KR20200077754A - 고춧잎 아임계 수 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증진용 조성물 - Google Patents
고춧잎 아임계 수 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증진용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 고춧잎 아임계 수 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증진용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 90~160℃로 가열하여 아임계 수 추출한 고춧잎 아임계 수 추출물은 고춧잎 물 추출물에 비해 대식세포의 NO(Nitric Oxide) 및 TNF-α의 분비량을 증가시키고, 비장세포의 증식을 촉진하는 효과가 현저하므로, 90~160℃로 가열하여 아임계 수 추출한 고춧잎 아임계 수 추출물을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 면역증진용 건강기능식품, 면역증진을 위한 동물용 사료 또는 면역력 저하에 의한 질환의 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 고춧잎 아임계 수 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증진용 조성물에 관한 것이다.
면역이란 외부 침입 인자에 대한 면역세포와 분자들의 상호 협동적인 반응을 말하며, 또한, 자기와 비자기를 식별하여 자기를 지키고 비자기를 죽이는 작용이고, 면역으로 인해 개체의 완전성 혹은 항상성을 유지하려는 생체 방어반응을 의미한다. 면역계는 외부의 침입 인자들로부터 우리 몸을 보호하는 세포와 분자들로 구성되고, 대식세포가 관련된 비특이적 면역과 T 림프구 및 B 림프구가 관련된 특이적 면역으로 분류할 수 있다.
비특이적 면역은 자연 면역이라고도 하며, 대식세포 및 백혈구에 의해 작용한다. 대식세포는 체내의 모든 조직에 분포하면서 박테리아, 바이러스 등의 감염성 병원체뿐만 아니라 노화된 정상 세포와 암세포 등에 대해 탐식 작용을 일으켜 제거하는 방어능력을 가지며, 항원 제시작용 및 인터류킨(interleukin) 계열, TNF-α 등의 다양한 사이토카인(cytokine)과 생리활성물질을 분비하여 면역반응을 극대화하는 중요 매개체 역할을 한다. 대식세포가 활성화되면 NO, TNF-α 등의 사이토카인을 분비하는데 이들은 암세포에 대한 독성을 나타내는 대표적 물질들로 알려져 있다.
특이적 면역은 적응 면역이라고도 하며, 항원 제시 세포가 포식하여 제시한 항원을 T 세포가 인식하면서 이루어지는 세포성 면역과 B 세포가 생산하는 항체에 의한 체액성 면역반응으로 이루어진다. 즉 생체는 외부 항원과 같은 외래 물질의 침입 혹은 감염에 대하여 자연 면역 및 적응 면역계가 적절하게 대항하여 항상성을 유지하게 되어 있다.
면역력의 저하는 본래 우리 몸이 가지고 있는 자연치유기능을 점차 약화시켜 다양한 질환 또는 증상을 유발한다. 이를 해결하기 위해서는 근본적으로 면역력 증진이 요구되지만, 면역력은 개인별로 차이가 있어, 장기적인 관점에서 접근할 필요가 있다. 현재까지 면역증진을 목적으로 한 다양한 치료제 또는 보조제가 개발되어 시판되고 있으나, 장기간 복용에 따른 부작용을 이유로 치료제보다는 상대적으로 안전한 보조제, 특히 천연보조제의 사용이 바람직한 방안으로 지목되고 있으며, 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
한편, 고춧잎은 수분 79.4%, 단백질 4.1%, 지질 1%, 섬유소 3.8%, 당질 8.2%, 회분 3.5%로 구성되어 있고, 풍부한 비타민 A, 비타민 C, 폴리페놀, 플라보노이드 등을 함유하고 있으며, DPPH 라디칼 소거능, 과산화수소 소거능 및 높은 항산화능을 가지고 있다는 것이 보고되었다.
고춧잎의 어린순은 일부 식용으로 활용되고 있지만, 대부분의 고춧잎과 줄기 부위는 폐기되고 있다. 고춧잎은 고추 과육과 달리 매운맛이 없으면서 유용한 물질을 함유하고 있으므로 이를 활용한 기능성 소재의 개발시 고기능성의 고부가 제품을 개발할 수 있어 산업적 활용가치가 매우 높은 자원이다.
최근 아임계 수를 이용하여 기능성 성분을 추출하는 방법이 알려져 있으나, 고춧잎 추출물과 관련된 연구는 거의 없는 실정이다. 아임계 수 추출(subcritical water extraction)은 물의 임계점(374℃, 22.1MPa) 이하의 온도와 압력 조건에서 이온화된 물을 이용하여 물질을 분해하고 추출하는 방법으로 PHWE(pressurized hot water extraction) 또는 PLPW(pressurized low polarity water extraction)라고도 한다. 이러한 아임계 추출의 장점은 사용 용매가 물이라는 점과, 추출에 소요되는 시간이 5~30분 정도로 짧다는 것이며, 페놀 화합물 같은 비극성 물질을 추출하는데 효율적인 것으로 알려져 있다.
한편, 면역증진용 조성물과 관련된 선행기술로는 한국등록특허 제1637476호에 청고추 추출물을 유효 성분으로 포함하는 인플라마좀 매개 염증성 질환 및 인플루엔자 바이러스 감염 예방, 개선용 조성물이 개시되어 있지만, 본 발명의 고춧잎 아임계 수 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증진용 조성물에 관해 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로, 고춧잎 아임계 수 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증진용 조성물을 제공하고, 상기 유효성분인 고춧잎 아임계 수 추출물이 고춧잎 물 추출물에 비해 더욱 증진된 대식세포의 면역 활성 및 비장세포의 증식을 유도하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 90~160℃로 가열하여 아임계 수 추출한 고춧잎 아임계 수 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증진용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 90~160℃로 가열하여 아임계 수 추출한 고춧잎 아임계 수 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증진용 사료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 90~160℃로 가열하여 아임계 수 추출한 고춧잎 아임계 수 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역력 저하에 의한 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 고춧잎 아임계 수 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증진용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 90~160℃로 가열하여 아임계 수 추출한 고춧잎 아임계 수 추출물은 고춧잎 물 추출물에 비해 대식세포의 NO(Nitric Oxide) 및 TNF-α의 분비량을 증가시키고, 비장세포의 증식을 촉진하는 효과가 현저하므로, 면역증진용 건강기능식품 조성물, 면역증진을 위한 동물용 사료 조성물 또는 면역력 저하에 의한 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물로 사용될 수 있다.
도 1은 대식세포에 대한 아임계 고춧잎 추출물의 세포독성을 확인한 결과이다. CON은 시료를 처리하지 않은 음성 대조군이다.
도 2는 아임계 고춧잎 추출물 처리에 의한 대식세포의 NO 분비량을 확인한 결과이다. CON은 시료를 처리하지 않은 음성 대조군이고, LPS는 면역반응 유도물질인 LPS(Lipopolysaccharide)를 처리한 양성 대조군이다. a~l은 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, p<0.05이다.
도 3은 아임계 고춧잎 추출물 처리에 의한 대식세포의 TNF-α 분비량을 확인한 결과이다. CON은 시료를 처리하지 않은 음성 대조군이고, LPS는 면역반응 유도물질인 LPS를 처리한 양성 대조군이다. a~j는 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, p<0.05이다.
도 4는 비장세포에 아임계 고춧잎 추출물을 처리하여 세포 증식효과를 확인한 결과이다. CON은 시료를 처리하지 않은 음성 대조군이고, Con A(콘카나발린 A, concanavalin A) 및 LPS는 비장세포 증식을 자극하는 화학물질인 Con A 또는 LPS을 처리한 양성 대조군이다. a~f는 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, p<0.05이다.
도 2는 아임계 고춧잎 추출물 처리에 의한 대식세포의 NO 분비량을 확인한 결과이다. CON은 시료를 처리하지 않은 음성 대조군이고, LPS는 면역반응 유도물질인 LPS(Lipopolysaccharide)를 처리한 양성 대조군이다. a~l은 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, p<0.05이다.
도 3은 아임계 고춧잎 추출물 처리에 의한 대식세포의 TNF-α 분비량을 확인한 결과이다. CON은 시료를 처리하지 않은 음성 대조군이고, LPS는 면역반응 유도물질인 LPS를 처리한 양성 대조군이다. a~j는 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, p<0.05이다.
도 4는 비장세포에 아임계 고춧잎 추출물을 처리하여 세포 증식효과를 확인한 결과이다. CON은 시료를 처리하지 않은 음성 대조군이고, Con A(콘카나발린 A, concanavalin A) 및 LPS는 비장세포 증식을 자극하는 화학물질인 Con A 또는 LPS을 처리한 양성 대조군이다. a~f는 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, p<0.05이다.
본 발명은 90~160℃로 가열하여 아임계 수 추출한 고춧잎 아임계 수 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증진용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현 예에서, 상기 아임계 수 추출은 90~160℃로 가열하여 추출할 수 있고, 바람직하게는 100~160℃로 가열하여 추출하는 것이고, 더 바람직하게는 150~160℃로 가열하여 추출하는 것이며, 더욱 바람직하게는 160℃로 가열하여 추출하는 것이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 아임계 수 추출은 1500~2000psi의 압력으로, 5~15분 동안 추출할 수 있으며, 바람직하게는 1600~1800psi의 압력으로, 7~13분 동안 추출할 수 있으며, 더 바람직하게는 1700psi의 압력으로 10분 동안 추출하는 것이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 아임계 수 추출물은 구체적으로
(1) 고춧잎 건조분말에 동량의 규조토를 혼합한 후 유리섬유(glass fiber) 필터에 넣고, 아임계 추출기에 장착된 셀(cell)에 투입한 후, 물을 주입한 다음 90~160℃가 될 때까지 가열하는 단계; 및
(2) 상기 단계 (1)에서 가열된 아임계 추출기에 1500~2000psi의 압력을 가해 5~15분 동안 추출하는 단계;를 포함하여 제조될 수 있고,
더 구체적으로는
(1) 고춧잎 건조분말 1~3g에 동량의 규조토를 혼합한 후 유리섬유(glass fiber) 필터에 넣고, 아임계 추출기에 장착된 22㎖ 용량의 셀(cell)에 투입한 후, 물을 주입한 다음 90~160℃가 될 때까지 가열하는 단계; 및
(2) 상기 단계 (1)에서 가열된 아임계 추출기에 1500~2000psi의 압력을 가해 5~15분 동안 추출하는 단계;를 포함하여 제조될 수 있으며,
더욱더 구체적으로는
(1) 고춧잎 건조분말 2g에 동량의 규조토를 혼합한 후 유리섬유(glass fiber) 필터에 넣고, 아임계 추출기에 장착된 22㎖ 용량의 셀(cell)에 투입한 후, 물을 주입한 다음 150~160℃가 될 때까지 가열하는 단계; 및
(2) 상기 단계 (1)에서 가열된 아임계 추출기에 1600~1800psi의 압력을 가해 5~15분 동안 추출하는 단계;를 포함하여 제조될 수 있지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에서 상기 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 또는 음료의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물은 총 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강을 목적으로 장기간 섭취하는 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 90~160℃로 가열하여 아임계 수 추출한 고춧잎 아임계 수 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증진용 사료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 고춧잎 아임계 수 추출물을 유효성분으로 함유하는 사료 조성물은 통상적인 사료와 함께 배식할 수 있으며, 본 발명의 사료 조성물을 통상적인 사료 조성물에 첨가하여 기능성 사료 조성물을 제조하여 이용할 수도 있다. 또한, 본 발명의 사료 조성물은 본 발명의 고춧잎 아임계 수 추출물 외 기능성 성분을 추가로 포함할 수도 있다. 상기 통상적인 사료 조성물과 본 발명의 고춧잎 아임계 수 추출물이 혼합된 기능성 사료 조성물의 제조 시, 본 발명의 고춧잎 아임계 수 추출물은 총 사료 조성물에 대하여 0.01 내지 30.00 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 20.00 중량%의 양으로 첨가될 수 있다. 사료 조성물의 상기 고춧잎 아임계 수 추출물의 유효용량은 상기 식품 조성물의 유효 용량에 준해서 사용할 수 있으나, 지속적인 면역 증진을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취인 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 사료 조성물은 가축 또는 가금을 대상으로 한다. 상기 가축 또는 가금은 소, 돼지, 닭, 말, 양, 당나귀, 노새, 멧돼지, 토끼, 메추라기, 집오리, 장닭, 투계용 닭, 비둘기, 칠면조, 개, 고양이, 원숭이, 햄스터, 생쥐, 래트, 구관조, 앵무새, 잉꼬, 카나리아 등이나 이들에 제한되는 것은 아니며 가정 내에서 사육 가능한 인간 이외의 포유동물 또는 조류이면 본 발명의 사료 조성물의 대상이라 할 것이다.
또한, 본 발명은 90~160℃로 가열하여 아임계 수 추출한 고춧잎 아임계 수 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역력 저하에 의한 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 면역력 저하에 의한 질환은 감기, 천식, 부비동염, 폐렴, 패혈증, 골수염, 수막염, 단순포진, 대상포진, 구내염 또는 건선일 수 있지만, 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 고춧잎 아임계 수 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 고춧잎 아임계 수 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 고춧잎 아임계 수 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다.
이하, 제조예 및 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 제조예 및 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
제조예
1. 고춧잎
아임계
수 추출물의 제조
본 발명의 고춧잎은 영양고추유통공사로부터 제공받아 사용하였고, 아임계 추출을 위해 Thermo사의 ASE 350 기기를 사용하였다.
제공받은 고춧잎은 분쇄 후 50 메쉬의 체를 쳐서 통과한 부분의 고춧잎 분쇄물 2g에 동량의 규조토를 혼합한 후 유리섬유(glass fiber) 필터에 넣고, 아임계 추출기에 장착된 22㎖ 용량의 셀(cell)에 투입하였다. 그 후 상기 고춧잎 분쇄물이 포함된 셀을 오븐에 투입한 후 증류수를 셀에 주입하면서 100, 160 또는 180℃가 될 때까지 각각의 셀을 가열하였다. 그 후 압력을 가해 압력이 1700psi까지 도달하면 10분 동안 추출되게 설정하여 고춧잎 아임계 수 추출물을 획득하였다.
고춧잎 물 추출물은 고춧잎 분말 3g에 30mL의 물을 첨가한 뒤 100℃ 항온 수조(water bath)에서 10시간 동안 추출하였다. 그 후 추출물을 원심분리하여 상등액을 회수하여 실험의 시료로 사용하였다.
실시예
1. 고춧잎
아임계
수 추출물의 대식세포에 대한 세포독성
선천 면역을 담당하는 주요한 단핵세포인 대식세포에 대한 고춧잎 아임계 수 추출물의 세포독성을 확인하기 위해 RAW 264.7 세포를 이용하여 MTT 분석을 실시하였다.
마우스 유래의 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)에서 분양받아 사용하였으며, 10%(v/v) FBS(fetal bovine serum, GIBCO, Carlsbsd, CA, USA), 1%(v/v) 항생제(100unit/mL 페니실린 및 100unit/mL 스트렙토마이신)가 포함된 DMEM(Dulbecco’ Modified Eagle Medium) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
RAW 264.7 세포는 96 웰 플레이트에 각 웰 당 1×106개의 세포가 되도록 분주하여 2㎍/mL의 LPS(lipopolysaccharid) 또는 50, 100, 200㎍/mL의 농도별 제조예 1의 시료를 각각 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 5mg/mL 농도의 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide] 시약을 각각의 웰에 20㎕씩 처리하고 2시간 동안 반응시킨 후 배양 상등액을 제거하고, DMSO(dimethyl sulfoxide)를 100㎕씩 첨가한 후 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 570nm에서 흡광도(optical density)를 측정하였다. 세포 독성은 아무것도 처리하지 않은 CON의 흡광도 값 100%를 기준으로 비교하였다.
그 결과, 도 1에 개시된 바와 같이 고춧잎 물 추출물 및 각각의 조건으로 제조한 고춧잎 아임계 수 추출물은 200㎍/mL까지 독성을 나타내지 않는 안전한 물질이라는 것을 확인하였다.
실시예
2. 고춧잎
아임계
수 추출물 처리에 의한 대식세포 면역활성
1) NO 분비량
배양액 내의 NO(Nitrite oxide) 농도는 그리스 시약(griess reagent)을 이용하여 측정하였다. RAW 264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 1×106 cells/mL 농도로 조절한 후 96 웰 플레이트에 접종하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 그 후 제조예 1의 시료를 50, 100, 200㎍/mL의 농도로 처리하였고, 양성 대조군으로는 2㎍/mL의 LPS를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배양액의 상등액을 얻은 후 그리스 시약과 반응시켰고, 분광광도계로 540nm에서 흡광도를 측정하여 NO 분비량을 아무것도 처리하지 않은 대조군(CON) 대비 백분율로 표시하였다.
그 결과, 도 2에 개시된 바와 같이 100~160℃ 조건으로 아임계 추출한 고춧잎 아임계 수 추출물 처리군은 아무것도 처리하지 않은 대조군 및 동일 농도의 고춧잎 물 추출물 대비 현저히 증진된 NO 분비량을 나타냈다. 하지만, 180℃ 조건으로 아임계 추출한 고춧잎 아임계 수 추출물 처리군의 NO 분비량은 오히려 고춧잎 물 추출물에 비해 낮았다.
따라서 100~160℃ 조건으로 아임계 추출한 고춧잎 아임계 수 추출물은 대식세포를 활성화시켜 NO의 생성을 촉진하므로, 외부 자극이 있기 전에 면역세포를 자극함으로써 면역반응 초기 생체 방어에 유리하게 작용할 수 있다.
2) TNF-α 분비량
대식세포에서 NO의 분비량을 증가시키는 100 및 160℃로 가열하여 아임계 추출한 고춧잎 아임계 수 추출물의 처리가 TNF-α 분비량에 미치는 영향을 확인하기 위해, 2㎍/mL의 LPS 또는 50, 100, 200㎍/mL 농도의 제조예 1의 고춧잎 아임계 수 추출물이 처리된 세포 배양 상등액에서 TNF-α의 함량을 ELISA(enzyme linked immuno sorvent assay) 키트(R&D system, MN, USA)를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 확인하였다. TNF-α의 농도는 키트에 포함되어있는 TNF-α의 표준용액을 희석하여 얻은 표준 직선과 비교하여 산출하였다.
그 결과, 도 3에 개시된 바와 같이 100~160℃로 가열하여 아임계 추출한 고춧잎 아임계 수 추출물은 농도 의존적으로 대식세포에서 TNF-α의 분비량을 증가시켰고, 동일 농도의 고춧잎 물 추출물에 비해 증가량이 현저하였다.
실시예
3. 고춧잎
아임계
수 추출물 처리에 의한
비장세포
증식효과
비장세포를 획득하기 위해 오리엔트바이오에서 9주령의 암컷 ICR 마우스를 공급받아 실험동물로 사용하였다. 물과 고형사료는 자유롭게 급여하면서 일주일 동안 순응시켰고, 체중이 30g 내외가 되도록 사육한 후 실험에 사용하였다. 동물실험실 습도는 40~60%, 온도는 22±2℃로 유지하여 조절하였다.
마우스 비장세포의 분리는 Mishell & Shiigi(1980)의 방법으로 시행하였다. 경추 탈골법으로 희생시킨 마우스의 비장을 무균상태에서 분리시켜 RPMI 1640 배양액으로 씻은 후, 잘게 마쇄하였고, 분리된 세포 현탁액을 세포 스트레이너(Cell strainer)에 통과시킨 후 RBC 용해 버퍼를 사용하여 적혈구를 용혈시킨 다음 3,000rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후 적혈구가 제거된 비장세포를 다시 RPMI 1640 배양액에 분산시켜 실험에 사용하였다.
상기 획득한 마우스 비장세포는 5×106 cell/mL가 되도록 희석하여 96 웰 플레이트의 각각의 웰에 90㎕씩 분주하였다.
그 후 제조예 1의 시료를 각각의 농도로 처리하였고, 양성 대조군으로는 미토젠인 Con A(5㎍/mL) 또는 LPS(15㎍/mL)를 10㎕씩 분주하였다. 그 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 44시간 동안 배양한 다음 10㎕의 MTT 시약을 첨가한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 MTT 분석을 실시하였다.
그 결과, 도 4에 개시된 바와 같이 100~160℃ 조건으로 아임계 추출한 고춧잎 아임계 수 추출물 처리군은 모든 농도에서 비장세포의 증식을 촉진시키는 효과가 고춧잎 물 추출물 및 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 우수하였으며, 농도 의존적으로 비장세포를 증식시키는 효과가 높았다. 하지만, 180℃ 조건으로 아임계 추출한 고춧잎 아임계 수 추출물 처리군은 고춧잎 물 추출물 처리군과 유사한 비장세포 증식효과를 나타냈다.
따라서 본 발명의 100~160℃ 조건으로 아임계 추출한 고춧잎 아임계 수 추출물은 고춧잎 물 추출물 및 180℃ 조건으로 아임계 추출한 고춧잎 아임계 수 추출물에 비해 면역세포에 영향을 미쳐 면역반응을 자극하는 효과가 현저하다는 것을 확인하였다.
Claims (6)
- 90~160℃로 가열하여 아임계 수 추출한 고춧잎 아임계 수 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증진용 건강기능식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 아임계 수 추출은 1500~2000psi의 압력으로, 5~15분 동안 추출하는 것을 특징으로 하는 면역증진용 건강기능식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 고춧잎 아임계 수 추출물은
(1) 고춧잎 건조분말에 동량의 규조토를 혼합한 후 유리섬유(glass fiber) 필터에 넣고, 아임계 추출기에 장착된 셀(cell)에 투입한 후, 물을 주입한 다음 90~160℃가 될 때까지 가열하는 단계; 및
(2) 상기 단계 (1)에서 가열된 아임계 추출기에 1500~2000psi의 압력을 가해 5~15분 동안 추출하는 단계;를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 면역증진용 건강기능식품 조성물. - 90~160℃로 가열하여 아임계 수 추출한 고춧잎 아임계 수 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증진용 사료 조성물.
- 90~160℃로 가열하여 아임계 수 추출한 고춧잎 아임계 수 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역력 저하에 의한 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 면역력 저하에 의한 질환은 감기, 천식, 부비동염, 폐렴, 패혈증, 골수염, 수막염, 단순포진, 대상포진, 구내염 및 건선 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 면역력 저하에 의한 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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