KR101989972B1

KR101989972B1 - 약물 유발성 신장질환 예방 또는 치료용 약제 조성물

Info

Publication number: KR101989972B1
Application number: KR1020120124163A
Authority: KR
Inventors: 소홍섭; 박래길; 오기수; 노태철; 곽태환
Original assignee: (주)나디안바이오
Priority date: 2012-11-05
Filing date: 2012-11-05
Publication date: 2019-06-18
Also published as: KR20140057870A

Abstract

본 발명은, 약물에 의해 유발된 신장 질환의 치료 또는 예방에 유효한 함량 이상으로 람노갈락투로난(Rhamnogalacturonan) II (RG-II)를 포함하고, 염증 반응 매개인자의 악순환(vicious cycle)에 의한 손상과 신장 조직으로 침윤되는 면역세포의 유도 염증반응을 억제하는 약물 유발성 신장질환 예방 또는 치료용 약제 조성물에 관한 것이다.

Description

약물 유발성 신장질환 예방 또는 치료용 약제 조성물 {Pharmaceutical Composition for Preventing and Treating Drug- Induced Renal Disease}

암(cancer)은 전 세계적으로 연간 약 700만 명의 사망 원인이 되는 질병이다. 현재 암을 치료하는 방법으로 수술, 방사선 치료, 유전자 치료 등 여러 방법들이 사용되고 있으나, 가장 많이 사용되고 있는 치료방법 중의 하나가 항암제를 투여하는 화학요법(chemotherapy)이다.

항암 화학요법은 전신 치료로, 대부분 주사나 경구로 항암제를 투여하면 혈류를 따라 전신에 퍼진다. 그러므로, 국소적인 효과보다는 전신에 퍼져있는 미세전이(micometastasis)에 작용하는 치료이다. 따라서, 전신적인 부작용이 많으며 수술이나 방사선치료에 비해서 그 정도가 매우 심한 편이다.

정상세포와 암세포 간의 약물에 대한 감수성 차를 이용하여 항암제가 암세포에 대해 선택적으로 작용하도록 하는 것이 화학요법이나 대부분의 항암제가 정상세포와 암세포를 구별하지 못하여 용량 제한적 특성(dose-limiting toxicity)을 나타내는데 그 문제점이 있다.

대표적인 항암제인 시스플라틴(cis-diammine-dichloroplatinum [II])은 난소암, 방광암, 폐암, 두경부암, 고환암 등의 치료를 위한 화학요법제로 임상에서 널리 사용되고 있다(Rosenberg B., Cancer, 55: pp2303-2315, 1985).

그러나 치료과정 중 약물의 제한된 함량 이상에서는 청각의 상실, 신경 독성, 신장 독성과 같은 부작용이 나타나며(Mollman et al., 1998; Screnci and McKeage, 1999), 고농도의 시스플라틴의 투여 시에는 간 독성 또한 빈번하게 관찰되는 것으로 알려져 있다(Cerosimo R. J., Ann. Pharm., 27: pp438-441, 1993; Cavalli F. et al., Cancer Treat. Rep., 62: pp2125-2126, 1978; Pollera C. F. et al., J. Clin. Oncol., 5: pp318-319, 1987).

시스플라틴-유발 신장독성 기작에는 신세뇨관 상피세포에 대한 직접적 독성 [Ciarimboli G et al., Am J Pathol 2005; 167: 1477-1484], 어팝토시스 [Wei Q et al., Kidney Int 2007; 72: 53-62], 세포-주기 단백질의 조절 이상 [Megyesi J et al., J Clin Invest 1998; 101: 777-782], p53 종양 억제자 단백질의 활성 [Wei Q et al., Am J Physiol Renal Physiol 2007; 293: F1282-1291], MAPK (mitogen-activated protein kinase) 신호전달 경로의 활성 [Jo SK et al., Kidney Int 2005; 67: 458-466], 산화 스트레스 [Lee S et al., Nephrol Dial Transplant 2006; 21: 2085-2095] 및 염증 [Ramesh G et al., J Clin Invest 2002; 110: 835-842] 등이 있다.

시스플라틴 투여는 48 내지 72 시간에서 손상된 신장 조직으로의 면역 세포의 침윤을 증가시키고 신손상이 발생하기 전에 손상된 신장세포와 상피세포에서 CX3CL1 발현을 증가시킨다 (Lu LH et al., J Pharmacol Exp Ther 2008; 324: 111-117). 시스플라틴-유발된 신손상 후에 ICAM-1(Intercellular adhesion molecule-1)과 MCP-1(monocyte chemoattactant protein-1)도 증가한다(Lee S et al., Nephrol Dial Transplant 2006; 21: 2085-2095; Lee S et al., 2006; 21: 2096-2105 ; Sung MJ et al., Kidney Int, 2008 [Epub ahead of print]).

한편, 람노갈락투로난(rhamnogalacturonan II, RG-II)는 1,4-결합된 α-D-갈락토실우론산 잔기를 함유한 다당류인 펙틴의 일종으로서, 펙틴의 다른 유형인 호모갈락투로난, 치환된 갈락투로난, RG-I에 비하여 드문 고도로 분지화된 다당류이다.

RG-II는 백본(backbone)이 D-갈락투론산 단위로만 이루어지므로 치환된 갈락투로난으로 분류되기도 한다. RG-II의 가장 특징적인 부분은 2-0-메틸푸코스(2-0-methylfucose), 2-0-메틸자일로스 (2-0-methylxylose), 아피오스(apiose), 아세르산(aceric acid), 2-케토-3-데옥시-D-만노-옥투로손산 (2-keto-4-deoxy-D-manno-octulosonic acid: KDO) 및 3-데옥시-D-릭소-2-헵투로사르산 (3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid: DHA)과 같은 드문 당이 존재하는 것이다.

본 출원의 발명자들은, 약물 유발성 신장 질환을 유도하는 염증 반응을 억제하는 경우, 항암제에 의한 부작용을 최소화하면서 치료 효과를 상승시킬 수 있다는 발상에 기인하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

구체적으로, 본 발명은, 염증 반응 매개인자의 악순환(vicious cycle)에 의한 손상과 신장 조직으로 침윤되는 면역세포의 유도 염증반응을 억제할 수 있는 약제 조성물로서, 유효 성분으로 RG-II를 포함하고 있는 약제 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 약제 조성물은, 약물에 의해 유발된 신장 질환의 치료 또는 예방에 효과를 갖는 유효 함량 이상의 함량으로 람노갈락투로난(Rhamnogalacturonan) II (RG-II)를 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 약물 유발성 신장 질환 치료 또는 예방용 조성물이다.

상기한 유효 함량은 투여되는 항암제 종류, 암의 종류 및 중증도, 환자의 연령 및 성별, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 상기 약물은 항암제, 더욱 구체적으로는, 백금 항암제일 수 있다. 상기 백금 항암제는, 시스플라틴, 카르보플라틴 또는 햅타플라틴 등일 수 있으며, 본 발명의 하나의 실시예에서, 상기 백금 항암제는, 시스플라틴일 수 있다.

이 경우, 상기 약물에 의해 유발된 신장질환은 시스플라틴에 의해 유발된 신장질환일 수 있고, 본 발명에 따른 약제 조성물은, 유효 함량으로서, 시스플라틴의 함량 대비 100 % 이상의 RG-II를 포함하고 있을 수 있다.

본 출원의 발명자들은, 이하에서 자세하게 설명되는 실험들을 통해서, RG-II가 염증 반응 매개인자의 활성을 억제하고, 염증 반응 과정에서 신장 조직으로 침윤되는 면역세포의 유도 염증반응을 억제할 수 있음을 확인하였다.

구체적으로, 상기 RG-II가 농도 의존적으로 염증성 사이토 카인의 증가를 억제할 수 있음을 확인하였다.

상기 염증성 사이토 카인은 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor- α, TNF-α), 인터루킨-1β(interleukin-1β, IL-1β) 및 인터루킨-6(interleukin-6, IL-6)으로 이루어진 군에서 선택된 하나일 수 있고, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 RG-II가 염증 반응 전사인자의 하나인 NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)의 활성화를 억제할 수 있음을 확인하였다.

시스플라틴 독성에 의한 매개인자의 하나는 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)이다. 세포 내 활성 산소종을 생성할 수 있는 시스템들 중에서, 대표적인 것이 미토콘드리아 및 세포막에서 니코틴아마이드-아테닌 다이뉴클레오타이드인산 산화효소(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase, NOX) 등에 의한 것이다.

시스플라틴에 의해 생성되는 활성 산소종의 양은 디클로로플루오레신아세테이트(dichlorofluroescein diacetate, DCFH-DA) 등과 같은 활성 산소종 반응 형광물질로 분석할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 RG-II가 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)의 생성을 억제할 수 있음을 확인하였다.

면역 반응에서 중요한 외부 항원 물질인 병원체 관련 분자 패턴(pathogen-associated molecular patterns : PAMPs)의 수용체 중의 하나인 톨-유사 수용체(toll-like receptors, TLRs)는 세포 손상시 발생되는 여러 손상 유도 세포내 물질인 손상 관련 분자패턴(damage-associated molecular patterns: DAMPs)을 인식하는 수용체 중의 하나이다.

따라서, TLRs의 발현 억제는, 세포 손상 시 발생하는 여러 손상 유도 세포내 물질인 DAMPs의 발현이 감소되었음을 의미한다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 RG-II가 세포 손상 시 발생하는 손상 유발 세포 내 물질인 손상 관련 분자패턴(damage-associated molecular patterns: DAMPs)을 인식하는 수용체인 TLRs(Toll-like receptors) 분자의 발현을 억제함을 확인하였다.

염증반응 과정에서 생성되는 다양한 케모카인(chemokines), MCP-1 (monocyte chemoattractant pretein-1) 및 ICAM-1 (intracellular adhesion molecule 1) 등에 의해 신장 조직으로 침윤되는 다양한 면역세포 유도 염증 반응에 의해 조직 손상이 증가된다. 이러한 면역세포들의 침윤은 다양한 세포 특이적 인자들 (CD11b, F4/80 등)과 신장조직세포에서 발현되는 MCP-1(monocyte chemoattractant protein-1 또는 ICAM-1(intracellular adhesion molecule 1) 등의 발현 분석으로 알 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따를 때, 상기 RG-II가 면역세포의 신장조직으로의 침윤을 억제함을 확인되었다.

보다 자세한 실험방법 또는 결과는 하기의 실험예들에서 자세하게 설명하기로 한다.

상기 RG-II는 식물 추출물로서, 구체적으로, 하기의 방법으로 인삼속 식물의 잎 및/또는 줄기로부터 추출되거나 와인부터 추출될 수 있다.

먼저, 인삼 잎 및/또는 줄기를 열수 추출하여 얻은 추출액을 여과하고, 여액을 흡착성 수지 및 이어서 음이온 교환수지 컬럼에 통과시킨 후 용출하며, 한외여과 등에 의해 농축 및 투석한 후, 60℃이하에서 10brix까지 감압농축한다. 농축액에 EDTA를 넣고 반응시킨 후, 유기용매를 이용하여 다당체를 침전시켜 분리한다. 그런 다음, 침전물에 물을 첨가하여 20brix로 맞춘 후 제균여과한다.

와인으로부터 RG-II를 추출하는 경우에는, 와인을 60℃ 이하에서 감압농축하여 얻은 농축물을 여과하고, 여액을 흡착성 수지 및 이어서 음이온 교환수지 컬럼에 통과시킨 후 용출하며, 한외여과 등에 의해 농축 및 투석한 후, 60℃이하에서 10brix까지 감압농축한다. 농축액에 EDTA를 넣고 반응시킨 후, 유기용매를 이용하여 다당체를 침전시켜 분리한다. 그런 다음, 침전물에 물을 첨가하여 1brix로 맞춘 후 열처리, 산가수분해 또는 효소처리한 후 농축하고 제균여과한다.

다당체의 침전을 위해 사용되는 유기용매는 저급 알코올이 바람직하다. 저급 알코올로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올 등 탄소수 5개 이하의 알코올이 사용될 수 있으며, 가장 바람직하게는 에탄올이 사용될 수 있다.

상기 인삼속 식물의 예로는 파낙스 진생 씨. 에이. 메이여(Panax ginseng C. A. Meyer), 파낙스 퀸크폴리옴(Panax quinquefolium), 파낙스 노토진생(Panax notoginseng), 파낙스 슈도진생(Panax pseudoginseng), 파낙스 자포니쿰(Panax japonicum) 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약제 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

이 때, 상기한 약제 조성물은, 유효 성분으로서, RG-II를 약제 조성물 전체 중량을 기준으로 0.01 내지 100.00 중량%로 포함하고 있을 수 있고, 경우에 따라서는, 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제 등을 포함하고 있을 수 있다.

약제 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 복숭아 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다.

또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propyleneglycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기한 약리학적 제제들은, 신장질환을 유발하는 약물과 병용 투여할하는 수 있다.

한편, 본 발명은 상기한 약제 조성물을 포함하는 항암제를 제공한다. 구체적으로, 상기 항암제는 시스플라틴일 수 있다.

이상에서와 같이, 본 발명에 따른 RG-II를 포함하는 약제 조성물은 항암제에 의한 부작용, 특히 시스플라틴에 의한 신장 독성의 치료 또는 예방에 효과가 있다. 아울러, 본 발명에 따른 RG-II를 포함하는 약제 조성물은 천연물 추출물을 유효성분으로 포함하고 있으므로, 부작용이 적은 장점이 있다.

도 1은 헤마톡실린-에오진 염색(hematoxylin-eosin stain, H＆E stain)을 이용하여 시스플라틴의 처리 시간에 따른 신장 손상 정도를 관찰한 도면이다;
도 2는 H＆E 염색을 이용하여 RG-II 처리군과 RG-II 비처리군에서 시스플라틴에 의한 신장손상 정도를 관찰한 도면이다;
도 3은 PAS 염색(periodic-acid-Schiff stain)을 이용하여 RG-II 처리군과 RG-II 비처리군에서 시스플라틴에 의한 신장손상 정도를 관찰한 도면이다;
도 4는 RG-II 처리군과 RG-II 비처리군에서 시스플라틴에 의한 크레아티닌 및 요소의 혈청 농도를 비교 분석한 그래프이다;
도 5는 RG-II 처리군과 RG-II 비처리군에서 시스플라틴에 의한 혈청 및 소변 내 TNF-α의 농도를 비교 분석한 그래프이다;
도 6은 RG-II 처리군과 RG-II 비처리군에서 시스플라틴에 의한 염증 유발 사이토카인들의 발현 정도를 면역조직화학법으로 관찰한 도면이다;
도 7은 RG-II 처리군과 RG-II 비처리군에서 시스플라틴에 의한 NF-kB p65 의 발현 정도를 관찰한 도면이다;
도 8은 RG-II 처리군과 RG-II 비처리군에서 시스플라틴에 의한 NOX 1의 발현 정도를 관찰한 도면이다;
도 9는 RG-II 처리군과 RG-II 비처리군에서 시스플라틴에 의한 NOX 4의 발현 정도를 관찰한 도면이다;
도 10은 RG-II 처리군과 RG-II 비처리군에서 시스플라틴에 의한 TLR4의 발현 정도를 관찰한 도면이다;
도 11은 RG-II 처리군과 RG-II 비처리군에서 시스플라틴에 의한 MCP-1의 발현 정도를 관찰한 도면이다;
도 12는 RG-II 처리군과 RG-II 비처리군에서 시스플라틴에 의한 HSP60의 발현 정도를 관찰한 도면이다.

이하 실시예에서 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이하 실시예를 참조하여 본 발명의 내용을 상술하지만, 본 발명의 범주가 그것에 의해 한정되는 것은 아니다.

제조예 1: 인삼으로부터 RG-II의 제조

인삼 잎 및 줄기 50kg에 증류수 2,000L를 첨가하고 열수 추출한 후 냉각시킨 다음, 추출액을 0.45um 여과지로 여과하였다. 추출 여액을 흡착성 수지(HP 20, Diaion 사)에 통과시키고, 충분히 세척하였다. 흡착성 수지 통과액을 10nM Tris-HCl, pH 8.0이 되도록 하여 음이온 교환수지 (상품명: PA312 스티렌계 강염기성 음이온 교환수지) 컬럼에 통과시킨 후, 사용 버퍼로 충분히 세척하였다. 용출액(0.55M NaCl / 10nM Tris-HCl, pH 8)으로 용출한 후, 이온교환수지 용출액에 0.2M NaCl을 첨가한 후 1M HCl로 pH를 4.0으로 조정하였다. 규조토와 한외여과(UF 30K)를 통과시켜 색과 발열물질을 제거하고, 2차 한외여과(UF 1K)를 사용하여 농축 및 투석시켰다. 투석액을 60℃ 이하에서 10brix까지 감압농축한 후, 농축액에 다당체 양의 0.2배수의 EDTA를 넣고, pH를 10으로 조정 한 후 30분간 반응시켰다. 반응 후 4배 수의 에탄올을 첨가하여 다당체를 침전 회수하였으며, 3회 이상 에탄올 침전을 하여 잔량의 EDTA를 완전히 제거하였다. 에탄올 침전물에 물을 넣어 20brix로 맞추고, 충분히 용해시킨 후 제균여과한 다음, 여액을 동결건조하였다.

수득한 다당체(MD40)를 10brix로 정제수에 용해한 후 0.2㎛ 여과지로 여과하여 시료를 준비하고, SP930D, UV730D, MIDAS, RI750F, SDV50A, CTS30로 구성된 영린 HPLC 시스템으로 GPC 분석하였다. 이동상은 0.2M NaCl이고, 유속은 0.4ml/분이며, 시료 주입량은 20㎕이었다. 표준 분자량은 Broad Branched Molecular Weight Dextran Standards Kit를 사용하였다. GPC 분석 결과 얻어진 분자량은 Mp(피크분자량) 6209, Mw(중량 평균분자량) 6551, Mn(수 평균분자량) 5179이었다.

또한, 수득한 다당체(MB40)에 대해 당 조성 분석, NMR 분석 등을 수행하여, 다당체가 RG-II임을 확인하였다.

제조예 2: 와인으로부터 RG-II의 제조(I)

와인을 60℃ 이하에서 초기량 대비 1/10 용량으로 감압농축하여 주정과 와인농축물을 회수한 다음, 농축물을 0.45㎛ 여과지로 여과하였다. 농축물 여액을 흡착성 수지(Hp 20, Diaion 사)에 통과시켰다. 흡착성 수지 통과액에 정제수를 넣어 10배수 희석한 후, 희석액에 Trisma를 넣어 pH를 8로 조정하였다. 희석액을 10nM Tris-HCl, pH 8.0으로 안정화된 음이온 교환수지(상품명: PA312 스티렌계 강염기성 음이온 교환수지) 컬럼에 통과시킨 후, 사용 버퍼로 충분히 세척하였다. 용출액(0.55M NaCl / 10nM Tris-HCl, pH 8)으로 용출한 후, 이온교환수지 용출액에 0.2M NaCl을 첨가한 후 1M HCl로 pH를 4.0으로 조정하였다. 규조토와 한외여과(UF 30K)를 통과시켜 색과 발열물질을 제거하고, 2차 한외여과(UF 1k)를 사용하여 농축 및 투석시켰다. 투석액을 60℃ 이하에서 10Brix까지 감압농축한 후, 농축액에 다당체 양의 0.2배수의 EDTA를 넣고, pH를 10으로 조정 한 후 30분간 반응시켰다. 반응 후 4배수의 에탄올을 첨가하여 다당체를 침전 회수하였으며, 3회 이상 에탄올 침전을 하여 잔량의 EDTA를 완전히 제거하였다. 에탄올 침전물에 물을 넣어 1brix로 맞추고 100℃에서 열처리한 후, 한외여과(1K)로 농축한 다음, 농축액을 제균여과 및 동결건조하였다.

수득한 다당체에 대해 GPC 분석, 당 조성 분석, NMR 분석 등을 수행하여, 다당체가 RG-II임을 확인하였다.

제조예 3: 와인으로부터 RG-II의 제조 (II)

에탄올 침전물에 물을 넣어 1brix로 맞추고 100℃에서 열처리하는 대신에, 에탄올 침전물을 물에 녹여 1brix로 맞춘 후 1brix 용액에 염산을 넣어 0.1M HCl로 맞춘 다음, 실온에서 30분간 반응시킨 후 에탄올을 4배수 넣어 다당체를 회수하고, 3회 정도 에탄올 침전을 하여 잔량의 염을 완전히 제거하는 것을 제외하고는, 제조예 2와 동일한 방법으로 RG-II를 수득하였다.

제조예 4: 와인으로부터 RG-II의 제조(III)

에탄올 침전물에 물을 넣어 1brix로 맞추고 100℃에서 열처리하는 대신에, 에탄올 침전물을 물에 녹여 용액을 1brix, pH 4.5로 맞춘 후, 이 용액에 펙티나제(pectinase)를 원료량 대비 10㎕/mg으로 처리한 다음, 반응액을 37℃에서 1시간동안 반응시킨 후 90℃에서 5분간 열처리하여 단백질을 불활성화한 다음, 불활성화된 단백질을 원심분리로 제거하고, 한외여과(30K 및 1K)로 잔존 단백질 및 엔도톡신을 제거하고 농축 투석하는 것을 제외하고는, 제조예 2와 동일한 방법으로 RG-II를 수득하였다.

실험예 1: 실험동물, 실험군 및 대조군의 준비

본 실험에는 8주령의 C57BL/6 쥐를 사용하였다. 실험에 사용한 모든 쥐들은 항온(22 ~ 26℃) 및 항습(55 ~ 60%)이 되는 무균 동물실에서 사육하였다. 하기와 같은 대조군 및 실험군들을 준비하였다. 하기 대조군 및 실험군들에서 채취한 혈액으로부터 분리한 혈청은 냉동보관하였고, 적출한 신장조직은 포르말린에 고정한 다음 파라핀 블록을 만들고 절편하였다.

대조군(Cont): 시스플라틴 및/또는 RG-II를 주사하지 않은 쥐에서 적출한 신장조직 또는 채취한 혈액

시스플라틴 단독 처리군(CDDP): 시스플라틴을 20 mg/kg mouse weight(이하 mg/kg)의 농도로 복강 투여한 후 3 일 동안 사육한 쥐에서 적출한 신장조직 또는 채취한 혈액

RG-II 단독 처리군(RG-II): 인삼 잎에서 추출한 다당체 RG-II를 40mg/kg의 농도로 매일 복강 투여한 쥐에서 적출한 신장조직 또는 채취한 혈액

시스플라틴 및 RG-II 처리군(CDDP+RG-II): 시스플라틴을 20 mg/kg의 농도로 복강 투여하고, 3 일의 사육 기간 동안 인삼 잎에서 추출한 다당체 RG-II를 40mg/kg의 농도로 매일 복강 투여한 쥐에서 적출한 신장조직 또는 채취한 혈액

실험예 2: 시스플라틴 처리 시간에 따른 조직 손상 변화

시스플라틴 단독 처리군의 사육 기간에 따라 신장이 손상되는 정도를 H＆E 염색을 통하여 관찰하였다.

도 1을 참조하면, 시스플라틴 주사 후 2일째 까지는 사구체 및 관류조직에 어떠한 변화나 손상이 나타나지 않았다.

그러나, 3일째 되는 조직에서는 사구체는 정상적으로 보이는 반면, 관류조직에서 세포들의 사멸에 의한 특이적인 손상을 확인하였다(CDDP-D3의 화살표 참조).

실험예 3: RG-II 처리군의 조직 손상 정도

H＆E 염색을 이용하여 시스플라틴 단독 처리군, RG-II 처리군(RG-II 단독 처리군과 시스플라틴 및 RG-II 처리군)에서의 신장조직 손상 정도를 비교하였다.

도 2를 참조하면, 시스플라틴 단독 처리군은 관류조직을 구성하는 세포들의 사멸로 확연한 손상을 보였다(CDDP-20의 화살표 참조).

반면에, RG-II가 처리된 군에서는 거의 손상을 확인할 수 없었으며, 단독군은 무처리군과 같은 정상적인 조직이 관찰되었다.

실험예 4: 신장 관류조직의 구조적 변화 조사

조직 내에 존재하는 글리코겐(glycogen)과 같은 다당체나 당단백질 및 당지질을 검출하여 조직의 정상유무를 확인하는 PAS 분석법을 이용하여, 시스플라틴 단독 처리군, RG-II 단독 처리군과 시스플라틴 및 RG-II 처리군에서의 신장조직 손상 정도를 비교하였다.

도 3을 참조하면, 대조군이나 RG-II 단독 처리군에서는 정상적인 관류조직이 관찰되었으나, 시스플라틴 단독 처리군 조직은 조직세포의 사멸에 의해 파괴된 구조가 관찰되었으며, 이러한 손상 조직이 시스플라틴 및 RG-II 처리군에서 억제되는 현상을 관찰할 수 있었다.

실험예 5: 생화학적 표적분자에 대한 RG-II의 영향 조사

시스플라틴에 의해서 유도되는 다양한 생화학적 표적분자의 변화에 대한 RG-II의 영향을 조사하기 위하여, 시스플라틴 단독 처리군, RG-II 처리군(RG-II 단독 처리군과 시스플라틴 및 RG-II 처리군)에서 채취한 혈액으로부터 분리한 혈청에서 크레아티닌(creatinine)과 요소(urea)를 분석하여 비교하였다.

도 4를 참조하면, 시스플라틴 단독 처리시, 크레아티닌과 요소의 농도가 증가하는 반면에, RG-II와 함께 처리시 유효하게 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 6: 염증 반응 매개인자에 대한 RG-II의 영향 조사

시스플라틴 단독 처리군, RG-II 처리군(RG-II 단독 처리군과 시스플라틴 및 RG-II 처리군)에서 채취한 혈액으로부터 분리한 혈청과 소변(urine)에 존재하는 염증 반응 매개인자의 양을 ELISA 법으로 분석하였다.

시스플라틴에 의한 신장 손장의 대표적 매개인자인 염증성 사이토카인은 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor- α, TNF-α), 인터루킨-1β(interleukin-1β, IL-1β) 및 인터루킨-6(interleukin-6, IL-6)이다.

도 5를 참조하면, 시스플라틴은 혈청과 소변(urine)에 존재하는 TNF-α 의 증가를 유도하고, RG-II는 TNF-α의 증가를 농도 의존적으로 억제시키는 효과를 확인할 수 있다.

또한, 도 6을 참조하면, 신장조직 내에서도 동일하게 다양한 염증성 사이토카인들의 발현이 RG-II에 의하여 현저하게 억제되는 현상을 확인할 수 있다.

실험예 7: NF-κB 활성에 대한 RG-II의 영향 조사

대표적인 염증 반응 유도 전사인자인 NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)의 활성과 연관되어 있는 NF-κB p65 (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells p65)의 발현을 관찰하였다.

도 7에 나타낸 바와 같이 시스플라틴에 의해 NF-κB p65의 신장 조직내 발현 증가가 RG-II에 의해 현저하게 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 8: 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)에 대한 RG-II의 영향 조사활성산소종 생성에 대표적인 유관 단백질인 니코틴아마이드-아테닌 다이뉴클레오타이드인산 산화효소 1(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase, NOX 1)및 니코틴아마이드-아테닌 다이뉴클레오타이드인산 산화효소 4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase, NOX 4) 단백질의 발현을 신장 조직에서 면역조직화학법으로 분석한 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다.

도 8 및 도 9를 참조하면, 시스플라틴 처리에 의하여 신장의 여러 조직, 특히 손상된 관류 조직 부분에서 NOX 1 및 NOX 4 단백질 발현의 현저한 증가를 확인할 수 있었으며, 상기 증가효과는 RG-II에 의해 유효하게 억제됨을 알 수 있었다.

실험예 9: 손상 관련 분자패턴(damage-associated molecular patterns: DAMPs)을 인식하는 톨-유사 수용체(toll-like receptors, TLRs)에 대한 RG-II의 영향 조사

시스플라틴 단독 처리군, RG-II 처리군(RG-II 단독 처리군과 시스플라틴 및 RG-II 처리군)에서의 TLR 4분자의 발현 패턴을 관찰하여 도 10에 나타내었다.

도 10을 참조하면, 시스플라틴에 의해 조직내 TLR 4발현이 증가됨이 관찰되었으며, 상기 변화는 RG-II에 의해 현저하게 억제되는 것을 확인하였다.

실험예 10: 면역세포들의 침윤에 대한 RG-II의 영향 조사

시스플라틴 단독 처리군, RG-II 처리군(RG-II 단독 처리군과 시스플라틴 및 RG-II 처리군)의 신장조직세포에서 발현되는 MCP-1 및 ICAM-1 등의 발현 분석으로부터 면역세포들의 침윤을 확인할 수 있으며, 그 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11을 참조하면, 시스플라틴이 처리된 신장 조직은 조직에서 전체적으로 MCP-1 단백질의 발현이 증가됨이 관찰되었으며, 상기 변화는 RG-II 전처리에 의해 현저하게 억제되는 것을 확인하였다.

실험예 11: HSP60 발현에 대한 RG-II의 영향 조사

HSP60 (heat shock protein 60)은 미토콘드리아에 위치하는 chaperone 단백질로서 다양한 단백질의 구조적 변화에 중요한 기능을 하고 있으나 염증반응 등 여러 환경에서 세포 밖으로 방출된 다음 TLR 및 RAGE (receptor for advanced glycation end products) 등의 수용체를 매개로 세포내 염증반응을 유도한다. 시스플라틴 단독 처리군, RG-II 처리군(RG-II 단독 처리군과 시스플라틴 및 RG-II 처리군)의 신장조직세포에서 발현되는 HSP60의 발현을 분석하였으며, 그 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12을 참조하면, 시스플라틴이 처리된 신장 조직은 조직에서 전체적으로 HSP60 단백질의 발현이 증가됨이 관찰되었으며, 상기 변화는 RG-II 전처리에 의해 현저하게 억제되는 것을 확인하였다.

Claims

유효 성분으로서 람노갈락투로난(Rhamnogalacturonan) II (RG-II)를 치료 또는 예방적 유효 함량 이상으로 포함하고 있는 백금 항암제 유발성 신장 질환 치료 또는 예방용 조성물.
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제 1 항에 있어서, 상기 백금 항암제는 시스플라틴인 것을 특징으로 하는 백금 항암제 유발성 신장 질환 치료 또는 예방용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 RG-II는 조성물 전체 중량을 기준으로 0.01 내지 100.00 중량%로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 백금 항암제 유발성 신장 질환 치료 또는 예방용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 RG-II는 농도 의존적으로 염증성 사이토 카인의 증가를 억제하는 것을 특징으로 하는 백금 항암제 유발성 신장 질환 치료 또는 예방용 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 염증성 사이토 카인은 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor- α, TNF-α), 인터루킨-1β(interleukin-1β, IL-1β) 및 인터루킨-6(interleukin-6, IL-6)으로 이루어진 군에서 선택된 하나인 것을 특징으로 하는 백금 항암제 유발성 신장 질환 치료 또는 예방용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 RG-II는 NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)의 활성화를 억제하는 것을 특징으로 하는 백금 항암제 유발성 신장 질환 치료 또는 예방용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 RG-II는 NF-κB p65 (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells p65)의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 백금 항암제 유발성 신장 질환 치료 또는 예방용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 RG-II는 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 백금 항암제 유발성 신장 질환 치료 또는 예방용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 RG-II는 니코틴아마이드-아테닌 다이뉴클레오타이드인산 산화효소 1(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase, NOX1)단백질과 니코틴아마이드-아테닌 다이뉴클레오타이드인산 산화효소 1(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase, NOX4) 단백질의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 백금 항암제 유발성 신장 질환 치료 또는 예방용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 RG-II는 세포 손상 시 발생하는 손상 유발 세포 내 물질인 손상 관련 분자패턴(damage-associated molecular patterns: DAMPs)을 인식하는 수용체인 톨-유사 수용체(toll-like receptors, TLRs) 분자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 백금 항암제 유발성 신장 질환 치료 또는 예방용 조성물.
제 12 항에 있어서, 상기 TLRs 분자는 TLR4 분자인 것을 특징으로 하는 백금 항암제 유발성 신장 질환 치료 또는 예방용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 RG-II는 면역세포가 신장조직으로의 침윤되는 것을 억제하는 것을 특징으로 하는 백금 항암제 유발성 신장 질환 치료 또는 예방용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 RG-II는 케모카인(chemokines), MCP-1(monocyte chemoattractant protein-1 또는 ICAM-1(intracellular adhesion molecule 1)의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 백금 항암제 유발성 신장 질환 치료 또는 예방용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 RG-II는 인삼의 잎 및/또는 줄기로부터 추출되거나 와인부터 추출되는 것을 특징으로 하는 백금 항암제 유발성 신장 질환 치료 또는 예방용 조성물.
제 1 항에 따른 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 약리학적 제제.
제 17 항에 있어서, 상기 약리학적 제제는, 백금 항암제와 병용 투여하는 것을 특징으로 하는 약리학적 제제.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 RG-II는 HSP60 단백질의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 백금 항암제 유발성 신장 질환 치료 또는 예방용 조성물.