KR101345734B1 - 참송이 버섯 유래 변성 베타글루칸을 함유하는 항암용 식품 조성물 또는 약학조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 참송이 버섯 유래 베타글루칸을 β-(1-6)-글루카네이즈[β-(1-6)-glucanase]로 가수분해하여 수득한 분지도가 0.50 ~ 0.24인 변성 베타글루칸을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항암 또는 면역기능 증진용 식품 조성물과 암 질환 치료용 약학 조성물을 개시한다.

Description

참송이 버섯 유래 변성 베타글루칸을 함유하는 항암용 식품 조성물 또는 약학조성물{Food composition or pharmaceutical composition for anti-cancer comprising modified beta-glucan from Chamsong-I mushoom}
본 발명은 항암용 식품 조성물 또는 약학 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 참송이 버섯 유래 변성 베타글루칸을 함유하는 항암용 식품 조성물 또는 약학조성물에 관한 것이다.
환경의 악화와 노년인구의 증가로 세계 암 발생률이 매년 5%이상 증가하고 있으며, 1997년 암을 원인으로 한 사망자가 600만 명으로 세계 사망률의 12%에 달했다. 국내에서도 매년 10만 명의 암환자가 새롭게 발생하고 5만 여명이 매년 사망하고 있으며, 암환자 증가율도 10%에 이르고 있다. 1999년 국립암센터의 통계에 따르면 환자는 12만 명으로서 남자는 위암(24%), 간암(16%), 폐암(16%), 대장암(10%)의 순서이며, 여자는 위암(16%), 자궁경부암(12%), 유방암(15%), 대장암(10%)의 순서로 암 환자가 발생했다.
이러한 암의 치료를 위해서는 외과적 수술요법, 화학요법, 생물요법, 방사선요법 등이 이용되고 있다. 화학요법은 흔히 말하는 약물요법으로서 핵산 알킬화제, 대사 길항제, 천연물, 호르몬제 등의 합성된 화학물질을 이용한 것이며, 생물요법은 우리 몸이 원래 가지고 있는 면역 기능을 회복시키거나 증진시켜 암세포의 활동력을 약화시킴으로써 암의 진행을 막는 것으로서, 사이토카인, 면역요법제, 유전자 치료제, 암백신, 신생혈관형성 억제제 등이 있다. 현재까지는 이러한 방법들을 단독 혹은 병용하여 치료에 응용하고 있으나 부작용, 약제내성, 재발 등으로 완벽한 치료법이 없는 상태이다.
지금까지 항암제 연구는 암세포처럼 세포분열이 왕성한 조직에 대한 세포독성을 근거로 하여 행하여지기 때문에 세포분열이 빠른 피부, 점막, 골수 같은 정상조직 세포에도 독성을 나타내게 된다. 따라서 효과적인 항암제 개발을 위해서는 암세포에만 특이적으로 작용하고 정상세포에 대해서는 독성이 적은 항암 활성물질의 탐색이 이루어져야 한다. 현재 식물과 미생물 등에서 추출한 항암물질에 대한 연구가 많이 진행되고 있으나, 이들 대부분이 미생물의 2차 대사산물이거나 생약재에서 추출된 물질에 관한 연구가 주를 이루고 있다.
그러나 항암물질의 독성문제 해결을 위해서는 미생물이나 생약 식물보다는 우리가 일상생활에서 흔히 섭취하고 있고 그 안정성이 입증된 식용작물을 이용한다면 그 안정성은 매우 높다고 할 수 있다.
한편, 버섯은 항암, 면역증강, 항산화, 콜레스테롤 저하 등 우수한 생리활성 가진 것으로 알려져 있는데, 최근 웰빙 열풍과 함께 수요가 확대되어 제약, 화장품, 식품 산업에서 기능성 첨가 원료로 그 활용성이 다변화되는 추세에 있다.
버섯을 항암 소재로 연구한 기술로, 한국 공개특허 제10-2006-0078291호에 버섯 자실체의 항암기능성 추출액 제조방법 및 이를 이용한 항암기능성 식품이 개시되어 있으나, 이는 버섯 자실체의 온수 추출액와 열수 추출액을 이용하는 것에 관한 것으로 항암 효과를 가지는 특정 물질에 대한 연구는 미흡하다는 한계점이 있었다.
또한, 한국 공개특허 제10-2003-0030636호에는 버섯 자실체의 발효를 이용하여 고활성 항암 단백다당체를제조하는 방법이 개시되어 있으나, 이는 항암효과가 충분히 높지 않다는 문제점이 있었다.
한편, 신품종인 참송이 버섯은 표고버섯을 개량하여 육종한 신품종으로서 맛과 향이 자연산 송이와 유사하여 현재 수도권 및 지방의 주요 백화점에서 고가(14,800원/150g)로 판매가 이루어지고 있다. 하지만 현재까지 참송이 버섯의 성분이나 생리활성에 대해서는 연구가 충분히 이루어지지 않은 실정이다.
이에 본 발명의 발명자들은 참송이 버섯을 항암 소재로 개발하기 위하여 예의연구한 결과 본 발명을 완성하기에 이른 것이다.
본 발명은 상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 천연 성분으로 이루어져 인체에 무해하고 항암 또는 면역기능 증진 효과가 탁월한 천연소재를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 참송이 버섯 유래 베타글루칸의 분지도를 조절하여 항암 또는 면역기능 증진효과가 매우 탁월한 항암소재를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 참송이 버섯 유래 베타글루칸을 β-(1-6)-글루카네이즈[β-(1-6)-glucanase]로 가수분해하여 수득한 분지도가 0.50 ~ 0.24인 변성 베타글루칸을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항암 또는 면역기능 증진용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 참송이 버섯 유래 베타글루칸을 β-(1-6)-글루카네이즈[β-(1-6)-glucanase]로 가수분해하여 수득한 분지도가 0.50 ~ 0.24인 변성 베타글루칸을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 암 질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변성 베타글루칸이 pH 6 ~ 8, 온도 37 ~ 45℃, 반응시간 3 ~ 5시간의 반응조건에서 가수분해된 것을 특징으로 한다.
이하에서는 본 발명의 항암 또는 면역기능 증진용 식품 조성물, 암 질환 치료용 약학 조성물에 대하여 자세히 설명하겠다.
본 발명의 참송이 버섯 유래 베타글루칸은 참송이 버섯으로부터 추출된 베타글루칸을 의미한다. 이때, 참송이 버섯으로부터 베타글루칸을 추출하는 방법은 특별히 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상 사용하는 공지의 추출방법을 다양하게 적용할 수 있다. 또한, 본 발명은 참송이 버섯으로부터 베타글루칸을 추출한 후 단백질 등을 제거하기 위하여 정제공정을 더욱 거치는 것이 바람직하다.
본 발명은 이와 같이 수득한 참송이 버섯 유래 베타글루칸을 β-(1-6)-글루카네이즈[β-(1-6)-glucanase]를 이용하여 가수분해함으로써 분지도가 0.50 ~ 0.24인 변성 베타글루칸을 수득할 수 있다.
본 발명의 변성 베타글루칸은 암세포를 직접 공격하지 않고 비특이적 면역반응으로 인간의 정상 세포의 면역기능을 활성화시켜 암세포의 증식과 재발을 억제하고, 대식세포(macrophage)를 활성화시켜 암세포가 있는 체내로 들어가 여러 가지 사이토카인(Cytokine)의 분비를 촉진시킴으로써 면역세포인 T세포와 B세포의 면역기능을 활성화시켜 준다.
특히, 본 발명의 변성 베타글루칸은 분지도가 0.50 ~ 0.24, 바람직하게는 0.32인데, 이와 같이 분지도가 조절됨으로써 NO 생성능이 탁월하게 증대되고, 유방암, 복강암 및 대장암 세포주에 대한 성장 저해능이 탁월하게 증대된다.
이때, β-(1-6)-글루카네이즈[β-(1-6)-glucanase]는 참송이 버섯 유래 베타글루칸의 β-(1->6)의 분지결합을 가수분해함으로써 베타글루칸의 분지도를 감소시켜 준다. 이때, β-(1-6)-글루카네이즈로는 "Westase, EC3.2.1.75, Takara, Tokyo, Japan[Streptomyces rochei DB-34의 액상 배양액에서 제조된 동결건조 파우더 형태로 β-1,6 glucanase로 작용함]"을 사용하는 것이 바람직하며, β-(1-6)-글루카네이즈의 활성은 37℃, pH 6.0의 조건에서 Pustulan 용액 (10 mg/mL)에서 1분간 1 μmoL의 환원당을 유리하는 효소량을 1 U으로 정의한다.
또한, 본 발명에서 가수분해는 pH 6 ~ 8, 온도 37 ~ 45℃, 반응시간 3 ~ 5시간의 반응조건에서 하는 것이 바람직하다. 상기 범위를 만족하는 경우, 분지도가 0.50 ~ 0.24인 변성 베타글루칸을 제조할 수 있다.
특히, 본 발명에서 항암 또는 면역기능 증진 효과가 가장 탁월한 분지도가 0.32인 변성 베타글루칸을 제조하기 위해서는, 정제된 참송이 버섯 유래 베타글루칸을 1 mg/mL의 농도로 50 mM phosphate buffer (pH 7.4)에 분산시키고 β-(1-6)-글루카네이즈[β-(1-6)-glucanase](20 ug/mL)를 가하여 40℃ 항온수조에서 4시간 동안 가수분해한 후, 100℃에서 10분간 열처리하여 효소를 불활성한 후, 8,000×g에서 30분간 원심분리하여 얻은 상등액을 48시간 동안 증류수에서 투석 (MWCO 12-14 kDa)하여 동결 건조하는 것이 바람직하다.
본 발명은 이와 같이 수득된 변성 베타글루칸을 항암 또는 면역기능 증진용 식품 조성물, 암 질환 치료용 약학 조성물로 다양하게 이용할 수 있다.
본 발명의 항암 또는 면역기능 증진용 식품 조성물은 전제 조성물에 대하여 상기 변성 베타글루칸을 0.1 중량%~50 중량% 포함하는 것이 바람직하다. 0.1 중량% 미만일 경우에는 그 효과가 미비하고, 50 중량%를 초과하는 경우에는 사용량 대비 효과 증가가 미미하여 비경제적이다.
또한, 본 발명의 항암 또는 면역기능 증진용 식품 조성물에 함유되는 변성 베타글루칸의 농도는 바람직하게는 10 μM ~ 1 mM인 것이 좋다.
또한, 본 발명의 항암 또는 면역기능 증진용 식품 조성물은 바람직하게 육류, 곡류, 카페인 음료, 일반음료, 초콜렛, 빵류, 스넥류, 과자류, 피자, 젤리, 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올성 음료, 술, 비타민 복합제 및 그 밖의 건강보조식품류 중 선택되는 어느 하나인 것인 것이 좋으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 본 발명의 암 질환 치료용 약학 조성물은 전체 조성물에 대하여 상기 변성 베타글루칸을 0.1 중량%~50 중량% 포함하는 것이 바람직하다. 0.1 중량% 미만일 경우에는 그 효과가 미비하고, 50 중량%를 초과하는 경우에는 사용량 대비 효과 증가가 미미하여 비경제적이다.
또한, 본 발명의 암 질환 치료용 약학 조성물에 함유되는 변성 베타글루칸의 농도는 바람직하게는 10 μM ~ 1 mM인 것이 좋은데, 반드시 이에 한정되지는 아니한다.
또한, 본 발명의 암 질환 치료용 약학 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 더욱 포함할 수 있다. 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유가 있으며, 이들은 1종 이상 사용될 수 있다. 또한, 예방 및 치료제가 약제인 경우 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등이 추가적으로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 암 질환 치료용 약학 조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화 하는 것이 좋다. 구체적인 제형의 예로는 경고제(PLASTERS), 과립제(GRANULES), 로션제(LPTIONS), 리니멘트제(LINIMENTS), 리모나데제(LEMONADES), 방향수제(AROMATIC WATERS), 산제(POWDERS), 시럽제(SYRUPS), 안연고제(OPHTALMIC OINTMENTS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제(ELIXIRS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPESIONS), 전제(DECOCTIONS), 침제(INFUSIONS), 점안제(OPHTHALMIC SOLUTIONS), 정제(TABLETS), 좌제(SUPPOSITIORIES), 주사제(INJECTIONS), 주정제(SPIRITS), 카타플라스마제(CATAPLSMA), 캅셀제(CAPSULES), 크림제(CREAMS), 트로키제(TROCHES), 틴크제(TINCTURES), 파스타제(PASTES), 환제(PILLS), 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
또한, 본 발명의 암 질환 치료용 약학 조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 좋다.
본 발명에 의하면, 천연 성분으로 이루어져 인체에 무해하고 항암 또는 면역기능 증진 효과가 탁월한 항암 소재를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면 참송이 버섯 유래 베타글루칸의 분지도를 조절하여 항암 또는 면역기능 증진효과를 탁월한 증진시킬 수 있다.
도 1은 참송이 버섯 유래 베타글루칸의 β-(1-6)-글루카네이즈에 의한 분지도 변화를 나타내는 그래프이다.
도 2는 β-(1-6)-글루카네이즈에 의해 변성된 베타글루칸의 분지도에 따른 NO 생성능의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 3은 β-(1-6)-글루카네이즈에 의해 변성된 베타글루칸의 분지도에 따른 암 세포 성장 억제능의 변화를 나타내는 그래프이다(10 ~ 200㎍/mL).
도 4는 β-(1-6)-글루카네이즈에 의해 변성된 베타글루칸의 분지도에 따른 암 세포 성장 억제능의 변화를 나타내는 그래프이다(100 ㎍/mL).
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
제조예 1 : 참송이 버섯으로부터 베타글루칸 추출
본 제조예에서는 Camelini 등(2005)의 방법을 변형하여 다음과 같이 참송이 버섯으로부터 베타클루칸을 추출하였다. 즉, 건조버섯(100 mesh 이하) 100 g에 10배 부피의 물(1 L)을 가한 뒤 2 M NaOH를 사용하여 pH를 12로 조정한 다음, 95℃, 120 rpm에서 12시간 추출한 다음 6,500×g에서 20분간 원심분리하여 상층액을 얻었다. 이 상층액에 3배량의 에탄올을 첨가하여 4℃에서 24시간 방치 후, 6,500×g에서 20분간 원심분리를 통하여 침전물을 회수함으로써, 참송이 버섯으로부터 베타클루칸을 추출하였다.
제조예 2 : 참송이 버섯 유래 베타클루칸의 정제
본 제조예에서는 상기 제조예 1에서 수득한 베타글루칸 추출물 내 단백질을 제거할 목적으로 반응액에 50배 가량의 0.1% acetic acid(pH 5.0)을 첨가하여 1시간 동안 교반한 뒤, MWCO 12,000-14,000인 셀룰로으즈(cellulose) 투석망을 이용하여 산을 제거한 다음 동결 건조하였다. 이후 Sevag 등(1938)의 방법에 따라 클로로포름과 부탄올을 4:1의 비율로 섞은 용액을 다당체에 첨가하여 추가적으로 단백질을 제거한 후, 다시 에탄올을 첨가하여 4℃에서 24시간 방치하고, 원심분리(12,000×g, 20 min)를 통하여 얻은 침전물을 3차 증류수에 용해시켜 freeze-thaw 방법으로 불순물이 제거될 때까지 반복하였다. 이후 투석망으로 저분자 물질을 제거하고 동결 건조하여 4℃에서 보관한 뒤 사용하였다.
실시예 1 : 참송이 버섯 유래 베타글루칸의 성분, 분자량 및 구조분석
본 실시예에서는 상기 제조예 1, 2를 통해 수득한 베타클루칸의 성분, 분자량 및 구조를 분석하였다.
총당은 페놀황산법, 단백질은 BCA법, 베타글루칸 함량은 Megazyme의 mushroom and yeast β-glucan assay kit (K-YBGL)를 이용하여 분석하였다.
또한, 구성당 분석은 TFA (Trifluoroacetic acid)를 이용하여 100℃에서 4시간 동안 산가수분해한 시료를 CarboPacTMPA1 column이 장착된 HPAEC-PAD system (Dionex, USA)을 이용하여 18 mM NaOH를 1.0 mL/min의 유속으로 분석하였다.
또한, 분자량 분포는 BioSep-SEC-S2000 and S4000 columns (300 x 7.8 mm, Phenomenex, Inc., Torrance, CA, USA)이 장착된 GPC (Agilent 1100 series, Palo Alto, CA, USA)를 이용하여 분석하고, molecular weight standard로 dextran을 사용하여 측정하였다. 이때, 시료의 농도는 0.1%로 0.45 um syringe filter로 여과한 후 분석하였다.
또한, 결합양식 분석은 NMR을 이용하여 분석하였다. 즉, 용매인 D2O 1 mL에 시료 80 mg을 녹여 NMR spectrometer(600 MHz, AVANCE 600, Bruker, Germany)를 이용하여 70℃에서 측정하였으며, trimethylsilyl propionate(TSP)를 내부표준물질로 사용하였다.
또한, GC-Mass spectrum은 다당류의 당쇄결합 양식을 조사하기 위해 Hakomori 방법에 따라 methylation, hydrolysis, reduction 및 acetylation을 통해 partially methylated alditol acetate로 전환된 시료를 GC-MS로 분석하였다. SP-2380 capillary column(0.25 mm > 30 m, 0.2 um film thickness, Supelco Inc., Bellefonte, PA, USA)이 장착된 Hewlett-Packard 5890A GC system을 이용하였으며, 이때, 컬럼온도는 60℃ for 1 min, 60 →150℃ (30℃ /min), 150 →180℃ (1℃ /min), 180 →231℃ (1.5℃ /min), 231 →250℃ (30℃ /min), 250℃ for 10 min으로 조정하였다. carrier gas로는 He(0.5 mL/min)을 사용하였고, 5970 mass selective detector에서 검출된 결과물을 이용하여 아래와 같은 방법으로 분지정도를 계산하였다 (Hawker et al., 1991).
Figure 112011083384013-pat00001
이때, NT, NB, NL은 각각 terminal residues, branched residues, linear residues의 함량을 의미함.
분석결과, 참송이 버섯 유래 베타글루칸의 분자량은 283 kDa, 구성당은 glucose(80.1%), galactose(11.5%), mannose(5.5%), fucose(3.0%)로 주로 glucose로 구성되어 있었다. 또한, 13C-NMR 측정 결과, 102.6, 73.3, 87.7, 69.8, 76.3, 63.6 ppm 에서 각각 β-(1→3)결합의 C1, C2, C3, C4, C5, C6의 peak가 나타났으며, 69.9 ppm에서 β-(1→6)의 분지결합을 보였다. 또한, 분지 정도 분석을 위하여 베타글루칸을 메틸화한 다음 GC-MS를 이용하여 분석한 결과, 0.67의 분지도를 가지고 있음이 확인되었다.
제조예 3 : β-(1-6)- Glucanase 를 이용한 다양한 분지 정도를 갖는 참송이 버섯 유래 베타글루칸의 제조
본 제조예에서는 Streptomyces rochei DB-34 액체배양액에서 얻어진 상업용 효소인 Westase (EC 3.2.1.75, Takara, Tokyo, Japan)를 이용하여 Frieman 등(2002)과 Hirokawa 등(2008)의 방법을 변형하여 분지가 조절된 베타글루칸의 다양한 구조변형물을 제조하였다.
50 mM phosphate buffer(pH 7.4)에 정제된 베타글루칸을 1,000 ug/mL의 농도로 분산시킨 후 효소(20 ug/mL)를 가하여 40℃ 항온 수조에서 48시간 동안 반응하면서 1,2,4,8,12,24,48 시간동안 가수분해가 진행된 반응물을 회수하여 100℃에서 10분간 열처리하여 효소를 불활성화시켰다.
8,000×g에서 30분간 원심분리하여 얻은 상등액에 존재하는 효소작용으로 생성된 glucose의 양을 glucose oxidase peroxidase(GOPOD) assay kit(D-GLUCOSE, Megazme International Ireland Ltd, Wicklow, Ireland)를 이용하여 측정하여 분지도 변화 정도를 계산하였다. 그 결과, 가수분해 8시간까지는 급격한 glucose 생성을 보였으나 이 후 큰 차이를 보이지 않다가 12시간 반응 후부터는 가수효과를 보이지 않았다(도 1 참조).
따라서, 1, 2, 4, 8, 12시간 동안 가수분해하여 얻은 변형물을 회수하여 메틸화 방법을 이용하여 분지도를 분석한 결과, 가수분해에 의하여 각각 0.67 -> 0.50 → 0.32 → 0.24 → 0.19로 분지도가 점차 감소함을 알 수 있었다(도 1 참조).
실시예 2 : 참송이 버섯 유래 베타글루칸의 분지 정도에 따른 생리활성 변화 (NO 생성능의 변화) 측정
본 실시예에서는 참송이 버섯 유래 베타글루칸의 분지 정도에 따른 NO 생성능의 변화를 측정하였다.
NO 생성능은 cytokine에 의한 Raw 264.7 세포가 발생하는 nitrite의 농도를 측정하기 위하여 griess 반응을 이용하였다. Raw 264.7 세포를 5×105 cells/well로 분주하여 37℃, 5% CO2 하에서 2시간 동안 배양하고, 시료를 첨가하여 20시간 동안 추가 배양하였다. 96 well plate에 상등액 100 uL와 griess reagent 100 uL를 넣고 10분 동안 실온에서 방치한 후에 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. NO의 농도는 sodium nitrate를 희석하여 흡광도를 측정하여 표준곡선을 작성하였고, 양성대조군으로 lipopolysaccharide (LPS)를 사용하였다.
참송이 버섯 유래 베타글루칸의 분지 조절 정도에 따른 NO 생성능을 측정한 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타나는 바와 같이, 참송이 버섯 유래 베타글루칸 본연의 분지도가 가수분해에 의해 0.67에서 0.32까지 감소함에 따라 NO 생성능이 유의적으로 증가하였으나, 가수가 더욱 진행되어 0.19까지 분지도가 감소되면서 오히려 NO 생성능도 감소함을 알 수 있었다.
NO 생성능은 항암효과 및 면역효과의 지표로 사용되는데, 이에 의하면 분지도가 0.32인 베타클루칸은 다른 분지도의 베타글루칸에 비하여 면역기능의 활성화 및 이로 인한 암세포의 증식과 재발의 억제 효과가 탁월함을 알 수 있었다.
실시예 3 : 참송이 버섯 유래 베타글루칸의 분지 정도에 따른 생리활성 변화(암세포 성장 저해능의 변화) 측정
본 실시예에서는 참송이 버섯 유래 베타글루칸의 분지 정도에 따른 암세포 성장 저해 활성 변화를 측정하였다.
암세포 성장저해 활성은 MCF-7 유방암 세포, Sarcoma 180 복강암 세포주 및 HT-29 대장암에 대해 MTT assay를 이용하여 측정하였다. 96 well plate에 암세포(1×104 cells/well)를 분주한 후 일정 농도의 베타글루칸 용액을 100 uL씩 분주하고 37℃, 5% CO2 incubator에서 72시간 배양하였다. 이후, 인산생리식염수에 5 mg/mL 농도로 제조한 MTT 용액 20 uL를 첨가하여 2,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상징액을 제거한 후 DMSO 200 uL를 가하여 30분간 교반 후 540 nm ELISA reader에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로 5-Fluorouracil(5-FU)를 사용하였다.
참송이 버섯 유래 베타글루칸의 분지 정도를 조절하여 제조한 다양한 구조변형물의 암세포주 종류에 대한 농도별 성장 저해 효과를 조사한 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 의하면, HT-29 (대장암), MCF-7 (유방암) 및 Sacorma 180 (복강암)에 대해 모든 시료에서 10-200 ug/mL의 농도범위에서 농도의존적인 활성을 보였으며, 분지도 32%의 구조변형물의 암세포 성장 억제능이 가장 높음을 알 수 있었다.
또한, 각각의 암세포 성장을 50% 저해하는데 필요한 각 시료의 필요량 (The half maximal inhibitory concentration, IC50 values)을 계산한 결과, 분지도 67%의 베타글루칸 시료와 비교하여 분지도를 32%로 조정함으로써 IC50값이 반으로 감소함을 확인할 수 있었다.
Figure 112011083384013-pat00002
한편, HT-29, MCF-7 및 Sacorma 180 세포주의 성장에 대한 참송이버섯 베타글루칸의 분지 정도의 효과를 100 ug/mL의 농도에서 비교한 결과, 분지도가 가수분해에 의해 32%까지 감소함에 따라 유의적으로 성장저해능이 증가하였으나, 가수가 더욱 진행되어 19%까지 분지도가 감소되면서 오히려 효과가 감소함을 알 수 있었다(도 4 참조).
이상 종합하면, 본 발명은 참송이 버섯 유래 베타글루칸에 대해 β-(1-6)-glucanase라는 특이적인 상업용 효소를 이용하여 40℃에서 4시간 동안 가수분해함으로써 우수한 항암활성을 보이는 분지도 0.32의 변형물을 제조할 수 있음을 알 수 있었다.
제조예 4 : 항암 또는 면역기능 증진용 식품 조성물 제조
본 제조예에서는 참송이 버섯 유래 변성 베타글루칸을 이용하여 항암 또는 면역기능 증진용 식품 조성물을 제조하였다.
제조예 4-1 : 선식 제조
현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60메쉬의 분말로 준비하였다. 검정콩, 검정깨 및 들깨 각각을 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 후 배전 및 분쇄하여 입도 60메쉬의 분말로 준비하였다. 이후, 현미 20 중량%, 율무 25 중량%, 보리 20 중량%, 찹쌀 9 중량%, 들깨 7 중량%, 검정콩 7 중량%, 검정깨 8 중량%, 변성 베타글루칸 3 중량%, 영지 0.5 중량% 및 지황 0.5 중량%을 혼합하여 선식을 제조하였다.
제조예 4-2 : 츄잉껌 제조
껌 베이스 25 중량%, 설탕 71.9 중량%, 향료 1 중량%, 물 2 중량% 및 변성 베타글루칸 0.1 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 츄잉껌을 제조하였다.
제조예 4-3 : 캔디 제조
설탕 55 중량%, 물엿 44.8 중량%, 향료 0.1 중량% 및 변성 베타글루칸 0.1 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 캔디를 제조하였다.
제조예 4-4 : 비스킷 제조
박력 1급 20.59 중량%, 중력 1급 27.22 중량%, 정백당 4.60 중량%, 식염 0.93 중량%, 포도당 0.78 중량%, 팜쇼트닝 11.78 중량%, 암모니움 1.54 중량%, 중조 0.17 중량%, 중아황산나트륨 0.15 중량%, 쌀가루 1.46 중량%, 비타민 B10.0001 중량%, 비타민 B20.0001 중량%, 밀크향 0.04 중량%, 물 20.6998 중량%, 전지분유 1.16 중량%, 대용분유 0.29 중량%, 제일인산칼슘 0.03 중량%, 살포염 0.29 중량% 및 분무유 7.27 중량%와 변성 베타글루칸 1 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 비스킷을 제조하였다.
제조예 4-5 : 건강음료 제조
꿀 0.30 중량%, 치옥토산아미드 0.0003 중량%, 니코틴산아미드 0.0003 중량%, 염산리보플라빈나트륨 0.0001 중량%, 염산피리독신 0.0001 중량%, 이노시톨 0.001 중량%, 오르트산 0.002 중량%, 물 98.6762 중량% 및 변성 베타글루칸 1 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 건강 음료를 제조하였다.
제조예 4-6 : 소시지 제조
돈육 60.18 중량%, 계육 30 중량%, 전분 3.7 중량%, 대두단백 1.5 중량%, 식염 1.62 중량%, 포도당 0.5 중량% 및 글리세린 1.5 중량%와 변성 베타글루칸 1 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 소시지를 제조하였다.
제조예 4-7 : 건강보조식품 제조
스피루리나 57 중량%, 구아검효소 분해물 8 중량%, 비타민 B1염산염 0.01중량%, 비타민 B6 염산염 0.01 중량%, DL-메티오닌 0.25 중량%, 스테아린산 마그네슘 0.7 중량%, 유당 22.2 중량% 및 옥수수전분 1.83 중량%와 변성 베타글루칸 10 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 정제형 건강보조식품을 제조하였다.
제조예 4-8 : 주류 제조
변성 베타글루칸 0.8 중량%를 소주, 맥주, 양주 또는 과실주와 혼합하여 에멀전 상태로 만든 후, 진공상태에서 7,000rpm으로 15분간 원심분리하거나 고속믹서기로 9,000rpm에서 혼합하여 변성 베타글루칸이 함유된 주류를 제조하였다.
제조예 5 : 암 질환 치료용 약학 조성물 제조
본 제조예에서는 참송이 버섯 유래 변성 베타글루칸을 이용하여 암 질환 치료용 약학 조성물을 제조하였다.
제조예 5-1 : 산제 제조
변성 베타글루칸 3g에 유당 2g을 혼합하고, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
제조예 5-2 : 정제 제조
변성 베타글루칸 150mg, 옥수수전분 120mg, 유당 120mg 및 스테아린산 마그네슘 4mg을 혼합한 후 통상의 정제 제조방법에 따라 타정하여 정제를 제조하였다.
제조예 5-3 : 캡슐제 제조
변성 베타글루칸 150mg, 옥수수전분 120mg, 유당 120mg 및 스테아린산 마그네슘 4mg을 혼합한 후 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
제조예 5-4 : 주사제 제조
변성 베타글루칸 150mg에 주사용 증류수 적량을 가하여 용해시키고, pH를 약 7.5로 조절한 다음 2ml 용량의 앰플에 충진 및 멸균시하여 주사제를 제조하였다.

Claims (4)

  1. 참송이 버섯 유래 베타글루칸을 β-(1-6)-글루카네이즈[β-(1-6)-glucanase]로 가수분해하여 수득한 분지도가 0.50 ~ 0.24인 변성 베타글루칸을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항암용 식품 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 변성 베타글루칸은,
    pH 6 ~ 8, 온도 37 ~ 45℃, 반응시간 3 ~ 5시간의 반응조건에서 가수분해된 것을 특징으로 하는 항암용 식품 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
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