CN101016328B - 一种分离纯化熊果酸、齐墩果酸的方法 - Google Patents
一种分离纯化熊果酸、齐墩果酸的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及了一种从苦丁茶中提取熊果酸、齐墩果酸的方法。该方法以海南产苦丁茶为原料，首先以纯水提取，过滤，所得滤渣以乙醇回流提取，醇提液采用无机膜过滤方法除去其中大分子杂质，超滤所得渗透液经纳滤浓缩、大分子树脂层析柱吸附洗脱、洗脱液浓缩结晶，得到总三萜酸粗品，所得总三萜酸粗品经水洗、乙醇溶解、碱化、酸化、再次水洗、重结晶后得到总三萜酸，所得总三萜酸产品经甲醇溶解致沸腾，趁热过滤，所得滤液经浓缩析晶得到齐墩果酸单体产品，所得沉淀物经水洗，乙醇溶解结晶得到熊果酸单体产品。上述苦丁茶水提液过滤所得滤液经超滤澄清、纳滤浓缩、聚酰树脂选择性吸附、洗脱，所得洗脱液经浓缩得到一定纯度的茶多酚单品。
Description
技术领域
本发明属于药物分离的技术领域。具体涉及了一种从苦丁茶中提取并纯化其主要的活性成分熊果酸、齐墩果酸，同时得到一定纯度的茶多酚副产品的方法。
背景技术
苦丁茶是我国民间的一种传统的植物药茶，在我国已经有2000多年的饮用历史，现代医学研究表明，苦丁茶在对心血管作用、抗氧化作用、降血脂作用、降血糖作用、增强免疫功能的作用、抗应激、抗疲劳作用、抗菌作用、微量元素的保健及药用功能、拮抗支气管平滑肌的收缩作用、毒理作用等很多方面都有很好的疗效，因而有较好的开发前景。
苦丁茶的成分比较复杂，除了茶多酚、氨基酸、儿茶素、糖脂、维生素等与普通茶叶相同的成分之外，还含有较多的三萜皂苷类成分，例如其中主要的活性成分熊果酸和齐墩果酸。
熊果酸属于五环三萜类化合物，又名乌索酸，乌苏酸，纯品为白色针状结晶，分子式为C30H48O3，分子量为456.68，化学名称为3β-羟基-熊果烷-12-烯-28-羧酸，熊果酸不溶于水，易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂。药理研究证明，熊果酸具有显著的抗致癌、抗促癌和免疫作用，能降低高血脂症、防治动脉粥样硬化以及由其引起的心脑血管疾病，因而熊果酸极有可能成为低毒高效的新一代抗癌、抗心脑血管疾病药物。
齐墩果酸是熊果酸的同分异构体，又称土当归酸，化学名称为3-羟基上土当归-12-烯-28-羧酸。齐墩果酸也具有保肝降酶、降血脂、抗炎利尿和促进免疫等药理作用，是国家非处方药目录收载的肝病辅助用药。
山楂、女贞子和栀子等多种植物叶或者果实中都含有一定量的熊果酸和齐墩果酸。已报道的提取方法主要以有机溶液浸提结合一定分离手段为主，例如CN1358733以乙醇回流提取、活性炭脱色、干燥等相结合的方法得到女贞叶中的熊果酸，虽然该发明较简便，但只能得到熊果酸粗品；CN1453289以乙醇提取、丙酮冲洗、醇类重结晶的方法得到泡桐叶中的熊果酸，操作过程中涉及一定的有机溶剂且提取效率一般；CN1569885以乙醇提取、石油醚和乙酸乙酯溶解、活性炭吸附分离提取杜鹃叶中的熊果酸，过程中涉及有机溶剂且得到的熊果酸含量较低；CN1508149以乙醇提取、沉降剂沉降、膜分离、大孔吸附以及有机溶液选择溶解的方法得到苦丁茶中的总三萜酸和熊果酸、齐墩果酸单品，分离纯化方法有所创新，但苦丁茶中的茶多酚类物质对熊果酸、齐墩果酸的后续分离造型较大的干扰，从而造成分离方法仍较为复杂。这些方法实现过程中均要使用一定的有机溶剂甚至是有毒的有机溶剂，且这些方法往往分离效率不高，产品的纯度也有一定的限制。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：为了克服现有分离纯化技术复杂且分离效率不高等不足而提出了一种工艺简便、分离效率高的以水提和醇提相结合的分离纯化熊果酸、齐墩果酸的方法。
本发明的技术方案为：基于苦丁茶中多酚类成分易溶于水而目标成分熊果酸、齐墩果酸不溶于水，且提取液中多酚类物质的存在对后续分离纯化工艺造成一定的干扰从而造成纯化工艺的复杂，首次提出利用该溶解性的性质，在传统醇提苦丁茶之前，加入纯水提取过程，通过浸提和抽滤，在第一步就将三萜酸与多酚类物质有效分离开来，降低了后续分离纯化工作的难度；另外，采用无机陶瓷微滤膜代替有机微滤膜澄清苦丁茶提取液，相对于有机膜，无机陶瓷膜具有化学稳定性好及抗微生物能力的优点，一般不与微生物发生作用，本身无毒，不污染被分离体系，特别适用于食品药物类体系的分离过程，而且，乙醇溶液在无机陶瓷膜内较好的溶胀性也有利于澄清过滤过程的进行；最后结合纳滤浓缩，大孔树脂吸附和过滤结晶等技术，从苦丁茶中提取并纯化其主要的活性成分熊果酸、齐墩果酸，同时得到茶多酚副产品。
本发明具体技术方案如下：
A)将苦丁茶叶片烘干，粉碎磨至细颗粒状，以纯水为提取液，在沸水水浴中提取，过滤，将过滤得到的滤渣，以乙醇溶液为溶剂，在沸水水浴中回流提取后过滤，滤液采用微滤、纳滤得到浓缩液；
B)将浓缩液注入大孔吸附树脂层析，吸附、洗脱后干燥，得到三萜酸粗品，将三萜酸粗品加入纯水中，在沸水浴中提取，过滤，所得沉淀加入乙醇溶解后，首先调节pH值至碱性过滤后滤液调节pH值至酸性，结晶得到三萜酸产品；
C)三萜酸产品在沸水浴中以甲醇回流提取至沸腾，趁热过滤，所得不溶物经水洗后在乙醇中重结晶得到熊果酸单体产品，过滤所得滤液经浓缩析晶得到齐墩果酸单体产品。
其中步骤A中苦丁茶水提液过滤后所得到的滤液，经过微滤膜澄清、纳滤浓缩后所得浓缩液注入聚酰树脂层析柱，通过吸附洗脱后干燥得到茶多酚产品。
茶叶的烘干温度为40℃～60℃度，烘干至恒重，粉碎磨至细颗粒状(80-100目)。
本发明中步骤A所涉及的苦丁茶的水提和醇提实验，通过设计实验考察水提时间、水提次数、醇提时间、醇提次数和加入纯水和乙醇与苦丁茶叶粉末的液固比这五个因素在不同水平下对所得醇提液中熊果酸、齐墩果酸浓度的影响，得到最优化的实验条件，从而最大限度的利用苦丁茶中所含有的熊果酸和齐墩果酸。纯水的加入量(mL)与所提取的苦丁茶叶质量(g)的液固比为10～100倍，沸水水浴中提取0.5～2小时。醇提时乙醇溶液的浓度为80％以上，加入量(mL)与所提取的苦丁茶叶质量(g)的液固比为10～100倍，优选提取两到三次。每次提取时间为2～3小时。步骤A中的微滤过程采用膜孔径为50nm～500nm的陶瓷膜在30℃～50℃，膜面流速在2～3m/s，错膜压力在0.15～0.2MPa进行。步骤A中的纳滤过程采用截留分子量为300～500纳滤膜进行浓缩。
其中步骤B中首先调节PH值到8～11范围内，过滤后将滤液pH值调节至2～5，所得沉淀物即三萜酸粗品。
本发明中所涉及到的浓缩、析晶的工艺条件参照现有的一般技术。
本发明中熊果酸、齐墩果酸含量分析方法：以高效液相色谱法测定苦丁茶中齐墩果酸的含量，色谱条件为ZORBAX ECLIPSE XDB-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：甲醇一水一磷酸二氢钠(90∶10∶0.1)；流动相用微滤膜过滤；检测波长λ＝220nm；流速0.6mL/min；柱温为25℃。
(1)茶多酚含量分析方法：基于多酚类物质能与亚铁离子形成蓝紫色络合物的性质，采用分光光度计在波长λ＝540nm处测定其吸光度，以此计算茶多酚的含量。
有益效果：
1、本发明首次提出了纯水提取与乙醇溶液回流提取相结合的方法，在提取过程第一步即有效的分离了苦丁茶中两大主要的有效成分一三萜酸和茶多酚，不仅有效的强化了有效成分的溶出，而且大大减少了后续分离过程的难度，从而缩短了提取时间，简化了提取步骤；
2、本发明采用无机陶瓷微滤膜代替有机微滤膜澄清苦丁茶提取液，相对于有机膜，无机陶瓷膜具有化学稳定性好及抗微生物能力的优点，一般不与微生物发生作用，本身无毒，不污染被分离体系，特别适用于食品药物类体系的分离过程，同时，乙醇溶液在无机陶瓷膜内较好的溶胀性也有利于澄清过滤过程的进行，因此，无机陶瓷膜的应用改善了分离过程的效果。采用微滤、纳滤等新型分离技术，不仅避免了使用有机溶剂，实现了绿色的提取过程，而且避免了有机溶剂和苛刻的操作条件对有效成分的破坏；采用大孔吸附树脂层析柱分离系统，乙醇溶液洗脱，有效的分离出总三萜酸；总三萜酸粗品，经水洗，乙醇溶解、碱化、酸化等过程，得到高纯度的总三萜酸；
3、采用热甲醇溶液选择性溶解提取，简化了熊果酸和齐墩果酸单体堤取的分离工艺；苦???茶粉水提液经过微滤澄清、纳滤浓缩，加入吸附树脂吸附，得到一定纯度的茶多酚副产品。整个分离过程除了甲醇和乙醇溶液，未用到任何有机溶剂，实现了分离纯化过程的绿色化，并且在得到熊果酸、齐墩果酸单体产品的同时，得到茶多酚副产品。
附图说明
图1为本发明工艺流程图。
具体实施方式
将苦丁茶叶片于40℃干燥，粉碎机粉碎
实验例1：
A)取5克苦丁茶粉末，加入100mL纯水为提取液，在沸水水浴中提取1小时，过滤，将过滤得到的滤渣，以100mL无水乙醇溶液为溶剂，在沸水水浴中回流提取两次，每次2小时，提取液过滤，滤液采用500nm陶瓷膜在操作温度为40℃、膜面流速3m/s和操作压力0.18MPa条件下澄清，检测得到澄清液中熊果酸浓度为0.428mg/mL，齐墩果酸浓度为0.149mg/mL，澄清液采用截留分子量为400的纳滤膜浓缩10倍得到浓缩液中熊果酸浓度为3.878mg/mL，齐墩果酸浓度为1.246mg/mL；
B)将浓缩液注入大孔吸附树脂层析，以乙醇淋洗，收集乙醇洗脱液，该洗脱液经浓缩干燥得到三萜酸粗品；将三萜酸粗品加入纯水中，在沸水浴中提取lh，过滤，所得沉淀加入乙醇溶解，以NaOH调节pH值至10后过滤，所得滤液以H2SO4调节Ph值至4后结晶得到三萜酸产品；
C)三萜酸产品在沸水浴中以甲醇回流提取至沸腾，趁热过滤，所得不溶物经水洗后在乙醇中重结晶得到熊果酸单体产品，该熊果酸单体纯度为92％，过滤所得滤液经浓缩析晶得到齐墩果酸单体产品，该齐墩果酸单体纯度为90％。
实验例2：
A)取3克苦丁茶粉末，加入100mL纯水为提取液，在沸水水浴中提取1小时，过滤，将过滤得到的滤渣，以100mL无水乙醇溶液为溶剂，在沸水水浴中回流提取三次，每次2小时，提取液过滤，滤液采用500nm陶瓷膜在操作温度为40℃、膜面流速2.5m/s和操作压力0.15MPa条件下澄清，检测得到澄清液中熊果酸浓度为0.286mg/mL，齐墩果酸浓度为0.101mg/mL，澄清液采用截留分子量为300的纳滤膜浓缩10倍得到浓缩液中熊果酸浓度为2.437mg/mL，齐墩果酸浓度为0.923mg/mL；
B)将浓缩液注入大孔吸附树脂层析，以乙醇淋洗，收集乙醇洗脱液，该洗脱液经浓缩干燥得到三萜酸粗品；将三萜酸粗品加入纯水中，在沸水浴中提取1h，过滤，所得沉淀加入乙醇溶解，以NaOH调节pH值至10.5后过滤，所得滤液以H2SO4调节Ph值至4后结晶得到三萜酸产品；
C)三萜酸产品在沸水浴中以甲醇回流提取至沸腾，趁热过滤，所得不溶物经水洗后在乙醇中重结晶得到熊果酸单体产品，该熊果酸单体纯度为93％，过滤所得滤液经浓缩析晶得到齐墩果酸单体产品，该齐墩果酸单体纯度为90％。
实验例3：
A)取5克苦丁茶粉末，加入100mL纯水为提取液，在沸水水浴中提取1小时，过滤，将过滤得到的滤渣，以100mL无水乙醇溶液为溶剂，在沸水水浴中回流提取一次，每次2小时，提取液过滤，滤液采用500nm陶瓷膜在操作温度为40℃、膜面流速2m/s和操作压力0.1MPa条件下澄清，检测得到澄清液中熊果酸浓度为0.147mg/mL，齐墩果酸浓度为0.191mg/mL，澄清液采用截留分子量为500的纳滤膜浓缩10倍得到浓缩液中熊果酸浓度为1.025mg/mL，齐墩果酸浓度为1.306mg/mL；
B)将浓缩液注入大孔吸附树脂层析，以乙醇淋洗，收集乙醇洗脱液，该洗脱液经浓缩干燥得到三萜酸粗品；将三萜酸粗品加入纯水中，在沸水浴中提取1h，过滤，所得沉淀加入乙醇溶解，以NaOH调节pH值至11后过滤，所得滤液以H2SO4调节Ph值至5后结晶得到三萜酸产品；
C)三萜酸产品在沸水浴中以甲醇回流提取至沸腾，趁热过滤，所得不溶物经水洗后在乙醇中重结晶得到熊果酸单体产品，该熊果酸单体纯度为90％，过滤所得滤液经浓缩析晶得到齐墩果酸单体产品，该齐墩果酸单体纯度为89％。
Claims (5)
1.一种分离纯化熊果酸、齐墩果酸的方法，其具体步骤如下：
A)将苦丁茶叶片烘干，粉碎磨至细颗粒状，以纯水为提取液，在沸水水浴中提取，过滤，将过滤得到的滤渣，以乙醇溶液为溶剂，在沸水水浴中回流提取后过滤，滤液采用微滤、纳滤得到浓缩液；
B)将浓缩液注入大孔吸附树脂层析，吸附、洗脱后干燥，得到三萜酸粗品，将三萜酸粗品加入纯水中，在沸水浴中提取，过滤，所得沉淀加入乙醇溶解后，首先调节pH值至碱性，过滤后滤液调节pH值至酸性，结晶得到三萜酸产品；
C)三萜酸产品在沸水浴中以甲醇回流提取至沸腾，趁热过滤，所得不溶物经水洗后在乙醇中重结晶得到熊果酸单体产品，过滤所得滤液经浓缩析晶得到齐墩果酸单体产品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤A中水提时纯水的加入量(mL)与加入的苦丁茶粉末质量(g)的液固比为10～100倍，沸水水浴中提取时间为0.5～2小时。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤A中醇提时乙醇溶液的浓度为80％以上，加入量(mL)与苦丁茶粉末质量(g)的液固比为10～100倍，每次提取时间为2-3小时，提取2-3次。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤A中微滤过程采用膜孔径为50nm～500nm的陶瓷膜在30℃～50℃，膜面流速为2～3m/s，错膜压力在0.15～0.2MPa进行；步骤A中的纳滤过程采用截留分子量为300～500的纳滤膜进行浓缩。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于首先调节pH值到8～11范围内，过滤后将滤液pH值调节至2～5，所得沉淀物即三萜酸粗品。
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