KR100544052B1 - 비만의 치료 및 예방 효능을 지닌 인삼속 식물 다당체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인삼속 식물의 다당체, 그것의 추출방법, 및 그것을 활성성분으로 포함하는 약제 조성물에 관한 것으로, 이러한 다당체는 인삼속 식물로부터 용이하게 추출될 수 있으며, 체지방을 저하시킴으로써 비만으로 인한 질병의 치료 및 예방에 탁월한 효과를 발휘한다. 또한, 인삼속 식물의 잎이나 줄기로부터 다당체를 추출하는 경우에는 매우 저렴한 비용으로 다당체를 제조할 수 있으므로 경제성면에서 유리하며, 인삼속 식물은 오랜기간동안 약제의 원료로 사용되어 왔으므로 독성 문제 등 약제로서의 제반 문제점들이 자연스럽게 해결될 수 있다.

Description

비만의 치료 및 예방 효능을 지닌 인삼속 식물 다당체 {Polysaccharides Of Plants Belonging To Panax Having Effect On Treatment And Prevention Of Obesity}

도 1∼4는, 실시예 1∼4의 실험 결과로서, 본 발명의 따른 파낙스 진생 씨.에이. 메이여의 다당체를 투여한 마우스군과 그렇지 않은 마우스군의 시간에 따른 체중 변화를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 비만의 치료 및 예방에 효과를 나타내는 인삼속 식물의 다당체, 그것의 추출방법, 및 그것을 활성성분으로 포함하는 약제 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 파낙스 진생 씨.에이. 메이여와 같은 인삼속 식물로부터 추출되며 체지방의 저하에 의해 비만의 치료 및 예방에 효과를 발휘하는 다당체 등을 제공한다.

비만(obesity)은 원발성 비만(단순성 비만: simple obesity)과 이차성 비만(증후성 비만: morbid obesity)으로 분류된다. 원발성 비만의 원인으로는 에너지의 과잉섭취, 에너지의 이용부족(운동부족), 및 방출열량(기초대사)의 저하 등을 들 수 있다. 임상적으로 비만으로 판정되는 경우의 대부분은 원발성 비만이다. 원발성 비만이 발현하여 그 상태가 지속되면 각종 건강 장해를 일으키는 원인이 된다. 한편, 이차성 비만은 임의의 기초질환이 원인이 되어 발생하는 비만으로, 예를 들어, 내분비성 비만, 시상하부성 비만, 유전성 비만 또는 약제에 기인한 비만 등을 들 수 있다.

비만은 건강에 대한 위험인자로, 예를 들어, 순환기계로의 부담증가에 의한 질환(고혈압증, 관상동맥질환 등), 대사이상 질환(당뇨병, 고중성지방혈증 등), 간장 또는 담도계의 이상(담석증), 호흡기능의 저하, 뼈 또는 관절계로의 과도한 하중으로 인한 질환(변형성 관절질환) 등의 원인이 되거나, 또는 활동성의 저하 등의 문제를 야기시킨다.

비만의 예방 및 치료를 위한 방법들이 다각적인 측면에서 연구되고 있고, 그 방법으로서, 열량제한 식이요법, 운동요법, 수술요법 그리고 식욕 억제제, 또는 에너지 대사 촉진제 등을 사용하는 약물요법 등이 제시되었으나, 여러 가지 이유로 인하여 기대하는 만큼 효과적으로 사용되지는 못하고 있다.

현재, 인삼을 증기로 자숙하여 제조하는 홍삼이 비만해소를 위한 제품으로 개발되어 시판 중에 있는데, 이는 인삼성분 중 사포닌이 위장에서 당 및 콜레스테롤의 흡수를 억제함과 동시에 흡수된 에너지의 발산을 촉진하는 기능에 의해 간접적으로 비만 방지 효능을 발휘하는 것이다. 그러나, 인삼의 다당체를 이용하여 비만을 해소하고자 하는 사례는 전무한 상태이다.

비만을 예방 또는 치료하는 또다른 방법으로서 식이조절 방법은, 절식을 통하여 식이를 조절하거나, 모르핀과 같은 약물 또는 포만감을 유발하는 호르몬제를 이용하여 식이를 조절하는 방법들이 있다.

최근에는, 싸이토카인의 투여에 의해서도 체중감소가 일어나는 것으로 확인되었는데, 감염에 대한 면역반응과 유사한 대사의 변화가 유도되면서 식이 섭취량 저하가 발생하게 된다. 식욕을 조절하는 것으로 알려져 있는 corticotrophin releasing hormone, cholecystokinin, prostaglandins, glucagons, insulin, 그리고 corticosteroids 등이 발열성 물질인 lipopolysaccharide와 싸이토카인에 의하여 유도되는 것으로 알려져 있다.

그러나, 인삼속 식물의 다당체가 비만의 예방 및 치료에 탁월한 효과를 발휘한다는 사실은 이제껏 전혀 알려져 있지 않다. 더욱이, 오랜기간 동안 약제의 원료로 사용되어온 인삼속 식물 중의 일부 성분이 이러한 효과를 발휘하는 것이 확인된다면, 경험측에 따른 독성의 문제점 등이 자연스럽게 해결될 수 있으므로, 그러한 효과는 매우 크다고 할 수 있다.

본 발명자는 인삼속 식물의 다당체 대한 광범위한 연구를 수행하였고, 그 결과, 이러한 다당체의 항암 효과와 관련하여 PCT/KR03/01042호를 출원한 바 있으며, 이러한 다당체의 반복투여에 의해 체중조절에 유의적인 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 목적은 체지방을 저하시켜 비만의 치료 및 예방에 사용될 수 있는, 인삼속 식물로부터 추출한 다당체(또는 다당체 분획)를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 이러한 다당체를 인삼속 식물로부터 추출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 이러한 다당체를 활성성분으로 포함하는 비만 치료 및 예방용 약제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 이러한 다당체 또는 약제 조성물을 사용하여 비만을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는 것이다.

따라서, 본 발명은 인삼속(panax) 식물로부터 추출하며 체지방 저하에 의한 비만의 치료 또는 예방에 사용될 수 있는 다당체를 제공한다.

이후의 실험예들에서도 볼 수 있듯이, 본 발명에 따라 인삼속 식물에서 추출한 다당체는, 별다른 부작용을 유발하지 않으면서 체지방을 저하시키므로, 비만의 치료 및 예방에 안전하게 사용될 수 있다.

상기 인삼속 식물의 예로는, 파낙스 진생 씨.에이. 메이여(panax ginseng C.A. Mayer), 파낙스 퀸크폴리옴(panax quinquefolium), 파낙스 노토진생(panax notoginseng), 파낙스 슈도진생(panax pseudoginseng), 파낙스 자포니쿰(panax japonicum), 베트남 진생(panax vietnamensis Ha et Grushv.) 등을 들 수 있으며, 이들의 선택적인 2 이상의 종류가 함께 사용될 수도 있다. 그 중에서도 특히 파낙 스 진생 씨.에이. 메이여가 바람직하다.

본 발명에 따른 다당체는, 이들 인삼속 식물의 뿌리, 잎, 줄기, 열매 등에서 각각 얻어지는 것이 모두 가능한데, 그 중에서도 경제적인 측면에서는 잎과 줄기로부터 얻어지는 것이 특히 바람직하다. 왜냐하면, 이미 약제학적 효능이 밝혀진 인삼 뿌리와는 달리, 인삼 잎과 줄기는 매년 생산되어 폐기되고 있으므로, 매우 낮은 원료비용으로 본 발명에서 목적하는 다당체를 얻을 수 있기 때문이다.

본 발명에 따른 다당체 중, 인삼 뿌리의 다당체의 분자량은 대략 520,000∼6,000 Da 사이의 분포를 나타내며 140,000 Da 부근에서 평균분자량을 가진다. 또한 인삼 잎과 줄기의 다당체의 분자량은 대략 340,000∼6,000 Da 사이의 분포를 나타내며 120,000 Da 부근에서 평균분자량을 가진다.

본 발명에 따른 다당체은 중성상 30∼80%, 산성당 10∼60% 및 단백질 0.01∼10%의 당 함량을 가지며, 그것의 당 조성은 람노스, 퓨코스, 아라비노스, 크실로스, 만노스, 글루코스, 갈락토스, 갈락투론산, 글루큐론산, KDO(3-deoxy-D-manno-2-octubsonic acid) 및 DHA(3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid)를 포함하고 있으며, 각 당의 구체적인 함량은 인삼속 식물의 종류, 추출 부위(뿌리, 잎, 줄기), 추출 방법 등에 따라 다소 차이를 보인다. 그 중 KDO와 DHA는 인삼의 잎과 줄기에만 포함되어 있는 다당인 것으로 확인되었다.

구체적으로, 용매추출을 통하여 얻은 추출물을 1 ㎎/㎖의 농도로 3차 증류수로 용해하여 분석한 결과, 파낙스 진생 씨.에이. 메이여의 뿌리는 중성당 함량이 32.8%, 산성당 함량이 57.3%, 단백질 함량이 6.4%이고, 잎과 줄기는 중성당 함량이 68.9%, 산성당 함량이 15.9%, 단백질 함량이 8.7%인 것으로 확인되었다. 또한, 이온교환수지, 흡착수지 등을 사용하여 정밀하게 분리/정제한 추출물을 1 ㎎/㎖의 농도로 3차 증류수로 용해하여 분석한 결과, 동일한 파낙스 진생 씨.에이 메이여의 뿌리는 중성당 함량이 35.4%, 산성당 함량이 64.5%, 단백질 함량이 0.09%이고, 당조성은 글루큐론산 58.3%, 갈락튜론산 6.2%, 글루코오스 26.8%, 갈락토오스 6.3%, 아라비노오스 1.4%, 람노오스 0.9% 등인 것으로 확인되었다. 반면에, 잎과 줄기는 중성당 함량이 51.3%, 산성당 함량이 46.8%, 단백질 함량이 0.1%이고, 당조성은 람노스 5.97%,, 퓨코스 1.22%, 아라비노스 14.86%, 자일로오스 0.44%, 만노스 1.93%, 글루코오스 3%, 갈락토오스 22.7%, 갈락투론산 31.4%, 글루큐론산 14.4%, KDO 1.38%, DHA 1.02% 등인 것으로 확인되었다.

본 발명은 또한 이러한 다당체를 인삼속 식물로부터 추출하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 다당체 추출방법은,

(a) 인삼속 식물의 뿌리, 잎, 줄기 및/또는 열매를 물에 넣고 pH 4∼10 및 0∼180℃에서 0.5∼20 시간 동안 냉침 또는 가열한 뒤, 인삼 뿌리 등을 분리하여 추출액을 얻는 단계;

(b) 상기 추출액을 농축한 후, 유기용매를 이용하여 다당체를 침전 및 분리하는 단계;

(c) 분리된 다당체로부터 유기용매를 제거하여 다당체를 얻는 단계;

를 포함하는 것으로 구성되어 있다.

상기 단계(a)에서, 반응 산도(pH)가 상기 범위를 넘어서면 일부 다당들이 변질될 가능성이 있으므로 바람직하지 않고, 반응 온도가 너무 낮으면 추출량이 매우 적고 공정의 원활한 진행이 어려우며 반대로 너무 높으면 일부 다당들이 변질될 가능성이 있으므로 바람직하지 않고, 반응 시간이 너무 짧으면 추출량이 매우 적고 반대로 너무 길면 공정의 경제성이 떨어지므로 바람직하지 않다. 상기 "냉침"은 대략 0∼25℃에서 침지하는 것을 의미한다. 사용되는 물의 량은 특별히 제한되는 것은 아니며, 용이한 추출을 위해, 인삼 뿌리 등의 부피를 기준으로 10∼20 배의 물을 사용할 수 있다.

상기 단계(b)에서, 추출액은 다당체의 효과적인 회수를 위하여 농축하게 되는데, 예를 들어, 진공∼760 mmHg의 감압조건에서 20∼90℃로 가열하여 당도계로 측정할 때 20 brix 이상이 될 때까지 농축할 수 있다.

농축된 추출액에 유기용매을 부가하여 다당체를 침적시키는데, 바람직하게는 0.1∼1 M의 염화나트륨, 및 0.1∼1 M의 저급알코올 또는 아세톤을 사용한다. 유기용매의 사용량은 추출액의 부피를 기준으로 1∼5 배, 바람직하게는 2∼4 배로 사용한다. 상기 저급알코올로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올 등 C₅ 이하의 알코올이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 에탄올을 사용한다.

단계(b) 및/또는 단계(c)에서 다당체의 분리는 여과(한외여과 등 포함), 원심분리, 이온교환수지, 흡착수지, 투석 등 다양한 방법에 의해 행해질 수 있으며, 본 발명에 따른 다당체를 분리할 수 있는 방법이라면 특별히 제한되는 것은 아니다. 또한, 이러한 분리공정은 다양한 방법들의 반복적인 수행으로 행해질 수도 있다. 더욱 효과적인 분리(정제)방법의 예가 다음에 설명되어 있다.

단계(a)에서 얻어진 추출액을 약 8.0 pH로 조정하고 0.4 M NaCl/10 mM Tris-HCl이 되도록 하여 음이온 교환수지 칼럼에 30 ㎖/min의 속도로 통과시킨다. 이 음이온 교환수지는 미리 0.4 M NaCl/10 mM Tris-HCl로 평형(equilibrium)시켜 색소나 불순물만을 흡착시키고 시료의 다당체들이 흡착되는 것을 막아 준다. 이 음이온 교환수지 칼럼을 사용버퍼로 충분히 세척하고, 이 통과액의 pH를 약 6~7 사이로 조정한 후 흡착성 수지 칼럼에 30∼50 ㎖/min의 속도로 통과시킨다. 증류수로 칼럼을 충분히 세척하고, 통과시킨 시료가 모두 흘러 나왔는지는 3배 에탄올 침전법으로 확인한다. 통과액의 부피에 약 3배 부피의 에탄올(95%)를 첨가시켜 다당을 침전시킨다. 침전된 다당을 회수하기 위하여 원심분리(5000 rpm, 15 min)하고 투석한다. 이 용액의 pH를 8로 조정하고 10 mM Tris-HCl(pH 8) 버퍼를 첨가한 후 음이온 교환수지 칼럼에 15∼20 ㎖/min의 속도로 흘려주어 흡착되도록 한다. 버퍼로 충분히 세척한 후, 0.5 M NaCl로 용출시킨다. 용출시킨 액에 에탄올을 약 3배 부피로 첨가하여 다당을 침전시키고 원심분리(5000 rpm, 15 min)하여 회수하고, 95% 에탄올로 2 회 세척하여 불순물을 제거한 후, 분자량 6000 미만으로 투석하여 남은 에탄올을 제거한다.

상기 단계(c)에서, 유기용매를 제거한 후 건조를 행하여 다당체를 분말의 형태로 얻을 수도 있다. 그러한 건조방법으로, 열풍, 진공건조, 동결건조, 분무건조 등이 사용될 수 있다.

이상 본 발명에 따른 다당체 추출방법을 설명하였지만, 다당체의 추출 효율을 높이거나 순도를 높이기 위하여 일부 공정의 변형 또는 부가가 가능할 수 있으며, 이들은 모두 본 발명의 범주에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

본 발명은 또한, 약제학적으로 허용되는 담체와, 활성성분으로서 상기 다당체를 약리학적 유효량으로 함유하는 약제 조성물, 구체적으로는, 비만 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.

상기 다당체는 목적하는 바에 따라 다양한 약제학적 투여형태로 제형화될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 제조함에 있어서, 활성성분, 구체적으로, 인삼속 식물 다당체를 제조하고자 하는 제형에 따라 선택될 수 있는 다양한 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 혼합한다.

활성성분은, 목적하는 바에 따라, 주사용 제제, 경피용 제제 또는 경구용 제제로 제형화될 수 있으며, 투여의 용이성 및 용량의 균일성 측면에서 바람직하게는 단일 투여형(unit dosage form)으로 제조된다.

경구용 제제를 제조하는 경우에는 통상의 약제학적 담체를 사용할 수 있다. 예를 들어, 현탁액, 시럽제, 엘릭시르 밀 용액제와 같은 경구용 액체 제제의 경우에는 물, 글리콜, 오일, 알콜 등을 담체로 사용할 수 있고, 산제, 환제, 캅셀제 및 정제와 같은 고체 제제의 경우에는 전분, 설탕, 카올린, 윤활제, 결합제, 붕해제 등을 사용할 수 있다. 투여의 용이성으로 인하여 정제 및 캅셀제가 가장 편리한 복용 형태이며, 정제 및 환제는 장피제로 제조하는 것이 바람직하다. 또한, 경구용 제제가 위산에 의해 분해하는 것을 방지하기 위하여 제산제를 병용하거나 정제 등의 경구투여용 고형제제를 장용피로 피복한 제제로 제형화하여 투여할 수도 있다.

비경구 제제의 경우, 담체로는 통상 멸균수를 사용하며, 용해 보조제와 같은 다른 성분도 포함시킬 수 있다. 주사용 제제, 예를 들어, 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액은 공지된 기술에 따라 적합한 분산제, 습윤제 또는 현탁제를 사용하여 제조할 수 있다. 여기에 사용될 수 있는 용매에는, 물, 링거액 및 등장성 NaCl 용액이 있으며, 멸균 고정오일도 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 사용한다. 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있으며, 또한 올레산과 같은 지방산도 주사용 제제에 사용할 수 있다.

경피 제제의 경우에는, 담체로서 침투 촉진제 및/또는 적당한 습윤제를 임의로 피부에 대한 자극성이 없는 적당한 첨가제와 함께 사용할 수 있다. 첨가제로는 피부를 통한 투여를 촉진시키고/시키거나 목적하는 조성물을 제조하는데 도움이 되는 것을 선택한다. 경피 제제는 경피용 패취, 크림 또는 연고와 같은 다양한 방식으로 투여된다.

활성성분이 체내에서 빠르게 제거되는 것을 방지하기 위하여, 본 발명에 따른 조성물은 서방성 제제의 형태로 만들어질 수도 있는데, 이때 사용될 있는 담체로는 당업계에 공지되어 있는 삽입물(implant), 마이크로캡슐화 전달계(miroencapsulated delivery system), 생분해성/생체적합성 고분자(biodegradable/biocompatible polymers) 등이 포함된다.

상기 약리학적 유효량(therapeutically effective amount)이란, 치료를 요하는 질병의 증상을 경감 또는 줄이거나 예방을 요하는 질병의 임상학적 마커 또는 증상의 개시를 줄이거나 지연시키는데 유효한 활성성분의 량을 의미한다. 약리학적 유효량은 치료를 요하는 병에 대한 공지된 생체내(in vivo) 및 생체외(in vitro) 모델 시스템에서 상기 다당체를 실험함으로써 경험적으로 결정될 수 있다.

활성성분인 인삼속 식물 다당체의 인체에 대한 투여량은, 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태에 따라 적절히 사용하여야 하지만, 일반적으로 성인에게 1 일 100 ㎍∼6000 ㎎, 바람직하게는 20∼5000 ㎎의 양으로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약제 조성물에는, 활성성분의 작용을 저해하지 않거나 활성성분의 작용을 보조하는 기타 성분들이 더 포함될 수 있으며, 기타 당업계에 공지된 다양한 형태로 제형화될 수 있다.

본 발명은 또한, 인삼속 식물의 다당체를 활성성분으로 사용하여, 비만으로 인해 유발되는 질병을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 상기 비만으로 인한 질병의 예로는, 앞서의 설명과 같이, 비만 그 자체인 원발성 비만 및 이차성 비만과, 순환기계로의 부담증가에 의한 질환(고혈압증, 관상동맥질환 등), 대사이상 질환(당뇨병, 고중성지방혈증 등), 간장 또는 담도계의 이상(담석증), 호흡기능의 저하, 뼈 또는 관절계로의 과도한 하중으로 인한 질환(변형성 관절질환) 등을 들 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 인삼속 식물의 다당체가 약리학적 유효량으로 인간 등에게 투여될 때에는, 체지방을 저하시킴으로써, 비만으로 인한 질병의 치료 및 예방에 효과적이다. 상기 "치료"란 발병 증상을 보이는 객체에 사용될 때 병의 진행을 중단 또는 지연시키는 것을 의미하며, 상기 예방이란 발병 증상을 보이지는 않지만 그러한 위험성이 높은 객체에 사용될 때 발병 징후를 중단 또는 지연시키는 것을 의미한다.

이하 본 발명을 발명의 구성 및 효과를 나타내기 위하여 실시예에 의거 보다 상세하게 설명하지만, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

[제조예 1] 인삼 뿌리의 조다당체 추출물의 제조

파낙스 진생 씨.에이. 메이여(Panax ginseng C.A. Mayer)의 뿌리 100 g에 1 ℓ의 물을 넣고 100℃에서 5 시간 동안 가열 추출하였다. 추출액과 인삼 뿌리를 부직포를 이용하여 분리시킨 후, 7,000 rpm으로 30 분간 원심분리하여 불용성 이물질을 제거한 후, 다당체가 함유된 상등액을 70℃, 760 ㎜Hg에서 20 brix가 되도록 농축하여, 농축액 100 ㎖을 얻었다. 농축액에 1 M의 농도로 염화나트륨을 용해시키고, 에탄올 300 ㎖을 넣어 혼합시킨 후, 1 시간 동안 방치하여, 상등액과 침전물을 분리하였다. 얻어진 침전물을 95% 에탄올 100 ㎖로 2 회 세척하여 불순물을 제거하고, 투석후 동결건조하여, 인삼 뿌리의 조다당체를 수득하였다.

[제조예 2] 인삼 잎의 조다당체의 제조

파낙스 진생 씨.에이. 메이여의 뿌리 대신에 그것의 잎을 사용하였다는 점을 제외하고는, 제조예 1과 동일한 방법으로, 인삼 잎의 조다당체를 수득하였다.

[제조예 3] 인삼 줄기의 조다당체의 제조

파낙스 진생 씨.에이. 메이여의 뿌리 대신에 그것의 줄기를 사용하였다는 점을 제외하고는, 제조예 1과 동일한 방법으로, 인삼 줄기의 조다당체를 수득하였다.

[제조예 4] 인삼 뿌리의 다당체의 제조

파낙스 진생 씨.에이. 메이여의 뿌리 500 g을 초퍼로 분쇄한 후, 증류수 5 ℓ에 넣고 약 15 시간 동안 4℃로 추출하였다. 거즈를 이용하여 추출액과 슬러지를 분리하고, 추출액을 원심분리(7000 rpm, 20 min)하여 상등액을 회수한다. 다당체가 함유된 상등액의 pH를 약 8.0으로 조정하고 0.5 M NaCl/10 mM Tris-HCl이 되도록 하여, 음이온 교환수지(상품명: PA312 styrene계 강 염기성 음이온 교환수지) 칼럼에 30 ㎖/min의 속도로 통과시켰다. 이 음이온 교환수지는 미리 0.5 M NaCl/10 mM Tris-HCl로 평형(equilibrium)시켜 색(color)이나 불순물만을 흡착시키고 시료의 다당체들이 흡착되는 것을 막아 주었다. 이 음이온 교환수지 칼럼을 사용버퍼로 충분히 세척하고, 이 통과액의 pH를 약 6~7 사이로 조정한 후, 흡착성 수지(상품명: Hp 20 Diaion사) 칼럼에 30~50 ㎖/min의 속도로 통과시켰다. 증류수로 칼럼을 충분히 세척하고, 통과시킨 시료가 모두 흘러나왔는지는 3배 에탄올 침전법 으로 확인한다. 통과액의 부피에 약 3배 부피의 에탄올(95%)를 첨가시켜 다당만을 침전시켰다. 이 다당을 회수하기 위하여 원심분리(5000 rpm, 15 min)하고 투석하였다. 이 용액의 pH를 8로 조정하고 10 mM Tris-HCl 버퍼를 첨가한 후, 버퍼로 평형된 음이온 교환수지(상품명: Q sepharose, Phamacia 사) 칼럼에 15~20 ㎖/min의 속도로 흘려주어 흡착되도록 하였다. 흡착되지 않고 통과한 액을 모아 에탄올을 3배 넣어 침전시킨 후 분리하여 중성의 다당체를 회수하였다. 10 mM Tris-HCl 버퍼로 충분히 세척한 후, 0.5 M NaCl로 용출시킨다. 용출시킨 액에 에탄올을 약 3배 부피로 첨가하여 다당을 침전시키고 원심분리(5000 rpm, 15 min)하여 회수였으며, 95% 에탄올로 2회 세척하여 불순물을 제거한 후, 분자량 6000 미만으로 투석하여 남은 에탄올을 제거한 뒤 동결건조 함으로써, 인삼 뿌리의 다당체를 수득하였다.

[제조예 5] 인삼 잎의 다당체의 제조

파낙스 진생 씨.에이. 메이여의 잎 500 g을 증류수 5 ℓ에 넣고 약 3 시간 동안 열수 추출한 뒤, 거즈를 이용하여 추출액과 슬러지를 분리하였다. 추출액을 원심분리(7000 rpm, 20 min)하여 상등액을 회수하였다. 이 상등액의 pH를 약 8.0으로 조정하고 0.4 M NaCl/10 mM Tris-HCl이 되도록 하여, 음이온 교환수지(상품명: PA312 styrene계 강 염기성 음이온 교환수지)칼럼에 30 ㎖/min의 속도로 통과시켰다. 이 음이온 교환수지는 미리 0.4 M NaCl/10 mM Tris-HCl로 평형시켜 색소나 불순물만을 흡착시키고 시료의 다당체들이 흡착되는 것을 막아주었다. 이 음이온 교환수지 칼럼을 사용버퍼로 충분히 세척하고, 통과액의 pH를 약 6~7 사이로 조 정한 후, 흡착성 수지(상품명: Hp 20 Diaion사) 칼럼에 30~50 ㎖/min의 속도로 통과시켰다. 증류수로 칼럼을 충분히 세척하고, 통과시킨 시료가 모두 흘러 나왔는지를 3배 에탄올 침전법으로 확인하였다. 통과액의 부피에 대해 약 3배 부피의 에탄올(95%)를 첨가하여 다당만을 침전시키고, 원심분리(5000 rpm, 15 min)한 후 투석하였다. 이 용액의 pH를 8로 조정하고 10 mM Tris-HCl 버퍼를 첨가한 후, 음이온 교환수지(상품명: Q sepharose, Phamacia 사) 칼럼에 15∼20 ㎖/min의 속도로 흘려주어 흡착되도록 하였다. 10 mM Tris-HCl 버퍼로 충분히 세척한 후, 0.5 M NaCl로 elution 시켰다. 용출시킨 액에 에탄올을 약 3배 부피로 첨가하여 다당을 침전시키고 이를 원심분리(5000 rpm, 15 min)하여 회수하였고, 95% 에탄올로 2 회 세척하여 불순물을 제거한 후, 분자량 6000 미만으로 투석하여 남은 에탄올을 제거한 뒤 동결건조하여, 인삼 잎의 다당체를 수득하였다.

[제조예 6] 인삼 줄기의 다당체의 제조

인삼 잎 대신에 인삼 줄기를 사용하였다는 점을 제외하고는, 제조예 5와 동일한 방법으로, 인삼 줄기의 다당체를 수득하였다.

[제조예 7] 주사제용 시료의 제조

제조예 4 내지 6에서 각각 얻어진 다당체들로부터 발열성 물질의 제거를 위하여, 실리카겔이 충진된 칼럼을 통과시킨 후, 에탄올을 3 배 부피로 첨가하여 다당을 침전시키고 원심분리하여 회수한 뒤, 95% 에탄올로 2 회 세척하여 불순물을 제거하였다. 이를 3차 증류수에 용해시킨 후 분자량 6,000으로 투석하여 에탄올을 제거하고, 무균화를 위하여 0.2 ㎛ 여과장치를 통과시켜, 발열반응 물질이 없는 무균의 시료를 제조하였다. 무균화된 시료를 3 ㎖ vial에 일정량씩 분주하여 냉동시킨 후 동결건조하였다. 건조된 시료는 생리식염수에 용해하여 주사용 시료를 제조하였다.

[실시예 1] 인삼 추출물의 성분분석

상기 제조예들에서 얻어진 추출물의 성분분석을 다음과 같이 수행하였다. 총 당 함량은 galactose를 표준물질로 하여 phenol-sulfuric acid 법(Dubois et al Anal. chem., 28, 350, 1956)으로, 산성당 함량은 β-D-galacturonic acid를 표준물질로 하여 m-hydroxybiphenyl 법(Blumenkrantz et al, Anal. biochem., 54, 484, 1973)으로, 단백질 함량은 bovine albumin을 표준물질로 하여 Lowry 법(Lowry et al, J. Biol, Chem., 193, 265, 1951)으로, KDO(3-deoxy-D-manno-2-octubsonic acid)상 물질은 thiobarbituric acid 법을 이용하여 각각 정량 분석하였다.

구성 당의 분석은 Jones 법(plant physiol., 49, 926, 1972)에 따라 alditol acetate 유도체화 하여 gas-liquid chromatography (GLC)법으로 수행하였다.

제조예 1∼3에서 얻은 조다당체들을 각각 1 ㎎/㎖의 농도로 3차 증류수로 용해하여 상기 분석법들에 따라 분석한 결과, 파낙스 진생 씨.에이. 메이여의 뿌리는 중성당 함량이 32.8%, 산성당 함량이 57.3%, 단백질 함량이 6.4%이었으며, 잎과 줄기는 중성당 함량이 68.9%, 산성당 함량이 15.9%, 단백질 함량이 8.7%이였다.

제조예 4∼6에서 얻은 정제다당체들을 각각 1 ㎎/㎖의 농도로 3차 증류수로 용해하여 상기 분석법들에 따라 분석한 결과, 파낙스 진생 씨.에이. 메이여의 뿌리는 중성당 함량이 35.4%, 산성당 함량이 64.5%, 단백질함량이 0.09%이었으며, 그것의 당조성은 글루큐론산 58.3%, 갈락튜론산 6.2%, 글루코오스 26.8%, 갈락토오스 6.3%, 아라비노오스 1.4%, 람노오스 0.9% 이다. 한편, 잎과 줄기는 중성당 함량이 51.3%, 산성당 함량이 46.8%, 단백질 함량이 0.1%이었으며, 그것의 당조성은 람노스 5.97%,, 퓨코스 1.22%, 아라비노스 14.86%, 자일로오스 0.44%, 만노스 1.93%, 글루코오스 3%, 갈락토오스 22.7%, 갈락투론산 31.4%, 글루큐론산 14.4%, KDO 1.38%, DHA(d-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid) 1.02% 이었다.

분자량은 HPLC(영린)로 확인하였으며, 칼럼은 GS-520HQ, GS-320HQ, GS-220HQ(Shodex Asaipack GS series, showa denko사) 칼럼을 차례로 연결하여 측정하였다. 그 결과, 인삼 뿌리의 분자량은 대략 520,000∼6,000 Da 사이의 분포를 나타내며 140,000 Da 부근에서 평균분자량을 나타냈으며, 인삼 잎와 줄기의 분자량은 대략 340,000∼6,000 Da 사이의 분포를 나타내며 120,000 Da 부근에서 평균분자량을 나타내었다.

[실시예 2] 인삼 뿌리 다당체의 항비만 효과 실험

당뇨 모델인 DB/DB(10 weeks, male) 마우스를 대상으로 인삼 뿌리에서 추출한 조다당체에 의한 항비만 효과 실험을 행하였다. 제조예 1에서 얻은 인삼 뿌리 조다당체를 PBS에 녹여 0.2 ㎛ filter로 무균 여과한 시료를 DB/DB 마우스의 복강 에 마우스당 500 ㎍와 1 ㎎(이상 다당체 량)의 농도로 매일 투여하였다. 체중은 5 일 간격으로 측정하였고, 사료의 섭취량을 매일 확인하였다.

15 일 동안 실험한 결과, DB/DB 정상군(다당체 비투여군)은 체중이 약 2.7% 가량 증가한 반면, 인삼 뿌리 다당체 500 ㎍을 투여한 군에서는 체중이 4.2% 감소하였고, 다당체 1 ㎎을 투여한 군에서는 체중이 10.5% 감소하였다 (도 1 참조).

[실시예 3] 인삼 잎과 줄기 다당체의 항비만 효과 실험

당뇨 모델인 DB/DB(10 weeks, male) 마우스를 대상으로 인삼 잎에서 추출한 조다당체에 의한 항비만 효과 실험을 행하였다. 제조예 2에서 얻은 인삼 잎 조다당체를 PBS에 녹여 0.2 ㎛ filter로 무균 여과한 시료를, DB/DB 마우스의 복강에 각각 마우스당 500 ㎍와 1 ㎎의 농도로 매일 투여하였다. 체중은 5 일 간격으로 측정하였고, 사료의 섭취량은 매일 확인하였다.

15 일 동안 실험한 결과, DB/DB 정상군은 체중이 약 2.7% 가량 증가한 반면, 인삼 잎 조다당체를 200 ㎍ 투여한 군에서는 체중이 5.6% 감소하였고, 조다당체를 500 ㎍ 투여한 군에서는 체중이 12.7% 감소하였다(도 2 참조). 식이 섭취량의 변화를 보면, 투여 초기에는 대조군에 비하여 식이 섭취량이 상대적으로 적은 것으로 나타났지만, 시간의 경과에 따라 대조군에 근접하는 식이섭취 양상을 나타내었다.

[실시예 4] 정제된 인삼 뿌리 다당체의 항비만 효과 실험

당뇨 모델인 DB/DB(10 weeks, male) 마우스를 대상으로, 인삼 뿌리에서 추출 한 다당체에 의한 항비만 효과 실험을 행하였다. 제조예 4에서 얻은 인삼 뿌리 조다당체를 PBS에 녹여 0.2 ㎛ filter로 무균 여과한 시료를, DB/DB 마우스의 복강에 각각 마우스당 200 ㎍와 500 ㎍의 농도로 매일 투여하였다. 체중은 5 일 간격으로 측정하였고, 사료의 섭취량은 매일 확인하였다.

15 일 동안 실험한 결과, DB/DB 정상군은 체중이 약 2.7% 가량 증가한 반면, 인삼 뿌리 다당체를 200 ㎍ 투여한 군에서는 체중이 3.5% 감소하였고, 다당체를 500 ㎍ 투여한 군에서는 체중이 8.6% 감소하였다(도 3 참조). 식이 섭취량의 변화를 보면, 투여 초기에는 대조군에 비하여 식이 섭취량이 상대적으로 적은 것으로 나타났지만, 시간의 경과에 따라 대조군에 근접하는 식이섭취 양상을 나타내었다.

[실시예 5] 정제된 인삼 잎 줄기 다당체의 항비만 효과 실험

당뇨 모델인 DB/DB(10 weeks, male) 마우스를 대상으로 인삼 줄기에서 추출한 다당체에 의한 항비만 효과 실험을 행하였다. 제조예 6에서 얻은 인삼 줄기 다다당체를 PBS에 녹여 0.2 ㎛ filter로 무균 여과한 시료를, DB/DB 마우스의 복강에 각각 마우스당 200 ㎍와 500 ㎍의 농도로 매일 투여하였다. 체중은 5 일 간격으로 측정하였고, 사료의 섭취량은 매일 확인하였다.

15 일 동안 실험한 결과, DB/DB 정상군은 체중이 약 2.7% 가량 증가한 반면, 인삼 줄기 다당체를 200 ㎍ 투여한 군에서는 체중이 4.2% 감소하였고, 다당체를 500 ㎍ 투여한 군에서는 체중이 9.7% 감소하였다(도 4 참조). 식이 섭취량의 변화를 보면, 투여 초기에는 대조군에 비하여 식이 섭취량이 상대적으로 적은 것으로 나타났지만, 시간의 경과에 따라 대조군에 근접하는 식이섭취 양상을 나타냈다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 다당체는 인삼속 식물로부터 용이하게 추출될 수 있으며, 이를 활성성분으로 사용하여 비만을 치료 및 예방할 수 있다. 또한, 인삼속 식물의 잎이나 줄기로부터 다당체를 추출하는 경우에는 매우 저렴한 비용으로 다당체를 제조할 수 있으므로 경제성면에서 유리하다. 더욱이, 인삼속 식물은 오랜기간동안 약제의 원료로 사용되어 왔으므로, 독성 문제 등 약제로서의 제반 문제점들이 자연스럽게 해결될 수 있다.

본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.

Claims (13)

1. 인삼속(panax) 식물인 파낙스 진생 씨.에이. 메이여(panax ginseng C.A. Mayer)부터 추출되며 체지방 저하에 의한 비만의 치료 및 예방에 사용될 수 있는 다당체 추출물.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 다당체 추출물은 진생 씨.에이. 메이여의 뿌리, 잎, 줄기 및 열매로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 부위로부터 추출되는 것을 특징으로 하는 다당체 추출물.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 다당체 추출물은 잎, 줄기, 또는 잎과 줄기로부터 추출되는 것을 특징으로 하는 다당체 추출물.
4. 제 2 항에 있어서, 상기 뿌리로부터 추출되는 다당체 추출물의 분자량은 520,000∼6,000 Da 사이의 분포를 나타내고 140,000 Da 부근에서 평균분자량을 가지며, 상기 잎과 줄기로부터 추출되는 다당체 추출물의 분자량은 340,000∼6,000 Da 사이의 분포를 나타내고 120,000 Da 부근에서 평균분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 다당체 추출물.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 다당체 추출물은 중성당 30∼80%, 산성당 10∼60% 및 단백질 0.01∼10%의 당 함량을 가지며, 그것의 당 조성은 람노스, 퓨코스, 아라비노스, 크실로스, 만노스, 글루코스, 갈락토스, 갈락투론산, 글루큐론산, KDO(3-deoxy-D-manno-2-octubsonic acid) 및 DHA(3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid)를 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 다당체 추출물.
6. (a) 인삼속(panax) 식물인 파낙스 진생 씨.에이. 메이여(panax ginseng C.A. Mayer)의 뿌리, 잎, 줄기 및 열매로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 부위를 물에 넣고 pH 4∼10 및 0∼180 에서 0.5∼20 시간 동안 냉침 또는 가열한 뒤, 상기 분위를 분리하여 추출액을 얻는 단계;

   (b) 상기 추출액을 농축한 후, C1-C5의 저급알코올을 포함하는 용매를 이용하여 다당체 추출물을 침전 및 분리하는 단계;

   (c) 분리된 다당체 추출물로부터 상기 용매를 제거하는 단계;

   를 포함하는 것으로 구성된, 제 1 항에 따른 다당체 추출물을 인삼속 식물로부터 추출하는 방법.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 용매는 0.1∼1 M의 염화나트륨 및 0.1∼1 M의 C1-C5 저급알코올로서 추출액의 부피를 기준으로 1∼5 배로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 저급알코올이 에탄올인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 6 항에 있어서, 상기 단계(b)에서의 분리는 여과, 원심분리, 이온교환수지, 흡착수지 또는 투석에 의해 행해지는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 약제학적으로 허용되는 담체와, 활성성분으로서 제 1 항에 따른 다당체 추출물을 약리학적 유효량으로 함유하는 비만 치료 및 예방용 약제 조성물.
11. 제 10 항에 있어서, 상기 조성물은 주사용 제제, 경피용 제제 또는 경구용 제제로 제형화되는 것을 특징으로 하는 조성물.
12. 삭제
13. 삭제

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