TWI244923B

TWI244923B - Whitening or moisturizing cosmetics

Info

Publication number: TWI244923B
Application number: TW092135752A
Authority: TW
Inventors: Tatsuji Enoki; Hiroaki Sagawa; Takanari Tominaga; Eiji Nishiyama; Nobuto Koyama
Original assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1997-11-11
Filing date: 1998-11-11
Publication date: 2005-12-11
Also published as: TW577743B; JP2006282675A; WO1999024447A1; CN1160364C; KR20010031895A; KR100544856B1; US20100137228A2; CN1285838A; US6911432B2; US6475990B1; ATE427314T1; EP1038879A1; US20090099101A1; EP1038879B1; JP4486064B2; US20050119191A1; JP4007760B2; EP1038879A4; CA2309691A1; DE69840706D1

Description

1244923 玖、發明說明：【技術領域】本&明係有關得自藻類之生理活性物質之利用，更特定口係有關含有以該生理活性物質為有效成分之醫藥、抗氧化㈣、保鮮劑、化粧料、該生理活性組合物之機能性食品或飲料，另有關機能性表現用糖。【先前技藝】 ^^年末有關細胞組織之死，注目於細胞凋亡（apotosis 或稱為自爆死）之樣式。此細胞/周ΤΓ不同於病理性細胞死之壞死，為從最初即併入、、、田胞本身之基因之死。亦即，任何之外部或内部之要因成為引發機’藉由編排細胞凋亡之基因被活性化，編排死虫白貝被生合成，又，於某種情形，作為失活型存在於細胞内又編排死蛋白質被活性化。如此，認為藉由生成之活性型編排死蛋白質，細胞自身被分解以至於死。如果能使如此之細胞凋亡表現於所希望之組織、細胞， /、J可使不要或有—害之細胞以自然之形式自生體排除，為具極深之意義。發明之目的開發以來自瓊脂等之藻類之寡糖作為食品材料為所期待 (食品化學（：7 —卜、歹S力少），1988_2，4〇_44 ;別冊食品化學-4，1990年12月，127-131 ;特開平6_38691號），但誘發細胞凋亡作用等之生理機能並不明白。本發明之目的為開發得自天然物之具有謗發細胞凋亡作

O:\90\90175.DOC\LAN 1244923 用等之生理機能之安全性高之物質，提供以該物質為有效成分之細胞凋亡誘發劑等之對該化合物顯示感受性之疾病用之醫藥品及以該物質為構成成分之機能性飲料食品等。【發明内容】概要說明本發明，則本發明之第1形式為含有選自以式:

表示之3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛化物、其水合物及彼等 < 2-0-甲基化物之化合物及具選自、該化合物於還原末端之可/谷性糖化合物之至少丨種化合物為有效成分，對該化合物 _ π感受性之疾病之治療或預防用醫藥組合物。本發明之第2形式為含有選自

用飫料食品或該疾病之預防用飲料食品。

本务明之第4形式為以含有本發明之第3形式之抗氧化劑

O:\90\90175.DOC\LAN 1244923 為特徵之飲料食品。本發明之第5形式為選自以式1表示之3,6_脫水吡喃半乳糖、其醛化物、其水合物及彼等之2_0-甲基化物之化合物及選自含有該化合物之可溶性糖化合物之抗氧化用糖。本發明之第6形式為以含有選自以式丨表示之3,6-脫水吡南半乳糖，其酸化物、其水合物及彼等之2_〇_甲基化物之化合物及選自含有該化合物之可溶性糖化合物之至少丨種化合物為有效成分為特徵之保鮮劑。本發明之第7形式為以選自瓊脂雙糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、/c _阿拉伯糖及万_D_吡喃半乳糖基_3,6_脫水 •2-0-甲基-L_半乳糖之至少丨種糖化合物為有效成分之化粧料。本1明之第8形式為含選自以式丨表示之3，6-脫水峨喃半乳糖、其醛化物、其水合物及彼等之2_〇_曱基化物之化合物及選自含該化合物之可溶性糖化合物之至少丨種之化合物之酸性飲料食品。本發明之另夕卜之形式為於製造含選自以^表示之Μ-脫水吡喃半乳糖、其醛化物、其水合物及彼等之2_〇_甲基化物〈化合物及選自含該化合物之可溶性糖化合物之至少^種之醫藥組合物、飲料食品、抗氧化劑、保鮮劑或化粧料之使用。以下，參照附圖，詳細說明本發明。發明之詳細說明以本發明之式i表示之3,6_脫水吨喃半乳糖（以下單稱為

O:\90\90175.DOC\LAN 1244923 3,6-脫水吡喃半乳糖）之醛化物，為以式2表示之化合物，

0H 其水合物為以式3表示之化合物 H0

-0H

又，3,6-脫水吡喃半乳糖之2-0-甲基化物為以式4表示之化合物 H0

另外，該甲基化物之酸化物為以式5表示之化合物 H0

0H

〇CH3 O:\90\90175.DOC\LAN -9- 1244923 其水合物為以式6表示之化合物 eH3〇

於本說明書之式1〜6之構造亦可以其他之表現形式表示，以式1〜6表示者亦包括那些，又亦包括彼等之互變異體。又，於式1〜6之立體配置，只要可得所希望之活性，並無特別限定，可為D-型，L-型或彼等之混合物。本發明之可溶性糖化合物，無特別限定，為含有至少一種選自3,6-脫水吡喃半乳糖，其醛化物，其水合物及彼等之 2-0-曱基化物之化合物（以下，將這些總稱為「式1〜6化合物」) 之可溶性之糖化物，將含有至少1種式1〜6化合物之物質（以下單稱為原料物質），於未滿pH7之酸性下，可以酸分解及/ 或酵素分解而得，又亦可藉化學合成法而得。本發明之可溶性糖化合物只要於使用時無固化或半固化 (膠凝）之化合物即無限定。從而，含有選自於使用時溶膠化之式1〜6化合物之至少1種化合物之糖化物，包含於本發明之可溶性之糖化合物。又，於本發明合宜使用之該可溶性之糖化物，例如包含其非還原末端為L-半乳糖-6-硫酸以外之糖之糖化合物，例如瓊脂雙糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖；/c _角菜雙糖及召-D-吡喃半乳糖基-3,6-脫水 -2-0-甲基-L-半乳糖等之糖化合物。 O:\90\90175.DOC\HMH -10- 1244923 為得該可溶性糖化合物所用之原料物質，無特別限定，可例示例如瓊脂糖、瓊脂膠、福諾拉膠、紫菜膠、角菜膠、普魯雪拉膠、皮魯捏膠等之紅藻之黏多糖「共立出版（公司）發行’多糖生化學丨_化學編-，第314頁（1969)」。又’此等多糖之含有物亦包含於原糖物質中。例如，作為瓊脂糖、瓊脂膠之原料，使用天草科之真草、鬼草、大房、平草、小婆草、紫紅藻等，海髮科之髮菜、大髮菜、等伊口斯科之伊吉斯、惠胡等，其他之紅藻類，通常，摻合數種澡類作為原料。原料藻料通常使用太陽曬乾者，於本發明可使用生藻類及乾燥藻類。又，亦可使用乾燥時一面撒水一面漂白之所謂漂白原藻。熱水抽水原料藻類後，藉由冷卻可得「涼粉」。自此「涼粉」藉冷凍脫水或壓榨脫水除去水分，藉由乾燥可得瓊脂二瓊脂可不問其起源之藻類為何種且亦可使用棒狀、帶狀、板狀、線狀、粉末狀等之種種形態者。通常瓊脂含約观瓊脂糖與約30%瓊脂膠，進行純化， J I備更阿純度 < 瓊脂糖。純化瓊脂糖可使用由純化度低 ' 反牴土阿又種種瓊脂糖含量者0 原料物質包含上記之瓊脂之原料藻類、涼粉、瓊脂、純化瓊脂糖、純化瓊轉、以此等製造過料得中間產物或副產物。瓊脂糖為以交互結合之D-半乳靜盥干孔楯與3,6-脫水L_半乳糖為主構造之多糖，D-半乳糖之1位盥 n 、 ” 脫水L-半乳糖之4位為 /5 _糖甘結合，又，3,6-脫水半乳择夕；、干孔糖< 1位與D·半乳糖之3

O:\90\90175.DOC\LAN -11 - 1244923 :以α -糖苷結合。α胃丨一結合藉稀酸溫和加水分解及藉“· =月曰_[Carbohydr Res ]第66卷，第2〇7頁（MM)]加水分解，又，石-1，4結合藉由石_瓊脂酶選擇性加水分解。又角义膠，為含於杉海苔科、海松科、棘海苔科等之紅澡類之多糖，已知^角菜膠、又_角菜膠 ' 々_角菜膠。 Λ：-角菜膠具〇_半乳糖_4_硫酸之丨位與3,6_脫水_〇_半乳糖之4位以冷_糖谷結合，又，3,6-脫水_d_半乳糖之1位與D —半乳糖-4-硫酸之3位以α_糖苷結合交互地反覆之基本構造。入-角菜膠具D-半乳糖之丨位與〇-半乳糖'卜二硫酸之斗位以冷糖苷結合，又，D_半乳糖'6_二硫酸之丨位與D_半乳糖之3位以α -糖知結合叉互地反覆之基本構造。角菜膠做為食品之膠凝劑使用。上记之原料物質以化學性、物理性及/或酵素上之方法部分分解之物，包含於本發明之原料物質。作為化學上分解方法，可舉於酸性至中性之加水分解，作為物理上分解方法，可舉電磁波及超音波之照射，作為酵素丨生刀解方法，可舉藉由加水分解酵素例如瓊脂酶、角菜膠酶等之加水分解。原料物質於酸性至中性之分解條件只要為生成具有細胞凋亡誘發性、抑癌性、活性氧產生抑制活性、一氧化氮（以下稱為NO)產生抑制作用等之抗氧化活性或免疫調節活性等（式1〜6之化合物，含有至少丨種之此等化合物之可溶性糖化合物，例如瓊脂雙糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、/c _角菜雙糖（以下單稱為角菜雙糖）及召_D_吡喃半乳糖

O:\90\90175.DOC\LAN -12- 1244923 基-3,6-脫水_2_〇_甲基心半乳糖等之糖化合物，又其非還原末端為L-半乳糖_6•硫酸以外之糖之具選自式^化合物之化合物於還原末端之糖化合物之條件即可，並無特別限定。例如’將原料物質溶解或懸浮於酸巾，藉使其反應，生成選自本發明所使用之式卜6之化合物，含至少⑽之此等化，物（可溶性糖化合物。χ，藉由於反應時加熱，使生成選自式1〜6化合物之化合物及含至少—種之彼等之化合物之可溶性糖化合物所必須之反應時間縮短。乂將原料物質’例如瓊脂糖及含有瓊脂糖之物質溶解或懸浮之酸之《並無特職定，可使用鹽酸、硫酸、硝酸等之無機酸、檸檬酸、甲酸、乙酸、乳酸、抗壞血酸等之有機酸或陽離子交_脂、陽離子交換纖維、陽離子交換膜等之固體酸。酸之濃度亦無特別限定’可以〇〇〇〇1〜5當量濃度，較佳 0.001 1备里/辰度使用。又反應溫度亦無特別限定，設定於〇〜20(TC，較好20〜13(rC即可。又，反應時間亦無^、，設定於數秒〜數日即可。酸之種類與濃度，反應溫度及反應時間，只要由含有至少1種選自作為原料之式卜6化合物之物質，例如選自瓊脂糖、角菜膠等之種類及作為目：之式 1〜6化合物，含有此等化合物之糖化合物之生成量，作為目的之具選自式1〜6化合物於還原末端之可溶性糖化合物之聚合度加以適宜選擇即可。一般，藉由選擇強酸、高濃度之酸、高溫比弱酸、低濃度之酸、低溫可使酸分解反應快速進行。〇：\9〇\9〇 17 5. D〇C\LAN -13- 1244923 又，使用固體酸之情形，強陽離子交換樹脂比弱陽離子交換樹脂，分解反應之效率佳。又，相當之原料物質之使用嚴忽多，或作用溫度愈咼，酸分解反應愈快速進行。例如，將瓊脂懸浮於0.1N HC1為10重量％，於i00°c加熱洛解13分，除去不溶物所得之使用於本發明之糖化合物溶液，即使冷卻，於其結冰點，已經不含膠凝。將含於此液中之糖類以凝膠過濾HPLC、正相HPLC等方法分析，則幾乎不見鬲分子之糖類，大部分分解成可溶性之丨〇糖以下之糖化合物。同樣地，固定酸之情形，將市售之強陽離子交換樹脂之Na型之1份重量以iN HC1做成H型後，加入79份重量之去離子水中，再將瓊脂以1〇份重量加入懸浮，於95。〇加熱180分所得之本發明之糖化合物溶液，即使冷卻，於其結冰點已經不會膠凝。將會於此液之糖類以凝膠過濾HpLc、正相HPLC等之方法分析，則幾乎不見高分子之糖類，大部分分解成可溶性之10糖以下之糖化合物。又，製造具選自本發明中使用之式卜6化合物之化合物於運原末端之可溶性糖化合物之時，使用檸檬酸、乳酸、蘋果酸等之有機酞，藉由酸之濃度由1〇〜數Μ，加熱溫度由70〜95°C，加熱時間由數10分〜24小時之範圍加以適宜選擇，大量地生成具有生理活性之寡糖例如抗氧化用寡糖。又万；加水为解後，藉由維持酸性，使不為鹼性條件下，生成之该生理活性寡糖顯示長期間之保存安定性。作為選自本發明使用之式1〜6化合物之化合物，含至少1 種《此等化合物之可落性糖化合物，例如瓊脂雙糖、壤脂

O:\90\90175.DOC\LAN -14- 1244923 四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、& _角菜雙糖及万_D_吡喃半乳糖基-3,6-脫水_2_〇_甲基心半乳糖等之糖化合物，可使用原料物^分解物，或中和之使用亦可，另外亦可純化後使用選自式1〜6化合物之化合物，具該化合物於還原末端之 ^性糖化合物’例如壤脂雙糖、壤脂四糖、壤脂六糖、夏月印糖/c -角菜雙糖、及比喃半乳糖基6·脫水 -2-0-甲基·]：_半乳糖等之寡糖，可以細胞调癌活性為指標加以純化。、 u作馮、、死化手段，可使用化學性方法，物理性方法等 > 人4 、 A知乏純化手段，藉由凝膠過濾法， t子量級分膜之級分法、溶媒抽出法、使用離子交換樹脂寺（各種層析法等之從來公知之純化方法之組合，可將選

自為酸分解物中生成L 玍成又目的冬細胞凋亡謗發性物質之式 1〜6化合物之化合物，本s 、、口土 y 1種乏孩化合物之可溶性糖化合物純化。如此所得之化合物之構造，以質量分析法、核磁共振法、紫外吸收光譜之敎、紅外吸收光譜之測定等之公知方法可以解析。為本發明之有效成分之1例之瓊脂雙糖、D-半乳糖之以與3,6-脫水-L-半乳糖之4位為以糖誓鍵結合之冰。 3,6-脫水七半乳糖以位為環口異構糖碳，所以存在“型與々型，任-者皆包含於本發明所使用之瓊脂雙糖中。又，使選自作為本發明有效成分使用之式1〜6化合物之化合物具有還原末端之糖化合物，為選自該式“化合物之化合物之⑽以外之«上鍵結糖之物，只要具細㈣亡誘發

O:\90\90175.DOC\LAN -15- 1244923 /舌性、抑癌活性、活性氧產生抑制活性、N〇產生抑制活性等之抗氧化活性及/或免疫調節活性者即可，並無特別限制例如可舉為原料物質之分解物例如瓊脂糖之酸分解物及-瓊脂酶分解產物之瓊脂雙糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、 %脂八糖、瓊脂十糖及冷-D-吡喃半乳糖基_3,6_脫水_2-〇-

甲基-L-半乳糖等。又，可舉角菜膠之酸分解物及角菜膠酶分解物，例如，角菜雙糖。另外，選自葡萄糖、甘露糖、半礼糖等 < 六碳糖、木糖、阿拉伯糖、核糖等之五碳糖、葡糖酸酸，半乳糖酸酸、甘露糖酸酸、古洛糖酸酸等之糖 _ 、胺基葡糖、胺基半乳糖等之胺基糖，Ν_乙酸神經胺酸等夂唾液酸、黑角藻糖等之去氧糖，此等之酯、醯胺及内酯之糖1個或複數個鍵結於選自式丨〜6化合物之化合物之 1位以外之《者亦包含於本發明之具選自式Η化合物之化合物於還原末端之糖化合物。另外，具選自此等之式1〜6 化合物之化合物於還原末端之糖化合物，例如瓊脂雙糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瑄脂八播

夏細八糖、κ _角菜雙糖及冷_D-吡喃半乳糖基- 3,6-脫水_2-〇_甲其τ在受丨撼！、/丨人 — ^ τ卷_L-牛礼搪寺芡糖化合物上鍵結丙酮酸及/或硫酸基者，又該糖化合物之羥基經甲基化者，亦包含於本發明之具選自U〜6化合物之化合物於還原末知之糖化合物。又，如μ二 .1 r. ^ 如上圮，於本發明具選自式1〜6化合物之化合物於還原末端> 4古^人此土、、 7木搪化合物，較佳地其非還原末端為L-半乳糖-6-硫酸以外之择。 2-0-甲基化物於還原末端之之1位為環口異構糖碳，所以具3,6-脫水吡喃半乳糖或其糖化合物之这原末端之化合物

O:\90\90175.DOC\LAN -16- 1244923 具該化合物於還原末端之糖化合物存在❹型與点型，任一者皆可作為具3,6-脫水,比喃半乳糖或其2办甲基化物於還原末端之糖化合物於本發明使用。又，只要具細胞凋亡謗發活性、抑癌活性、活性氧產生抑㈣性、N 0產生抑㈣性等之抗氧化活性及/或免疫調節活性等之生理活性，則對分子量並無特別限制。作為選自本發明使用之式卜6化合物之化合物，具該化合物於還原末端之糖化合物之還原末端之化合物，當然亦可

使用α型、点型、醛化物型、水合型之混合物及D_型、型之混合物等。如此本發明使用〈選自式卜6化合物之化合物，具該4 I物万、延原末袖之糖化合物，具有細胞凋亡誘發活性、才癌/舌性、活性氧產生抑制活性、過氧化脂質其產生抑制性、NO屋生抑制活性等之抗氧化活性免疫調節活性、抗土敏活除才艮據本發明首先提供含有選自式了〜6化合物之化^

物及選自具該化合物於還原末端之可溶性糖化合物之至」種化口物為有效成分之用於治療或預防對至少^種之此，化合物顯示感受性之疾病之醫藥組合物，例如此等疾病；治療劑或預防劑。么乍為對此等化合物顯示感受性之疾病包含例如需要誘養〈疾病、癌性疾病、需要抑制活性氧產生之疾病、、、制過氧化月曰質基產生之疾#、需要抑制漏產生之名 I:或調節免疫之疾病，包含例如過敏性疾病，本㈣ '、或予’、防用醫藥組合物可做為細胞凋亡誘發劑、抑癌

O:\90\90175.DOC\LAN -17- 1244923 劑：活性氧產生抑制劑、過氧化脂質基產生抑制劑、一氧化氮產生抑制劑等之抗氧化劑、抗炎症劑、免疫調節劑、抗過敏劑等。例如，本發明之細胞凋亡謗發劑有效於排除自體免疫疾病w者之自反應性淋巴球、癌細胞、病毒感染細胞等，藉於所望之組織、細胞表現細胞凋亡，可將不要或有害之、’、田月L*以自然之形式自生體排除。作為本發明之細胞调亡謗發劑有效之疾病，可舉例如全身性紅斑性狼瘡、免疫中介性腎小球性腎炎、多發性硬化症、膠原病等之自體免疫疾病，及濕性關節炎等。本發明之細胞凋亡誘發劑，可使用於細胞凋亡誘發方法’該方法有用於細胞凋亡誘發機制之解明，細胞调亡謗發劑、細胞凋亡謗發抑制劑之篩選等。又，藉由本發明之細胞凋亡謗發劑之細胞凋亡誘發作用藉由Caspase之抑制劑例如抗IL-1 /5酶，抑制劑 -V[Z-Val-Ala-DL-Asp(OMe)-氟甲基酮：寶酒造社製]抑制，所以可認為是藉由依賴Caspase之細胞凋亡之細胞死。此Caspase於種種之細胞死之時先行提高，藉由其之過份表現，謗發細胞死，由於藉由肽抑制劑及為抑制蛋白質之 CrmA、p35抑制細胞调亡’及於Caspase-1、Caspase-3剔除之小鼠抑制了正常可見之細胞凋亡之一部分，所以明白作為細胞凋亡之重要介體發揮機能「生化學，第70卷，第14〜21 頁（1998)」。亦即，於細胞凋亡之過程，為半胱胺酸蛋白酶之Caspase被活化，將核及細胞溢之蛋白質分解。Caspase首 -18-

O:\90\90175.DOC\LAN 1244923 先口成為則驅體，藉由剪接成活化型。此至〔⑸沖％之活化之&制决定細胞之生死。於哺乳類存在10種以上之

Caspase ’上位之CasPase剪接下位之Caspase，所以細胞内蛋白質分解活性雪崩式地擴增[細胞工學，第口卷，第 75 8 80頁（1998)]。相反地，以為半胱胺酶之c抑制劑將其剪接活性抑制，則可停止藉由〜㈣依賴型之細胞洞亡之細胞死。使用糸本發明之化合物，有用於例如活性氧之產生抑制以省化合物為有效成分之活性氧產生抑制劑等之抗乳化劑有用於治療或預防活性氧之產生及/或過剩為起因之疾病。活性氧可大分類為自由基與非自由基之活性氧。自由基系統活性氧中有羥基自由基、羥基過氧基自由基、過氧基自由基、烷氧基自由基、二氧化氮（N〇2)、N〇、嘧璐自由基、過氧化物。-方面，於非自由基系活性氧，有單氧、過氧化氫、脂質氫過氧化物、次氯酸、臭氧、過氧亞硝酸。任何-者皆與許多之病態，亦即各種炎症性疾病、糖尿病、癌、動脈硬化、神經疾病、貧血再灌流障礙等有關。於生體内不斷地以幾個途徑生成低濃度之活性氧。此為生理上自粒線體等之電子傳達系漏出之過氧化物與過氧化氫、銅及鐵等之遷移金屬催化之藉由羥基自由基、嗜中性球及單核球等生成之供預防感染用之次氯酸、精胺酸之分解而生成之NO等，任一者皆為不可避免的。對於此等之活性氧生成，生體具有作為活性氧消去系之酵素、低分子化 O:\90\90175.DOC\LAN -19- 1244923 。物料生成與消去之平衡。然而，此等途徑不知何種原因被活1相反地消去隸失活化，活性氧生成系相對、消去系具優勢《情形，生體變成受到氧化性障礙。將如 :之狀態稱為氧化應力。另夕卜’不只是生體内失去平衡之 ’“ ’大氣與食品等之生體外之物亦常使生體受到氧化應力，於日常生活上無法避免氧化應力。 “ 亦即，氧化應力如上記般，與種種疾病有關，生體常暴 =於來自氧化應力之疾病，或與疾病之惡化有關之狀況;; 從而，對於如此之氧化應力引起之疾病之預防、治療或惡化之防止，本發明之抗氧化劑例如活性氧產生抑制劑皆^ 有用。又，必定職氧化應力者為脂質過氧化反應，此反應為過氧化脂質自由基可能的話一舉進行之反應。因此，：成 =4-羥基_2_壬烯醛（HNE)為以谷胱甘肽及蛋白質為特異性標：之毒性醛。其之與麵及與蛋白質之反應生成物於各種届’悲組織檢出’被認為是否為與氧化應力有關之疾病病態《4發因+。因此’含有於可抑制過氧化脂質自由基之生成之本發明中使用之抗氧化物質之抗氧化劑，有用於預防及治療藉由氧化應力之生活習慣病疾病。 NO為來自内皮細胞之血管平滑肌鬆弛因子（edrf)之本體[Nature’第327卷第524〜526頁（1987)]。根據本發明，提供需要抑制NO產生之疾病治療劑或預防劑。於本發明，需要抑制NO產生之疾病，並無特別限制，例如有毒性休克及藉某種細胞活素之治療等引起之全身性低

O:\90\90175.DOC\LAN -20- 1244923 血壓，血壓反應下降，自體免疫疾病，炎症，關節炎，風濕性關節炎，糖尿病，炎症性腸疾病，血管機能不全，病因性血管擴張，組織損傷，心血管系貧血，痛感過敏症，腦缺血，伴隨血管新生之疾病，癌等，包括記載於特表平 9-504524號、特表平9-505288號、特表平8-501069號、特表平8-512318號、特表平6-508849號之各公報之疾病。於自L-精胺酸與氧產生L-瓜胺酸與NO之NO合成酵素 (NOS)中，有常發現之cNOS與衍生型之iNOS。於巨噬細胞等，iNOS藉由細胞毒素及細胞活素（LPS，INF - τ等）之刺激而衍生，產生NO。iNOS本身於生體系之維持，不能不存在。然而，一方面，由於種種之要因，必要以上地過量表現，藉由產生過量之NO，已明白引起種種之疾病。本發明者等於藉由西方吸潰法以蛋白質之層次，藉由 RT-PCR以信使-RNA層次確認選自式1〜ό化合物之化合物及具該化合物於還原末端之可溶性糖化合物，例如瓊脂雙糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖抑制此iNOS之表現。亦即，於本發明使用之化合物，藉由抑制由於種種要因過量地表現而產生過量NO之iNOS之表現，有效於治療及預防需要抑制NO 產生之疾病。本發明化合物抑制巨嗟細胞產生Ν Ο，有用於治療、預防起因於巨嗟細胞產生Ν Ο之疾病、炎症、癌等。又，本發明使用之糖化合物之NO產生抑制並非對於為NO產生謗發物質之LPS及INF-τ之拮抗抑制。藉預先加使用於本發明之糖化合物，可見NO產生抑制效果之增強，本發明之化合物作 O:\90\90175.DOC\LAN -21 - 1244923 為抗氧化物質之產生抑制之預防劑，極為有用。本發明之NO產生抑制劑，有用於1^〇產生機制研究，N〇作用機制研究，又，亦可用於有關1^〇產生機制之物質之篩選。固形癌之增大，必須血管新生，血管内皮增殖因子/血管透過性几進因子（VEGF)於此過程扮演重要角色。於種種癌細胞藉由NO衍生VEG。本發明iN〇產生抑制劑，藉抑制1^〇產生，亦抑制癌細胞之VEG產生，其結果，於癌組織周邊之血笞新生受抑制。將本發明之N〇產生抑制劑投予皮下移植癌細胞使形成固形腫瘍之小鼠，則癌組織之周邊血管之形成變成不充分，癌脫落。亞硝胺為於2級胺上附加亞硝基之一群化合物，已知有數百種，其中許多藉由對DNA損傷，對動物顯示發癌性。亞硝胺對人類之發癌亦深深有關，通常於胃中藉由亞硝酸鹽與胺之反應而生成。NO於pH中性之生理條件下亦與胺反應，生成亞硝胺。又，於疫學上與癌之關係很高之肝吸蟲感染患者及肝硬變患者，NO產生為亢進的。從而，藉由投丁本發明之NO產生抑制劑，防止NO產生之尤進，尤其可予写防高危險群之發癌。如以上，本發明之NO產生抑制劑於發癌之抑制及於癌組織之抑制血管新生之2階段，顯示抑癌作用。 NO又誘發炎症性病變上被認為特徵性之浮腫，亦即血管透過性亢進作用[Madea 等，Japanese Journal of Cancer Research)第85卷，第331〜334頁（1994)]，又使為炎症性介質 O:\90\90175.DOC\LAN -22- 1244923 之前列腺素類之生合成尤進[以丨〜血以等，pr〇ceedngs 〇f

National Academy of sciences，USA)第 9〇卷，第 724〇〜7244 ’、（1993)]方面’ N〇與過氧化物自由基快速反應，生成過氧亞硝酸離子，過氧亞硝酸離子亦被認為是引起炎症性之細胞、組織障礙。活性化之免疫細胞進入臟器，放出細胞活素則誘發N〇之產生胰島素依賴型糖尿病為藉由特異性地破壞胰島石細肊而引起之疾病，被認為為藉由N〇之破壞。又，伴隨慢性關即性風濕病、變形性關節風濕病、痛風性關節炎，貝賽特氏病（BehCet，s Disease)之關節炎之患者之病變部之關節液與該患者之正常關節及健康常人之關節之關節液相比，含高濃度 NO才又予此等患者本發明之N〇產生抑制劑，則抑制於病變部之NO產生，改善症狀。 ' 於腦缺血及再灌流後，N〇產生增大，伴隨這些，腦組織受損傷。腦缺血時，藉投予患者本發明之N〇產生抑制劑，則腦組織之損傷減輕，改善預後。本發明 < 免疫調節劑具淋巴球胚細胞化反應抑制作用，混合淋巴球反應抑制等之免疫調節作用，本發明之免疫調節劑有用於作為免疫因子之異常為起因之疾病之治療劑或預防劑。於此，淋巴球胚細胞化反應，為分裂素結合於淋巴球表面之受體，使淋巴球活化，促進其之分裂、增殖之反應。混合淋巴球反應為藉由混合培養由同種異系動物所得之、林

O:\90\90175.DOQLAN -23- 1244923 巴球’身發藉由主要組織適合抗原之不—致之淋巴球之活〜促進淋巴球〈分裂、增殖。本發明之免疫調節劑抑制等〈反應’特刎有用於起因於淋巴球之異常亢進之自體她生疾病，例如慢性腎炎、潰癌性大腸炎、ί型糖尿病、 k f生風關即炎等《慢性疾病之、治療或預防，又於移植片排斥反應之抑制亦有用。由抗原之結合釋放誘發脫即時型過敏反應，於由氣患者’具大的任務，抑制 ’被認為極有效於治療及以IgE抗體敏化之肥大細胞藉顆粒之化學介質。此之I型，亦即喘與異位性皮膚炎所代表之過敏自肥大細胞釋放化學介質之物質預防此等過敏疾病。為I型過敏反應之模式夕士白、心悮式又大机文動皮膚過敏反應（PCA)自肥大細胞之脫顆粒開始接基#罢、人Ά 闹知接者釋放含於顆粒中之組織胺、 5_羥色胺等之化學介質，引翹、貝51起血$透過性 < 冗進，最後使皮膚局部發生色素漏出之庫。及I 本挺式為現在作為活體内之抗過敏劑之評估模式中最繁用者。選自式1〜6化合物之化合物及具該化合物於還原末端之可冷f生糖化口物具PCA抑制作用，根據本發明提供以選自式 1 6化口物《化合物及選自具該化合物於還原末端之可溶性糖化合物之至少1種化合物為有效成分之抗過敏劑。此㈣敏劑於藉由抑制1型過敏反應得以治療之疾病例如支氣管氣％、異位性皮廣火、两 > 鱼、反膚火、過敏性鼻灸、花粉症、蓴麻疹、接觸性皮膚炎、過敏性处、戢f生、、、口艇火寺芡治療、預防上極為有用。

〇A90_75.DOC\LAN -24- 1244923 上§己之本發明之治療用或預防用醫藥組合物，例如細胞调亡誘發劑之製造可將選自式卜6化合物之化合物及選自具孩化合物於還原末端之可溶性糖化合物之至^種&合物為有效成分’與公知之醫藥用載劑組合製劑。般而3 ’將此等化合物與藥學上可容許之液狀或固體狀，劑摻合，且按須要加溶劑、分散劑、乳化劑、緩衝劑、 ld賦开m、黏合劑、崩散劑、潤滑劑等，可做成錠劑、顆粒劑、散劑、粉末劑、膠囊劑等之固形劑、通常液劑、懸浮劑、乳劑等之液劑。、 d 又了將此做為於使用前添加通當載劑即得以成液狀之乾燥品。、、本發明之細胞祠亡誘發劑，可藉由經口劑及注射劑、點滴用劑等之非經口劑之任一者投藥。、醫藥用載劑可按上記投藥形式及劑型加以選擇，經口劑 (情形’利用澱粉、乳糖、白糖、甘露糖、羧甲基纖維素、玉米殿粉、無機鹽等…於製備經口劑時，亦可另摻合黏合劑、崩散劑、界面活性劑、潤滑劑、流動性促進劑、鱗味劑、著色劑、香料等。一方面’非經口劑之情形，依習用法，可將為本發明有效成分之具細胞调亡誘發性之糖化合物溶解乃至懸浮為稀釋劑之注射用蒸餘水、生理食鹽水、葡萄糖水溶液、 >王射用植物油、麻油、花生油、大豆油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇等，按須要加殺菌劑、穩定劑、等張劑等而製備。 ^ 本發明之細胞调亡誘發劑以適合製劑形式之投予途徑投

O:\90\90175.DOC\LAN -25- 1244923 樂。投予方法亦無特別限定，射背彳可以例如靜脈内、肌肉内劑亦包含栓劑等。可以内用、外用及注射。注、皮下、皮内等投藥，外用 /發明之細胞调亡謗發劑之投予量，可依其製劑形式、投予方法，使用目的及適用於此之患者之年齡、體重、症 :大而適宜設定，並非一定’一般製劑中含有之有效成分之里夂’成人每日U)微克〜毫克/公斤。當然，投予量依種種條件而異，所以亦有比上記投予量少之量即為充分之情形’或亦有必要超過此範圍之情形。本發明之藥劑照原樣經口投予外，亦可添加於任意之飲食品使日常性地攝取。本發明之抑癌劑之製造，可以選自式丨〜6化合物之化合物及選自具該化合物於還原末端之可溶性糖化合物之至少 u 1種化合物為有效成分，將此與公知之醫藥用載劑組合，製即可。抑癌劑之製造按照上記細胞凋亡謗發劑之製造方法進行。作為抑癌劑，以適合製劑形式之投予途徑投藥。投予方法亦無特別限定，可以内用，外用及注射。注射劑可以例如靜脈内、肌肉内、皮下、皮内等投予，外用劑亦包含栓劑等。作為抑癌劑之投予量，依其製劑形式，投予方法、使用目的及適用於此之患者年齡、體重、症狀而適宜設定，並 ”’、足—般會於製—中之有效成分之量為成人每日1 〇微克〜200¾克/公斤。當然，投予量依種種條件而異，亦有比上記投予量少即充分之情形，或亦有必要超過範圍之情

O:\90\90175.DOC\LAN -26- 1244923 形。本發明之藥劑照原樣經口投予外，亦可添加於任意、飲食品’使曰常地攝取。又’本發明之抗氧化劑，活性氧產生抑制劑、過氧化脂質自由基產生抑制劑、N0產生抑制劑、免疫調節劑、心敏劑可依上記細胞凋亡謗發劑製造，用量、 ° 州凌依上記細胞凋亡謗發劑使用即可。亦即，作為抗氧化劑、活性氧產生抑制劑、過氧化脂皙自由基產生抑制劑、N◦產生抑制劑、免疫調節劑或抗= 劑，按製劑形式以適當投予途徑投予。投予方法亦無特別限定，可以内用、外用及注射。注射劑可以例如靜脈内力、肌肉内、皮下、皮内等投予，外用劑亦包含栓劑。抗氧化劑、活性氧產生抑制劑、過氧化脂質自由基產生抑制劑、NO產生抑制劑、免疫調節劑或抗過敏劑之投予量，依其製劑形式、投予方法，使用目的及適用於此之患者里年齡、體重、症狀而適宜設定，並非一定，一般含於製劑中之有效成分為成人每日1〇微克〜2〇〇毫克/公斤。當然，投予量依種種條件而異，亦有比上記投予量少之量即充分之情 ^或亦有必要超過範圍之情形。本發明之藥劑除照原樣經口投予外，亦可添加於任意之飲食品，日常性地攝取。其次，本發明之飲食品為含有選自式i〜6化合物之化合物及選自含该化合物之可溶性糖化合物之至少丨種化合物，例如選自由原料物質於小於pH 7之酸性下之酸分解及/或酵素分解生成之瓊脂雙糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、 K -角菜雙糖及召吡喃半乳糖基-3,6-脫水_2_〇_甲基半

O:\90\90175.DOC\LAN -27- 1244923 扎糖等之糖化合物之至少丨種化合物，添加及/或稀釋所成之良或飲良，藉由其之細胞凋亡誘發作用、抑癌作用、抗氧化作用、免疫調節作用等’極有用於改善、預防對選自式1 6化合物之化合物及含有該化合物之可溶性糖化合物、V 1種頬7感文性之疾病，例如需要謗發細胞凋亡之疾

' 士丨生疾病、而要抑制活性氧產生之疾病、需要抑制NO 產生《疾祸、需要免疫調節之疾病、過敏性疾病等之症狀。、本1明《食品或飲料之製造方法，無特別限定，可採用

° 加工及一般所用之食品或飲料之製造方法，製造之食品或飲料中含選自式1〜6化合物之化合物及選自且該化合物於還原末端之可溶性糖化合物之至少_ 選自藉原料物質於小於7>妒w ::7《故性下之酸分解及/或酵素分南半乳糖基'一〇-甲…乳 ° 土〆1種化合物為有效成分即可。本發明又飲食品並無特別限

如小麥粉力…i _加工品加工品(例通心粉類、麵包類、餘類、麵條類、麵、料,麵類、隸等）、油脂加工品（例如可塑性 ::τ加味品等)、大豆加工品(例如豆腐類、生寺）、食品加工品（例如火腿、培根、加壓火腿夭内旦水產製品⑼如冷料魚肉、 I 4等）、字丸子、薩摩油豆腐…二τ丸、魚肉、山魚、魚卵加工品、水產心肋'魚肉火腿、香腸、柴水屋麵頭、细煮等）、乳製品（例如原料乳、

O:\90\90175.DOC\LAN -28 - 1244923

奶精、養樂多、床、A :木夕牛油、乳路、煉乳、粉乳、冰洪淋等)、蔬 Λ加工品(例如菜糊類、果醬類、酶潰物類、果料、蔬菜飲料、混合飲料筈〗#早来r 只人科寺）、果子類（例如巧克力、餅乾類、本酒Π:蛋叙::餅菓子、米菓類等)、酒精飲料(例如曰地:钍國酒、葡萄油、威士忌、米酒、伏特加酒、白蘭他、A、子酒、甜酒、啤酒、清涼酒精飲料、果實酒、立 t類等)/嗜好飲料（例如綠茶、紅茶、烏龍茶、咖啡、清、:'酸飲料等)、調味料(例如醬油、調味汁、醋、料且、、•裝瓶裝袋裝食品（例如牛飯、爸飯、赤飯、咖哩、種已調理之食品）、半乾燥或濃縮食品⑼如肝糊、 :二空麵包料、麵條、烏龍麵之汁、濃縮湯類)、乾燥食 /即席麵類’即席咖哩、即溶咖啡、果汁粉末、湯汁理之〉席旦醬汁’已調理之食品、已調理之飲料、已調 )^凍艮"口（例如寻喜燒、茶碗蒸、烤鰻魚片、鐵口/土、燒買、餃子、各種牛排、水果難尾酒等卜固形食 =液體食品(例如湯等)、香辛料類等之農產、林產加工品、田屋加工品、水產加工品等。入本::明之飲食品中含選自式“化合物之化合物及選自 1 合物於還原末端之可溶性糖化化合物之至少！種化 Π吝例如選自由原料物f於少於PH 7之酸性下酸分解及7 二/'分解生成之瓊脂雙糖、瓊脂四冑、瓊脂六糖、瓊脂其^、、=/角菜雙糖及Π口比喃半乳糖基-3,6-脫水_2_〇_甲 “ /t,糖寺《糖化合物之至少1種以上之化合物，加以添 P 3 #釋’只要含有供表現其之生理機能之必要量，則

O:\90\90175.DOC\LAN -29- 1244923 其形狀無特別限定，亦包含錠劑狀、顆粒狀、膠囊狀等之形狀之可經口攝取之形狀物。 3,6-脫水吡喃半乳糖或其之2-0-甲基化物及具該化合物於還原末端之糖化合物，半縮醛易於開環，末端易得醛。此醛及3,6-脫水吡喃半乳糖之醛化物之醛易於與具有反應於酸之反應性之化合物，例如如胺基酸等之親核性物質反應，經反應之式1〜6化合物或糖化合物，例如寡糖變成失去還原末端之選自式1〜6化合物之化合物之狀態。因此，選自式1〜6化合物之化合物及具彼等之化合物於還原末端之寡糖失去所有之種種生理活性。亦即，於飲料或食品中使選自式1〜6化合之化合物及選自具彼等之化合物於還原末端之糖化合物之化合物保持穩定，有必要將對此等之醛顯示反應性之化合物之莫耳濃度保持比此等之醛之莫耳濃度低之狀態。因此，於本發明之食品或飲料之製造，藉由對從來未控制之對此等之醛顯示反應性之化合物量進行控制，使選自式1〜6化合物之化合物及選自具該化合物於還原末端之寡糖之化合物實質上無減少，可提供高量含有此等化合物之食品或飲料。又，發現選自式1〜6化合物之化合物及選自於具該化合物於還原末端之糖化合物之還原末端之該式1〜6化合物之化合物，於酸性下為穩定，本發明之食品或飲料之製造方法於酸性下進行全部過程，藉由將所得之食品或飲料做成酸性食品或酸性飲料，可提供高量含有選自式1〜6化合物之化 O:\90\90175.DOC\LAN -30- 1244923 «物及選自具M化合物於還原末端之可溶性糖化合物之至少1種之化合物之酸性食品或酸性飲料。於本發明（酸性食品或酸性飲料之製造，對將原料物質酸分解之酸之種類無特別限制，亦可使用有機、無機之任何《酸’但所仔〈瓊脂酸分解物之風味以有機酸分解物者為佳，藉適宜地使用有機酸可得新穎之風味之酸性分解物。作為有機酸，按目的加以選擇即可，亦可單獨或併用2 種以亡。作為有機酸，例如乙酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、酒石酸、號箱酸、富馬酸等為適宜。分解條件並無特別限定，使用有機酸如檸檬酸之情形，將原料物質例如壤脂之酸分解於6G〜13G°C，較好95〜1G5t，進行3〜则分，較好 30〜200分，有機酸之酸味變化，成為味道之平衡佳，舌觸感為圓的、滑溜之酸味組合物。有機酸量為〇〇5〜3〇重量％，口且地為0.2〜10重，選自式卜6化合物之化合物及選自具該化合物於還原纟端之可溶性糖化合物之i少、i種化合物之含有量為_重量％，合宜地為5〜15重量％含量所成之加熱處理物為較佳酸味之酸味料。所得之酸味料於清涼飲料酸性調味料、酸性食品等之製造極為有用。本發明 < 酸性食品或酸性飲料含多量具生理活性之選自式1〜6化合物之化合物及選自具該化合物之可溶性糖化合物之至少1種化合物，例如藉由原料物質於少於7之酸性下酸分解及/或酵素分解而生成之瓊脂雙糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、角菜雙糖及点_D_吡喃半乳糖基_3,6_ 脫水2 Ο曱基-L-半乳糖等之糖化合物，此等具有細胞调亡 O:\90\90175.DOC\LAN -31- 1244923 绣發作用、抗癌作用等之生理機能，藉由攝取這些為有預防發癌、抑制癌等效果之食品或飲料。亦即，本發明之酸性食品或酸性飲料為對選自式卜6化合物之化合:及選自具該化合物之可溶性糖化合物之至h種化合物顯示咸受性〈疾病顯示症狀改善作用或預防作用之健康食品或飲料，尤其為對胃腸健康之保持有用之食品或飲料。

又’本發明之選自式卜6化合物之化合物及選自含該化合物之可溶性糖化合物之至少化合物，例如藉由原料物質於少於pH 7之酸性下之酸分解及/或酵素分解生成之壤脂雙糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、f角菜雙糖及石办吨喃半乳糖基·3,6-脫水_2_◦甲基_L_半乳糖等之糖化合物具^活性氧產生抑制作用、過氧化脂f自由基產生抑制作用寺 < 抗氧化活性，可作為例如、抗氧化用食品用之抗氧化劑或抗氧化用飲料用之抗氧化劑，例如活性氧產生抑制 d過乳化脂質自由基產生抑制劑、N〇產生抑制劑，使用於抗氧化用食品或抗氧化用飲料之製造。

^ 根據本發明，提供含有選自式1〜6化合物之化合物及選自含該化合物之可溶性糖化合物之至少ι種化合物為有效：分之抗氧化劑，尤其是飲食品用之抗氧化劑。 2I明 < 抗氧化劑之劑型並無特別限定，依添加對象之良之種頒，依習用法可做成粉末狀、糊狀、乳化物等 2適且一型，含選自本發明使用之化合物及糖化合物之化口物為有效成分〈抗氧化用飲食品，藉使用本發明之抗氧化劑可簡便地製造。、

O:\90\90175.DOC\LAN 32 - 1244923 根據本發明另提供選自式丨〜6化合物之化合物及選自含孩化合物之可溶性糖化合物之抗氧化用糖。例如，該抗氧化用糖可作為原料物質於少於pH 7之酸性下之酸分解物及/ 或酵素分解物而得。又可使用其之純化物、部分純化作為原料物質可單獨使用來自紅藻類之原料物質例如瓊脂、瓊脂糖、角菜膠等或併用2種以上。無特別限定，代表性抗氧化用糖可例示含有選自式丨〜6化合物之化合物之可溶性糖化合物，例如瓊脂雙糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、/c _角菜雙糖及沒_D_吡喃半乳糖基_3,6•脫水_2_〇_ 甲基-L-半乳糖等之抗氧化用糖。本發明之抗氧化用糖有用於生體内之氧化物質，例如活性氧之除去及產生抑制，該抗氧化用糖有用於起因於活性氧之產生及過剩之疾病之症狀改善或預防。如上記，於生體内活性氧生成系相對於除去系為佔優勢之情形，生體由於受到氧化性障礙產生之氧化應力與種種疾病有關，生體常遭受與藉由氧化應力之疾病或疾病之惡化有關义狀況 '因而，如此之氧化應力引起之疾病之預防、治療或惡化防止，每日攝取適度之抗氧化物質為所期望。母曰攝取適度之量，希望自飲食品攝取，含有稀釋及/或添加本發明 < 抗氧化用糖，所成之飲食品作為抗氧化用食品或抗氧化用飲料，或作為抗氧化應力食品或抗氧化應力飲料，極為有用。 k自用於本务明之化合物及糖化合物之化合物亦具保水 I4生以此等之至少1種化合物為有效成分，可製造抗便秘

O:\90\90175.DOC\LAN -33- 1244923 ^抗便秘用食品、抗便秘用飲料。根據本發明，另提供以含選自式1〜6化合物之化合物於還 =末崎乏可溶性糖化合物，例如瓊脂雙糖、瓊脂四糖、瓊月曰’、糖、瓊脂八糖、K _角菜雙糖及m南半乳糖基_3,6_ ^ 〇甲基-L-半乳糖等之寡糖為有效成分之化粧料。該糖化合物可作為原料物質於少於pfl 7之酸性下之酸分解及/ 广酵素分解物而得。又，亦可使用其純化物、部分純化物。

為原料物貝’可單獨使用例如來自紅藻類之原料物質，例如瓊脂、瓊脂糖、角菜膠等，或併用2種以上。下為化粧料，以上記化合物為有效成分，可製備霜劑 1 ’夜、洗劑、顏面料、面膜等之基礎化粧料，口紅、粉^ 寺之化粧用化粧料、沐浴乳、肥息等之形式。又，對二

2效’可做成頭髮調整液、髮油、頭髮定型液、吹髮劑 ::::員髮塗膜等之頭髮製品及洗髮精、潤絲精、剛之旦用化粧品等之護髮製品之形式。摻合於化㈣白作用、保濕作用、抗氧化作科適宜決定民其他成分可使用摻合於通常化粧料者。又， =:用；保濕作用以鳩測定即可，例如可以特^ 7號公報記載之方法測定。本發明之化作用、活之保濕作用應用作用等化粧料由對皮膚之美白作用、保濕作用、抗性氧產生抑制作用、抗氧化應力作用、 \抗氧化作用、活性氧產生抑制作用、抗氧 ’顯示優越之性質。另外，根據本發明提供以選自式1〜6化合物之化合物及選

O:\90\90175.DOC\LAN -34- 1244923 自含該化合物於還原末端之可溶性糖化合物之至少丨種化合物，例如瓊脂雙糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、 K _角菜雙糖及点-D-吡喃半乳糖基_3,6_脫水_2_〇_甲基_L_半礼糖等之寡糖為有效成分之保鮮劑。該化合物可作為例如原料物質於少於pH 7之酸性下之酸分解物及/或酵素分解物 =得。又，亦可使用其純化物、部分純化物。作為原料物質可單獨使用含有選自來自紅藻類之式1〜6化合物之化合物之物質’例如瓊脂、瓊脂糖、角菜膠等，或併用2種以上。選自式1〜6化合物之化合物及選自含有該化合物於還原 f端之可溶性糖化合物之至少化合物，例㈣脂雙糖、夏月曰四糖、扠脂穴糖、瓊脂八糖、《_角菜雙糖及冷吡喃，乳糖基·3,6·脫水_2·〇-甲基.L·半乳_等之糖化合物具抗乳化作用、保鮮作用、㈣麵活性抑制仙，以此等為有效成分’依公知之製劑方法，可製造有效地防止食品變色、腐敗、氧化等之食品保鮮劑。本發明之保鮮劑，於種種食品、生鮮食品、加工食品等之味道及鮮度之保為有用。之化合物及選自含有，任何一者，以1克/ ’皆無確認急性毒性。 ’但本發明並非限於選自使用於本發明之式1〜6化合物該化合物之可溶性糖化合物之化合物公斤之投予量經口或腹腔内投予小鼠以下’舉實施例更具體說明本發明此等之實施例。【實施方式】實施例1

O:\90\90175.DOC\LAN -35- 1244923 (υ將市售瓊脂粉末（和光純藥社製）400毫克懸浮於1N HCl 20¾升’以電磁爐加熱溶解。冷卻溶解液，以他⑽使成pH 4。於此水溶液中加水使成4〇毫升，於12〇t處理4小時。此之酸分解液以NaOH使成pH 6.5，以〇·2微米（Corning 公司製）之濾膜過濾。以含56°C下處理30分之胎牛血清（JRH Bi〇science公司製）10%之11?]\41164〇培養基（〇113(：〇公司製）於3 7。〇下培養之人類前骨髓性白血病細胞HL-60 (ATCC CCL-240)以該培養基懸浮使成2500個/90微升將此懸浮液各9〇微升分注於96孔培養皿（Falcon公司製，對各別之懸浮液分別添加各1〇微升之上記之酸分解液、上記之酸分解液之1〇倍稀釋物及水，於37 C、5% C〇2存在下培養，培養開始後24小時及48小時，以光學顯微鏡觀察細胞之形態後，藉由按照「細胞凋亡實驗计畫書」「秀潤社，田沼靖一監修，第i 56頁（丨994)」之 MTT法，加5毫克/毫升之3-(4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5_二苯基四銼化溴（Sigma公司製）磷酸緩衝食鹽水溶液1〇微升，再繼績培養4小時，加含〇.〇4〜HC1之2-丙醇1〇〇微升，充分攪拌，於590 nm測吸光度，比較自測定之吸光度計算之生細胞數。此結果，於添加上記分解液及其之丨〇倍稀釋液之培養基，與添加水者相比，生細胞數顯著減少。又，於死細胞觀察到細胞凋亡小體。 (2)將瓊脂粉末400毫克懸浮於in HC1 20毫升，以熱磁爐加熱溶解，製備酸分解液。冷卻溶解液後，添加5〇擰檬 ,:^0\90175.D〇C\LAN -36- 1244923 酸緩衝液pH3 20毫升，以NaOH使pH為6.5，以0.2微米 (Corning公司製）之濾膜過濾，將酸分解液。將此之酸分解液及將此酸分解液稀釋10倍者，藉由與上記貫施例ΐ-(ι)相同方法，測定hl-60細胞之增殖抑制活性及細胞调ΤΓ誘發活性。其結果，此酸分解液亦顯示與實施例 1 -(1)記載之酸分解液約同等之癌細胞增殖抑制活性及細胞凋亡謗發活性。 (3) 將瓊脂粉末4〇〇毫克懸浮於1N HC1 40毫升，於沸騰水浴上溶解，得溶解液，將此溶解液分成八等份，於沸騰水浴上保持0、30、60、90、120、180、210分後，冷卻，以 2N NaOH調整 PH於 6.5。將分別之處理液藉與實施例1_(U相同方法，測定HL-60 細胞之增殖抑制活性及細胞凋亡謗發活性。其結果，有關〇分及30分處理液，顯示與實施例記載之酸分解液間等之活性，60分以上之處理液並無顯示兩活性。 (4) 分別將300毫克之瓊脂粉末懸浮於30毫升之1、0.5、 0.25、0.13、0.063、0.031、0·016、0.0078N 之 HC 卜於沸騰水浴上保持10分，製備溶解液。將此溶解液冷卻後，以2N NaOH調整pH於 6.5。

藉由與實施例1-(1)相同之方法，測定各別之處理液之 HL-60細胞之增殖抑制活性及細胞凋亡謗發活性。其結果，有關自1Ν(ρΗ 0.05)，至0.063N (pH 1.3)之鹽酸處理液，顯示與實施例1-(1)記載之酸分解液同等之活性。於小於 0.063N之HC1濃度，隨著HC1濃度下降，活性減少，於0.0078N O:\90\90175.DOC\LAN -37- 1244923 之HC1處理液，亦檢出兩活性。 (5)於40φ升之1N HC1&〇 12N狀丨中，分別添加4〇〇毫克 (¾脂粉末，於沸騰水浴上保持1〇分，製備溶解液。此溶解液以2N Na0H中和於ρΗ 6·5後，使用歇洛化因 (CellufinOGCLJS，以含有1〇%乙醇之02Μ…^進行凝膠過濾。對各別之溶離液，藉由與實施例1-(1)相同方法，測定HL-60細胞之增殖抑制活性及細胞凋亡謗發活性。又，增殖抑制活性如下記般測定為相對活性。有關添加各別之溶離液培養3天之HL-60細胞，藉實施例己載之ΜΤΤ法，求590 nm之吸光度（AbsT)。有關添加凝膠過滤用溶離液代替溶離液培養之HL-60細胞’藉實施例1 -(1)記載之MTT法，求590 nm之吸光度 (AbsC)。

相對活性：AbsC-AbsT 圖1表示瓊脂之0.12NHC1分解物之凝膠過濾之溶離圖。圖中縱軸表藉由酚硫酸法測定之溶離液中之糖含量（吸光度4 8 0 nm :白圈）或相對活性（黑圈），橫軸表溶離部分編號 (1份溶離部分為12毫升）。如圖1、圖2所示，瓊脂之酸分解物顯示癌細胞增殖抑制活性，又於死細胞觀察到細胞凋亡小體。圖1之溶離部分編號51〜64之溶離液’及溶離部分編號 65〜84之溶離液分別合併，製備細胞凋亡謗發用及/或抑癌用之糖化合物。圖2之溶離部分編號60〜78之溶離液，及溶離部分編號 O:\90\90175.DOC\LAN -38- 1244923 79〜95之溶離液分別合併，製備細胞凋亡謗發用及/或抑癌用之糖化合物。實施例2 (1)將市售瓊脂（Agar Noble，Difco公司製）1克懸浮於100 毫升之0.1NHC1，以電磁爐加熱至沸騰為止使溶解。冷卻至室溫，調成pH 6後，以寇司莫奈斯滤膜（Cosmonice Filter， Nacalai Tesque公司製）過滤，其滤液2毫升以以下之逆相HPLC分離。管柱：TSK-凝膠ODS 80Ts(20毫米x250毫米，東梭公司製） TSK保護管柱ODS 80Ts(20毫米x250毫米，東梭公司製）移動相：0.1 %三氟乙酸（TFA)水溶液流速：9毫升/分檢出：於215 nm之吸光度分取各溶離學，減壓下使乾後，溶於300微升之水。各部分過滤滅菌，各10微升放入96孔微定量皿。於其中加含5,000 個HL-60細胞（ATCC CCL-240)之10%胎牛血清（Gibco公司製）之RPMI 1640培養基（日水公司製）90微升，於5% 002存在下，於37°C培養48小時。以光學顯微鏡觀察細胞之形態後’加5¾克/ ¾升之3-(4,5-二甲基p塞哇-2-基）-2,5-二苯基四 4坐化溴鱗酸缓衝食鹽水溶液10微升，再繼續培養4小時，加含0.04NHC1之2-丙醇100微升，徹底攪拌，測定於590 nm之吸光度，將此作為細胞增殖度。其結果，於添加來自8.26分之峰之溶離部分之分區，觀察到細胞凋亡小體，與添加水之對照分區比，於590 nm之吸 O:\90\90175.DOC\LAN -39- 1244923 光度低，細胞增殖受抑制。 (2)將來自實施例2-(1)記載之8 26分之峰之溶離部分工㈧微升以以下之大小排斥HPLC層析法分離。管柱：TSK-凝膠α-2500(7.8毫米χ3〇〇毫米，東梭公司製）TSK保護管柱α(6毫米χ4〇毫米，東梭公司製）移動相：〇.〇l%TFA水溶液流速：0.8毫升/分檢出：示差屈折計以大小排斥HPLC層析法之分離圖示於圖3。亦即圖3為表 π瓊脂之酸分解物之大小排斥HPLC層析圖之圖，橫軸表溶離時間（分）’縱軸表示差屈折計之輸出。分取分離之各峰，減壓下使乾。將各部分溶於水中使成 10毫克/毫升，過濾滅菌後，以上記實施例2-(1)記載之方法，測定細胞凋亡謗發活性與癌細胞增殖抑制活性。其結果，溶離時間8.87分與9·40分之峰具兩活性。溶離時間8.87分之物質與9.4〇分之物質溶於磷酸緩衝食鹽水，於放置i小時後，關樣之大小排除肌c分析: 其結果，任一者之樣品皆可見溶離時間8·87分與9.4〇分之 :、:峰之面積比約為相等。因而明白以磷酸緩衝水溶液狀態溶離時間8.87分之物質與9.40分之物質為平衡狀態。將來自溶離時間8.87分與9.4〇分之峰之部分合併，減壓下使乾固’得細胞凋亡謗發性及抑癌性物質。 :(3)用DX 302質量分析計（日本電子社製）進行實施例2_⑺ 记載又細胞凋亡謗發性及抑癌性物質之質量分析。用甘油

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為基質，以負離子模式測定。 FAB-MS m/z 323[M-H]- 415[M+甘油-H]-507[M+2甘油-Η]- 其結果示於圖4。亦即，圖4為表示細胞凋亡謗發性及抑癌性物質之質譜之圖，橫軸表m/z值，縱軸表相對強度（％)。測定實施例2-(2)所得之細胞凋亡謗發性及抑癌性物質之核磁共振光譜。核磁共振裝置使用jNM-A500(日本電子社製）。

^-NMR 5 3·36 (1H，dd，J=8.0，10.0Hz)、3.51 (1H，dd，J=3.0, 10.0Hz)、3·56 (1H，m)、3.58 (lH，m)、3·63 (1H，m)、3.67 (lH，m)、3.70 (1H，机 J=3.0，10.0Hz)、3·77 (1H，d， J=3.0Hz)、3·83 (1H，dd，J: 4.5, 10.0Hz)、3.93 (1H，dd，J=5.0, 3·5ΗΖ)、4.23 (1H，m)、4·25 (1H，m)、4.41 (1H，d，J=8.0Hz)、 4.85 (1H，d，J=6.〇Hz) 樣品溶於重水，hod之化學位移以4·65 ppm表示。 13c-nmr 61·9、69·4、71.5、73.37、73.42、73.8、76·0、76·1 认7、86.5、9〇·7、1〇3.3 才水口〜合於重水，二噚烷之化學位移以67·4 ppm表示。、人細胞凋亡謗發性及抑癌性物質之1H-NMR質譜示於圖万、圖5桜軸表化學位移值（ppm)，縱軸表信號之強度。

O:\90\90175.DOC\LAN -41 - 1244923 又，將樣品溶於二甲亞砜，測定1h_nmr光譜。

^^NMR 占 9·60(1Η，醛之 Η) 圖6中表細胞凋亡謗發性及抑癌 <丨舡物貝乏於重二甲亞砜溶知中之iH-NMR光譜。於圖6，橫軸表仆戽广、 μ 仏w衣化學位移（ppm)，縱軸表信號強度。」此等之質量分析JH-NMR、uc_NMR^析結果，鐘疋貫施例2-(2)記載之細胞调亡謗發性及抑纟性物質為壤脂雙糖。又’瓊脂雙糖之還原末端之3,6·脫水半乳料非水溶媒中主以開環之醛化物存在，可藉由於重二甲亞砜溶媒中 < H-NMR表示。又，於水溶液中，以醛化物之水合物存在’ 可藉由於重水溶媒中之1h_NMr表示。由以上之結果明白，於實施例2_(2)所得之細胞凋亡謗發性及抑癌性物質為瓊脂雙糖。 (4)將實施例2-(2)所得之細胞凋亡謗發性及抑癌性物質，亦即被脂雙糖落於水使成〇 · 7 8毫克/毫升，1 0微升放入9 6孔微定量皿之孔内，以上記實施例2气丨）記載之方法，測定細胞凋亡謗發活性及癌細胞增殖抑制活性。其結果，於光學顯微鏡觀察，可見細胞凋亡小體，與對照之加水之分區相比’加瓊脂雙糖之分區約86%之細胞增殖受抑制。亦即，瓊脂雙糖以78微克/毫升謗發HL-60細胞之細胞凋亡，抑制細胞增殖。實施例3 (1)將市售瓊脂（Agar Noble)2.5克懸浮於50毫升〇·ιΝ O:\90\90175.DOC\LAN -42- 1244923 HCl，於100°C加熱13分溶解。冷卻至室溫，以NaOH中和至 pH於中性附近後，以寇司莫奈斯濾膜過濾，以以下之正相HPLC分離。管柱：TSK-凝膠Amide-80(21.5毫米x300毫米，東梭公司製）溶媒A : 90%乙腈水溶液溶媒B ·· 50%乙腈水溶液流速：5毫升/分溶離：由溶媒A至溶媒B之直線濃度梯度（80分）—溶媒 B(20分）。檢出：於195 nm之吸光度樣品施加直· 2ml 分取滯留時間66.7分，78.5分及85.5分之峰，進行質量分析時，此等物質分別為瓊脂雙糖、瓊脂四糖及瓊脂六糖。依上記之HPLC之分離加以反覆8次，減壓下使乾，得122毫克之瓊脂雙糖、111毫克之瓊脂四糖及55毫克之瓊脂六糖。其結果示於圖7〜圖10。亦即圖7為表瓊脂雙糖、瓊脂四糖及瓊脂六糖之正相HPLC之溶離樣式圖，橫軸表滯留時間 (分），縱軸表於195 nm之吸光度。圖8為表66.7分之學之質譜之圖，橫軸表m/z值，縱軸表相對強度（％)。圖9為表78.5 分之峰之質譜之圖，橫軸表m/z，縱轴表相對強度（％)。圖 10為表85.5分之峰之質譜之圖，橫軸表m/z，縱軸表相對強度（％)。 (2)於實施例3-(1)所得之瓊脂雙糖之100 mM水溶液450微 O:\90\90175.DOC\LAN -43- 1244923 升中，加ίο倍濃度之磷酸緩衝食鹽水（寶酒造社製，τ9〇〇)5〇微升與10單位/微升之冷_半乳糖苷酶（Sigma公司製，G5635) 磷酸緩衝食鹽水落液50微升混合，於37它使反應丨小時。於此反應液中加5毫升之丨-丁醇：乙醇=1: i混合物，以離心除去不溶物。將此液施於管柱層析法用矽膠 BW-300SP(3x50公分，富士西利西亞化學社製），以丨_丁醇：乙醇：水=5 : 5 : 1為溶離劑，以壓縮機加壓於〇·3公斤/平方厘米，進行分離。使每1溶離部分為7毫升進行級分，取各溶離部分之一部分以薄層層析法分析時，於第14號至17號之溶離部分含高純度之3,6-脫水-L-半乳糖，收集此等之溶離邵分，減壓下使乾，得3.8毫克3,6-脫水半乳糖。本物貝之構造藉質量分析法及核磁共振法確認。其結果示於圖11〜圖13。亦即圖π為表示3,6-脫水_L_半乳糖之吳瑨之圖，橫軸表m/z值，縱軸表相對強度（％)。圖丄2 及圖13分別為表示3,6_脫水半乳糖之於重水溶媒中及於重二甲亞砜溶媒中之iH_NMR質譜之圖，橫軸表化學位移值 (ppm) ’縱軸表信號之強度。由於3,6-脫水-L-半乳糖亦於重二甲亞砜溶媒中之ιΗ_ NMR表示在9.60 ppm之醛之η信號，所以於非水溶媒中以開環之趁化物存在，又從重水中之1H-NMR光譜，顯示於水溶液中，以其之醛化物之水合物存在。貢施例4 (1)實施例3所得之3,6_脫水-L-半乳糖之20 ιηΜ水溶液以滅菌水稀釋2倍、4倍及8倍，以實施例2-(1)記載之方法，測

O:\90\90175.DOC\LAN -44- 1244923 定細胞凋亡謗發活性及癌細胞增殖抑制活性。其結果，於添加3,6-脫水-L-半乳糖之2倍稀釋液添加分區（最後濃度1 mM)觀察到細胞凋亡小體，於590 nmi吸光度為對照之添加水之分區之2分之1以下。 (2)將實施例3-(1)所得之瓊脂雙糖、瓊脂四糖及瓊脂六糖之50 mM水溶液過濾滅菌，以滅菌水稀釋2倍、4倍、8倍 16倍、32倍、64倍及128倍。以實施例2_(丨）記載之方法’測定此等稀釋液對各種細胞之增殖抑制活性。所用之細胞及培養基示於表1、表2。表1 細胞培養基〜人類前骨髓性白血病細胞 HL-60 (ATCC CCL 240) 含10%胎牛血淸(奇布可公司）~~ RPMI164〇培養基(日水（二)公司人類末稍淋巴球 RPMI1778 (ATCC CCL 156) 同上小鼠單核球 RAW264.7 (ATCC TIB 71) 含10%胎牛血淸DMEM培養基 (曰水公司）人類胃癌細胞 MKN45(理硏基因銀行、RCB1001) 含10%胎牛血淸RPMH64Q培養基人類肝癌細胞 HepG2 (ATCC HB 8065) 含10%胎牛血淸DMEM培養基人類結腸腺癌細胞 HT-29 (ATCC HTB38) 含10%胎牛血淸McCOY’S培養基 (百歐維他卡（A彳才夕彳夕力）公司）人類結腸腺癌細胞 HCT116(ATCC CCL-247) 同上纖維肉腫 HT-1080 (ATCC CCL-121) 含10%胎牛血淸D-MEN培養基 (百歐維他卡彳才夕/夕力）公司） -45-

O:\90\90175.DOC\LAN 1244923 表2 細胞培養基一芽細胞 A-172 (ATCC CRL1620). 含]〇%胎个lill淸D-MEN培费· 人類乳癌細胞 MCF7 (ATCC HTB-22) 含10%胎牛血淸DMEM培養基 1 · 人類乳癌細胞 T-47D (ATCC HTB-133) 含10°/。胎牛血淸RPMI 1640培養基人類膀胱癌細胞 T24 (ATCC HTB-4) 含ίο%胎牛血淸McCoy’s培養基人類子宮頸部癌細胞 HeLa S3 (ATCC CCL-22) 含]〇%胳牛血淸DMEM培養基人類肺癌細胞 A549 (ATCC CCL-185) 同上_ 人類結腸腺癌細胞 WiDr (ATCC CCL-218) 含10%眙牛血淸RPMI 1640培養基 'V 此結果顯示瓊脂雙糖、瓊脂四糖及瓊脂六糖對此等細胞之增殖抑制活性。其結果示於表3。又，表3中之數字表於 590 nm之吸光度與添加水之對照相比為2分之1以下之分區中所添加之稀釋液之稀釋倍率，1倍稀釋相當於細胞培養液中之濃度5 mM。其次，於瓊脂雙糖、瓊脂四糖及瓊脂六糖’ 基於於590 nm之吸光度之變化，算出顯示50%增殖抑制率之濃度（IC5〇)，表示於表4中。 O:\90\90175.DOC\LAN -46- 1244923 表3 細胞瓊脂雙糖瓊脂四糖瓊脂六糖 HL-60 32 64 64 RPMI1788 64 128 128 RAW264.7 16 32 32 MKN45 8 16 16 HepG2 8 8 16 HT-29 8 16 32 HCT116 16 32 32 HT-1080 8 16 16 A-172 16 16 16 MCF7 16 16 16 T-47D 16 16 16 T24 8 8 8 HeLa S3 8 8 16 A549 8 8 16 WiDr 8 8 16

表4

細胞 1C50(/Z M) 瓊脂雙ffi 璁脂四糖墩脂六糖 HL-60 170 97 78 RPM11788 44 28， 22 RAW264.7 179 133 109 MKN45 344 196 166 •HepG2 652 413 430 HT-29 622 208 '144 HCT116 244 158 136 HT-1080 317 21β 185 A-172 • 289 185 151 MCF7 274 276 238 丁-47D 210 183 158 T24 352 399. 365 HeLa S3 353 400 1 334 A549 570 494 279 WiDr 405 - 399 334 O:\90\90175.DOC\LAN -47- 1244923 貫施例5 將市售瓊脂5克懸浮於5〇毫升之〇·1Ν HC1，於100°C加熱13 分溶解。冷卻至室溫後，以Na〇H中和至pH中性附近之本加熱處理液2毫升施於充填以水洗淨之活性炭（6〇-15〇網目， Nacalai Tesque公司製，〇79-21)之管柱（1()χ255 毫米）。以 2〇〇愛升之水洗淨後，依2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、 17.5%、20%、22.5%、25%、27.5%、30%、35%、40%、45%、及5 0%乙醇水溶液之順序，分別以2〇〇毫升溶離。各溶離部分減壓下濃縮，點於矽膠片60F254(默克公司製），以1-丁醇：乙醇：水=5 ·· 5 : i展開後，以苔黑酚試劑 [400 Φ克之台黑紛-水合物（Nacalai TeSqUe公司製）溶於22 8 毫升硫酸，加水成2〇〇毫升]噴霧，觀察斑點。其結果，5%及7.5%乙醇水溶液溶離部分中，有瓊脂雙糖， 15/〇及17.5%乙醇水溶液溶離部分中有瓊脂四糖，225%及 25%乙醇水溶液溶離部分有瓊脂六糖，27·5%及3〇%乙醇水溶液落離部分中有瓊脂八糖，分別皆以高純度含於其中。實施例6 册貫訑例5所得之瓊脂雙糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖及瓊八糖（以下，有將此等寡糖稱為瓊脂寡糖之情形）溶於水中成2.5 mM及1.25 mM，過濾滅菌。將HL_6〇細胞懸浮於含胎牛血清之RPMi 1640培養基使成25幻〇5個/45毫升，加記各寡糖水溶液0.5毫升，於5%c〇2存在下，於37它培小時及叫時。取細胞培養液之—部分，加錐蟲藍^亂鏡下測定生細胞數。其結果，於各分區與水加分區⑽

O:\90\90175.DOC\LAN -48- 1244923 相比生細胞數減少，觀察到細胞凋亡小體。、「ϋ果示出圖14、圖15。亦即，圖14為表示添加最後濃度為250 a Μ之寡糖，培養HL-6〇細胞時之培養時間與生細胞數< 圖，圖15為表示添加最後濃度為125//M之寡糖，培養 HL-60細胞時之培養時間與生細胞數之圖。於圖14及圖15，秘轴表培養時間（時間），縱軸表生細胞數& 1 毫升），黑圈（鲁）表加水（對照），菱形（◊)表加瓊脂雙糖，白圈（〇）表加瓊脂四糖，三角形（△)表加瓊脂六糖，四角形（□)表加瓊脂八糖。實施例7 (1) 將/c _角菜膠（Sigma公司製，（^1263)或又_角菜膠（和光純藥社製，038-14252)0.2克懸浮於20毫升之0·1ΝΙΚ：卜於95 °C加熱1〇分。以1NNa〇H中和後，以水稀釋15倍，2·25倍， 3.38倍及5·06倍，以實施例2_(1)之方法，測定對11^6〇細胞之細胞增殖抑制活性。其結果，於^ _角菜膠加熱物之添加 1.5倍、2·25倍及3.38倍稀釋液之分區與Λ -角菜膠加熱物之添加1.5倍、2.25倍稀釋液之分區，於590 nm之吸光度為添加水之分區之2分之1以下，又，可見到細胞凋亡小體。 (2) 將市售瓊脂（Agar Noble)、瓊脂糖L〇3(寶酒造社製）及市售之棒瓊脂分別懸浮於〇.1NHCl使成1%，於i〇(rc加熱15 分。將此加熱液冷卻後，以1N NaOH中和後，以水稀釋2倍、 4倍、8倍及1 6倍’以實施例2-(1)之方法，測定對hl-60細胞之細胞增殖抑制活性。其結果，於瓊脂及瓊脂糖之酸分解物之添加2〜8倍稀釋液之分區與棒瓊脂酸分解物之添加2 O:\90\90175.DOC\LAN -49- 1244923 倍、4倍稀釋液之分區，於59〇nm之吸光度為添加水之對照〈分區《2分之1以下，又，可見到細胞凋亡小體。上記酸分解物分別以正相Ηριχ分析時，於任一者之分解物，皆可檢出以瓊脂雙糖為始之瓊脂寡糖。貫施例8 (1)將市售扠脂懸浮於以下之酸水溶液使成1 %濃度。〇、·5Μ、1M或 2M檸檬酸、0.1M、〇.5M、遺或2乂硝酸；〇·ιμ 或〇·5Μ；δ/υ酸；〇·1Μ、〇·5Μ 或 1Μ 磷酸；〇·1Μ 鹽酸。私此等ί复爿曰懸浮液以電磁爐加熱至溶解後，以中和:以蒸顧水稀釋2、4、8、16或32倍，以實施例⑴記载乏万法，測疋對HL-60細胞之細胞凋亡謗發活性及癌細胞增殖抑制活性。曰此結果，進行上記之各種酸加熱處理之瓊脂，對HL-60謗發細胞凋亡，抑制細胞增殖。其結果示於表5。又，表$中义數字表π於59〇 nmi吸光度，與加水之對照相比為2分之 1以下之稀釋液之稀釋倍率。又，括弧内之數字表示，於無加瓊脂，將本實施例所用之最大濃度之酸以Na〇H*和後，以蒸餾水稀釋添加之情形，其於590 nm之吸光度與加水之對照相比為2分之1以下之稀釋液之稀釋倍率。表5 0.1M 0.5M 1M 2M 檸檬酸 8 16(8) 硝酸 8 16 16⑺ 硫酸 8 16(2) 磷酸 4 8 16⑴ 鹽酸 16

O:\90\90175.DOC\LAN -50- 1244923 (2)實施例8-(1)所得之瓊脂之酸加熱處理物，以以下之正相HPLC分析。管柱：PALPAK S型（4.6x250毫米，寶酒造社製，CA8300) 溶媒A : 90%乙腈水溶液溶媒B : 50%乙腈水溶液流速：1毫升/分溶離：溶媒A(10分）—自溶媒A至溶媒B之直線濃度梯度（40分）-> 溶媒B(10分）

檢出：於195 nm之吸光度管柱溫度：40°C

此結果，於0.5M、1M、2M檸檬酸，0.1M、0.5M、1M、 2M硝酸，0.1M、0.5M硫酸、0.1M、0.5M、1M磷酸，0.1M 鹽酸中進行加熱處理之樣品中，含以瓊脂雙糖為始之瓊脂寡糖。其代表性結果示於圖16。亦即，圖16為於0.5M磷酸中進行加熱處理之瓊脂之正相HPLC之溶離樣式之圖，橫軸表滞留時間（分），縱軸表於195 nm之吸光度。實施例9 市售瓊脂（伊那瓊脂S型-7，伊那食品工業社製）5克懸浮於 20、50或100 mM檸檬酸45毫升，於95°C加熱，於下記時間加熱後，取樣一部分。 20 mM檸檬酸處理物310分、350分、380分、440分及530 分，50mM檸檬酸處理物100分、120分、140分、160分、180 O:\90\90175.DOC\LAN -51 - 1244923 分、200分、220分、240分、260分、290分及320分， 100 mM檸檬酸處理物60分、70分、80分、90分、100分、 120 分、140 分、160 分、180 分、200 分、220 分及 240 分。將各樣品之10倍稀釋液1微升點於矽膠片60F254(默克公司製）上，以1-丁醇：乙醇：水=5 : 5 : 1展開，以苔黑酚-硫酸法檢出。此結果，於各樣品中含瓊脂雙糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖等之瓊脂寡糖。 20 mM擰檬酸處理物至350分加熱為止，瓊脂寡糖之含量增加，其後約成一定。 50 mM檸檬酸處理物至200分加熱為止，瓊脂寡糖之含量增加，其後約成一定。 100 mM檸檬酸處理物至160分加熱為止，瓊脂寡糖之含量增加，其後約成一定。最後之壤脂寡糖之含量局至以南濃度之择橡酸處理之樣品之程度。分析於如同實施例8-(2)之正相HPLC之各樣品時，可得與薄層層析法同樣之結果。但，於100 mM擰檬酸處理物比50 mM檸檬酸處理物含多量之雜質，與加熱時間一起，雜質增加。實施例10 (1)將實施例3-(1)製備之瓊脂雙糖溶解使成0.05mM、 O.lmM、0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、ImM。將各樣品1微升點於矽膠片60F254上，以CHC13 : CH3OH :乙酸=7 : O:\90\90175.DOC\LAN -52- 1244923 2 : 2之溶媒展開3次，以苔黑酚-硫酸法使發色。經發色之片藉由 FOTODYNE F〇TO/Analyst Archiver Ecripse(中央科學貿易社販售），作為畫像數據取入，以畫像解析軟體1-D Basic(先進美國生物技術學公司製）將此畫像數據進行晝像處理，將各濃度之瓊脂雙糖之斑點強度數值化，製作檢量線。檢量線之圖示於圖17。亦即，圖17為表示瓊脂雙糖之檢量線之圖，將相對於各濃度之瓊脂雙糖之斑點之強度作圖，橫軸表瓊脂雙糖之濃度（mM)，縱軸表斑點之強度作圖。又，圖17中之計算式為表示斑點之強度（y)與瓊脂雙糖之濃度（X)之關係，瓊脂雙糖之濃度於未知之樣品，藉由所得之斑點之強度，可自計算式算出瓊脂雙糖之濃度。又，同樣地作成實施例5所得之瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖之檢量線。 (2)將市售之瓊脂（Agar Noble)0.2克懸浮於90毫升水中，以電磁爐加熱溶解，冷卻至室溫附近。於此加1M HC1或1Μ 擰檬酸10毫升，分別製備0.2%瓊脂0.1Μ HC1水溶液及0.2% 瓊脂〇. 1Μ椁檬酸溶液。此溶液於90°C加熱，於5分、10分、 20分、30分、1小時、2小時、4小時、8小時、21小時之各時間取樣。各樣品以實施例10-(1)中記載之方法進行薄層層析法，求斑點之強度，算出瓊脂雙糖之濃度。又，各樣品加以適宜稀釋，使瓊脂雙糖之濃度於0.5 mM至1 mM之範圍。圖18，圖19中表示於0.2%瓊脂0.1 M HC1溶液及0.2%瓊脂 0.1Μ檸檬酸溶液之加熱時間與瓊脂雙糖之生成量之關係。 O:\90\90175.DOC\LAN -53- 1244923 亦即，圖18為0.2%瓊脂於〇.1M HC1溶液之加熱時間與瓊脂雙糖之生成量之關係之圖，圖19為〇.2%瓊脂於〇1M擰檬酸溶液之加熱時間與瓊脂雙糖之生成量之關係之圖。^圖 18，圖19，橫軸表加熱時間（時間），縱軸表瓊脂雙糖之濃度 (mM)。如圖18所示，0.2%瓊脂於(UMHC1溶液，於丨小時瓊脂雙糖之濃度達最高，其後減少。又，如圖19所示，〇2%瓊脂於0.1M檸檬酸溶液，至8小時瓊脂雙糖之濃度慢慢增加，第 21小時減少。又，於0.2%瓊脂於〇.1MHC1溶液中之加熱5分之樣品及0.2%瓊脂於0.1Μ檸檬酸溶液之加熱5、1 〇、2〇分之樣品，瓊脂雙糖之濃度為檢出界限以下。 (3)將新穎瓊脂（Difco公司製編碼0142-17-0)懸浮於5、 50、500 mM檸檬酸中使成10%，於65、8〇、95χ：加熱，加熱後於30分、1、2、4、8、24小時取樣，以實施例1〇_(1)記載之方法，測定瓊脂寡糖之生成量。其結果’將瓊脂溶於5 mM檸檬酸之情形，於8〇艺可見到若干之瓊脂寡糖生成，於65°C，瓊脂寡糖幾乎無生成。於 95 C 5复爿曰雙糖於8〜24小時頻示高值，瓊脂四糖亦於$〜24 小時顯示高值。瓊脂溶於50 mM檸檬酸之情形，於65t，瓊脂寡糖幾乎無生成。於8(TC，瓊脂雙糖於24小時顯示高值，瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖於4〜8小時顯示高值。於％ °C，壤脂雙糖於24小時顯示高值，瓊脂四糖、瓊脂六糖、壤脂八糖於4〜8小時顯示高值。瓊脂溶於5〇〇 mM檸檬酸之情形於65 C，於4〜24小時可見若干之瓊脂寡糖生成。於8〇

O:\90\90175.DOC\LAN -54- 1244923 、人夏知又糖於2〜24小時顯示高值。瓊脂四糖、瓊脂六糖、。万；1〜6/、時顯示高值。瓊脂八糖於1〜2小時顯示高值。於95 一丄复知又糖於1〜24小時顯示高值，瓊脂四糖於1〜2小時顯丁阿值。瓊脂六糖、瓊脂八糖於3〇分至1小時顯示高值。藉5〇〇 mM檸檬酸之加水分解之例示於圖刈及圖21。亦即圖20為於5〇〇 mM檸檬酸，80°C之瓊脂寡糖生成之圖，圖中縱軸表示瓊脂寡糖生成量（圓形：瓊脂雙糖，三角形·· 瓊脂四糖，四角形：瓊脂六糖，χ形··瓊脂八糖），橫軸表時間。又，圖21為表示於500 mM擰檬酸、95t之瓊脂寡糖生成<圖，圖中縱軸表示瓊脂寡糖生成量（圓形··瓊脂雙糖，三角形：瓊脂四糖，四角形：瓊脂六糖，χ形：瓊脂八糖），橫軸表時間。 (4) 使用50、500、1000 mM之乙酸，以與實施例1〇_⑺同樣之方法，測定瓊脂寡糖之生成。其結果，瓊脂溶於50 mM乙酸之情形，於8〇它可見若干之瓊脂寡糖生成，於65t，瓊脂寡糖幾乎無生成。瓊脂溶於 500 mM乙酸之情形，於65t，瓊脂寡糖幾乎無生成。於8〇 C及95 C，可見若干瓊脂寡糖生成，瓊脂溶於1〇〇〇 mM乙酸之情形，於65°C，幾乎無瓊脂寡糖生成。於8〇r，瓊脂顯示24小時，瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖於8小時生成若干。於95 C，瓊脂雙糖於8小時顯示高值，瓊脂四糖、瓊脂六糖、壤脂八糖亦於8小時顯示高值。 (5) 使用60、600、1200 mM乳酸之情形，以與實施例1(H3) 同樣之方法，測定瓊脂寡糖之生成。 O:\90\90175.DOC\LAN -55- 1244923

其結果，瓊脂溶於60 mM乳酸之情形，於95 °C可見若干之瓊脂寡糖生成，於65，80°C，幾乎無瓊脂寡糖生成。瓊脂落於600 mM乳酸之情形，於8(TC，於8〜24小時，瓊脂雙糖頭不高值。瓊脂八糖於4小時顯示高值。於95 °C，於4〜8小時’ ί夏脂雙糖顯示高值，瓊脂四糖，瓊脂六糖於2〜6小時顯不高值。瓊脂溶於1200 mM乳酸之情形，於80°C瓊脂雙糖於 4〜24小時顯示高值，瓊脂四糖、瓊脂六糖於2〜6小時顯示高值。瓊脂八糖於2小時顯示高值，於95 °C，瓊脂雙糖於2〜8 小時顯示高值，瓊脂四糖、瓊脂六糖於1〜2小時顯示高值。藉1200 mM乳酸之加水分解之例示於圖22及圖23。亦即，圖22為顯示於12〇〇mM乳酸，8〇χ：之瓊脂寡糖生成之圖，圖中縱轴表示瓊脂寡糖生成量（圓形：瓊脂雙糖，三角形：瓊月曰四糖，四角形：瓊脂六糖，X形：瓊脂八糖），橫軸表時間。又，圖23為表示於1200 mM乳酸、95°C之瓊脂寡糖生成之圖圖中縱軸表示瓊脂寡糖生成量（圓形：瓊脂雙糖，三

角形：瓊脂四糖，四角形：瓊脂六糖，χ形：瓊脂八糖），橫軸表時間。、⑹使用20、200、1000 mM磷酸，以如同實施例ι〇_⑺ 方法’測定瓊脂寡糖之生成。其結果，瓊脂溶於20 mM蘋果酸之情形，於95它可見若之瓊脂寡糖生成，於65，8Gt，瓊脂寡糖幾乎無生成。 =溶於200 mM蘋果酸之情形，於65。〇，於以小時可見若，脂寡糖生成。於_，瓊脂雙糖於8〜24小時顯示高值 5夏脂四糖杯8小時顯示高值。瓊脂六糖S4小時顯示,

O:\90\90175.DOC\LAN -56- 1244923 值。瓊脂八糖於4小時顯示高值。於95t，瓊脂雙糖於4〜8 小時顯示高值，瓊脂四糖於4小時顯示高值。瓊脂溶於1〇⑻ mM蘋果酸之情形，於65它於24小時可見若干瓊脂寡糖之生成。於80 C，瓊脂雙糖於2〜24小時顯示高值，瓊脂四糖於 2〜6小時顯示高值。瓊脂六糖、瓊脂八糖於2小時顯示高值。於95 C，缓脂雙糖於1〜8小時顯示高值，瓊脂四糖於丨〜2小時顯示高值。瓊脂六糖、瓊脂八糖於丨小時顯示高值。棱脂之藉1000 mM蘋果酸之加水分解之例示於圖24及圖 25。亦即，圖24為於1000 mM蘋果酸，8〇t：之瓊脂寡糖之生成之圖’圖中縱軸表瓊脂寡糖生成量（圓形：瓊脂雙糖，三角形：瓊脂四糖，四角形：瓊脂六糖，X形：瓊脂八糖），橫軸表時間。又圖25為表於1〇〇〇 mM蘋果酸、95 °C之瓊脂寡糖生成之圖，圖中縱軸表示瓊脂寡糖生成量（圓形：瓊脂雙糖’二角形：瓊脂四糖，四角形：瓊脂六糖，X形：瓊脂八糖）’橫轴表時間。 (7)將新穎瓊脂懸浮於 100、200、300、400、5 00、600、 700、800、900、1000 蘋果酸中，使成 10%，於 70、80、 90 C加熱。加熱後，於30分、1、2、3、4、8、24小時取樣，以如同貫施例丨〇_(3)之方法，測定瓊脂寡糖之生成。於300 mM以上之蘋果酸濃度，於7〇它亦可於8小時以上見到同的瓊脂寡糖生成。於1 〇〇〇 mM、70°C之加水分解例示於圖26。亦即，圖26為於1〇〇〇mM蘋果酸、7(rc之瓊脂寡糖生成<圖’圖中縱軸表瓊脂寡糖生成量（圓形：瓊脂雙糖，三角形：瓊脂四糖），橫軸表時間。

O:\90\90175.DOC\LAN 1244923 由上記實施例10-(3)〜（7)之結果，作為製造j皇脂寡糖所用之酸以檸檬酸、乳酸、蘋果酸，酸之濃度以數+mM至數M，加熱溫度以70〜95°C，加熱時間以數十分至24小時為佳。 (8)使用F-套組乳糖/半乳糖（B〇ehringer Mannhdm公司製，編號176303)，使0-半乳糖甞酶作用於瓊脂雙糖，以測定所生成之半乳糖之濃度之方法，進行瓊脂雙糖之定量。依套組之使用方法進行定量，但半乳糖甞酶之反應變更成37°C、1小時。檢量線使用乳糖製作，算出乳糖換算之莫耳濃度（mM)後，更換成瓊脂雙糖濃度（毫克/毫升）。使用於上記實施例製備之瓊脂雙糖、瓊脂四糖' 瓊脂六糖、瓊脂八糖，試著以上記方法定量。其結果瓊脂雙糖計开值與男測值一致。其另一方面，瓊脂四糖、瓊脂六糖、坡月曰八糖以上#方法並無貫質上檢出。亦即，明白瓊脂雙糖以外之瓊脂寡糖於上記檢出方法無實質上檢出，明白藉使用上記方法，可進行瓊脂寡糖中之瓊脂雙糖之濃度測定。 (9)將市售瓊脂（伊那瓊脂s_7型：伊那食品工業社製）ι⑻ 克及11型之強陽離子交換樹脂（Diaion SK 104H:三菱化成製）1〇克於90C之去離子水900克中混合，於95它一面攪拌 1 80刀，進仃瓊脂之酸分解。接著，冷卻至室溫，以活性炭 10/0 W/W(重量/重量比）及寅式鹽545(歇來特公司製）、〇.5% W/W助劑（求過滤，製備濾液。〇分析如同實施例8_(2)之正相HpLC製備之濾液，作為瓊脂寡糖確為以瓊脂雙糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖為

O:\90\90175.DOC\LAN 1244923 主成分生成。該濾液使用pH 2.4，酸度1.7，白利糖9.4%，上記實施例 1 〇-(8)記載之F-套組乳糖/半乳糖測定之瓊脂雙糖量為7.4%。 (10)將Η型之強陽離子交換樹脂（來雅離子SK 104H) 18.5 克放入去離子水100克中，於95°C攪拌將瓊脂（伊那瓊脂S-7 型）以下以10分間隔，各加10克5次，接著，各加15克2次，另外，各加20克3次，最後加30克。瓊脂之合計添加量為185 克後，於95°C攪拌150分，接著，冷卻至室溫。藉傾倒分開樹脂與液體後，分離液以活性炭3% w/w及寅式鹽545(歇來特公司製）、0.5% w/w助劑過濾，製備濾液。分析以如同實施例8-(2)之正相HPLC製備之濾液，作為瓊脂寡糖，確認以瓊脂雙糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖為主成分生成。該濾液用pH 1.2,酸度11.9,白利糖64%，上記實施例1〇·(8) 記載之F-套組乳糖/半乳糖測定之瓊脂雙糖量為24.4%。 (Π)使用市售瓊脂（伊那瓊脂S-7型）1〇〇克，以種種磷酸濃度之去離子水配成1升，於95°C —面攪拌進行瓊脂液化。又，使用以1% w/v(重量/體積比）檸檬酸濃度之去離子水配成1升者，與磷酸同樣地進行瓊脂液化。液化意即於其冰點亦不膠凝之狀態，測定成其狀態之時間（液化時間）。又，液化時及其後之瓊脂雙糖生成量，用上記實施例1〇_(8)記載之F_套組乳糖/半乳糖測定。其結果示於表6、表7。 O:\90\90175.DOC\LAN -59- 1244923 表6 磷酸濃度 (% W/V) 液化時間 (分） 95 t：保持時間 (分) 瓊脂雙糖 (克/升） 0.2 150 150 2.57 180 3.80 300 7.97 0.3 120 120 4.88 180 7.04 , 300 13.90 0.5 110 110 6.09 180 8.48 300 21.40 1.0 90 90 7.58 120 18.80___ 表7 檸檬酸濃度 (% W/V) 液化時間 (分） 95 °C保持時間份）瓊脂雙糖 (克/升） 1.0 90 90 0.95 120 3.40 150 4.09 * 300 5.70 360 14.80 實施例11 (1)將市售瓊脂（伊那瓊脂S-7型，伊那食品工業社製）15〇克，食添用檸檬酸（無水）（三榮源FFI公司製）15克以去離子水配成1·5升，使溫度上升至92°C後，於92〜95°C下攪拌保持130 分。接著，冷卻至室溫，以寅式鹽545 (歇來特公司製）之0.5%

O:\90\90175.DOC\LAN -60- 1244923 助劑過濾，製備濾液（瓊脂分解寡糖溶液）。分析如同實施例 8-(2)之正相HPLC製備之濾液，作為糖化合物確認以瓊脂雙糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖為主成分生成。該濾液之pH約2.6，酸度為0.92，白利糖為9.2%，以實施例10-(8)記載之方法測定之瓊脂雙糖生成量為43.1 mM。 (2)將實施例11-(1)製備之濾液（瓊脂分解寡糖溶液）稀釋 2 0倍，添加酸味料、矯味劑、製造瓊脂雙糖2.2 5 mM之清涼飲料。其之摻合表示於表8及表9。亦即表8為葡萄柚味清涼飲料之摻合表示，表9為紫蘇味清涼飲料之摻合表。將示於各表之原料添加於水，溶解、製備清涼飲料，分注於200毫升空罐。示於表5之摻合之清涼飲料碳酸鹽化，作為0.8公斤/平方厘米（20°C)之氣壓之碳酸飲料。各分別之飲料之分析值示於表8、表9之下欄。表8 瓊脂分解纖溶液 50毫升 1/7葡萄柚 20克維生素C 0.2克棒檬酸 0.2克麥芽糖 1.25 克葡萄柚 1克去離子水差額計 1000毫升 pH 3.2 酸度* 0.23 白利糖度 2.2 酸度* : 0.1N NaOH ml/10晕升(以下同樣 O:\90\90175.DOC\LAN -61 - 1244923 表9 瓊脂分解寡糖溶液 5〇毫升 — 紫蘇萃取物 20克維生素C 0.2克檸檬酸 0.2克紫蘇矯味劑 0.5克去離子水差額計 1000毫升 pH 2.9 酸度* 0.10 白利糖度 0.6 對各別之本發明品之碳酸飲料，以10名審查小組進行5階段（5良，1惡）之官能評估。對象使用以同樣酸度之檸檬酸液取代者代替瓊脂分解寡糖溶液。葡萄柚味之官能評估之平均值示於表10，紫蘇味之官能評估之平均值示於表11。表1〇 - 本發明品 '對照舌觸感圓潤 4.6 3.1 滑溜 4.8 3.0 味道之平衡 4.5 2.9 食感之總和 4.6 3.1 O:\90\90175.DOC\LAN -62- 1244923 表11

舌觸感圓潤滑溜味道之平衡食感之總和 4.5 4.3 4.2 4.3 2.5 2.4 2.5 2.4 又月口p刀別Μ對恥相比以飲、圓們、私你κ、、义未又平衡諧調、觸感闺潤，滑溜感乏評估，為靳銪卩去與、箭、、，主a 、、 4新頭味覺〈飲料。又，碳酸鹽化之 >目λ?、飲料亦為分別鱼L ^ 样、品飲料。 I、上ζ冋樣又新穎之味覺之本發明 (3)於上|己表8、表9記載之洛、、令私戰炙7目必飲枓中加乙醇，製備成乙醇6% ν/ν，或8% Wv，分注人含万；200笔升空罐。接著，將該乙醇飲料竣酸鹽化，製浩為〇 s八A 、表k為0.8厶斤/平万厘米（2〇〇c)之氣壓之本發明之清涼碳酸醇飲料。 ^本發明之清涼錢醇飲料與不含瓊脂分解寡糖溶液之對 ’、、、相比，飲料 < 味之平衡諧調，舌觸感圓潤，滑溜感之評估，為新穎味覺之清涼碳酸醇飲料。實施例12 (1)如下記製備含瓊脂之檸檬酸分解物之飲料。其之摻合表不於表12。亦即，表12之本發明品1使用以實施例ii-(i) 製備之遽液（瓊脂寡糖液）0.1% w/v及瓊脂（超瓊脂AX-30 :伊那食品工業社製）0.25% w/v、檸檬酸0.07% w/v。本發明品2 典添加瓊脂寡糖液，使用瓊脂0.25% w/v、檸檬酸0.08%

O:\90\90175.DOC\LAN -63- 1244923 w/v。本發明品1及2分別將瓊脂溶於溫水後，混合其他材料’於酸性下93。(：、10秒，未滿93°C〜80°C、20分，另外未滿80°C〜75°C、15分進行加熱，製造含瓊脂之擰檬酸分解物之飲料。一方面，對照為與本發明品2之該摻合，以93。〇、 10秒之加熱條件進行。對於各別之具黏糊性之含瓊脂檸檬酸分解物之飲料（本發明品1及2)以10名評審小組進行5階段（5良，1惡）之官能評估。官能評估之平均值示於表13。表12

—明品1 2.5 1.0 1.5 1.5 66.0 66.0 0.7 0.8 0.5 0.5 2.0 2.0 差額 1000毫升 1000毫升 3.68 3.67 1.53 1.57 7.5 7.4 0.06 0.02 麵旨酸糖(福)**:以實施例10-⑻記載之方法測定瓊脂(克）瓊脂難液偉升） 1/7蔔萄柚杲汁(克）顆粒糖(克）檸檬酸(克）檸檬酸鈉(克）香料(克）去離子水 it '~~—

pH 酸度* 白利糖度 - _瓊脂雙糖(mM) * * 表13 舌觸感圓潤滑溜味道之平衡食感之總和本發明品1 4.4 4.5 4.4 4.5 本發明品2 4.1 4.3 4.2 4.3 對照 3.6 3.8 3.6 3.7 0 ： \90\90175. DOOLAN -64- 1244923 ，本發明品⑴與對照比較，飲料之味道平衡諧調、黏糊度恰好，舌觸感圓潤、滑溜感之評估，為新類味覺之飲料。又由添加之檸檬酸存在下之加熱處理，本發明品丨及2確認有抗氧化用寡糖、瓊脂雙糖生成，提供新穎之抗氧化用含暴糖飲料。於未滿80 C〜75 C，15分之加熱條件換成分別為75〇c 下1天’ 85C下5分’ l〇3t；T5分，122tT4^，以實施例 1〇-(8)記載之心去，敎瓊脂雙糖之生成量時，分別為〇〇3

福、〇·〇2福、〇.〇4 mM及us續，亦確認由加熱處理生成瓊脂雙糖，而且加熱條件愈強，瓊脂雙糖之生成增加。 (2)貫施例12-(1)記載之本發明品卜本發明品2及對照之飲料中加乙醇使成乙醇2% v/v 或4% v/v，使相當於此之差額之去離子水減少，製備乙醇飲料。刀剎對應於本發明品丨、本發明品2之乙醇飲料與對照之乙醇飲料相比，飲料之味道之平衡諧調，黏糊度恰好，舌觸感圓潤’滑溜感之評估，為新穎味覺之飲料。又，上記本發明之乙醇飲料之冷凍物顯示冰果子露狀之良好食感。實施例13

⑴市售瓊脂（Agar N()ble)懸浮於〇1N鎖使成1%濃度，於 37 C下處理5小時、16小時或48小時。a.里液以蒸顧水稀、睪倍以貝訑例9圮載之薄層層析法分析，確認以5小時處理，5夏脂寡糖只生成一點f占，16小時處理與5小時處理者

O:\90\90175.DOC\LAN -65- 1244923 增加，48小時處理更為增加。 (2)平售瓊脂（Agar Noble)懸浮#磷酸緩衝食鹽水或蒸顧 ^成1 /W度’於12 1 C加熱4小時。此加熱處理物以蒸铜水稀釋10倍，以實施例9記載之薄層層析法分析，確認於鱗酸緩衝食鹽水中加熱處理之樣品中之痕量，而於蒸館水中加熱士理之樣品中者與其相比顯然多量之瓊脂寡糖生成。 2，前者之加熱處理後之pH約7，後者約5，冷卻至室溫則前者膠凝而後者無膠凝。貫施例14 。（1)瓊脂（Agar Noble)懸浮於〇.1N HC1使成1〇%濃度，於1〇〇 C加扁19分。將上記樣品丨〇 ml施加於以水平衡之東洋珍珠 (T0Y0PEARL) HW4〇c(東梭社製）管柱（4.4公分x8s公分），以每分h4毫升之流速以水為移動相，進行過遽層析法。溶離之物質以示差屈折計，檢出，分取各7毫升。於溶離時間406分、435分、471分及524分確認波峰，以貫施例9記載之薄層層析法將對應各波峰之部分加以分析，明白這些依序為瓊脂八糖、壤脂六糖、壤脂四糖及壤脂雙糖。將此等部分冷凍乾燥，得3〇毫克之瓊脂八糖、 Φ克瓊脂六糖、150毫克瓊脂四糖及14〇毫克瓊脂雙粹。 (2)實施例14-(1)所得瓊脂雙糖、瓊脂四糖之各1〇〇 mM水溶液25微升中，加100毫升半胱胺酸水溶液5〇微升，加磷酸缓衝食鹽水925微升，於37t：反應1小時或16小時。以= 濃度之L-離胺酸水溶液代替L-半胱胺酸水溶液進行同浐反 O:\90\90175.DOOLAN -66- 1244923 將各反應樣品點於②膠片·254上，以^丁醇：乙醇：水 5 : 5 : 1展開，以苔黑酚硫酸法檢出。此結果，於L半胱胺酸之1小時反應樣品，瓊脂雙糖、瓊脂四糖之斑點消失。又，认!主祕0亡舻 τ 、、次又於L-丰胱胺I、L_離胺酸之16小時反應樣品，任一者皆消失瓊脂雙糖、瓊脂四糖之斑點。以如同實施例8-(2)之正相HPLC分析各樣品時，得到與薄層層析法同樣結果。 (3)將實施例14-(2)製備之各反應樣品1〇微升，放入％孔微足里皿之孔内，以貫施例2-(丨）記載之方法，測定對於之癌細胞增殖抑制活性。其結果，於瓊脂雙糖、瓊脂四糖之斑點消失之樣品，可見到活性之消失。亦即，於瓊脂雙糖、瓊脂四糖及L_半胱胺酸之1小時反應樣品及瓊脂雙糖、瓊脂四糖及L_半胱胺酸， L-離胺酸之16小時反應樣品，與同濃度之瓊脂雙糖、瓊脂四糖比較，細胞增殖抑制活性約為丨/丨〇。實施例15 ⑴將/c -角菜膠（Sigma公司製，C-1263)2·5克懸浮於50毫升之0· IN HC1 ’於1 〇〇 C加熱1 6分溶解。冷卻至室溫，以Na〇H 中和至pH中性附近後，以寇司莫奈斯濾膜過滤，以以下之正相HPLC分離。管柱·· PALPAK S型（4.6x250厘米，寶酒造社製，CA8300) 溶媒A : 90%乙腈水溶液溶媒B : 50%乙腈水溶液流速：1毫升/分 O:\90\90175.DOC\LAN -67- 1244923 溶離：由溶媒A(1 0分）—由溶媒A至溶媒B之直線濃度梯度 (40分）-> 溶媒B(10分）檢出：於2 1 5 nm之吸光度管柱溫度·· 40°C 施加樣品量：50微升於正相HPLC之分離圖示於圖27。亦即，圖27為表示/c-角菜膠酸分離物之正相HPLC層析圖之圖，橫軸表滯留時間，縱軸表於21 5 nm之吸光度。分取各溶離峰，減壓下使乾後，溶於1 〇〇微升水。各部分過滤滅菌’以實施例2 - (1)記載之方法’測定對H L - 6 0細胞之細胞增殖抑制活性。其結果，於添加來自27.797分、 33.905〜34.784分、36.226〜36.654分之各峰之部分之分區，觀察到細胞凋亡小體，與對照之添加水分區比較，於590 nm 之吸光度低，細胞增殖受抑制。將來自溶離時間27.797分之峰之部分，以上記HPLC條件分離12次，收集之減壓下使乾，得細胞凋亡誘發性及抑癌性物質。 (2)實施例15-(1)記載之細胞凋亡謗發性及抑癌性物質之質量，用DK302質量分析計（日本電子社製）進行。用甘油為基質，以負離子模式測定。 FAB-MS m/z 403[M-H]- 495[M+甘油-Η]- 其結果示於圖28。亦即，圖28為表示細胞凋亡誘發性及 O:\90\90175.DOC\LAN -68- 1244923 抑癌性物質之質譜之圖’橫軸表m/z值，縱軸表相對強度。測定實施例15_⑴所得之細胞调亡謗發性及抑癌性物質义核磁共振光譜。核磁共振裝置用JNM_A5〇〇(日本電子社製）。圖29中表示細胞凋亡謗發性及抑癌性物質之顧光譜。於圖29,橫軸表化學位移值（ppm)，縱轴表信號之強度。、此等質量分析藉由1H-NMR之解析結果，實施例15_(1)記載之、、、田胞’周ΤΓ身發性及抑癌性物質鑑定為《_角菜雙糖吡喃半乳糖基-4_硫酸酯_(1— 4)_3,6_脫水半乳糖]。由以上明白實施例15·⑴所得之細胞调亡謗發性及抑癌性物質為/c -角菜雙糖。 (3)貝施例15-(1)所得之κ _角菜雙糖溶於水使成丨.56 、、1〇彳政升放入96孔微定量m之孔内，以實施例2_〇)記載之方去測定細胞凋亡謗發活性與癌細胞增殖抑制活性。 a ^果义光學頭微鏡觀察，可見細胞凋亡小體，與添加 =之對分區比較，於添加κ _角菜雙糖之分區，細胞增殖勺〇又抑制。因而，凡-角菜雙糖以156 // Μ於HL-60細胞中身毛細胞;周+，抑制細胞增殖。實施例1 6 (1)市售 <壤脂粉末（和光純藥社製）4.5克懸浮於0.1N HC1 1 5 0笔升，以兩、包磁爐加熱溶解，溶解液於沸騰水浴上保持10 二义理後將加熱處理之壤脂溶液放冷至室溫為止，由離心降土了、、w 、、 ’、不/谷物。接著，回收離心上清液，以1N NaOΗ 調pH於6·8。盤仏㊉士宁此離心上清液15 0毫升，添加同量之乙酸乙

O:\90\90175.DOC\LAN -69- 1244923 酉旨後’強烈攪拌，分配於乙酸乙酯相與水相。經分配之水相以蒸發器使乾，再溶於15〇毫升水，將溶解時之不溶物由離心除去，得上清液。又乙酸乙酯相以蒸發器使乾，溶於 100毫升之離子交換水，以IN NaOH調pH於6.5。將乙酸乙酯相、水相以孔徑0.2微米之濾膜（Corning公司製）過濾滅菌後，以水稀釋1〇、20、30倍，以如同實施例2-(1) 之方法測定對HL-60細胞之增殖抑制活性。其結果，水相確認有增殖抑制活性，乙酸乙酯相無確認出增殖抑制活性。製備之水相溶液50毫升藉由歇洛化因GCL-25管柱（41 X 905毫米）過濾。含10%乙醇之〇·2Μ NaC1&溶離劑。溶離圖示於圖30。亦即，圖30為藉由歇洛化因GCL-25之凝膠過濾結果之圖，圖中縱軸表藉由酚硫酸法測定之溶離液中之糖含1(吸光度490 nm :黑圈符號）、橫軸表溶離部分編號〇部分為10毫升）。將各溶離部分各1微升點於矽膠片6〇f254(默克公司製），以 1-丁醇：乙酸：水=4 : 1 : 2展開後，於苔黑酚試劑[4〇〇笔克之荅黑酚水合物（和光純藥社製）溶於22·8毫升硫酸，加水成200毫升]噴霧，於加熱至15〇t：之電熱板上加熱，觀察斑點。藉上記之TLC分析確認斑點之部分編號由4〇至12〇分別各 5支部分匯集後，滅菌過濾，測定對111^6〇細胞之增殖抑制活性。其結果，部分編號86至90確認最強之增殖抑制活性。 (2)回收部分編號86至88，以蒸發器使乾，得〇·94克之粉狀物。所得粉狀物溶於30毫升之9〇%乙醇，以咒濾膜 O:\90\90175.DOC\LAN -70- 1244923 (ADVANTEC公司製）除去白色沉澱物，藉由交聯葡聚糖 (Sephadex)LH-20管柱（35x650毫米）凝膠過遽。溶離劑使用 90%乙醇。落離圖示於圖31。亦即圖31為表示藉由交聯葡聚糖LH-20管柱之凝膠過滤結果之圖，圖中縱轴表藉由驗硫酸法測定之溶離液中之糖含量（吸光度490 nm :黑圈記號）、橫軸表部分編號（1個部分為10毫升）。各溶離部分用如同上記之矽膠片分析。 TLC分析之結果檢出之成分可分類為部分編號3〇至35，％

至40, 41至44, 45至48, 49至53之5群。對各部分編號，將 125微升匯集成上記之5群，以蒸發器使乾，溶於5〇〇微升之離子交換水，測定對HL-60細胞之增殖抑制活性。將對HL-60細胞最最強之增殖抑制活性之部分編號36至 4〇以蒸發器使乾，溶於5毫升之丁醇··乙酸：水=4 : 2，將此施加於以i丁酵：乙酸：水=4: 1:2洗淨之充填石夕膠 6OF254之管柱。溶離劑使用卜丁醇：乙酸：水㈠：1: 個部分=3毫升）。

各落離部分如同上記，使用矽膠片分析。其結果檢之成分大分為部分編號46至52(第以羊）、6〇至7〇(第2群）、至84(第3群）、86至94(第4群）、96至120(第5群）。各群以蒸發器使乾，溶於各5毫升之離子交換水，以孔 0·45微米之遽膜（陳紹公司製）過滤。測定所得之各溶液 HL 60之增殖抑制活性。並制活性。一。果，弟3、4、5群確認增殖確認為瓊對第4、5群之構造，藉由TLC分析及質量分析，

O:\90\90175.DOC\LAN -71 . 1244923 脂雙糖。對第3群之構造，藉由質量分析及NMR分析，確認為冷-D_ 峨喃半乳糖基-(1—4)_3,6_脫水_2-〇-甲基丄，半乳糖。圖32 為表示召-D-吡喃半乳糖基-(1~>4)-3,6-脫水-2-0-甲基-L-半乳糖之光讀之圖，橫軸表^/以直，縱軸表相對強度（％)。又，圖33為表示万_D-吡喃半乳糖基脫水_2-〇_甲基 -L_半乳糖之η-NMR光譜之圖，橫軸表化學位移（ppm)，縱軸表信號之強度。冷-D-吡喃半乳糖基-(1—4)_3，脫水甲基_L_半乳糖與瓊脂雙糖相同，明白對HL-60細胞具強的細胞增殖抑制活性。實施例17 (1)來自實施例3所得之瓊脂之糖類如下地測定過氧化脂質自由基產生抑制活性。將金色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)3A (National Collection of Type Cultture，NCTC 83 19)接種於 5毫升腦心培養基（Brain heart mediiium，Difco公司製，0037-17-8)， 3 7 °C下培養一晚。由離心收集菌體，以磷酸緩衝食鹽水洗3 次後，懸浮於磷酸緩衝食鹽水使成1x1 〇7菌落形成單位/毫升。將100微升之上記菌懸浮液、100微升之樣品水溶液、 100微升之1毫克/毫升高鐵血紅蛋白（Sigma公司製，M9250) 水溶液及600微升之磷酸緩衝食鹽水及1〇〇微升之5〇 mM第三丁基過氧化氫（片山化學社製；03-4990)水溶液混合，於 3 7 °C使反應30分。加1毫升之2xNMP培養基[8克之營養肉湯 O:\90\90175.DOC\LAN -72- 1244923 (迪夫可公司製，0003-01-6)、5克胰酶解腺（Dic〇f^司製， 0123-17-3)、5克之NaC卜 10克之甘露醇（Nacalai Tesque& 司製 ’ 213-03)’ 0.035克之酚鹽（Nacalai Tesque公司製，268-07) 溶於蒸餘水，成500毫升，以NaOH調pH於7.4後，過濾滅菌者]停止反應，以NMP培養基（2xNMP培養基以滅菌水稀釋2 倍者）各3倍地分12階段稀釋者之各16〇微升放入96孔微定量 ϋϋ之孔内，於37 C培養一晚。培養基之顏色以肉眼觀察，將可見菌生育而使培養基由紅色變成黃色之孔之樣品，作為具有過氧化脂質自由基產生抑制活性者。其結果示於表14。於表14，+表示可見到菌之生育之孔之樣品’-表無見到菌之生育之孔之樣品。又，示於表之最上列之濃度為將第三丁基過氧化氫及菌體於37 °c下反應30分之反應液中之樣品之濃度。表 14 ____

______0.1 mM 瓊脂雙糖 + 瓊脂四糖一半乳糖 _ 以上之結果，瓊脂雙糖與瓊脂四糖中可見強的過氧化脂質自由基產生抑制活性。角菜雙糖及3,6-脫水-2-0-甲基-L-半乳糖亦可確認同樣之活性。 (2)市售之瓊脂（伊奈瓊脂S-7型，伊奈食品工業社製）5克懸浮於50mM檸檬酸45毫升，於93t加熱155分，以NaOH調成 pH 6之樣品（檸檬酸處理），與懸浮於1〇〇 mM HC1 45毫升， O:\90\90175.DOC\LAN -73 - 1244923 於95°C加熱13分，以NaOH調成pH 6之樣品（HC1處理物），以水稀釋1、2、4、8、10、1〇〇倍，以如同實施例17_(1)之方法測定過氧化脂質自由基生成抑制活性。其結果，檸檬酸處理物與鹽酸處理物之任一者皆至1〇倍稀釋為止可確認活性，任一者皆確認同等之過氧化脂質自由基產生抑制活性。實施例1 8 瓊脂雙糖對藉由刀豆素（C〇nA)之淋巴球胚細胞化反應之抑制作用自ddY小鼠（日本SLC ;雄，7週齡）摘出脾臟，粉碎之懸浮毛含10%胎牛血清（海克隆、彳夕口一 ^ )之RPMi_i64〇培養基（Gibco)，得單細胞液。將細胞懸浮液採種於塑膠皮氏口養皿杰C〇2培養杂37 C下培養2小時，使接著性細胞接著於皮氏培養m ’使用非接著性細胞作為脾臟淋巴球。調整細胞濃度於2x106細胞/毫升，以2〇〇微升/孔播種於96孔微疋量皿，於對照群以外之各孔，添加各濃度之瓊脂雙糖。另外’於全部孔中添加5微克之c〇I1 A(Nacalai Tesque)，於 C〇2培養态，37 C下培養1天。培養後各孔中加工微居理之3H_ 胸苷，再培養1天，以液體閃爍計數器測定併入細胞之量。其結果示於圖34。亦即，圖34為表示於藉由c〇nA之淋巴球胚細胞化反應，瓊脂雙糖濃度與胸苷併入量之關係，檢軸表瓊脂雙糖濃度，縱軸表3H_胸苷併入量（cpm)。白長條圖表無刺激時，斜線長條圖表藉c〇nA刺激時之3H_胸苷併入里由圖34可明白’瓊脂雙糖對於分裂素刺激時之小鼠淋巴球之增殖頑不用量依賴性抑制作用，以微克/毫升幾乎

O:\90\90175.DOC\LAN -74- 1244923 完全抑制，確認對淋巴球活性化之抑制作用。又，3,6-脫水 p比喃半乳糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、瓊脂雙糖及3，6-脫水-2-0-甲基-L-半乳糖亦認定同樣之活性。實施例19 瓊脂雙糖對混合淋巴球反應之抑制作用自BALB/c小鼠（日本SLC ;雄，6週齡）及C57BL/6小鼠（日本SLC ;雄，6週齡）摘出脾臟，依上記方法得脾臟淋巴球。各細胞懸浮液濃度調成2xl06細胞/毫升，各1〇〇微升混合，播種於96孔微定量皿中。對照群以外之各孔内添加各濃度之故〗曰雙糖’於C〇2培養斋’於37C下培養4天。培養後，各孔中加1微居理之3H-胸苷，再培養1天，以液體閃燦計數器測定併入細胞之量。其結果示於圖3 5。亦即，圖3 5為表示於混合淋巴球反應，瓊脂雙糖濃度與胸苷之併入量之關係之圖，橫軸表壤脂 i糖;辰度’縱軸表胸嘗之併入量（cpm)。白長條圖表單獨使用來自任一系統之細胞時，斜線長條圖表混合來自兩系統之細胞時之3H-胸苷併入量。由圖35可明白，瓊脂雙糖對方；藉兴體抗原刺激活性之淋巴球顯示用量依賴性抑制作用，以10微克/毫升幾乎完全抑制，確認對淋巴球之活性之抑制作用。又’ 3，6-脫水被喃半乳糖、瓊脂四糖、瓊脂六粉、壤脂八糖、瓊脂雙糖及3,6-脫水-2-0-甲基半乳糖亦確認同樣之活性。實施例20 (1)將RAW264.7細胞（ATCC TIB 71)懸浮於含1〇%胎牛血 O:\90\90175.DOOLAN -75- 1244923 清（Gibco公司製）、不含酉分鹽、含2 mM L-越胺酸（Life

Technologies Oriental公司製，25030-149)之達爾貝可改良鳶戈培養基（Dulbecco’s Modified Eagle Medium，百歐維他卡公司製，12-917F)使成3xl05細胞/毫升，於48孔微定量m之孔内各加500微升，於5% C〇2存在下，37°C培養12小時。各孔中添加10微升之25微克/毫升脂聚糖（LPS，夕戈馬公司製，1-2012)與 10微升之 5000、1500、500、150或 50 μ Μ瓊脂雙糖或新瓊脂雙糖（夕戈馬公司製，G4410)水溶液，再培養12小時後，藉由NO於培養基中氧化，進行所生之Ν02-濃度之測定。又，作為對照，設定無加LPS之區分及無加瓊脂雙糖或新穎瓊脂雙糖之分區。上記培養後，於1〇〇微升培養基中加1〇〇微升之4%格利斯 (夕口一只）試劑（Sigma公司製，G4410)，於室溫放置15分後，測於490 nmi吸光度。自溶於上記培養基之已知濃度之

NaN〇2製作之檢量線計算培養基中之N〇2-濃度。測定全部以 3連進行。此結果’瓊脂雙糖濃度依賴性地抑制藉由LPS之謗發N〇產生’新瓊脂雙糖無抑制。其結果示於圖36及37。亦即，圖36為表示添加瓊脂雙糖於各培養條件下培養時之培養基中之度之圖。圖37為表示添加新瓊脂雙糖於各培養條件下培養時之培養基中之N02_濃度之圖。於圖36、37，橫軸表培養條件，縱軸表1^〇2-濃度（#M)。，使用3,6-脫水峨喃半乳糖、角菜雙糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瘦脂八糖及3,6-脫水_2-〇_甲基_L_半乳糖代替壤脂雙糖

O:\90\90175.DOC\LAN 1244923 亦可得同樣結果。 (2) 市售瓊脂（伊那瓊脂S-7型，伊那食品工業社製）5克懸浮於45毫升之0.1N HC1，於95°C處理13分。冷卻至室溫後，以 NaOH中和，以0.22微米之MILLEX-GP濾膜（Millipore公司製，SLGPR25LS)過濾。對此樣品（瓊脂鹽酸分解溶液）及實施例11-(1)所得之瓊脂分解寡糖溶液（瓊脂檸檬酸分解溶液），以實施例20-(1)記載之方法測定NO抑制活性。亦即，對於預先於48孔微定量皿培養之RAW264.7細胞，於各孔中加10微升之25微克/毫升之LPS與10微升之上記樣品之20倍稀釋液，進行測定。又，作為對照設定無加LPS之分區，無加上記樣品之分區及加2.5 mM檸檬酸之分區。又，測定全部以2連進行。此結果，瓊脂鹽酸分解溶液、瓊脂檸檬酸分解溶液皆抑制藉由LPS之NO產生之誘發。其結果示於圖38。亦即，圖 3 8為表示添加瓊脂鹽酸分解溶液、瓊脂擰檬酸分解溶液培養時之培養基中之N02-濃度之圖。於圖38，橫軸表培養條件，縱軸表N〇2-濃度（//M)。 (3) 以如同實施例20-(2)之方法，使用100 mM半乳糖 (NacalaiTesque公司製，編號 165_11)、100mM3,6-脫水 _D-半乳糖（船越（Funakoshi)公司製，編碼G0002)水溶液，進行 NO產生抑制活性之評估。其結果，3,6-脫水-D-半乳糖抑制NO產生，而半乳糖無抑制。其結果示於圖39。亦即，圖39為表示添加3,6-脫水-D-半乳糖、半乳糖培養時之培養基中之N〇2-濃度之圖。於圖 O:\90\90175.DOC\LAN -77- 1244923 39 ’橫軸表培養條件，縱軸表n〇2-濃度（# Μ)。 (4)將RAW 264.7細胞懸浮於實施例20_(1)記載之達爾貝可改良禽戈培養基使成3X1 〇5細胞/毫升，於48孔微定量皿之孔中各加500微升，於5%C〇2存在下，於37°C培養10小時。氧化以實施例2〇_(1)記載之方法定。又，作為對照，設定無加LP 無加瓊脂雙糖之分區。又，所有接著，加10微升之5,000 // M瓊脂雙糖水溶液，分別培養工、 2、4、6小時。其後，除去培養上清液，於各孔中重新各加 500微升之上記達爾貝可改良鳶戈培養基，加1〇微升之微克/毫升之LPS、800單位/毫升之干擾素(INF-r，寇斯莫百歐公司販售，GZM_MG-IFN)水溶液、培養丨小時。其後，除去培養上清液，於各孔中重新各加5〇〇微升之上記達爾貝可改良鳶戈培養基，再培養16小時後，藉由N〇於培養基中，進行所生之N02-濃度測

性。 L-半乳糖皆確認同樣之活實施例21 拉乂檸檬酸溶液使成 (1)瓊脂粉末（和光純藥社製）放入

O:\90\90175.DOC\LAN 1244923 最後k度為3% ’於95 C進行160分之加熱處理，製備抑癖試驗用之寡糖溶液。自曰本Charles River公司購入4週齡、雄性之去胸腺小氣 (SPF/VAFBalb/cAnNCrj-nu)，預飼養！週。於此小鼠以 1·5χ106細胞/小鼠，皮下移植人類大腸癌細胞株 HCT116(ATCC CCL-247)。大腸癌細胞株移植第2週後至使用之前，將上記抑癌試驗用寡糖溶液調整於pH 6.5者，每週5日地作為飲料水，使自由攝取。每1隻小鼠1日平均攝取3·5毫升。又，將東方酵母社製之MF作為飼育用餌使自由地攝取。開始投予寡糖第4週，摘出投予寡糖之各小鼠之固形癌，將其重量與使攝取通常之飲料水之對照群之固形癌重量比較。又，本試驗以各群丨〇隻進行。其結果，於經口投予抑癌試驗用樣品之群，確認有意性 <癌增殖抑制，於經口投予來自瓊脂之寡糖者，顯示強抑癌作用。其結果示於圖41。亦即，圖41為表示本發明之寡糖之抑癌活性之圖，縱軸表固形癌重量（克），橫軸表對照群、投予寡糖群。又，於經口投予抑癌試驗用樣品中和物之群，完全地癌消失之個體有1例。 (2)使用貫施例丨1_(丨）記載之瓊脂寡糖溶液，進行對艾氏 (Ehrlich’s)腹水癌之抑癌試驗。用5週齡之雌性ddY系小鼠（體重約25克），腹腔内投予

O:\90\90175.DOC\LAN -79- 1244923 U.2X106細胞/小鼠)艾氏癌細胞’自生存數算出平均生存日數及延命率。小鼠以1群8隻，設定對照群，實施例u_⑴記載之壤脂分解寡糖洛液之3.3倍稀釋液攝取群及丨6·7倍稀釋液攝取群之 3群。亦即，製備於實施例η_(1)製備之瓊脂分解寡糖溶液之分別之水稀釋液，從投予癌細胞之3日前，令自由攝取飲水梭为解暴糖溶液之3 · 3倍稀釋液攝取群之每1日之該稀釋液攝取量為5毫升/日/小鼠。瓊脂分解寡糖溶液之167倍稀釋液彳砰取群之母1日之該稀釋液攝取量為6毫升/日/小時。又，對照群每1日為7毫升/小鼠之水攝取。其結果’於對照群平均生存日數為118日，相對於此，瓊月曰刀％•暴糖溶液之3 · 3倍稀釋液攝取群、及瓊脂分解寡糖溶液之16.7倍稀釋液攝取群之平均生存日數分別為19.8日及 14.4日，延命率分別為168%及ι22%，被認為為有意性之延命效果。實施例22 於威斯塔（Wistar)系大鼠（雄，5週齡，體重約150克；曰本 SLC)之腹腔内注射1 〇〇微克之白蛋白（〇a ; sigma公司）及1 I升之明蓉[商品首傑克特明蓉（Imj ect Alum);匹阿士（匕。了只）公司]使敏化，14日後自腹大動脈採末稍血，其血清作為抗OA抗體。於威斯塔大鼠（雄，7週齡，體重約200克；日本SLC)之剃毛之背部’皮下投予抗OA抗體1〇〇微升使被動敏化。敏化48 小時後於各群4隻之大鼠腹腔内投予實施例11-( 1)記載之瓊 O:\90\90175.DOC\LAN -80- 1244923 月曰刀解暴糖溶液或其丨0倍水稀釋液2毫升。對照群之大鼠，腹腔内投予2毫升水。投予30分後’由尾靜脈注射含〇·1%〇Α、0.5%伊凡斯藍 (Nacalai Tesque)之生理食鹽水丨毫升，引起pcA。抗原誘發 3〇分後’將大鼠斷頭、放血使死，切除背部色素漏出之部位、回收。回收之皮膚浸於1毫升之1N KCl(Nacalai Tesque)放置1夜後’加含0·6Ν H3P〇4(默克公司）之丙酮液（Nacalai Tesque)9 見升抽出色素’以ELIS A讀取機測定620 nm之吸光度。皮膚 < 漏出色素量藉由伊凡斯藍之檢量線求出。結果示於圖42。亦即，圖42為表示本發明之寡糖之ρ〇Α 抑制 < 圖’圖中縱軸表色素漏出量（微克/部位），橫軸表使用之瓊脂分解寡糖溶液。如圖所示，藉由投予瓊脂分解寡糖溶液，由於PCA之色素漏出被抑制至一半以上，與對照比較，顯示有意性之差 (ρ<0·05)。又，3,6-脫水吡喃半乳糖、瓊脂雙糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、扠月曰八糖、角菜雙糖及3,6-脫水_2_〇_甲基_L_半乳糖確認同樣之效果。實施例23 於6孔培養m中’分注懸浮於含1〇% fbs之rPmI-1640成 5x10細胞/孔/2¾升培養基之小鼠黑素瘤細胞bi6bl6，於 °C培養。第2天，添加1〇〇微升之瓊脂雙糖溶液（2毫克/毫升〜0.2¾克/¾升），於第7天交換培養基，同時添加微升之

O:\90\90175.DOC\LAN -81 - 1244923 瓊脂雙糖溶液（2毫克/毫升〜0.2毫克/毫升）。第8天回收細胞，將DNA、RNA、蛋白質分解處理後，測定400 nm之吸光度，檢定黑色素產生抑制作用。亦即，將培養基吸除後，每孔添加溶於20 mM EDTA溶液之0.25%胰蛋白酶0.3毫升，於37°C培養10分。接著，添加2 毫升之新培養基’將細胞懸浮’回收於試官。接者’離心除去培養基後，以2毫升之PB S使細胞懸浮，再度離心分離。除去上清液後，於細胞中加含3 0微升之5 mM氯化獻之5 0 mM乙酸鈉緩衝液（pH 5.0)與1微升之70,000單位/毫升之 DNase I(寶酒造社製），徹底混合後，於37°C培養2小時，將 DNA分解。接著加10毫克/毫升之核糖核酸酶A(Sigma公司製）1微升，於50°C培養1小時，將RNA分解。最後對於細胞數2xl06加含100微克/毫升之蛋白酶K(Sigma公司製）、 0.1%Triton X及 10 mM EDTA之 100 mM Tris-磷酸緩衝液（pH 7.8)使液之總量為200微升，於37°C培養16小時後，測定400 nm之吸光度。結果示於表15。如表15所示，認定瓊脂雙糖於50、100微克/毫升之濃度有黑色素產生抑制活性，確認瓊脂雙糖之美白效果。又，瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、角菜雙糖及3，6-脫水-2-0-甲基半乳糖，認定有同樣效果。表15 瓊脂雙糖微克庵升平均 400nm吸光度 SD 100 0.383 土 0.007 50 0.392 土 0.172 10 0.521 + 0.256 §摔 J ^ 0.487 土 0.038 註)測定以3連進行對照係添加100微升培養基 O:\90\90175.DOC\LAN ~ 82 -

Claims

1244923 拾、申請專利範圍： /1^

一種美白用或保溼用化粧料，其係以選自瓊脂雙糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、ZC -角菜雙糖及/3 -D-吡喃半乳糖基-3，6-脫水-2-0-甲基-L-半乳糖之至少1種糖化合物為有效成分。

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