90 90 0. 95
1 20 3. 40
1 50 4. 09
300 5. 70
360 14. 80
実施例 1 1
(1) 市販の寒天 （伊那寒天タイプ S_ 7、 伊那食品工業社製） 1 50 g、 食添用クェン酸 （無水） （三栄源エフ 'エフ · アイ社製） 1 5 gを脱イオン 水で 1. 5リツトルに合せ、 品温 92°Cに上昇させた後、 92〜95°Cに、 撹拌下に 1 30分保持した。 ついで、 室温まで冷却し、 セライ ト 545 (セ ライ ト社製） の 0. 5%ボディフィードでろ過し、 ろ液 （寒天分解オリゴ糖 溶液） を調製した。 実施例 8— （2) と同様の順相 HP LCで調製したろ液 を分析し、 糖化合物としてァガロビオース、 ァガロテトラオース、 ァガ口へ キサオース、 ァガ口才クタオースが主成分として生成していることを確認し た。
該ろ液の p Hは約 2. 6、 酸度は 0. 92、 ブリックスは 9. 2 %、 実施 例 1 0— （ 8 ) 記載の方法で測定したァガロビオース生成量は 43. 1 mM であった。
(2) 実施例 1 1一 （1) にて調製したろ液 （寒天分解オリゴ糖溶液） を 20倍に希釈し、 酸味料、 甘味料、 フレーバーを添加し、 ァガロビオース 2. 25 mMの清涼飲料を製造した。 その配合表を表 8および表 9に示す。 すなわち表 8、 はグレープラルーツ 味清涼飲料の配合表であり、 表 9はシソ味清涼飲料の配合表である。 - それぞれの表に示す原料を水に添加し、 溶解して清涼飲料を調製し、 20 0 m 1空缶に分注した。 表 5に示す配合の清涼飲料はカーボネーショ 0. 8 k g/c m2 ( 20 °C) のガス圧となる炭酸飲料とした。
それぞれの飲料の分析値を表 8、 表 9の下欄に示す。
表 8 寒天分解ォリゴ糖溶液 50 m 1 1/7グレープフノレーッ 20
ビタミン C 0 2 g クェン酸 0 2 g マノレ トース 25 g グレープフルーツフレーバ'
脱塩水 残余 計 1000 m 1
PH 3. 2
酸度 * 0. 23
ブリックス度 2. 2 酸度 * : 0. 1 N N a OH m l 0m l (以下同様) 表 9 寒天分解オリゴ糖溶液 50 m 1
計
シソエキス 20 g ビタミン C 0, 2 g クェン酸 0 2 シソフレーバー 0 5 脱塩水
000 m 1
PH 2. 9
酸度 * 0. 1 0
プリックス度 0. 6
それぞれの本発明品の炭酸飲料についてパネラー 1 0名で 5段階 （5良、 1悪） の官能評価を行った。 対象は寒天分解オリゴ糖溶液の代わりに酸度を 同様にしたタエン酸液で置換したものを用いた。
グレープフルーツ味の官能評価の平均値を表 10に、 シソ味の官能評価の 平均値を表 1 1に示す。
P
59 表 10 本発明品 対 照 舌ざわり感
まろやかさ 4. 6 3. 1
なめらかさ 4. 8 3. 0 味のバランス 4. 5 2. 9 食感の総合 4. 6 3
本発明 対 照 舌ざわり感
まろやかさ 4. 5 2. 5
なめらかさ 4. 3 2. 4
味のバランス 4. 2 2. 5
食感の総合 4. 3 2. 4
本発明品はそれぞれ対照に比べ、 飲料の味のバランスが調い、 舌ざわり感 がまろやかで、 なめらかな感じに仕上っているとの評価で新規な味覚の飲料 となった。 また、 カーボネーシヨン前の清涼飲料も、 それぞれ上記と同様の 新規な味覚の本発明品の飲料であった。 (3) 上記表 8、 表 9記載の清涼飲料にエチルアルコール 6% V V、 ま たは 8% V/Vに成るようにエチルアルコールを加えて調製し、 2 Q Om 1 空缶に分注した。 ついで、 該アルコール飲料をカーボネ一シヨンして 0. 8 k g/cm2 (20°C) のガス圧となる本発明の清涼炭酸アルコール飲料を製 造した。
本発明の清涼炭酸アルコール飲料は寒天分解ォリゴ糖溶液を含有しない対 照と比べ、 飲料の味のバランスが調い、 舌ざわり感がまろやかで、 なめらか な感じに仕上っているとの評価で新規な味覚の清涼炭酸アルコール飲料とな つた。
実施例 12
(1) 寒天のクェン酸分解物を含有する飲料を下記のように調製した。 そ の配合表を表 1 2に示す。 すなわち、 表 12の本発明品 1は実施例 1 1一 (1) にて調製したろ液 （寒天オリゴ糖液） を 0. 1%WZVおよび寒天 (ウルトラ寒天 AX— 30 ：伊那食品工業社製） 0. 25%WZV、 クェン 酸 0. o yo/oWZvを用いた。 本発明品 2は寒天オリゴ糖液は添加せず、 寒 天 0. 25%W/V、 クェン酸 0. 08%W/Vを用いた。 本発明品 1およ び 2はそれぞれ寒天を温水で溶解後、 他の材料を混合し、 酸性下で 93°C、 10秒間、 93 °C未満〜 80 °Cで 20分間、 さらに 80 °C未満〜 75 °Cで 1 5分間の加熱を行い寒天のクェン酸分解物を含有する飲料を製造した。 一方、 対照は本発明品 2と同配合であるが 93 °C、 10秒の加熱条件で行った。 それぞれのとろみのついた寒天クニン酸分解物含有飲料 （本発明品 1およ び 2) についてパネラー 10名で 5段階 （5良、 1悪） の官能評価を行った。 官能評価の平均値を表 13に示す。 表 1 2
計 本発明品 1 本発明品 2 寒天 （g) 2 5 2.
寒天オリゴ糖液 （m 1 ) 1 0 0
1 Z7グレープフルーツ果汁 （g 5 1.
グラニュー糖 （g) 66, 0 66.
クェン酸 （g) 0, 7 0.
タエン酸ナトリウム （g) 0 5 0.
香料 (g) 2 0 2.
脱塩水 残余
000m l 1 000m l pH 3. 68 3. 67 酸度 * 1. 53 1. 57 ブリックス度 7. 5 7. 4 ァガロビオース （mM) * * 0. 06 0. 02 ァガロビオース （mM) * * ：実施例 1 0— （8) 記載の方法で測定
表 1 3 本発明品 1 本発明品 2 対 照 舌ざわり感
まろやかさ 4. 4 4. 1 3. 6 なめらかさ 4. 5 4. 3 3. 8 味のバランス 4. 4 4. 2 3. 6 食感の総合 4. 5 4. 3 3. 7 本発明品 1および 2は対照に比べ、 飲料の味のバランスが調い、 とろみも ほどよく、 舌ざわり感がまろやかで、 なめらかな感じに仕上っているとの評 価で新規な味覚の飲料となった。 また添加クェン酸存在下の加熱処理により、 本発明品 1および 2において抗酸化用オリゴ糖、 ァガロビオースの生成が認 められ、 新規な抗酸化用オリゴ糖含有飲料が提供された。
また、 80°C未満〜 75°Cで 1 5分間の加熱条件を、 75°Cで 1 日、 8 5 °Cで 5分間、 1 03 で 5分間、 1 22でで 45秒間にそれぞれ置き換え てァガロビオースの生成量を実施例 10— ( 8 ) 記載の方法で測定したとこ ろ、 それぞれ 0. 03mM、 0. 02mM、 0. 04111^ ぉょび0. 05m Mであり、 加熱処理により、 ァガロビオースが生成すること、 また、 加熱条 件が強くなるほど、 ァガロビオース生成が増加することも確認された。
(2) 実施例 1 2— (1) 記載の本発明品 1、 本発明品 2および対照の飲 料にエチルアルコール 2 % V Z V、 または 4 % V Vになるようにェチルァ ルコ一ルを加え、 その分残余の脱塩水を減少させてアルコール飲料を調製し た。
本発明品 1、 本発明品 2にそれぞれ対応するアルコール飲料は対照のアル コール飲料に比べ、 飲料の味のバランスが調い、 とろみもほどよく、 舌ざわ り感がまろやかで、 なめらかな感じに仕上っているとの評価で新規な味覚の 飲料となった。 また、 上記本発明のアルコール飲料の凍結物は、 シャ一べット状の良好な 食感を示した。
実施例 1 3
(1) 市販の寒天 （ァガー ノーブル） を 1%濃度になるように 0. 1 N 塩酸に懸濁し、 37°Cで 5時間、 16時間または 48時間処理した。 この処 理液を蒸留水で 1 0倍希釈し、 実施例 9に記載の薄層クロマトグラフィーで 分析したところ、 5時間処理でァガロオリゴ糖の生成がわずかに認められ、 1 6時間処理では 5時間処理よりも増加し、 48時間処理ではさらに増加し た。
(2) 市販の寒天 （ァガー ノーブル）を 1%濃度になるようにリン酸緩衝 食塩水または蒸留水に懸濁し、 1 21°Cで 4時間加熱した。 この加熱処理物 を蒸留水で 1 0倍希釈し、 実施例 9に記載の薄層クロマトグラフィーで分析 したところ、 リン酸緩衝食塩水中で加熱処理した試料には痕跡量の、 蒸留水 中で加熱処理した試料にはそれよりも明らかに多量のァガロオリゴ糖の生成 が認められた。 なお、 前者の加熱処理後の pHは約 7、 後者のそれは約 5であ り、 室温まで冷却すると前者はゲル化したが後者はゲル化しなかった。
実施例 14
(1) 寒天 （ァガー ノーブル）を 1 0%濃度となるように 0. I N HC 1に懸濁し、 1 00°Cで 1 9分間加熱した。 水で平衡化したトヨパール （T OYOPEARL) HW40 C (東ソ一社製） カラム （4. 4 c mX 85 c m) に上記試料 1 0m 1をアプライし、 毎分 1. 4m lの流速で水を移動相 としてゲルろ過クロマトグラフィーを行った。 溶出する物質は示差屈折計で 検出し、 7m lずつ分取した。
溶出時間 406分、 435分、 47 1分および 524分にピークが認めら れ、 実施例 9に記載の薄層クロマトグラフィーで各ピークに対応する画分を 分析したところ、 これらは順にァガロォクタオース、 ァガ口へキサオース、 ァガロテトラオースおよびァガロビオースであることが明らかになった。 こ れらの画分を凍結乾燥して 3 Omgのァガロォクタオース、 1 0 Omgのァ ガ口へキサオース、 1 5 Omgのァガロテトラオースおよび 14 Omgのァ ガロビオースを得た。 ―
(2) 実施例 14— (1) で得たァガロビオース、 ァガロテトラオースの 各 1 00 mM水溶液 25 μ 1に 100 m 1の L—システィン水溶液 50 μ 1 を加え、 リン酸緩衝食塩水 925 μ 1 を加え、 37°Cで 1時間または 1 6時 間反応させた。 同様の反応を L—システィン水溶液の代りに同濃度の Lーリ ジン水溶液においても行った。
各反応試料 1 μ 1をシリカゲルシート 60 F 254にスポットして 1ーブタノ ール：ェタノール：水 = 5 ： 5 ： 1で展開し、 オルシノール硫酸法で検出し た。
この結果、 L—システィンの 1時間反応試料において、 ァガロビオース、 ァガロテトラオースのスポットが消失していた。 また、 L—システィン、 L —リジンの 16時間反応試料においては、 どの試料もァガロビオース、 ァガロ テトラオースのスポットが消失していた。
実施例 8— （2) と同様の順相 HP LCで各試料を分析したところ、 薄層 クロマトグラフィーと同様の結果が得られた。
(3) 実施例 14一 (2) で調製した各反応試料 1 0 1を 96穴マイク ロタイタ一プレートのゥエルに入れ、 実施例 2— （1) 記載の方法で HL— 60に対するがん細胞増殖抑制活性を測定した。
その結果、 ァガロビオース、 ァガロテトラオースのスポットが消失した試 料において活性の消失が見られた。 すなわち、 ァガロビオース、 ァガロテト ラォースと L—システィンの 1時間反応試料およびァガ口ビオース、 ァガロ テトラオースと L一システィン、 L—リジンの 1 6時間反応試料において、 同濃度のァガロビオース、 ァガロテトラオースと比較して、 細胞増殖抑制活 性が約 1 / 1 0となっていた。
実施例 1 5
(1) κ一力ラゲナン （シグマ社製、 C— 1 263) 2. 5 gを 5 Om l の 0. 1 N HC 1に懸濁し、 1 00°Cで 1 6分間加熱して溶解した。 室温 まで冷却して N a OHで pH中性付近まで中和した後、 コスモナイスフィルタ 一でろ過し、 以下の順相 HH P L Cで分離した。 カラム—： PALPAK type S (4. 6 X250匪 、 宝酒造社製、 CA8300) 溶媒 A： 9 0 %ァセトニトリル水溶液
溶媒 B ： 5 0%ァセトニトリル水溶液
流速： 1 m l /分
溶出：溶媒 A ( 1 0分間） →溶媒 A から溶媒 Bの直線濃度勾配 （40 分間） →溶媒 B ( 1 0分間）
検出： 2 1 5 nm における吸光度
カラム温度： 40°C
試料アプライ量： 5 0 μ 1
順相 HP LCでの分離図を図 2 7に示す。 すなわち、 図 2 7は κ—力ラゲ ナン酸分解物の順相 HP LCクロマトグラムを示す図であり、 横軸は保持時 間 （分） 、 縦軸は 2 1 5 nmにおける吸光度を示す。
各溶出ピークを分取し、 減圧下乾固した後、 Ι Ο Ο μ 1の水に溶解した。 各画分をろ過滅菌し、 実施例 2— (1) 記載の方法で HL— 6 0細胞に対す る細胞増殖阻害活性を測定した。 その結果、 2 7. 7 9 7分、 3 3. 90 5
〜34. 7 84分、 3 6. 22 6〜3 6. 6 54分の各ピーク由来の画分を 添加した区分において、 アポトーシス小体が観察され、 対照の水添加区分に 比べて 5 9 0 nmにおける吸光度が低く、 細胞増殖が阻害されていた。 溶出時間 2 7. 7 9 7分のピーク由来の画分を上記 HP LCの条件で 1 2 回分離して集めて減圧下乾固し、 アポトーシス誘発性および制がん性物質を 得た。
(2) 実施例 1 5— ( 1) 記載のアポトーシス誘発性および制がん性物質 の質量分析を DK 3 0 2質量分析計 （日本電子社製） を用いて行った。 ダリ セロールをマトリックスとして用い、 ネガティブイオンモードで測定した。 F AB- S
m /z 403 [M — H] -
495 [M+グリセロール一 H] - その結果を図 2 8に示す。 すなわち、 図 2 8はアポトーシス誘発性および 制がん性物質のマススペク トルを示す図であり、 横軸は mZz値、 縦軸は相 対強度を示す。
実施例 1 5— (1) で得たアポトーシス誘発性および制がん性物質の核磁 気共鳴スペク トルを測定した。 核磁気共鳴装置は J NM— A500 (日本電 子社製） を用いた。
図 29にアポトーシス誘発性および制がん性物質の1 H— NMRスぺク トル を示す。 図 29において、 横軸は化学シフト値 （p pm) を、 縦軸はシグナ ルの強度を示す。
これらの質量分析、 — NMRの解析結果より、 実施 1 5— (1) 記載の アポトーシス誘発性および制がん性物質は κ—力ラビオース [j3— D—ガラ ク トビラノシル一4ースルフェート一 （1→4) —3， 6—アンヒ ドロ一 D
—ガラタ トース] と同定された。
以上より、 実施例 1 5_ (1) で得たアポトーシス誘発性および制ガン性 物質は κ—力ラビオースであることが明らかとなった。
(3) 実施例 1 5— (1) で得た κ一力ラビオースを 1. 56mMとなる ように水に溶解し、 10 μ 1を 96穴マイクロタイタ一プレートのゥエルに 入れ、 実施例 2— (1) 記載の方法でアポト一シス誘発活性とがん細胞増殖 抑制活性を測定した。 その結果、 光学顕微鏡観察においてアポトーシス小体 が見られ、 対照の水添加区分に比べ、 κ一力ラビオース添加区分では細胞増 殖が約 70%抑制されていた。 よって、 Κ一力ラビオースは 1 56 μΜで Η L— 60細胞にアポトーシスを誘発し、 細胞増殖を抑制した。
実施例 1 6
(1) 市販の寒天粉末 （和光純薬社製） 4. 58を0. 1 Nの塩酸 1 50 m l に懸濁し、 電子レンジで加熱溶解し、 溶解液を沸騰湯浴上で 10分間保 持した。 この加熱処理後室温になるまで加熱処理寒天溶液を放冷し、 遠心分 離により不溶物を除去した。 つぎに、 遠心上清を回収し、 1 Nの水酸化ナト リウムで pH6. 8に調整した。 この遠心上清 1 5 Om 1に対し同量の酢酸ェ チルを添加後、 強く撹拌し、 酢酸ェチル相と水相に分配した。 分配された水 相をエバポレーターで乾固し、 再度 1 5 Om 1の水に溶解した、 溶解時の不 溶物を遠心分離により除去し上清を得た。 また酢酸ェチル相は、 エバポレー ターで乾固-し、 10 Om 1のイオン交換水に溶解し、 1 Nの水酸化ナトリウ ムで pHを 6. 5に調整した。
酢酸ェチル相、 水相をポアサイズ 0. 2 μπιのフィルター （コ一二ング社 製） でろ過滅菌した後、 水で 1 0、 20、 30倍に希釈し、 実施例 2—
( 1 ) と同じ方法により H L— 60細胞に対する増殖抑制活性を測定した。 その結果、 水相には増殖抑制活性が認められたが、 酢酸ェチル相には増殖抑 制活性が認められなかった。
調製した水相溶液 5 Om 1をセル口ファイン GC L— 25カラム （41 X
905 mm) によりゲルろ過した。 溶出液としては 10 %エタノール含有の 0. 2M Na C l。 図 30に溶出図を示す。 すなわち、 図 30はセルロフ ァイン GCL— 25によるゲルろ過の結果を示す図であり、 図中縦軸はフヱ ノール硫酸法により測定した溶出液中の糖含量 （吸光度 490 nm: 黒丸 印） 、 横軸は分画番号 （ 1分画 10 m 1 ) を示す。
各溶出画分をシリカゲルシ一ト 60 F 254 (メルク社製） に各 Ι μ ΐをスポ ットし、 1ーブタノ一ル：酢酸：水 =4 ： 1 ： 2で展開した後、 オルシノ一 ル試薬 [ 400 m gのオルシン一水和物 （和光純薬社製） を 22. 8 m 1の 硫酸に溶解し、 水を加えて 20 Omlとしたもの] を噴霧し、 1 50°Cに加熱 したホットプレート上で加熱し、 スポットを観察した。
上記の TLC分析によりスポットが確認された分画番号 40から 1 20を、 各々、 5本ずつまとめた後、 滅菌ろ過し、 HL— 60細胞に対する増殖抑制 活性を測定した。 その結果、 分画番号 86から 90に最も強い増殖抑制活性 が認められた。
(2) 分画番号 86から 88を回収し、 エバポレーターで乾固し、 0. 9 4 gの粉体を得た。 得られた粉体を 30 m 1の 90 %ェタノールに溶解し、 5 Cフィルター （ADVANTEC社製） で白色沈殿物を除去し、 セフアデックス
(Sephadex) LH— 20カラム （35 X 650mm) によりゲルろ過した。 溶出液としては 90%エタノールを用いた。 図 3 1に溶出図を示す。 すなわ ち、 図 3 1はセフアデックス LH— 20カラムによるゲルろ過の結果を示す 図であり、 図中、 縦軸はフエノール硫酸法により測定した溶出液中の糖含量 (吸光度 4-90 nm: 黒丸印） 、 横軸は分画番号 （ 1分画 1 0 m 1 )' を示す。 各溶出画分を上記と同様シリカゲルシートを用いて分析した。
TLC分析の結果検出された成分は、 分画番号 30から 35、 36から 4 0、 41から 44、 45から 48、 49から 53の 5グループに大別された。 各分画番号につき 1 25 μ 1を上記のグループにまとめ、 エバポレーターで 乾固し、 500 μ 1のイオン交換水に溶解し、 HL— 60細胞に対する増殖 抑制活性を測定した。
HL— 60細胞に対して最も強い増殖抑制活性のあった分画番号 36から 40をエバポレーターで乾固し、 5m 1の 1ーブタノ一ル：酢酸：水 =4 ： 1 ： 2に溶解し、 これを、 1—ブタノール：酢酸：水 =4 ： 1 ： 2で洗浄し たシリカゲル 60 F 254を充填したカラム （20 X 7 10mm) にアプライし た。 溶出液としては 1—ブタノール：酢酸：水 =4 ： 1 ： 2を用いた （1画 分 = 3 m 1 ) 。
各溶出画分を上記と同様に、 シリカゲルシートを用いて分析した。 その結 果、 検出された成分は、 分画番号 46から 52 (グループ 1) 、 60から 7
0 (グループ 2) 、 72から 84 (グループ 3) 、 86から 94 (グループ 4) 、 96から 1 20 (グループ 5) に大別された。
各グループをエバポレーターで乾固し、 各々 5m 1のイオン交換水に溶解 し、 ポアサイズ 0. 45 /zmのフィルター （IWAKI 社製） でろ過した。 得ら れた各溶液の H L— 60に対する増殖抑制活性を測定した。 その結果、 ダル
—プ 3、 4、 5に増殖抑制活性が認められた。
グループ 4、 5の構造については T LC分析および質量分析により、 ァガ ロビオースであることを確認した。
グループ 3の構造については、 質量分析および NMR分析によって、 β— D—ガラク トビラノシル一 （1→4) 一 3, 6—アンヒ ドロ一 2— 0—メチル
—L—ガラク トースであることが確認された。 図 32は、 j3—D—ガラク ト ビラノシルー （1→4) —3, 6—アンヒ ドロ一 2— 0—メチルー L—ガラク トースのマススペク トルを示す図であり、 横軸は m/z 値、 縦軸は相対強度 (%) を示す。 また、 図 33は ]3— D—ガラタ トピラノシル一 （1→4) —3, 6—アンヒ卞口一 2— 0—メチル一 L一ガラク トースの1 H— NMRスぺク ト ルを示す図であり、 横軸は化学シフト値 （p pm) 、 縦軸はシグナルの強度 を示す。
/3— D—ガラク トビラノシルー （1→4) 一 3， 6—アンヒ ドロー 2— 0 ーメチルー L—ガラク トースは、 ァガロビオースと同様、 HL— 60細胞に 対して強い細胞増殖抑制活性を有することが判明した。
実施例 1 7
( 1 ) 実施例 3で得た寒天由来糖類の過酸化脂質ラジカル産生抑制活性を 以下のようにして測定した。
スタフイロコッカス . ァウレウス （Staphylococcus aureus) 3 A (ナショ ナル ' コレクション ·ォブ ' タイプ . カルチヤ一、 NCTC 831 9) を 5m 1のブレインハートインフュージョン培地 （ディフコ社製、 0037— 1 7-8) に接種し、 37°Cで 1晚培養した。 遠心によって菌体を集め、 リ ン酸緩衝食塩水で 3回洗浄した後、 1 X 1 07コロニー形成単位 Zm 1になる ようにリン酸緩衝食塩水に懸濁した。 100 1の上記菌懸濁液、 1 00 μ
1の試料水溶液、 1 00 μ 1の 1 m g /m 1メ トへモグロビン （シグマ社製、 M9250) 水溶液および 600 μ 1のリン酸緩衝食塩水および 1 00 1 の 50mM tert—ブチルヒ ドロペルォキシド （片山化学社製、 03— 49 90) 水溶液を混合して 37 °Cで 30分間反応させた。 l rn lの2 XNMP 培地 [8 gのニュートリエントブロス （ディフコ社製、 0003— 01—
6) 、 5 gのトリプトン （ディフコ社製、 0 1 23— 1 7— 3) 、 5 gの N a C 1、 1 0 gのマンニトール （ナカライテスク社製、 2 1 3— 03) 、 0. 035 gのフエノールレッ ド （ナカライテスク社製、 268 - 07) を蒸留 水に溶解して 500m 1 とし、 N a OHでpH7. 4に調整後、 ろ過滅菌し たもの] を加えて反応を停止し、 NMP培地 （2 XNMP培地を滅菌水で 2 倍希釈したもの） で 3倍ずつ 1 2段階希釈したもの各 1 60 μ 1を 96穴マ イクロタイタ一プレートのゥエルに入れ、 37°〇で1晚培養した。 培地の色 を肉眼で観察し、 菌が生育して培地が赤色から黄色に変化したゥヱルが見ら れた試料を過酸化脂質ラジカル産生抑制活性を持つものとした。 その結果を表 14に示す。 表 14において、 +は菌の生育したゥエルが見 られた試料を、 一は菌の生育したゥエルが見られなかった試料を示す。 また、 表の最上列に示した濃度は tert—プチルヒ ドロペルォキシドおよび菌体を 3 7 °Cで 30分間反応させた反応液中の試料の濃度である。
表 14
0. 1 mM mM ァガロビオース + +
ァガロテトラオース +
ガラク トース
以上の結果、 ァガロビオースとァガロテトラオースに強い過酸化脂質ラジ カル産生抑制活性が見られた。 力ラビオースおよび 3， 6—アンヒ ドロー 2 —〇一メチル一 L—ガラク トースにも同様の活性を認めた。
(2) 市販の寒天 （伊奈寒天タイプ S— 7、 伊奈食品工業社製） 5 gを 5 OmMクェン酸 45 m 1に懸濁し、 93 °Cで 1 55分加熱し、 Na OHでpH 6に調製したサンプル （タエン酸処理物） と、 10 OmM塩酸 45m 1に懸 濁し、 95°Cで 1 3分加熱し、 N a OHで pH 6に調製したサンプル （塩酸処 理物） を水で 1、 2、 4、 8、 10、 100倍希釈し、 過酸化脂質ラジカル 生成抑制活性を実施例 1 7— (1) と同様の方法で測定した。 その結果、 ク ェン酸処理物、 塩酸処理物のどちらも 1 0倍希釈まで活性が確認され、 どち らも同等の過酸化脂質ラジカル産生抑制活性が確認された。
実施例 1 8
コンカナパリン A (C o n A) によるリンパ球幼若化反応に対するァガロ ビオースの抑制作用 d d Yマウス （日本 S L C ;ォス、 7週令） より脾臓を摘出し、 細かく粉 砕して 1 0%牛胎児血清 （ハイクローン） を含んだ R PM 1 - 1 6 0培地 (ギブコ） に懸濁して単細胞液を得た。 細胞浮遊液をプラスチックシャーレ に播種して炭酸ガス培養器で 3 7°C、 2時間培養し、 接着性細胞をシャーレ に接着させて除き、 非接着性細胞を脾臓リンパ球として用いた。 細胞濃度を
2 X 1 06細胞 Zm 1に調整し、 9 6ウェルマイクロタイタ一プレートに 2 0 0 μ 1 ゥエルで播種し、 対照群以外の各ゥヱルに、 各濃度のァガロビオー スを添加した。 さらに、 全てのゥエルに 5 μ gの C ο η Α (ナカライテス ク） を添加し、 炭酸ガス培養器で 3 7°C、 1 日間培養した。 培養後 1 μ C i の3 H—チミジンを各ゥヱルに加え、 さらに 1 日間培養して細胞への取込み量 を液体シンチレーシヨンカウンターで測定した。
その結果を図 3 4に示す。 すなわち、 図 3 4は C o n Aによるリンパ球幼 若化反応においてァガロビオース濃度と、 3H—チミジン取込み量との関係を 示す図であり、 横軸はァガロビオース濃度、 縦軸は3 H—チミジン取込み量 ( c p m) を示す。 白棒グラフは刺激なしの場合の、 斜線棒グラフは C o n
Aにより刺激した場合の3 H—チミジン取込み量を示す。 図 34から明らかな ように、 マイ トジ工ン刺激のマウスリンパ球の増殖に対しァガロビオースは 用量依存的な抑制作用を示し、 1 0 0 /Z g/m 1でほぼ完全に抑え、 リンパ 球の活性化に対する抑制作用が認められた。 また、 3， 6 _アンヒ ドロガラ タ トビラノース、 ァガロテトラオ一ス、 ァガ口へキサオース、 ァガロォクタ オース、 力ラビオースおよび 3 , 6—アンヒ ドロー 2— O—メチル一 L—ガ ラク トースにも同様の活性を認めた。
実施例 1 9
混合リンパ球反応に対するァガロビオースの抑制作用
BAL BZ cマウス （日本 S L C ;ォス、 6週令） および C 5 7 B LZ6 マウス （日本 S L C ; ォス、 6週令） より脾臓を摘出し、 上記の方法により 脾臓リンパ球を得た。 各細胞浮遊液の濃度を 2 X 1 06細胞/ m 1に調整し、 1 0 0 μ 1ずつを混合して 9 6ウェルマィクロタイタ一プレートに播種した。 対照群以外の各ゥ ルに、 各濃度のァガロビオースを添加し、 炭酸ガス培養 器で 3 Ί。じ: 4日間培養した。 培養後 1 μ C iの3 H—チミジンを各ゥエルに 加え、 さらに 1 日間培養して細胞への取込み量を液体シンチレーシヨンカウ ンターで測定した。
その結果を図 3 5に示す。 すなわち、 図 3 5は混合リンパ球反応において ァガロビオース濃度と、 3H—チミジン取込み量との関係を示す図であり、 横 軸はァガロビオース濃度、 縦軸は3 H—チミジン取込み量 （c pm) を示す。 白棒グラフはいずれかの系統由来の細胞を単独で用いた場合の、 斜線棒グラ フは両系統由来の細胞を混合した場合の3 H—チミジン取込み量を示す。 図 3 5から明らかなように、 ァロ抗原刺激により活性化されたリンパ球に対して ァガロピオ一スは用量依存的な抑制作用を示し、 1 0 β g/m 1でほぼ完全 に抑え、 リンパ球の活性化に対する抑制作用が認められた。 また、 3， 6— アンヒ ドロガラク トピラノース、 ァガロテトラオース、 ァガ口へキサオース、 ァガロォクタオース、 力ラビオースおよび 3， 6—アンヒ ドロ一 2—O—メ チル一L—ガラク トースにも同様の活性を認めた。
実施例 20
( 1) 1 0%ゥシ胎児血清 （ギブコ社製） 含有、 フエノールレッ ド不含、 2 mM L—グルタミン （ライフテックオリエンタル社製、 2 5 030- 1
4 9) 含有ダルベッコ改良イーグル培地 （バイオウイタカ一社製、 1 2 - 9
1 7 F) に RAW2 64. 7細胞 （ATCC T I B 7 1 ) を 3 X 1 05細 胞 Zm 1になるように懸濁し、 48穴マイクロタイタープレートのゥエルに
5 00 1ずつ加え、 5%炭酸ガス存在下、 3 7°Cで 1 2時間培養した。 各 ゥエルに 1 0 μ 1の 2 5 μ g/m 1 リポポリサッカライ ド （L P S、 シグマ 社製、 L- 20 1 2) と Ι Ο μ Ιの 5 000、 1 5 00、 500、 1 50ま たは 5 0 μΜ ァガロビオースまたはネオアガロビオース （シグマ社製、 G 44 1 0) 水溶液を添加し、 さらに 1 2時間培養した後、 NOが培地中で酸 ィ匕されることによって生ずる N02 -濃度の測定を行った。 なお、 対照として L P Sを加えない区分およぴァガ口ビオースまたはネオァガロビオースを加 えない区分を設定した。
上記培養後、 1 00 μ 1 の培地に 1 00 μ 1 の 4 %ダリース試薬 （シグマ 社製、 G4- 41 0) を加え、 室温で 1 5分間放置した後、 490 ηώにおけ る吸光度を測定した。 上記培地に溶解した既知の濃度の N a Ν〇2で作製した 検量線から培地中の Ν Ο 2_濃度を計算した。 測定はすべて 3連で行った。 この結果、 ァガロビオースは濃度依存的に L P Sによる NO産生誘導を抑 制し、 ネオアガロビオースは抑制しなかった。 その結果を図 36と図 37に 示す。 すなわち、 図 36はァガロビオースを添加して各培養条件で培養した 時の、 培地中の N02—濃度を示す図である。 図 37はネオアガロビオースを 添加して各培養条件で培養した時の培地中の N O 2 _濃度を示す図である。 図 36、 図 37において横軸は培養条件を、 縦軸は N〇2 -濃度 （μΜ) を示す。 ァガロビオースの代りに、 3， 6—アンヒ ドロガラク トピラノース、 カラ ビオース、 ァガロテトラオース、 ァガ口へキサオース、 ァガロォクタオース および 3， 6—アンヒ ドロー 2—0—メチル一 L—ガラク ト一スを用いても 同様の結果が得られた。
(2) 市販の寒天 （伊那寒天タイプ S— 7、 伊那食品工業社製） 5 gを 4 5m lの◦. I N H C 1に懸濁して 95 °Cで 1 3分間処理した。 室温まで 冷却した後、 Na OHで中和し、 0. 22 μπιの MI LLEX— GPフィル ター （ミリポア社製、 SLGPR25LS) でろ過した。 この試料 （寒天塩酸分解溶 液） と実施例 1 1一 （1) で得た寒天分解オリゴ糖溶液 （寒天クェン酸分解 溶液） について、 実施例 20— (1) 記載の方法で NO抑制活性を測定した。 すなわち、 あらかじめ 48穴マイクロタイタープレートで培養した RAW2
64. 7細胞に対して、 各ゥエルに 1 0 1の 25 g/m 1の L P Sと 1 0 μ 1の上記試料の 20倍希釈液を加え、 測定を行った。 なお、 対照として L P Sを加えない区分、 上記試料を加えない区分および 2. 5mMクェン酸 を加えた区分を設定した。 また、 測定はすべて 2連で行った。
この結果、 寒天塩酸分解溶液、 寒天クェン酸分解溶液ともに L P Sによる
NO産生誘導を抑制した。 その結果を図 38に示す。 すなわち、 図 38は寒 天塩酸分解溶液、 寒天クェン酸分解溶液を添加して培養した時の培地中の N 〇2—濃度を示す図である。 図 38において横軸は培養条件を、 縦軸は N〇2 - 濃度 （μΜ) を示す。 (3) 実施例 20— （2) と同様の方法で、 l O OmM ガラク fース (ナカライテスク社製、 コード 1 65— 1 1) 、 1 0 OmM 3， 6—アン ヒ ドロ一 D—ガラク トース （フナコシ社製、 コード GO 002) 水溶液を用 いて、 NO産生抑制活性の評価を行った。
その結果、 3， 6—アンヒ ドロ一 D—ガラク トースは NO産生を抑制した 力 S、 ガラク トースは抑制しなかった。 その結果を図 39に示す。 すなわち、 図 39は 3， 6—アンヒ ドロ一 D—ガラク トース、 ガラク トースを添加して 培養した時の培地中の N〇2—濃度を示す図である。 図 39において横軸は培 養条件を、 縦軸は N〇2-濃度 （μΜ) を示す。
(4) 実施例 20— （1) 記載のダルベッコ改良イーグル培地に RAW 2
64. 7細胞を 3 X 105細胞 Zmlになるように懸濁し、 48穴マイクロタイ タープレートのゥエルに 500 μ 1ずつ加えて 5%炭酸ガス存在下、 37°C で 1 0時間培養した。 ついで、 10 μ 1の 5， 000 Μァガロビオース水溶 液を添加して、 それぞれ 1、 2、 4、 6時間培養した。 その後、 培養上清を 除去し、 各ゥヱルに新たに上記ダルベッコ改良イーグル培地を 500 μ 1ず つ加え、 Ι Ο μ Ιの 2. 5 / g/m lの LPS、 800U,m lのインター フエロン一 γ ( I FN— γ、 コスモバイオ社販売、 GZM- MG- IFN) 水溶液を添 加して 1時間培養した。 その後、 培養上清を除去し、 各ゥエルに新たに上記 ダルべッコ改良イーグル培地を 500 μ 1ずつ加え、 さらに 1 6時間培養し た後、 NOが培地中で酸化されることによって生ずる Ν〇2一濃度の測定を実 施例 20— （ 1 ) 記載の方法で行った。 なお、 対照として L P S、 I FN- 水溶液を加えない区分およびァガロビオースを加えない区分を設定した。 また、 測定はすべて 2連で行つた。
この結果、 ァガロビオースは前もって細胞に添加されている時間が長いほ ど、 NOの産生を抑制した。 すなわち、 ァガロビオースをあらかじめ細胞培 養培地に添加しておくことで、 LP S、 I FN— γで誘導される NOの産生 を抑制、 予防できた。 その結果を図 40に示す。 図 40は各培養条件で培養 したときの培地中の N〇2—濃度を示す図である。 図 40において横軸は培養 条件を示し、 縦軸は N02_濃度を示す。 また、 3， 6—アンヒ ドロガラク ト P
75 ビラノース； ァガロテトラオース、 ァガ口へキサオース、 ァガロォクタォー ス、 力ラビオースおよび 3， 6—アンヒ ドロ一 2—O—メチルー L一ガラク トースに同様の活性を認めた。
実施例 21
(1) 寒天粉末 （和光純薬社製） を終濃度 3%となるように 5 OmMクェ ン酸溶液にいれ、 95°C、 1 60分の加熱処理を行い、 制がん試験用のオリ ゴ糖溶液を調製した。
日本チヤ一ルスリバ一社より 4週令、 雄性のヌードマウス （S PFZVA FB a 1 b/ c AnNC r j -n u) を購入し、 1週間予備飼育した。 この マウスにヒ ト大腸がん細胞株 HCT 1 1 6 (ATCC CCL— 247) を
1. 5 X 1 06細胞 マウスとなるように皮下移植した。
大腸がん細胞株移植 2週間目から、 上記制がん試験用オリゴ糖溶液を使用 直前に pH6. 5に調整したものを週に 5日、 飲料水として自由に摂取させた マウス 1匹当り 1 日平均 3. 5m l摂取していた。 また、 飼育用餌としてォ リエンタル酵母社製の MFを自由に摂取させた。
オリゴ糖投与開始後 4週間目にオリゴ糖投与群の各マウスの固形がんを摘 出し、 その重量を、 通常の飲料水を摂取させた対照群の固形がん重量と比較 した。 なお本試験は各群 1 0匹で行った。
その結果、 制がん試験用試料の経口投与群において有意ながん増殖抑制が 認められ、 寒天由来のオリゴ糖は経口投与において、 強い制がん作用を示し た。
その結果を図 41に示す。 すなわち、 図 41は本発明のオリゴ糖の制がん 活性を示す図であり、 縦軸は固形がん重量 （g) 、 横軸は対照群、 オリゴ糖 投与群を示す。
なお、 制がん試験用試料中和物の経口投与群において、 完全にがんが消失 した個体が 1例あった。
(2) 実施例 1 1一 （1) 記載の寒天オリゴ糖溶液を用い、 ェ一ルリッヒ 腹水がんに対する制がん試験を行った。
5週齢の雌性 d dY系マウス （体重約 25 g) を用い、 エーリツヒがん細 胞を腹腔内投与 （1. 2 X 1 06細胞ノマウス） し、 生存数より平均生存日数 および延命率を算定した。 - マウスは 1群 8匹で対照群、 実施例 1 1一 （ 1 ) 記載の寒天分解ォリゴ糖 溶液の 3. 3倍希釈液摂取群および 1 6. 7倍希釈液摂取群の 3群を設定し た。 すなわち、 実施例 1 1一 （1) にて調製した寒天分解オリゴ糖溶液のそ れぞれの水希釈液を調製し、 がん細胞投与の 3日前より自由に飲水摂取させ た。 寒天分解ォリゴ糖溶液の 3. 3倍希釈液摂取群の 1 日当たりの該希釈液 摂取量は 5 m 1 Z日 マウスであった。 寒天分解オリゴ糖溶液の 16. 7倍 希釈液摂取群の 1 日当たりの該希釈液摂取量は 6 m 1 /日 マウスであった。 なお、 対照群は 1 日当たり 7m 1 /マウスの水摂取であった。
その結果、 対照群では平均生存日数が 1 1. 8日であったのに対し、 寒天 分解オリゴ糖溶液の 3. 3倍希釈液摂取群、 および寒天分解オリゴ糖溶液の 1 6. 7倍希釈液摂取群の平均生存日数は、 それぞれ 1 9. 8日および 14. 4日であり、 延命率はそれぞれ 1 68 %および 1 22 %と有意な延命効果が 認められた。
実施例 22
ウィスター系ラッ ト （ォス、 5週齢、 体重約 1 50 g ； 日本エスエルシ 一） の腹腔内に 1 00 μ gの卵白アルブミン （OA； シグマ社） および l m 1のァラム [商品名ィムジェク ト ァラム（Imject Alum) ； ピアス社] を注射 して感作し、 14日後に腹大動脈より抹消血を採取し、 その血清を抗 OA抗 体とした。
ウィスター系ラット （ォス、 7週齢、 体重約 200 g ； 日本エスエルシ 一） の剃毛した背部に抗 OA抗体 Ι Ο Ο μ 1を皮下投与して受動感作した。 感作 48時間後に実施例 1 1一 （1) 記載の寒天分解オリゴ糖溶液またはそ の 10倍水希釈液 2m 1を各郡 4匹のラットの腹腔內に投与した。 対照郡の ラットには 2m 1の水を腹腔内に投与した。
投与 30分後に 0. 1% OA, 0. 5%エバンスブルー （ナカライテス ク） を含んだ生理食塩水 l m 1を尾静脈より注射して PC Aを惹起した。 抗 原誘発 30分後にラットを断頭、 放血死させ、 背部の色素が漏出した部位を 切除し回収した。
回収した皮膚は 1 m 1の 1 N KC 1 (ナカライテスク） に浸して 1晚放 置した後、 0. 6N H3P〇4 (メノレク社） を含んだアセトン液 （ナカライ テスク） 9m 1を加えて色素を抽出し、 E L I S Aリーダーで 620 nmの 吸光度を測定した。 皮膚の漏出色素量はエバンスブルーの検量線より求めた。 結果を図 42に示す。 すなわち、 図 42は本発明のオリゴ糖の PC A抑制 を示す図であり、 図中縦軸は色素漏出量 （/i gZ部位） 、 横軸は使用した寒 天分解オリゴ糖溶液を示す。
図に示すように、 寒天分解オリゴ糖溶液の投与により、 PC Aによる色素 漏出は半分以下まで抑制され、 対照に比べ有意の差 （p< 0. 05) を示し た。
また、 3， 6—アンヒ ドロガラク トピラノース、 ァガロビオース、 ァガロ テトラオース、 ァガ口へキサオース、 ァガロォクタオース、 力ラビオースお よび 3， 6—アンヒ ドロー 2— O—メチル一L—ガラク ト一スに同様の効果 を認めた。
実施例 23
6穴プレートに 5 X 1 04細胞7穴 21111培地となるように 1 0%F B S 含有 RPM 1 - 1 640に懸濁したマウスメラノーマ細胞 B 1 6 B L 6を分 注し、 37°Cでインキュベートした。 2日目に、 1 00 μ 1のァガロビオー ス溶液 （2mgZm 1〜0. 2mgZm l ) を添加し、 7日目に培地を交換 し、 同時に 1 00 μ 1のァガロビオース溶液 （2mgZm 1〜0. 2mg/ m l ) を添加した。 8日目に細胞を回収し、 DNA、 RNA、 タンパク質を 分解処理した後、 400 nmの吸光度を測定し、 メラニン産生抑制作用を検 定した。
すなわち、 培地を吸引除去した後、 20mM E D T A溶液に溶解した 0.
25%トリプシンを 1穴当り 0. 3m l添カ卩し、 37 °Cで 1 0分インキュべ ートした。 ついで、 2m 1の新しい培地を添加し、 細胞を懸濁して試験管に 回収した。 ついで、 培地を遠心除去した後、 2m 1の PB Sで細胞を懸濁し、 再度遠心分離した。 上清を除去した後、 細胞に 30 μ 1の 5mM塩化マンガ ンを含む 5 OmM酢酸ナトリゥムバッファー （pH5. 0) と 1 1の 70, 00 OU/m 1の DN a s e I (宝酒造社製） を加えて良く混合した後、 3 7°Cで 2時間インキュベートして、 DNAを分解した。 そして l OmgZm 1のリボヌクレアーゼ A (シグマ社製） を 1 μ 1加え、 50。Cで 1時間ィン キュベ一トして RNAを分解した。 最後に 1◦ 0 μ g/m 1のプロティネー ス K (シグマ社製） 、 0. 1 %トリ トン Xおよび 1 OmM EDTAを含む 1 0 OmMトリス一塩酸バッファー （pH7. 8) を細胞数 2 X 106に対し て液の総量が 200 / 1 となるように加え、 37 °Cで 1 6時間インキュベー トした後、 400 nmの吸光度を測定した。
結果を表 1 5に示す。 表 1 5に示すようにァガロビオース 50、 1 00 μ g/m 1の濃度においてメラニン産生阻害活性が認められ、 ァガロビオース の美白効果が確認された。 また、 ァガロテトラオース、 ァガ口へキサオース、 ァガロォクタオース、 力ラビオースおょぴ 3， 6 _アンヒ ドロー 2—O—メ チル一 L—ガラク トースに同様の効果を認めた。 表 1 5 ァガロビオース 400 nm 吸光度
μ g / m l 平 均 ± S D
1 00 0. 383 士 0. 007
50 0. 392 土 0. 1 72
10 0. 521 0. 256 対照 0. 487 + 0. 038 注） 測定は 3連で行い、 対照は培地 100 μ 1を添加した。 以上記載したごとく、 本発明によれば、 アポトーシス誘発剤、 制がん剤、 活性酸素産生抑制剤、 過酸化脂質ラジカル産生抑制剤、 NO産生抑制剤等の 抗酸化剤、 免疫調節剤の有効成分として有用な、 3， 6—アンヒ ドロガラク トピラノース、 そのアルデヒ ド体およびそれらの 2—O—メチル化体より選 択される化合物ならびに該化合物を含有する可溶性の糖化合物、 例えば、 当 該化合物含有物の pH 7未満の酸性下での酸分解およびノまたは酵素分解によ り生成するァガロビオース、 ァガロテトラオース、 ァガ口へキサオース、 ァ ガロォクタオース、 力ラビオース、 3， 6—アンヒ ドロ一 2—O—メチルー L一ガラク トース等の機能性物質が提供される。
これらの物質は、 アポトーシス誘発用医薬、 制がん用医薬、 活性酸素産生 抑制用医薬、 N O産生抑制用医薬等の抗酸化用医薬、 免疫調節用医薬、 抗ァ レルギ用医薬の有効成分として有用であり、 また、 これらの糖化合物から選 択される糖化合物を含有、 添加および Zまたは希釈してなる食品または飲料 はアポトーシス誘発作用、 制がん作用、 活性酸素産生抑制作用、 N O産生抑 制作用等の抗酸化作用、 免疫調節作用、 抗アレルギー作用を有する機能性食 品または飲料として有用であり、 がん患者やウィルス性疾患患者の病変細胞 にアポトーシスを誘発し、 これらの疾患の予防、 症状改善に有効な食品また は飲料が提供される。 とりわけ、 大腸がん、 胃がん等消化器系のがんの場合、 本発明の上記化合物を食品、 飲料として経口的に摂取することによりがん細 胞にアポトーシスを起こすことができるため、 本発明の食品または飲料は消 化器系がんの予防、 症状改善に優れた効果を有している。 さらに、 その活性 酸素産生抑制作用等の抗酸化作用により上記の食品または飲料は抗酸化スト レス用食品または飲料としても優れている。
また本発明の機能性物質は、 活性酸素産生抑制用の抗酸化用糖として有用 であり、 本発明の抗酸化用糖を含有、 希釈および/または添加してなる食品 または飲料は、 活性酸素等の生体內酸化物質が起因となる疾病の症状改善用 食品または飲料として有用である。 さらに、 本発明の食品または飲料はその 有効成分である 3 , 6 _アンヒ ドロガラク トビラノースもしくはそのアルデ ヒ ド体またはそれらの 2 _ 0—メチル化体より選択される化合物およびノま たは該化合物を含有する糖化合物の作用により、 便秘改善または予防に効果 を有する。 本発明により提供される抗酸化用糖は食品または飲料に活性酸素産生抑制 作用等の抗酸化性を付与する新機能性糖化合物として有用である。 - また、 本発明の機能性物質は鮮度保持効果を有し、 食品、 生鮮物の味ゃ鮮 度の保持に極めて有用である。
さらに、 本発明の糖化合物を含有する化粧料は美白用、 保湿用化粧料とし て有用である。
本発明によれば、 当該機能性物質を含有、 希釈および/または添加してな る酸性食品または酸性飲料も提供されるが、 該食品または飲料の製造方法に おいては、 該機能性物質の含量に影響を及ぼす因子が実質的に除去されてお り、 極めて有用性の高い、 機能性物質の高含有食品または高含有飲料が得ら れる。 さらに、 有機酸存在下で製造される酸味料も呈味性、 機能性に優れた 新規酸味料として有用である。

Claims

式 1
一一口青
Figure imgf000083_0001
の で表される 3， 6—アンヒ ドロガラク トピラノース、 そのアルデヒ ド体、 そ 囲
の抱水体およびそれらの 2— Ο—メチル化体より選択される化合物ならびに 該化合物を還元末端に有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される少 なくとも 1種の化合物を有効成分として含有する、 該化合物に感受性を示す 疾患の治療または予防用の医薬組成物。
2 . 糖化合物が、 式 1で表される 3， 6—アンヒ ドロガラク トピラノース、 そのアルデヒ ド体、 その抱水体およびそれらの 2— Ο—メチル化体より選択 される少なくとも 1種の化合物を含有する物質の pH 7未満の酸性下での酸分 解物および/または酵素分解物である請求項 1記載の医薬組成物。
3 . 式 1で表される 3， 6—アンヒ ドロガラク トピラノース、 そのアルデ ヒ ド体、 その抱水体およびそれらの 2— Ο—メチル化体より選択される少な くとも 1種の化合物を含有する物質が、 寒天、 ァガロースおよび力ラゲナン からなる群より選択される少なくとも 1種の物質である請求項 2記載の医薬 組成物。
4 . 糖化合物がァガロビオース、 ァガロテトラオース、 ァガ口へキサォ一 ス、 ァガロォクタオース、 Κ—力ラビオースおよび ]3—D—ガラク トビラノ シル一 3， 6—アンヒ ドロ一 2— O—メチル一 L—ガラク トースからなる群 より選択される少なくとも 1種の糖化合物である請求項 1〜 3いずれか 1項 に記載の医薬組成物。
5 . 疾患が、 アポト一シス誘発を要する疾患、 がん性疾患、—活性酸素産生 抑制を要する疾患、 一酸化窒素産生抑制を要する疾患または免疫調節を要す る疾患である請求項 1〜 6のいずれか 1項に記載の医薬組成物。
6 . 式 1で表される 3， 6—アンヒ ドロガラク トピラノース、 そのアルデ ヒ ド体、 その抱水体およびそれらの 2— O—メチル化体より選択される化合 物ならびに該化合物を還元末端に有する可溶性の糖化合物からなる群より選 択される少なくとも 1種の化合物を含有、 添加および Zまたは希釈してなる、 これらの化合物に感受性を示す疾患の症状改善用食品または飲料、 または該 疾患の予防用食品または飲料。
7 . 糖化合物が、 式 1で表される 3， 6—アンヒ ドロガラク トピラノース、 そのアルデヒ ド体、 その抱水体およびそれらの 2—O—メチル化体より選択 される少なくとも 1種の化合物を含有する物質の pH 7未満の酸性下での酸分 解物および/または酵素分解物である請求項 6記載の食品または飲料。
8 . 式 1で表される 3， 6—アンヒ ドロガラク トピラノース、 そのアルデ ヒ ド体、 その抱水体およびそれらの 2—O—メチル化体より選択される少な くとも 1種の化合物を含有する物質が、 寒天、 ァガロースおよび力ラゲナン からなる群より選択される少なくとも 1種の物質である請求項 7記載の食品 または飲料。
9 . 糖化合物がァガロビオース、 ァガロテトラオース、 ァガ口へキサォ一 ス、 ァガロォクタオース、 κ —力ラビオースおよび j3 _ D—ガラク トビラノ シル一 3， 6—アンヒ ドロ一 2—O—メチル一 L—ガラク トースからなる群 より選択される少なくとも 1種の糖化合物である請求項 6〜 8いずれか 1項 に記載の食品または飲料。
1 0 . 疾患が、 アポトーシス誘発を要する疾患、 がん性疾患、 活性酸素産 生抑制を要する疾患、 一酸化窒素産生抑制を要する疾患または免疫調節を要 する疾患である請求項 6〜 9のいずれか 1項に記載の食品または飲料。
1 1 . 式 1で表される 3， 6 —アンヒ ドロガラク トピラノース、 そのアル デヒ ド体、 その抱水体およびそれらの 2— O—メチル化体より選択される化 合物ならびに該化合物を含有する可溶性の糖化合物からなる群より選択され る少なくとも 1種の化合物を有効成分として含有することを特徴とする抗酸 化剤。 -
1 2 . 糖化合物が、 式 1で表される 3， 6—アンヒ ドロガラク トピラノー ス、 そのアルデヒ ド体、 その抱水体およびそれらの 2— O—メチル化体より 選択される少なくとも 1種の化合物を含有する物質の pH 7未満の酸性下での 酸分解物および Zまたは酵素分解物である請求項 1 1記載の抗酸化剤。
1 3 . 式 1で表される 3， 6—アンヒ ドロガラク トビラノース、 そのアル デヒ ド体、 その抱水体およびそれらの 2—〇一メチル化体より選択される少 なくとも 1種の化合物を含有する物質が、 寒天、 ァガロースおよびカラギー ナンからなる群より選択される少なくとも 1種である請求項 1 2記載の抗酸 化剤。
1 4 . 糖化合物がァガロビオース、 ァガロテトラオース、 ァガ口へキサォ ース、 ァガロォクタオース、 κ一力ラビオースおよび /3— D—ガラク トピラ ノシルー 3， 6—アンヒ ドロ一 2—〇一メチル一 L—ガラク トースからなる 群より選択される少なくとも 1種の糖化合物である請求項 1 1〜 1 3のいず れか 1項に記載の抗酸化剤。
1 5 . 抗酸化剤が、 活性酸素産生抑制剤である請求項 1 1〜 1 4のいずれ か 1項に記載の抗酸化剤。
1 6 . 請求項 1 1〜 1 5のいずれか 1項に記載の抗酸化剤を含有すること を特徴とする食品または飲料。
1 7 . 式 1で表される 3， 6—アンヒ ドロガラク トピラノース、 そのアル デヒ ド体、 その抱水体およびそれらの 2— O—メチル化体より選択される化 合物ならびに該化合物を含有する可溶性の糖化合物からなる群より選択され る抗酸化用糖。
1 8 . ァガロビオース、 ァガロテトラオース、 ァガ口へキサオース、 ァガ ロォクタオース、 κ—力ラビオースおよび ]3—D—ガラク トピラノシル一 3， 6 _アンヒ ドロ一 2—〇一メチル一 L—ガラク トースからなる群より選択さ れる少なくとも 1種の糖化合物である請求項 1 7記載の抗酸化用糖。
1 9 . 活性酸素産生抑制用糖である請求項 1 7または 1 8記載の抗酸化用
2 0 . 式 1で表される 3， 6—アンヒ ドロガラク トピラノース、 そのアル デヒ ド体、 その抱水体およびそれらの 2— O—メチル化体より選択される化 合物ならびに該化合物を含有する可溶性の糖化合物からなる群より選択され る少なくとも 1種の化合物を有効成分として含有することを特徴とする鮮度 保持剤。
2 1 . 糖化合物が、 式 1で表される 3， 6—アンヒ ドロガラク トピラノー ス、 そのアルデヒ ド体、 その抱水体およびそれらの 2—〇一メチル化体より 選択される少なくとも 1種の化合物を含有する物質の pH 7未満の酸性下での 酸分解物およびノまたは酵素分解物である請求項 2 0記載の鮮度保持剤。
2 2 . 式 1で表される 3 , 6—アンヒ ドロガラク トピラノース、 そのアル デヒ ド体、 その抱水体およびそれらの 2— O—メチル化体より選択される少 なくとも 1種の化合物を含有する物質が、 寒天、 ァガロースおよびカラギー ナンからなる群より選択される少なくとも 1種の物質である請求項 2 1記載 の鮮度保持剤。
2 3 . 糖化合物がァガロビオース、 ァガロテトラオース、 ァガ口へキサォ —ス、 ァガロォクタオース、 一力ラビオースおよび —D—ガラク トピラ ノシルー 3， 6—アンヒ ドロ一 2—Ο—メチル一 L—ガラク ト一スからなる 群より選択される少なくとも 1種の糖化合物である請求項 2 0〜 2 2いずれ か 1項記載の鮮度保持剤。
2 4 . ァガロビオース、 ァガロテトラオース、 ァガ口へキサオース、 ァガ ロォクタオース、 κ—力ラビオースおよび ]3—D—ガラク トピラノシル一 3， 6—アンヒ ドロ一 2— Ο—メチル一 L—ガラク トースからなる群より選択さ れる少なくとも 1種の糖化合物を有効成分とする化粧料。
2 5 . 式 1で表される 3， 6—アンヒ ドロガラク トピラノース、 そのアル デヒ ド体、 その抱水体およびそれらの 2—〇一メチル化体より選択される化 合物ならびに該化合物を含有する可溶性の糖化合物からなる群から選択され る少なくとも 1種を含有、 添加および Ζまたは希釈してなる、 酸性食品また は酸性飲料。
2 6 . 糖化合物がァガロビオース、 ァガロテトラオース、 ァガ口へキサォ —ス、 ァガロォクタオース、 κ—力ラビオースおよび )3 _ D—ガラクトピラ ノシルー 3， 6—アンヒ ドロ一 2— O—メチル一 L—ガラク トースからなる 群より選択される少なくとも 1種の糖化合物である請求項 2 6に記載の酸性 食品または酸性飲料。
2 7 . 式 1で表される 3， 6—アンヒ ドロガラク トピラノース、 そのアル デヒ ド体、 その抱水体おょぴそれらの 2— O—メチル化体より選択される化 合物ならびに該化合物を含有する可溶性の糖化合物からなる群より選択され る少なくとも 1種の化合物の、 アポトーシス誘発、 制がん、 活性酸素産生抑 制、 過酸化脂質ラジカル産生抑制、 N〇産生抑制剤または免疫調節用の医薬 組成物製造における使用。
2 8 . 式 1で表される 3， 6—アンヒ ドロガラク トピラノース、 そのアル デヒ ド体、 その抱水体およびそれらの 2— O—メチル化体より選択される化 合物ならびに該化合物を含有する可溶性の糖化合物からなる群より選択され る少なくとも 1種の化合物の、 アポトーシス誘発、 制がん、 活性酸素産生抑 制、 過酸化脂質ラジカル産生抑制、 N O産生抑制剤または免疫調節用の飲食 品製造における使用。
2 9 . 式 1で表される 3， 6—アンヒ ドロガラク トピラノース、 そのアル デヒ ド体、 その抱水体およびそれらの 2— O—メチル化体より選択される化 合物ならびに該化合物を含有する可溶性の糖化合物からなる群より選択され る少なくとも 1種の化合物の抗酸化剤または鮮度保持剤の製造における使用。
3 0 . ァガロビオース、 ァガロテトラオース、 ァガ口へキサオース、 ァガ ロォクタオース、 κ—力ラビオースおよび |3— D—ガラク トピラノシル一 3， 6—アンヒ ドロ一 2—〇一メチル一 L—ガラク トースからなる群より選択さ れる少なくとも 1種の糖化合物の、 化粧料の製造における使用。
PCT/JP1998/005065 1997-11-11 1998-11-11 Medicaments, aliments ou boissons renfermant des substances physiologiquement activees derivees d'algues WO1999024447A1 (fr)

Priority Applications (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP98953005A EP1038879B1 (en) 1997-11-11 1998-11-11 Drugs, foods or drinks with the use of algae-derived physiologically active substances
EA200000512A EA004148B1 (ru) 1997-11-11 1998-11-11 Фармацевтическая композиция на основе 3,6-ангидрогалактопиранозы, и/или ее производных, и/или растворимого сахарида, содержащего данное соединение, применение композиции и входящих в ее состав ингредиентов, пищевой продукт, содержащий указанную композицию, и применение пищевого продукта
CA002309691A CA2309691A1 (en) 1997-11-11 1998-11-11 Drugs, foods or drinks with the use of algae-derived physiologically active substances
JP2000520455A JP4007760B2 (ja) 1997-11-11 1998-11-11 藻類由来の生理活性物質を利用した医薬、食品または飲料
US09/554,235 US6475990B1 (en) 1997-11-11 1998-11-11 Drugs, foods or drinks with the use of algae-derived physiologically active substances
KR1020007004993A KR100544856B1 (ko) 1997-11-11 1998-11-11 조류 유래의 생리활성물질을 이용한 의약, 식품 또는 음료
AU10517/99A AU753435B2 (en) 1997-11-11 1998-11-11 Drugs, foods or drinks with the use of algae-derived physiologically active substances
DE69840706T DE69840706D1 (de) 1997-11-11 1998-11-11 Arzneimittel, speisen oder getränke mit physiologisch aktiven stoffen aus algen
US10/228,195 US6911432B2 (en) 1997-11-11 2002-08-27 Drugs, foods or drinks with the use of algae-derived physiologically active substances
US11/034,243 US7417031B2 (en) 1997-11-11 2005-01-13 Use of algae-derived physiologically active substances for treating a carcinomatous disease
US12/222,492 US20100137228A2 (en) 1997-11-11 2008-08-11 Drugs, foods or drinks with the use of algae-derived physiologically active substances

Applications Claiming Priority (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP32391797 1997-11-11
JP9/323917 1997-11-11
JP2014698 1998-01-19
JP10/20146 1998-01-19
JP13097398 1998-04-27
JP10/130973 1998-04-27
JP10/164410 1998-05-29
JP16441098 1998-05-29
JP10/212041 1998-07-13
JP21204198 1998-07-13

Related Child Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US09/554,235 A-371-Of-International US6475990B1 (en) 1997-11-11 1998-11-11 Drugs, foods or drinks with the use of algae-derived physiologically active substances
US09554235 A-371-Of-International 1998-11-11
US10/228,195 Division US6911432B2 (en) 1997-11-11 2002-08-27 Drugs, foods or drinks with the use of algae-derived physiologically active substances
US10/228,195 Continuation US6911432B2 (en) 1997-11-11 2002-08-27 Drugs, foods or drinks with the use of algae-derived physiologically active substances

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1999024447A1 true WO1999024447A1 (fr) 1999-05-20

Family

ID=27520204

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP1998/005065 WO1999024447A1 (fr) 1997-11-11 1998-11-11 Medicaments, aliments ou boissons renfermant des substances physiologiquement activees derivees d'algues

Country Status (12)

Country Link
US (4) US6475990B1 (ja)
EP (1) EP1038879B1 (ja)
JP (2) JP4007760B2 (ja)
KR (1) KR100544856B1 (ja)
CN (1) CN1160364C (ja)
AT (1) ATE427314T1 (ja)
AU (1) AU753435B2 (ja)
CA (1) CA2309691A1 (ja)
DE (1) DE69840706D1 (ja)
EA (1) EA004148B1 (ja)
TW (2) TW577743B (ja)
WO (1) WO1999024447A1 (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002029099A1 (fr) * 2000-10-03 2002-04-11 Takara Bio Inc. Technique de criblage de substance physiologiquement active
JP2007084518A (ja) * 2005-09-26 2007-04-05 Kochi Univ 海藻由来の免疫抑制物質を製造する方法
US7217817B1 (en) * 1999-05-14 2007-05-15 Takara Bio Inc. Agarobiose-containing composition
JP2009102279A (ja) * 2007-10-25 2009-05-14 Kose Corp 抗シワ剤およびシワ形成防止用皮膚外用剤
JP2014234382A (ja) * 2013-06-05 2014-12-15 伊那食品工業株式会社 ＰＰＡＲγ発現向上剤、並びにそれを含む基礎代謝向上剤、疲労回復向上剤、医薬用組成物及び飲食品

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999024447A1 (fr) * 1997-11-11 1999-05-20 Takara Shuzo Co., Ltd. Medicaments, aliments ou boissons renfermant des substances physiologiquement activees derivees d'algues
US6608032B1 (en) * 1999-01-20 2003-08-19 Takara Shuzo Co., Ltd. Medicinal compositions
AU2005400A (en) * 1999-01-20 2000-08-07 Takara Shuzo Co., Ltd. Remedies
US20030144488A1 (en) * 2000-05-26 2003-07-31 Susumu Hizukuri Novel saccharide, process for preparation of the same and use thereof
WO2003086422A1 (fr) * 2002-04-17 2003-10-23 Takara Bio Inc. Agents therapeutiques
JP4506880B2 (ja) * 2008-06-17 2010-07-21 ユーハ味覚糖株式会社 美容飲料及びその製造方法
CN103054118B (zh) * 2008-04-30 2014-05-07 悠哈味觉糖有限公司 饮料组合物及其制造方法
US20150216778A1 (en) 2012-01-18 2015-08-06 Korea University Research And Business Foundation Method for Preparing 3,6-Anhydro-L-Galactose, And Use Thereof
WO2013109096A1 (ko) * 2012-01-18 2013-07-25 고려대학교 산학협력단 3,6-안하이드로-l-갈락토오스의 제조방법 및 이의 용도
CN102823641A (zh) * 2012-09-18 2012-12-19 国家海洋局第三海洋研究所 一种海藻寡糖在制备水果保鲜剂的应用及其方法
KR101489732B1 (ko) * 2013-03-15 2015-02-04 고려대학교 산학협력단 3,6-안하이드로-l-갈락토오스를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 조성물
KR20150033575A (ko) * 2013-09-23 2015-04-01 다인바이오 주식회사 네오아가로올리고당을 포함하는 면역 증강용 또는 항암용 조성물
KR101521711B1 (ko) 2013-10-14 2015-05-19 고려대학교 산학협력단 신규한 아가로올리고당 분해효소 및 이를 이용한 아가로오스로부터 3,6-안하이드로-l-갈락토오스와 갈락토오스의 생산방법
CN104886228A (zh) * 2015-06-25 2015-09-09 集美大学 一种罗非鱼片保鲜剂及其使用方法
JP7244977B2 (ja) * 2016-03-11 2023-03-23 シオノギヘルスケア株式会社 腸内細菌叢調整用組成物
KR101960503B1 (ko) * 2016-11-15 2019-03-21 고려대학교 산학협력단 항충치 활성을 갖는 아가로바이오스 또는 아가로올리고당의 용도
KR101864800B1 (ko) * 2016-12-07 2018-06-07 고려대학교 산학협력단 해조류 유래 무수갈락토오스의 생산방법
JP7190792B2 (ja) * 2017-05-22 2022-12-16 シオノギヘルスケア株式会社 体調維持用、体調増進用、又は体調調節用の組成物
KR102011721B1 (ko) * 2017-11-28 2019-08-19 고려대학교 산학협력단 포도상구균의 생육을 억제하는 한천 유래 올리고당의 용도
CN108410632A (zh) * 2018-05-18 2018-08-17 中国海洋大学 一种具有保健功能海洋琼胶低聚糖黄酒的制备方法
JPWO2021095696A1 (ja) * 2019-11-11 2021-05-20
JP7487987B1 (ja) 2023-12-21 2024-05-21 伊那食品工業株式会社 アガロオリゴ糖の分析方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS53113043A (en) * 1977-03-10 1978-10-03 Kyodo Shiryo Co Ltd Production of food preservatives
JPS62210958A (ja) * 1986-03-13 1987-09-17 Meiji Seika Kaisha Ltd 澱粉含有組成物の老化防止方法
JPS62210955A (ja) * 1986-03-13 1987-09-17 Shokuhin Sangyo Baioriakutaa Syst Gijutsu Kenkyu Kumiai 食品の老化防止方法
JPH0892303A (ja) * 1994-09-20 1996-04-09 Showa Sangyo Co Ltd 新規な糖、その製造方法および免疫賦活剤
JPH08151313A (ja) * 1994-11-25 1996-06-11 Kanebo Ltd 化粧料

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61502124A (ja) * 1984-05-09 1986-09-25 ジ　オ−ストラリアン　ナシヨナル　ユニヴア−シテイ− 免疫応答の調節方法
JPS62210965A (ja) 1986-03-13 1987-09-17 Shokuhin Sangyo Baioriakutaa Syst Gijutsu Kenkyu Kumiai 低カロリ−飲食品およびその製造方法
US5041541A (en) * 1988-05-05 1991-08-20 The Procter & Gamble Company Functional sugar substituted with reduced calories
JP2803000B2 (ja) 1989-03-18 1998-09-24 マルハ株式会社 フロロタンニン類を有効成分とする抗酸化剤
FR2656874B1 (fr) 1990-01-11 1992-04-03 Commissariat Energie Atomique Procede de production et d'extraction d'anti-oxydants a partir d'une culture de micro-organismes et photobioreacteur pour la mise en óoeuvre de ce procede.
JP3223038B2 (ja) 1993-07-20 2001-10-29 一丸ファルコス株式会社 寒天オリゴ糖のエステル化物を含有する化粧料
JPH07322886A (ja) 1994-06-01 1995-12-12 Japan Tobacco Inc オリゴ糖及び単糖の製造方法
JPH08208435A (ja) 1995-02-02 1996-08-13 Shiseido Co Ltd 固型水系化粧料
WO1999024447A1 (fr) * 1997-11-11 1999-05-20 Takara Shuzo Co., Ltd. Medicaments, aliments ou boissons renfermant des substances physiologiquement activees derivees d'algues
US6608032B1 (en) * 1999-01-20 2003-08-19 Takara Shuzo Co., Ltd. Medicinal compositions
AU2005400A (en) * 1999-01-20 2000-08-07 Takara Shuzo Co., Ltd. Remedies

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS53113043A (en) * 1977-03-10 1978-10-03 Kyodo Shiryo Co Ltd Production of food preservatives
JPS62210958A (ja) * 1986-03-13 1987-09-17 Meiji Seika Kaisha Ltd 澱粉含有組成物の老化防止方法
JPS62210955A (ja) * 1986-03-13 1987-09-17 Shokuhin Sangyo Baioriakutaa Syst Gijutsu Kenkyu Kumiai 食品の老化防止方法
JPH0892303A (ja) * 1994-09-20 1996-04-09 Showa Sangyo Co Ltd 新規な糖、その製造方法および免疫賦活剤
JPH08151313A (ja) * 1994-11-25 1996-06-11 Kanebo Ltd 化粧料

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7217817B1 (en) * 1999-05-14 2007-05-15 Takara Bio Inc. Agarobiose-containing composition
WO2002029099A1 (fr) * 2000-10-03 2002-04-11 Takara Bio Inc. Technique de criblage de substance physiologiquement active
JP2007084518A (ja) * 2005-09-26 2007-04-05 Kochi Univ 海藻由来の免疫抑制物質を製造する方法
JP2009102279A (ja) * 2007-10-25 2009-05-14 Kose Corp 抗シワ剤およびシワ形成防止用皮膚外用剤
JP2014234382A (ja) * 2013-06-05 2014-12-15 伊那食品工業株式会社 ＰＰＡＲγ発現向上剤、並びにそれを含む基礎代謝向上剤、疲労回復向上剤、医薬用組成物及び飲食品

Also Published As

Publication number Publication date
TW577743B (en) 2004-03-01
JP2006282675A (ja) 2006-10-19
CN1160364C (zh) 2004-08-04
KR20010031895A (ko) 2001-04-16
KR100544856B1 (ko) 2006-01-24
US20100137228A2 (en) 2010-06-03
CN1285838A (zh) 2001-02-28
US6911432B2 (en) 2005-06-28
US6475990B1 (en) 2002-11-05
ATE427314T1 (de) 2009-04-15
EP1038879A1 (en) 2000-09-27
US20090099101A1 (en) 2009-04-16
TWI244923B (en) 2005-12-11
EP1038879B1 (en) 2009-04-01
JP4486064B2 (ja) 2010-06-23
US20050119191A1 (en) 2005-06-02
JP4007760B2 (ja) 2007-11-14
EP1038879A4 (en) 2004-06-16
CA2309691A1 (en) 1999-05-20
DE69840706D1 (de) 2009-05-14
AU1051799A (en) 1999-05-31
TW200404555A (en) 2004-04-01
AU753435B2 (en) 2002-10-17
US7417031B2 (en) 2008-08-26
EA200000512A1 (ru) 2000-12-25
US20030105029A1 (en) 2003-06-05
US20100048491A2 (en) 2010-02-25
EA004148B1 (ru) 2004-02-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4486064B2 (ja) 藻類由来の生理活性物質を利用した医薬、食品または飲料
JP2006117662A (ja) 治療剤
TW577744B (en) Medicinal compositions containing 3,6-anhydrogalactopyranose as active ingredient
WO1997033593A1 (fr) Produit obtenu par traitement thermique d&#39;acide uronique, et aliments, boissons ou medicaments contenant ce produit
JP2010184886A (ja) 新規化合物
KR101900480B1 (ko) 물여뀌 추출물을 이용한 항산화용 조성물
JP2007326864A (ja) 医薬組成物
JP2010155787A (ja) 抗炎症剤、抗老化剤、抗肥満剤、及び育毛剤、並びに、化粧料、及び美容用飲食品
KR20230144935A (ko) 치커리 추출물, 늙은 호박 발효물 및 차전자피 분말을 유효성분으로 포함하는 기능성 식품 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 98813026.2

Country of ref document: CN

AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY CA CH CN CU CZ DE DK EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IS JP KE KG KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MD MG MK MN MW MX NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT UA UG US UZ VN YU ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW SD SZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10517/99

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020007004993

Country of ref document: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1998953005

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2309691

Country of ref document: CA

Ref document number: 2309691

Country of ref document: CA

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09554235

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200000512

Country of ref document: EA

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1998953005

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1020007004993

Country of ref document: KR

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 10517/99

Country of ref document: AU

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 1020007004993

Country of ref document: KR