KR102082106B1

KR102082106B1 - 이리도이드 고함유 노니 열매 추출물 또는 이의 분획물의 제조방법, 면역증진 활성물질 고함유 노니 열매 추출물 또는 이의 분획물의 제조방법 및 노니 열매 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 면역 증진용 조성물

Info

Publication number: KR102082106B1
Application number: KR1020190065431A
Authority: KR
Inventors: 장지환; 김진학; 진보라; 최수영; 김현지
Original assignee: 코스맥스엔비티 주식회사; 코스맥스엔에스 주식회사
Priority date: 2019-06-03
Filing date: 2019-06-03
Publication date: 2020-02-27
Also published as: AU2020264340A1; US20220080018A1; WO2020246777A1; US11628195B2; AU2020264340B2

Abstract

본 발명은 이리도이드 고함유 노니 열매 추출물 또는 이의 분획물의 제조방법, 면역증진 활성물질 고함유 노니 열매 추출물 또는 이의 분획물의 제조방법 및 노니 열매 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 면역 증진용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 특정 농도 범위의 에탄올을 추출 용매로 하여 노니 열매 추출물을 제조하는 단계를 포함하는 이리도이드 고함유 노니 열매 추출물 또는 이의 분획물의 제조방법, 면역증진 활성물질 고함유 노니 열매 추출물 또는 이의 분획물의 제조방법 및 상기 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 면역 증진용 약학 조성물 및 건강기능식품 조성물을 제공한다.

Description

이리도이드 고함유 노니 열매 추출물 또는 이의 분획물의 제조방법, 면역증진 활성물질 고함유 노니 열매 추출물 또는 이의 분획물의 제조방법 및 노니 열매 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 면역 증진용 조성물 {METHOD FOR PREPARING NONI FRUIT EXTRACT CONTAINING HIGH IRIDOIDS CONTENT AND IMMUNE-ENHANCING COMPOSITION COMPRISING NONI FRUIT EXTRACT OR FRACTION THEREOF}

노니(Morinda citrifolia L.)는 꼭두서니과 노니속에 속하는 상록관목으로 비타민 A, C가 풍부하게 들어 있고, 생리활성물질인 플라보노이드, 이리도이드, 알카로이드 등이 함유되어 있으며, 특히 남태평양 폴리네시아인(타히티 원주민)들은 오랫동안 노니를 식용과 치료적 기능의 목적으로 사용되어 왔으며, 현재에도 주스 및 생식(분말) 등의 원료로 사용되어 건강식품으로 주목받고 있는 열대식물이다.

2009년 발견된 이리도이드(iridoid)는 독특한 식물의 화학물질로 외부적 환경 요인에 의해 스스로를 방어하기 위해 만들어내는 물질로 주로 약용식물에서 발견되며, 피부노화, 고혈압, 당뇨 등 면역기능 향상에 도움을 주는 성분으로 19종의 성분이 보고되었다.

그러나, 현재까지 노니로부터 이리도이드를 효율적으로 추출하는 방법에 대한 연구는 미비한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 이리도이드 화합물 중 디아세틸아스페룰로사이드산(Deacetylasperulosidic acid, DAA), 아스페룰로사이드산(Asperulosidic acid, ASPA) 및 아스페룰로사이드(Asperuloside, ASP)를 노니 열매로부터 효율적으로 추출하는 방법을 개발하고자 하였으며, 특정 농도 범위의 에탄올을 추출 용매로 사용하는 경우 상기 3종의 이리도이드 화합물을 고함량으로 함유하는 노니 열매 추출물을 제조할 수 있고, 이러한 방법으로 제조된 추출물 또는 이의 분획물이 면역 증진에 탁월한 효능을 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

한편, 대한민국 공개특허 제10-2009-0072555호에는 노니열매의 농축액 제조방법이 개시되어 있으나, 이는 노니 특유의 이미(異味) 또는 이취(異臭)를 효과적으로 제거하기 위한 방법을 제시하고 있을 뿐, 노니 열매로부터 상기 3종의 이리도이드 화합물 또는 면역증진 활성물질을 효율적으로 추출하기 위한 방법에 대해서는 제시한 바가 없다.

본 발명의 목적은 노니로부터 이리도이드를 효율적으로 추출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 노니 열매 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 면역 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 노니로부터 면역증진 활성물질을 효율적으로 추출하는 방법을 제공하는 것이다.

상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 이리도이드 고함유 노니 열매 추출물 또는 이의 분획물의 제조방법을 제공한다:

a) 노니 열매를 분쇄하는 단계;

b) 분쇄물 중량 대비 5 내지 15배수의 10 (w/w)% 내지 60 (w/w)% 에탄올을 분쇄물에 투입하는 단계; 및

c) 60℃ 내지 100℃에서 1시간 내지 8시간 동안 추출하여 추출물을 제조하는 단계.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 b) 단계의 에탄올은 20 (w/w)% 내지 50 (w/w)% 에탄올일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 c) 단계의 추출은 교반 추출일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 제조방법은 d) 추출물을 여과 및 농축하여 농축액을 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 이리도이드는 디아세틸아스페룰로사이드산(Deacetylasperulosidic acid, DAA), 아스페룰로사이드산(Asperulosidic acid, ASPA) 및 아스페룰로사이드(Asperuloside, ASP)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.

본 발명은 또한, 노니 열매 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 면역증진용 약학 조성물 및/또는 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 추출물은 5 (w/w)% 내지 50 (w/w)% 에탄올을 추출 용매로 하여 제조된 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 분획물은 5 (w/w)% 내지 50 (w/w)% 에탄올 추출물의 정제수 분획물일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 분획물은 10kDa 이상의 분자량을 갖는 다당체를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는 면역증진 활성물질 고함유 노니 열매 추출물 또는 이의 분획물의 제조방법을 제공한다:

a) 노니 열매를 분쇄하는 단계;

b) 분쇄물 중량 대비 5 내지 15배수의 5 (w/w)% 내지 50 (w/w)% 에탄올을 분쇄물에 투입하는 단계; 및

c) 60℃ 내지 80℃에서 1시간 내지 8시간 동안 추출하여 추출물을 제조하는 단계.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 제조방법은 d) 수득된 추출물을 정제수로 분획하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 면역증진 활성물질은 이리도이드 및 10kDa 이상의 분자량을 갖는 다당체일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 이리도이드는 디아세틸아스페룰로사이드산(Deacetylasperulosidic acid, DAA), 아스페룰로사이드산(Asperulosidic acid, ASPA) 및 아스페룰로사이드(Asperuloside, ASP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 이리도이드 고함유 노니 열매 추출물의 제조방법 및 면역증진 활성물질 고함유 노니 열매 추출물의 제조방법은 특정 농도 범위의 에탄올을 추출 용매로 하여 노니 열매로부터 3종의 이리도이드 화합물 (DAA, ASPA 및 ASP)을 효율적으로 추출하는 것이 가능하며, 에탄올을 추출 용매로 사용하기 때문에 식품 가공상 가장 친환경적이며 경제적이다. 또한, 본 발명의 면역 증진용 조성물은 실질적인 유효물질인 10kDa 이상의 분자량을 갖는 다당체를 고농도로 함유하여 면역 증진에 탁월한 효능을 나타낸다.

도 1은 본 발명의 노니 열매 추출물의 제조방법을 개략도로 나타낸 것이다.
도 2는 추출 용매에 따른 노니 열매 추출물의 총 이리도이드 함량을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 30 (w/w)% 에탄올 노니 열매 추출물의 HPLC 프로파일 및 3종의 이리도이드 화합물 (DAA, ASPA 및 ASP)의 정보를 나타낸 것이다.
도 4는 각 용매 추출물을 대식세포주 RAW264.7에 처리한 후 TNF-α 생성량을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 노니 열매 추출물의 분획물 제조방법을 개략도로 나타낸 것이다.
도 6은 각 분획물을 대식세포주 RAW264.7에 처리한 후 TNF-α 생성량을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 7의(A)는 표준물질로 사용된 풀루란(pullulan)의 GPC 크로마토그래피를 나타낸 것이고, (B)는 정제수 분획물(Frc-01)의 GPC 크로마토그래피를 나타낸 것이다.

상술한 바와 같이, 이리도이드는 노니에서 발견되는 유용한 생리활성 성분으로 알려져 있으나, 이를 효율적으로 추출하는 방법에 대한 연구는 미비한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 이리도이드 화합물 중 디아세틸아스페룰로사이드산(Deacetylasperulosidic acid, DAA), 아스페룰로사이드산(Asperulosidic acid, ASPA) 및 아스페룰로사이드(Asperuloside, ASP)를 노니 열매로부터 효율적으로 추출하는 방법을 개발하고자 하였으며, 특정 농도 범위의 에탄올을 추출 용매로 사용하는 경우 상기 3종의 이리도이드 화합물을 고함량으로 함유하는 노니 열매 추출물을 제조할 수 있었고, 이러한 방법으로 제조된 추출물 또는 이의 분획물이 면역 증진에 탁월한 효능을 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 a) 노니 열매를 분쇄하는 단계; b) 분쇄물 중량 대비 5 내지 15배수의 10 (w/w)% 내지 95 (w/w)% 에탄올을 분쇄물에 투입하는 단계; 및 c) 60℃ 내지 80℃에서 1시간 내지 8시간 동안 추출하여 추출물을 제조하는 단계;를 포함하는 이리도이드 고함유 노니 열매 추출물 또는 이의 분획물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "추출물"은 상기 노니 열매, 보다 바람직하게는 건조된 노니 열매의 추출처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.

본 발명의 제조방법에서 사용된 노니 열매는 상업적으로 판매되는 것을 구입하거나, 자연에서 채취 또는 재배된 것을 사용할 수 있으며, 과육, 과피 및 씨를 모두 포함한 자연 또는 열풍건조 방법으로 건조 된 노니 열매를 사용한다.

본 발명의 상기 추출물은, 상기 각각의 해당 식물의 천연, 잡종 또는 변종 식물로부터 추출될 수 있고, 식물 조직 배양물로부터도 추출이 가능하다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 추출물을 추출하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2 종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 구체적인 일실시예에서는 교반 추출을 이용하여 추출물을 제조하였다.

본 발명의 제조방법에서 상기 노니 열매를 추출하는데 사용되는 추출 용매의 종류는 에탄올이다. 에탄올을 이용한 추출 (즉, 주정추출)은 식품 가공상 가장 친환경적이며 경제적인 추출방법일 뿐만 아니라, 메탄올, 헥산, 에틸아세테이트, 메틸클로라이드 또는 아세톤과 같은 기타 다른 유기 용매를 추출 용매로 사용할 때보다 이리도이드를 효율적으로 추출할 수 있음을 본 발명을 통해 확인하였다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 b) 단계의 에탄올의 농도는 10 (w/w)% 내지 95 (w/w)%, 보다 바람직하게는 10 (w/w)% 내지 60 (w/w)%, 보다 더 바람직하게는 20 (w/w)% 내지 60 (w/w)%, 가장 바람직하게는 20 (w/w)% 내지 50 (w/w)%일 수 있다.

본 발명의 제조방법은 상기 용매를 사용하여 건조된 노니 열매를 1회 이상 추출하여 용매 추출물을 제조할 수 있으며, 상기 용매 추출물을 감압 증류한 후 동결 건조 또는 분무 건조하여 얻은 건조 추출물을 제조할 수 있다.

본 발명자들은 도 1에 나타난 바와 같이 추출 용매로 정제수, 10 (w/w)% 에탄올, 30 (w/w)% 에탄올, 50 (w/w)% 에탄올, 70 (w/w)% 에탄올 및 95 (w/w)% 에탄올을 각각 사용하여 노니 열매 추출물을 제조하였고, 도 2에 나타난 바와 같이 다양한 용매 추출물 중 10 (w/w)%, 30 (w/w)% 및 50 (w/w)% 에탄올 용매 추출물에서 높은 총 이리도이드 함량을 나타냄을 확인하였다. 이들 용매 추출물 중 가장 높은 총 이리도이드 함량을 나타낸 30 (w/w)% 에탄올 추출물에 대해 HPLC를 수행한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 디아세틸아스페룰로사이드산(Deacetylasperulosidic acid, DAA), 아스페룰로사이드산(Asperulosidic acid, ASPA) 및 아스페룰로사이드(Asperuloside, ASP)가 존재함을 확인하였다.

상기와 같이 제조된 각 용매 추출물의 면역 증진 효과를 확인하기 위해, 본 발명자들은 각 용매 추출물을 대식세포주 RAW264.7에 처리하여 TNF-α 생성 효과를 확인하였다. 그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 10 (w/w)%, 30 (w/w)% 및 50 (w/w)% 에탄올 용매 추출물에서 우수한 TNF-α 생성 효과가 나타남을 확인하였다.

그러나, 가장 높은 총 이리도이드 함량을 나타냈던 30 (w/w)% 에탄올 추출물에 비해 10 (w/w)% 에탄올 추출물의 TNF-α 생성 효과가 우수하였는데, 이는 총 이리도이드 함량이 높은 경우 우수한 면역 증진 효과를 나타내지만, 총 이리도이드 함량과 면역 증진 효과가 정비례하는 것은 아님을 시사한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "분획물"은 여러 다양한 구성 성분들을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 분획을 수행하여 얻어진 결과물을 의미한다.

본 발명에서 상기 분획물을 얻는 분획 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 분획 방법의 비제한적인 예로는, 건조된 노니 열매를 추출하여 얻은 추출물에 소정의 용매를 처리하여 상기 추출물로부터 분획물을 얻는 방법을 들 수 있다.

본 발명에서 상기 분획물을 얻는 데에 사용되는 용매의 종류는 정제수인 것이 바람직하다. 정제수 이외의 다른 용매를 사용하는 경우, 이리도이드를 비롯한 면역 증진 활성을 나타내는 생리활성물질의 함량이 급격하게 감소하여, 의도한 생리활성이 나타나지 않을 수 있다.

본 발명의 구체적인 일실시예에서는 도 5에 나타난 바와 같이 30 (w/w)% 에탄올을 추출 용매로 하여 제조된 노니 열매 추출물을 정제수, 10 (w/w)% 에탄올, 30 (w/w)% 에탄올 및 70 (w/w)% 에탄올 조건으로 각 구획 별로 분획 및 정제하였고, 각 분획물을 대식세포주 RAW264.7에 처리하여 TNF-α 생성 효과를 확인하였다. 도 6에 나타난 바와 같이, 정제수 분획물인 분획 1(Frc-01)의 TNF-α 생성 효과가 가장 우수하며, 다른 분획물들에서는 동일 효과가 미비함을 확인하였다.

추가로, 본 발명자들은 정제수 분획물에서 실질적으로 면역 증진 효능을 나타내는 물질을 규명하기 위해 GPC (Gel Permeation Chromatography) 분석을 수행하여 분자량을 확인하였으며, 도 7에 나타난 바와 같이 10kDa 이상의 분자량을 갖는 다당체가 면역 증진 효능을 나타내는 실질적인 유효성분임을 확인하였다.

이러한 결과를 바탕으로, 도 4에 나타난 TNF-α 생성 효과를 재해석하면 10 (w/w)% 에탄올 추출물은 30 (w/w)% 및 50(w/w)% 에탄올 추출물에 비해 총 이리도이드 함량은 낮으나, 이들 추출물보다 10kDa 이상의 분자량을 갖는 다당체의 함유량이 높아 결과적으로 가장 우수한 면역 증진 효과를 나타낸 것으로 해석할 수 있다.

본 발명은 또한, 전술한 제조방법으로 제조된 이리도이드 고함유 노니 열매 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 면역 증진용 약학 조성물 및/또는 건강기능식품 조성물을 제공한다.

도 2 및 4에서 확인되는 바와 같이, 총 이리도이드 함량과 면역 증진 효과가 정비례하는 것은 아니며, 도 7에서 확인되는 바와 같이 실질적으로 면역 증진 효능을 나타내는 물질은 10kDa 이상의 다당체이므로, 본 발명의 조성물은 이리도이드를 효율적으로 추출하는 방법에 추출 용매로 사용된 에탄올 농도와 상이한 농도 범위의 에탄올을 사용할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 면역 증진용 조성물은 5 (w/w)% 내지 50 (w/w)% 에탄올, 보다 바람직하게는 5 (w/w)% 내지 40 (w/w)% 에탄올, 가장 바람직하게는 5 (w/w)% 내지 30 (w/w)% 에탄올을 추출 용매로 하여 제조된 노니 열매 추출물을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 면역 증진용 조성물은 5 (w/w)% 내지 50 (w/w)% 에탄올 노니 열매 추출물의 정제수 분획물을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상기 정제수 분획물은 정제수를 용출액으로 하여 5 (w/w)% 내지 50 (w/w)% 에탄올 노니 열매 추출물의 농축액에 대해 오픈 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 수득될 수 있고, 이때 오픈 컬럼에 충진되는 합성수지는 소수성 합성수지인 것이 바람직하다.

도 7에 나타난 바와 같이 상기 정제수 분획물에서 10kDa 이상의 분자량을 갖는 다당체가 면역 증진 효능을 나타내는 실질적인 유효성분임을 확인하였는바, 본 발명의 면역 증진용 조성물에 포함되는 상기 정제수 분획물은 10kDa 이상의 분자량을 갖는 다당체를 유효성분으로 하여 우수한 면역 증진 효능을 나타낸다.

상기와 같은 결과를 바탕으로, 추가로 본 발명은 a) 노니 열매를 분쇄하는 단계; b) 분쇄물 중량 대비 5 내지 15배수의 5 (w/w)% 내지 50 (w/w)% 에탄올을 분쇄물에 투입하는 단계; 및 c) 60℃ 내지 80℃에서 1시간 내지 8시간 동안 추출하여 추출물을 제조하는 단계;를 포함하는 면역증진 활성물질 고함유 노니 열매 추출물 또는 이의 분획물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 면역증진 활성물질 고함유 노니 열매 추출물 또는 이의 분획물 제조방법은 d) 수득된 추출물을 정제수로 분획하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 d) 단계에서 정제수 이외의 다른 용매를 사용하는 경우, 이리도이드를 비롯한 면역 증진 활성을 나타내는 생리활성물질의 함량이 급격하게 감소하여, 의도한 생리활성이 나타나지 않을 수 있다.

본 발명의 면역증진 활성물질 고함유 노니 열매 추출물 또는 이의 분획물의 제조방법에 있어서, 상기 면역증진 활성물질은 이리도이드 및 10kDa 이상의 분자량을 갖는 다당체일 수 있고, 상기 이리도이드는 디아세틸아스페룰로사이드산(Deacetylasperulosidic acid, DAA), 아스페룰로사이드산(Asperulosidic acid, ASPA) 및 아스페룰로사이드(Asperuloside, ASP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 면역증진 활성물질 고함유 노니 열매 추출물 또는 이의 분획물의 제조방법에 있어서, 추출 용매로 사용된 에탄올의 농도를 제외한 각 단계에 대한 상세한 설명은 전술한 이리도이드 고함유 노니 열매 추출물의 제조방법과 동일하므로, 그 기재를 생략한다.

상기 제조방법에 있어서, 면역증진 활성물질을 가장 효율적으로 추출할 수 있는 에탄올의 농도 범위는 5 (w/w)% 내지 50 (w/w)%, 보다 바람직하게는 5 (w/w)% 내지 40 (w/w)%, 가장 바람직하게는 5 (w/w)% 내지 30 (w/w)%일 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은, 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 약학적 제형으로 제조될 수 있다. 제형의 제조에 있어서, 활성 성분을 담체와 함께 혼합 또는 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다.

따라서, 본 발명의 약학 조성물은, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있고, 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들어, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되고, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들어 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식에 따를 수 있다. 상기 투여 방식은 목적 조직에 도달할 수 있는 한 제한되지 않으나, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 목적하는 투여 방식에 따라 다양한 제형으로 제작될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.

상기 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분 한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 통상적인 1일 투여량은 당업자가 적절하게 선택할 수 있으며, 1회 또는 수 회로 나누어 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물을 매일 투여 또는 간헐적으로 투여해도 좋고, 1일당 투여 횟수는 1회 또는 2~3회로 나누어 투여하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 조성물은 면역 증진을 위하여 단독으로, 또는 다른 약물 치료와 병용하여 사용할 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 면역 증진이 필요한 개체에 투여하여 면역을 증진시킬 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "개체"란, 대사성 질환이 발병되었거나 발병할 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 건강기능식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.

본 발명의 건강기능식품 조성물에 포함될 수 있는 필수 성분으로 상기 노니 열매 추출물 또는 이의 분획물을 함유하는 것 외에는 다른 성분에는 특별히 제한이 없으며 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약추출물, 식품 보조 첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

또한, 상기 식품 보조 첨가제는 당업계에 통상적인 식품 보조 첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함한다.

상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외에 향미제로서 천연 향미제(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 건강보조식품은 건강기능식품 및 건강식품 등을 포함한다.

상기 건강기능(성)식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 건강기능식품 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

30(w/w)% 에탄올을 이용한 노니 열매 추출물의 제조

가공 및 건조된 노니 열매에 혼입된 이물질 등이 있는지 확인 및 선별한 후 추출 효율성을 높이기 위해 건조된 노니 열매를 40 내지 100 메쉬(mesh)로 분쇄하였다. 분쇄된 분쇄물의 중량 대비 10배수의 30(w/w)% 에탄올을 추출기에 넣은 후 원료인 건조된 노니 열매 분쇄물을 서서히 투입하였다. 원료 투입이 완료된 후 온도를 80℃에서, 4시간 동안 교반 추출하였다. 이후 와트만 (Whatman) No.4 종이필터 여과지를 사용하여 여과를 진행하였다. 여과가 완료된 추출액을 60 ~ 70℃에서 감압 농축 과정을 거쳐 농축액을 제조한 다음 동결 건조하여 분말 형태로 제조하였다 (수율 28%).

10 (w/w)% 에탄올을 이용한 노니 열매 추출물의 제조

추출 용매를 10 (w/w)% 에탄올을 사용한 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 노니 추출물을 제조하였다 (수율 24%).

50 (w/w)% 에탄올을 이용한 노니 열매 추출물의 제조

추출 용매를 50 (w/w)% 에탄올을 사용한 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 노니 추출물을 제조하였다 (수율 21%).

[비교예 1]

정제수를 이용한 노니 열매 추출물의 제조

추출 용매를 정제수를 사용한 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 노니 추출물을 제조하였다 (수율 17%).

[비교예 2]

70 (w/w) % 에탄올을 이용한 노니 열매 추출물의 제조

추출 용매를 70 (w/w)% 에탄올을 사용한 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 노니 추출물을 제조하였다 (수율 15%).

[비교예 3]

95 (w/w) % 에탄올을 이용한 노니 열매 추출물의 제조

추출 용매를 95 (w/w)% 에탄올을 사용한 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 노니 추출물을 제조하였다 (수율 7%).

실시예 1 내지 3 및 비교예 1 내지 3에서 사용한 추출 용매를 표 1에 정리하여 나타내었다.

실시예/비교예	추출 용매
실시예 1	30 (w/w)% 에탄올
실시예 2	10 (w/w)% 에탄올
실시예 3	50 (w/w)% 에탄올
비교예 1	정제수
비교예 2	70 (w/w)% 에탄올
비교예 3	95 (w/w)% 에탄올

노니 열매 추출물의 이리도이드 함량 분석

상기 실시예 1 내지 3 및 비교예 1 내지 3을 통해 제조된 각각의 추출물에 대한 이리도이드 함량 분석을 실시하였다,

각 추출물을 50ml 메스 플라스크에 약 100mg씩 분취한 후 용량선에 맞게 증류수를 넣고 완전히 용해시켰다. 0.45㎛의 시린지 필터에 여과한 시험액을 분석에 사용하였다. HPLC 분석방법은 하기 표 2에 나타내었고, 분석한 결과 값을 각 실시예 및 비교예의 추출 수율로 환산하여 도 2에 나타내었으며, 실시예 1 추출물의 HPLC 프로파일을 도 3에 나타내었다.

구분	상세 내용
기기	Agilient
검출기	UV(DAD)
파장	238nm
컬럼	InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 (150×4.6mm, 5㎛)
이동상	A: 증류수에 용해된 0.1% 포름산B: 아세토니트릴에 용해된 0.1% 포름산
유속	0.5ml/분
주입 용량	10㎕
오븐 온도	40℃
실행 시간	40분

도 2에 나타난 바와 같이, 실시예 1 내지 3의 노니 열매 추출물의 총 이리도이드 함유량이 비교예 1 내지 3의 노니 열매 추출물 보다 현저히 높았고, 그 중에서도 실시예 1의 추출물이 가장 높은 이리도이드 함량을 갖는 것으로 확인되었다.

노니 열매 추출물의 면역 증진 효과 확인

상기 실시예 1 내지 3 및 비교예 1 내지 3을 통해 제조된 각각의 추출물에 대한 면역 증진 효과를 확인하기 위해, 본 실시예에서는 추출물 처리에 따른 대식세포 유래 TNF-α의 생성을 측정하였다. TNF는 선천 면역을 매개하고 조절하는 사이토카인으로, 항원에 자극된 T림프구, NK세포, 비만세포에 의해서도 분비되지만 활성화된 대식세포가 주된 생산세포이므로, 면역 증진 효과를 분석하기 위한 인자로서TNF의 생성을 측정하였다.

구체적으로, 배양한 마우스 대식세포주 RAW264.7 (KCLB#40071, 한국세포주은행)을 RPMI1640 배지 (Gibco, Cat#11875-093)를 사용하여 1Х10⁶ 세포/ml의 농도로 조절한 후, 96 웰 플레이트에 접종하고, 5% CO₂ 및 37℃에서 18시간 동안 전배양 하였다. 이후 배지를 제거하고 각각의 추출물을 각각 50 및 200㎍/mL의 농도로 함유하는 배지를 처리하여 배양하였다. 24시간 후 상층액을 100㎕ 씩 또 다른 96 웰 플레이트에 옮기고 R&D systems 사의 마우스 TNF-α ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 키트 (Cat#SMTA00B))를 이용해 제조사 지시에 따라 TNF-α 농도를 측정하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에서 확인되는 바와 같이, 실시예 1 내지 3의 노니 열매 추출물이 비교예 1 내지 3의 노니 열매 추출물보다 우수한 TNF-α 생성 효과를 나타내었고, 그 중에서도 실시예 2의 10 (w/w)% 노니 추출물이 가장 우수한 TNF-α 생성 효과를 나타내었다.

노니 열매 추출물의 활성물질 확인

6-1. 노니 열매 추출물의 분획물 제조

실시예 1의 30 (w/w)% 에탄올 노니 열매 추출물이 우수한 면역 증진 효과 및 가장 높은 총 이리도이드를 함유하고 있는 것으로 확인되었으므로, 이를 대상으로 명확한 유효성분을 확인하기 위해 추가적으로 분획을 제조하여 선별하였다.

구체적으로, 도 5에 나타난 바와 같이 실시예 1의 30 (w/w)% 에탄올 노니 열매 추출물을 TRILITE^® GSH-20 수지 (소수성 합성수지)가 충진된 오픈 컬럼에 투입하고, 용출액으로 정제수, 10 (w/w)% 에탄올, 30 (w/w)% 에탄올 및 70(w/w)% 에탄올 조건으로 각 구획 별로 실시예 1의 30 (w/w)% 에탄올 노니 열매 추출물을 분획 및 정제하였다. 각 분획물(fractionation)에 대한 면역 증진 활성은 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 확인하였고, 그 결과는 도 6에 나타내었다.

도 6에서 확인되는 바와 같이, 정제수 분획물인 분획 1(Frc-01)의 면역 증진 효과가 가장 높게 나타났으며, 다른 분획물들에서는 면역 증진 효과가 미비함을 확인하였다. 이를 통해, 친수성 기질이 보다 높은 부분에서 면역 증진 효능을 나타냄을 알 수 있다.

6-2. 정제수 분획물의 GPC 분석

면역 증진 효능을 나타내는 정제수 분획물(Frc-01)에서 실질적으로 효능을 나타내는 물질의 분자량을 측정하기 위해 GPC (Gel Permeation Chromatography) 분석을 진행하였다. 표 3에는 분석조건을 나타내었고, 도 7의 (A)에는 표준물질로 사용된 풀루란(pullulan)의 GPC 분석 수행 결과를 나타내었으며, (B)에는 정제수 분획물(Frc-01)의 GPC 분석 수행 결과를 나타내었다.

구분	상세내용
기기	Tosh사 EcoSEC HLC-8320 GPC
검출기	RI-검출기
컬럼	2×TSKgel GMPWxl + TSKgel G2500PWxl (7.8×300mm)
이동상	0.1M NaNo₃
유속	1.0ml/분
주입 용량	100㎕, 3mg/ml
오븐 온도	40℃

GPC 분석 결과 정제수 분획물의 평균 분자량이 약 10kDa 이상인 다당체들을 포함하며, 이들 다당체들이 면역 증진 효능을 나타내는 실질적인 유효성분임을 확인하였다.

Claims

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10(w/w)% 에탄올로 추출한 노니 열매 추출물 또는 이의 정제수 분획물을 포함하는 면역 증진용 약학 조성물로서, 상기 추출물 및 분획물은 이리도이드 및 10kDa 이상의 분자량을 갖는 다당체를 포함하는 면역 증진용 약학 조성물.
제6항에 있어서, 상기 이리도이드는 디아세틸아스페룰로사이드산(Deacetylasperulosidic acid, DAA), 아스페룰로사이드산(Asperulosidic acid, ASPA) 및 아스페룰로사이드(Asperuloside, ASP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인 면역 증진용 약학 조성물.
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10(w/w)% 에탄올로 추출한 노니 열매 추출물 또는 이의 정제수 분획물을 포함하는 면역 증진용 건강기능식품 조성물로서, 상기 추출물 및 분획물은 이리도이드 및 10kDa 이상의 분자량을 갖는 다당체를 포함하는 면역 증진용 건강기능식품 조성물.
제10항에 있어서, 상기 이리도이드는 디아세틸아스페룰로사이드산(Deacetylasperulosidic acid, DAA), 아스페룰로사이드산(Asperulosidic acid, ASPA) 및 아스페룰로사이드(Asperuloside, ASP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인 면역 증진용 건강기능식품 조성물.
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