CN116528690A - 包含诺丽果提取物或其分馏物的解酒用组合物及其用途 - Google Patents
包含诺丽果提取物或其分馏物的解酒用组合物及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及包含诺丽果提取物或其分馏物的解酒用组合物，更详细地提供将特定浓度的乙醇作为提取溶剂，制备成大量包含具有优秀的解酒功能性的平均分子量为8kDa至10kDa的多糖体的诺丽果提取物或其分馏物。
Description
技术领域
本发明涉及包含诺丽果提取物或其分馏物的解酒用组合物及其用途，更详细地提供将特定浓度的乙醇作为提取溶剂，制备成大量包含具有优秀的解酒功能性的平均分子量为8kDa至10kDa的多糖体的诺丽果提取物或其分馏物。
背景技术
宿醉为酒后出现的身体上、精神上不愉快的总称，作为客观症状，是指恶心、呕吐、困意、头痛、运动能力下降、血液学变化、激素的变化等现象。根据基于遗传的个人偏差、环境状态(营养状态、运动状态、脱水程度、健康状态)，宿醉程度的差异非常严重。
酒后酒精通过三种途径代谢，当乙醇的浓度低时，利用存在于胃肠道或肝脏的乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase，ADH)和乙醛脱氢酶(Acetaldehyde dehydrogenase，ALDH)的作用代谢为乙醛和乙酸，当乙醇的浓度高时，利用存在于小孢体的微粒体乙醇氧化系统(Microsomal ethanol oxidizing system，MEOS)代谢为乙醛和乙酸，之后经过存在于过氧化物酶体(peroxisome)的过氧化氢酶(catalase)的作用等最终分解为二氧化碳(CO2)和水(H2O)。当适量的酒精流入时，上述描述的代谢系统顺畅地起到作用，防止酒精引起的各种症状的产生，但当大量的酒精流入时，代谢系统的平衡被破坏，无法维持体内稳态，短期内引起头痛或头重感、集中力减退、烧心及消化不良等，长期内有可能产生肝功能障碍。
由此，将多种生药原材料作为对象，对用于解酒的多种功能性食品或饮料进行研究和实验。其中，开发利用枳根果实提取物的多种解酒饮料(韩国公开专利第10-2020-0068817号)，作为当前市场销售的代表性的解酒饮料的肯迪醒(Condition)(CJ公司)同样将枳根果实提取物作为原料。此外，正在市场销售中的大部分产品利用包含生药原材料在内的功效优秀的多种物质，但不仅使用量不足，也缺乏对最终产品的功效的客观验证，因而对产品的可靠度整体低。
因此，当前持续需要开发通过客观验证解酒功效，确保消费者的信赖，还减少过量饮酒引起的社会损失，可有助于健康生活的产品。
对此，本发明人通过确认当将特定浓度的乙醇作为提取溶剂制备诺丽果提取物时，体内包含参与乙醇分解的ADH活性增进效果最优秀的平均分子量为8kDa至10kDa的多糖体，可发挥卓越的解酒功效，完成本发明。
发明内容
技术问题
因此，本发明的目的在于，提供利用将特定浓度的乙醇作为提取溶剂制备的诺丽果提取物或其分馏物的解酒用组合物和/或解酒用食品组合物。
本发明的再一目的在于，提供利用将特定浓度的乙醇作为提取溶剂制备的诺丽果提取物或其分馏物的解酒方法。
本发明的另一目的在于，提供当制备用于解酒的药剂时，将特定浓度的乙醇作为提取溶剂制备的诺丽果提取物或其分馏物的用途。
解决问题的方案
为了解决上述的问题，提供如下的解酒用组合物，其包含：多糖体，来源于诺丽果提取物，平均分子量为8kDa至10kDa；或者诺丽果提取物或其分馏物，包含平均分子量为8kDa至10kDa的多糖体。
根据本发明的优选一实施例，上述诺丽果提取物可将10％乙醇作为提取溶剂制备。
根据本发明的优选再一实施例，上述分馏物可以为以10％乙醇提取的诺丽果提取物的纯化水分馏物。
根据本发明的优选另一实施例，上述组合物可呈现a)增进乙醇脱氢酶(Alcoholdehydrogenase)的活性；b)增进醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase)的活性；c)减少血液酒精浓度和/或d)血液乙醛减少效果。
本发明还提供包含上述的组合物的解酒用食品组合物和/或保健食品组合物。
本发明还提供解酒方法，在上述解酒方法中，以有效量将包含来源于诺丽果提取物的平均分子量为8kDa至10kDa的多糖体或含有上述多糖体的诺丽果提取物或其分馏物的组合物给药到需要其的个体中。
追加地，本发明提供当制备用于解酒的药剂或食品时，包含来源于诺丽果提取物的平均分子量为8kDa至10kDa的多糖体或含有上述多糖体的诺丽果提取物或其分馏物的组合物的用途。
发明的效果
本发明的诺丽果乙醇提取物及其分馏物由平均分子量为8kDa至10kDa的多糖体组成，呈现优秀于由具有其他平均分子量的多糖体组成的提取物的ADH和/或ALDH的活性，具有卓越的解酒功效。并且，将纯化水和乙醇作为提取溶剂，因而食品加工上最环保且经济。
附图说明
图1表示作为被发现包含在诺丽中的多酚类化合物的绿原酸(chl orogenicacid)、对甲氧基苯甲酸(p-anisic acid)、没食子酸(gallic acid)、表儿茶素(epicatechin)、咖啡酸(caffeic acid)及4-羟基苯甲酸(4-hydroxybenzoic acid)的乙醇脱氢酶(Alcohol Dehydrogenase，ADH)活性增进功效的测定结果。
图2表示作为被发现包含在诺丽中的芦丁、莨菪亭及三种环烯醚萜化合物的去乙酰基车叶草苷酸(Deacetylasperulosidic acid，DAA)、车叶草苷酸(Asperulosidic acid，ASPA)及车叶草苷(Asperuloside，ASP)的ADH活性增进功效的测定结果。
图3为表示根据作为提取溶剂的乙醇的浓度的诺丽果提取物的ADH活性变化的图表。
图4中测定10％乙醇诺丽果提取物的纯化水分馏物、30％乙醇分馏物及70％乙醇分馏物的ADH活性，并由图表表示。
图5a及图5b按照顺序表示多糖体标准品的凝胶渗透色谱(Gel permeationchromatography，GPC)结果和校准曲线(图5a)及10％乙醇诺丽果提取物的纯化水分馏物(图5b)的GPC结果。
图6a及图6b按照顺序表示多糖体标准品的GPC结果和校准曲线(图6a)及30％乙醇诺丽果提取物的纯化水分馏物的GPC结果(图6b)。
图7a表示比较例1的成熟诺丽果汁原液的粗多糖体的ADH活性。
图7b表示诺丽果提取物的水饱和丁醇分馏物的ADH活性。
图8a表示多糖体标准品的GPC结果和校准曲线。
图8b至图8d按照顺序表示诺丽果汁原液(图8b)、诺丽果汁原液的粗多糖体(图8c)及水饱和丁醇分馏物(图8d)的GPC结果。
图9由简图表示用于从10％乙醇诺丽果提取物按照不同多糖体尺寸制备分馏物的方法。
图10表示以Brix和性状差异为基准对通过图9的方法获取的共10个分馏物进行分组。
图11a表示用作标准物质的普鲁兰(安捷伦普鲁兰多糖试剂盒(Agilent pullulanpolysaccharide kit)，PL2090-0101)的GPC结果及校准曲线。
图11b至图11e按照根据图10的分组分离的4个分馏物(分馏1至分馏4)顺序表示GPC结果。
图11f表示被熟知平均分子量为9～11kDa的葡聚糖的GPC结果。
图12表示包含在图10的各4个分馏物(分馏1至分馏4)的多糖体的平均分子量及葡聚糖的平均分子量。
图13表示图10的分馏1至分馏4及葡聚糖的ADH活性。
图14表示用于评价生物体内(in vivo)中的乙醇诺丽果提取物的解酒功效的动物实验设计中试样的给药时间表。
图15中根据图14的给药时间表的试样及酒精给药之后，测定随着时间的经过的血液乙醇浓度，并由图表表示。
图16中根据图14的给药时间表的试样及酒精给药之后，测定随着时间的经过的血液乙醛浓度，并由图表表示。
图17中根据图14的给药时间表的试样及酒精给药之后，在第五个小时摘除肝脏，测定肝脏中的ADH及ALDH的活性，并由图表表示。
具体实施方式
如上所述，正在市场销售中的大部分产品利用包含生药原材料在内的功效优秀的多种物质，但不仅使用量不足，还缺乏对最终产品的功效的客观验证，对产品的可靠度整体低。由此，当前持续要求开发客观验证解酒功效，可确保消费者的信赖的产品。
对此，本发明人通过确认当将特定浓度的乙醇作为提取溶剂制备诺丽果提取物时，体内包含参与乙醇分解的ADH活性增进效果最优秀的平均分子量为8kDa至10kDa的多糖体，可发挥卓越的解酒功效，摸索上述问题的解决方案。
因此，本发明的第一实施方式涉及如下的解酒组合物，其包含：来源于诺丽果提取物的平均分子量为8kDa至10kDa的多糖体；或者诺丽果提取物或其分馏物，包含平均分子量为8kDa至10kDa的多糖体。
本发明中使用的术语“提取物”包含上述诺丽果，更优选地，包含通过干燥的诺丽果的提取处理得到的提取液、上述提取液的稀释液或浓缩液、干燥上述提取液来得到的干燥物、上述提取液的粗纯化物或纯化物或它们的混合物等，可利用提取液本身及提取液形成的所有剂型的提取物。
本发明的组合物中使用的诺丽果可购买商业上销售的，或使用自然采集或栽培的，使用全部包含果肉、果皮及种子的以自然或热风干燥方法干燥的诺丽果。
本发明的诺丽果提取物可从该植物的天然、杂种或变种植物中提取，也可从植物组织培养物中提取。
在本发明的组合物中，上述诺丽果提取物可将乙醇作为提取溶剂制备。利用乙醇的提取(即，乙醇提取)不仅是食品加工上最环保且经济的提取方法，相比于将甲醇、己烷、乙酸乙酯、氯甲烷或丙酮之类的其他另一有机溶剂作为提取溶剂时，可有效提取环烯醚萜。
在本发明的组合物中，上述乙醇的浓度为10％至20％，更优选地可以为10％至15％，最优选地可以为10％。
本发明中使用的术语“分馏物”意味着为了从包含各种各样的组成成分的混合物中分离特定成分或特定成分组执行分馏来得到的结果物。
本发明中获取上述分馏物的方法不受特别限制，可根据该技术领域中通常使用的方法执行。作为上述分馏方法的非限制性例，可例举对提取干燥的诺丽果来得到的提取物处理规定的溶剂从上述提取物中得到分馏物的方法。
本发明中用于获取上述分馏物的溶剂的种类优选为纯化水。当使用除了纯化水之外的其他溶剂时，呈现解酒功效的生理活性物质的含量急剧减少，所图的解酒功效有可能不完善地出现或几乎不出现。
因饮酒被体内吸收的乙醇主要在肝脏中代谢，并经过乙醛氧化为乙酸盐，向体外排出，据熟知在从上述乙醇氧化为乙醛的过程中ADH起到作用，在通过酒精氧化生成的乙醛的分解/氧化过程中ALDH起到作用。
正常的酒精代谢过程为摄取的酒精被肠胃或小肠吸收，进入血管内，移至肝脏，在肝细胞中可通过酒精分解酶的作用酒精氧化为乙醛，乙醛分解酶重新起到作用，乙醛分解为乙酸盐，分解为二氧化碳、水，向体外排出。
宿醉的原因尚未被发现，但具有脱水、酒精及酒精代谢物(乙醛、甲醛、丙酮等)的毒性作用，或营养素的吸收障碍引起的营养素缺乏等多数学术，据最近报告由作为酒精的代谢产物的乙醛、丙酮等引起(Tomita Y，Haseba T，Kurosu M，Watanabe T(1990).ArukoruKenk yut Yakubutsu Ison.25(2).116-128)(Tsukamoto S，Muto T.Nagoy a T，ShimamuraM，Saito T，Tainaka H.(1989).Alcohol Alcohol.24(2).101～108)。
因此，本发明具体的一实施例中确认诺丽的多种生理活性成分中呈现解酒功效的实质性有效成分，制备提高其含量的提取物或分馏物。据公知诺丽包含绿原酸(chlorogenic acid)、对甲氧基苯甲酸(p-anis ic acid)、没食子酸(gallic acid)、表儿茶素(epicatechin)、咖啡酸(caffeic acid)及4-羟基苯甲酸(4-hydroxybenzoic acid)之类的多种多酚类化合物、去乙酰基车叶草苷酸(Deacetylasperulosidic acid，DAA)、车叶草苷酸(Asperulosidic acid，ASPA)及车叶草苷(Asperu loside，ASP)之类的环烯醚萜化合物、芦丁、莨菪亭等，因而评价对各个个别成分的ADH活性，但如从图1及图2中所确认，可知经实验的所有个别成分未呈现相比于对照组的ADH活性增加，并非是实质性的有效成分。
通过确认被发现包含在诺丽果中的多种个别成分不影响酒精分解，本发明具体的再一实施例中将诺丽果制备成多种提取物形态，确认各个提取物的ADH活性增进功效。如从图3中所确认，ADH活性按照诺丽果热水提取物<50％乙醇诺丽果提取物<30％乙醇诺丽果提取物<10％乙醇诺丽果提取物的顺序呈现高。
本发明另一具体的一实施例中为了将呈现最优秀的ADH活性的10％乙醇诺丽果提取物作为对象明确有效成分制备追加分馏物并筛选，其结果，如图4所示，10％乙醇诺丽果提取物的纯化水分馏物中呈现最高的ADH活性，确认到ADH活性上升因子大部分包含在纯化水分馏物，根据GPC分析结果，如图5所示，确认到包含在纯化水分馏物的实质性有效成分为分子量为8kDa至10kDa的多糖体。
追加地，本发明的还一具体的一实施例中为了确认10％乙醇诺丽果提取物和30％乙醇诺丽果提取物的功效差异是否由主要组成成分的差异引起，对30％乙醇诺丽果提取物的纯化水分馏物执行GPC，根据分析结果，如图6所示，确认到30％乙醇诺丽果提取物的纯化水分馏物内主要包含平均分子量为10kDa以上的多糖体。
若比较图5a至图5b及图6a至图6b的结果，则确认10％乙醇诺丽果提取物的主要组成成分为平均分子量为8～10kDa的多糖体，相反，30％乙醇诺丽果提取物的主要组成成分为平均分子量为10kDa以上的多糖体，判断ADH活性增进功效根据多糖体的平均分子量不同。
本发明的又一具体的一实施例中为了确认ADH活性是否根据多糖体的平均分子量不同，制备成熟诺丽果汁原液、成熟诺丽果汁原液的粗多糖体及10％乙醇提取物的水饱和丁醇分馏物，确认到它们的酒精分解能力及多糖体的平均分子量。
如从图4中所确认，比较例1的成熟诺丽果汁原液未呈现相比于未处理试样的对照组的ADH活性增加，呈现明显低于10％乙醇诺丽果提取物及其纯化水、30％乙醇及70％乙醇分馏物的ADH活性。根据GPC分析结果，如图8b所示，诺丽果汁原液主要包含平均分子量为1.0kDa的多糖体。
如从图7a中所确认，成熟诺丽果汁原液的粗多糖体仍然呈现低于10％乙醇诺丽果提取物及其纯化水分馏物的相同容量的ADH活性。根据GPC分析结果，如从图8c中所确认，成熟诺丽果汁原液的粗多糖体主要包含平均分子量为13.2kDa的多糖体。
如从图7b中所确认，10％乙醇诺丽果提取物的水饱和丁醇分馏物呈现明显低于10％乙醇提取物及其纯化水分馏物的ADH活性。根据GPC分析结果，如从图8d中所确认，水饱和分馏物主要包含平均分子量为1.1kDa的多糖体。
通过如上所述的结果，判断相比于其他平均分子量，平均分子量为8～10kDa的多糖体呈现优秀的酒精分解能力。
本发明的追加的具体的一实施例中为了验证来源于诺丽提取物的平均分子量为8～10kDa的多糖体分馏物的解酒有效性，按照不同分子量尺寸分离10％乙醇诺丽果提取物内多糖体来确认到它们的ADH分解能力。其结果，如从图13中所确认，可确认来源于诺丽的多糖体，尤其尺寸为8～10kDa的多糖体为呈现最优秀的宿醉功效的有效成分。
因此，在本发明的组合物中，作为具有解酒功效的有效成分，上述诺丽果乙醇提取物及其纯化水分馏物包含平均分子量为8kDa至10kDa的多糖体作为主要组成。
本发明人为了在本发明的追加的具体的一实施例中确认包含平均分子量为8kDa至10kDa的多糖体作为主要组成的10％乙醇诺丽果提取物的生物体内(in vivo)解酒功效，按照图14的试样给药时间表将诺丽果乙醇提取物和酒精(乙醇)给药之后，测定随着时间的经过的血液乙醇浓度、血液乙醛浓度、肝脏中的ADH及ALDH活性。
其结果，如图15至图17所示，确认到诺丽果乙醇提取物给药组中血液乙醇浓度(图15)及血液乙醛浓度(图16)以浓度依赖性的方式显著减少，肝组织中的ADH及ALDH活性(图17)增加。
因此，本发明的包含平均分子量为8kDa至10kDa的多糖体作为主要组成的诺丽果提取物及其分馏物通过增进ADH和/或ALDH活性有效去除宿醉原因物质，可改善呕吐、恶心、眩晕、口渴、乏力、头痛、肌肉痛、记忆中断、烧心等宿醉现象。
本发明的第二实施方式涉及利用上述的解酒用组合物的食品组合物。
本发明的食品组合物可理解为均包含通常的功能性食品或保健食品的概念。
上述保健食品(functional food)是指与特定保健用食品(food for specialhealth use，FoSHU)相同的术语，意味着除了营养供给之外，加工成有效呈现生物调节功能的医学、医疗效果高的食品。其中，“功能(性)”意味着得到对针对人体的结构及功能调节营养素或生理学作用等之类的保健用途有用的效果。本发明的食品可通过该领域中通常使用的方法制备，当上述制备时，可添加该领域中通常添加的原料及成分来制备。并且，作为上述食品的剂型，只要是被认定为食品的剂型，就可以不受限制地制备。本发明的保健食品组合物能够以多种形态的剂型制备，与通常药品不同，将食品作为原料，具有当长期服用药品时，无副作用等的优点。
本发明的保健食品以改善宿醉为目的可包含相比于总重量的1.0至10.0重量百分比的诺丽果乙醇提取物和/或其分馏物。当诺丽果乙醇提取物和/或其分馏物小于1.0重量百分比时，有可能无法充分实现宿醉的改善效果，当大于10.0重量百分比时，产品本来的质量有可能无法实现或费用效率下降。
上述功能性食品可包含通常的食品添加物，除非有其他规定，上述食品添加物可根据食品的药品安全处批准的食品添加物规范的总则及一般试验法等依据该品种相关规格及基准判断是否适合。
作为记载于上述食品添加物规范的品种，例如可例举酮类、甘氨酸、柠檬酸钾、烟酸、肉桂酸等化学合成物、柿子色、甘草提取物、结晶纤维素、高粱色素、瓜尔胶等天然添加物、L-谷氨酸钠制剂、面类添加碱剂、保鲜料制剂、焦油色素制剂等混合制剂类。
本发明的保健食品组合物包括片剂、颗粒、粉末、胶囊、液态溶液和/或丸等形态，可添加本发明的组合物的食品例如有各种食品类，例如饮料、口香糖、茶、维生素复合剂、保健补品类等。
具体地，上述片剂形态的功能性食品能够以常规方法将诺丽果乙醇提取物和/或其分馏物、赋形剂、结合剂、崩解剂及与其他添加剂的混合物颗粒化之后，放入润滑剂等进行压缩成型，或直接压缩成型上述混合物来制备。并且，上述片剂形态的功能性食品可根据需要包含矫味剂等，可根据需要利用适当的去皮剂去皮。
上述胶囊形态的功能性食品中硬胶囊剂可在通常的硬胶囊中填充茄子提取物及与赋形剂等添加剂的混合物或其粒状物或去皮的粒状物来制备，软胶囊剂可将诺丽果乙醇提取物和/或其分馏物及与赋形剂等添加剂的混合物填充于明胶等胶囊基剂来制备。
上述软胶囊剂可根据需要包含甘油或山梨糖醇等增塑剂、着色剂、保鲜剂等。
上述丸形态的功能性食品能够以适当的方法将诺丽果乙醇提取物和/或其分馏物、赋形剂、结合剂、崩解剂等的混合物成型来调配，可根据需要以白糖或其他适当的去皮剂进行去皮，或利用淀粉、滑石或适当的物质进行丸衣。
上述颗粒形态的功能性食品能够以适当的方法将诺丽果乙醇提取物和/或其分馏物、赋形剂、结合剂、崩解剂等的混合物制备成粒状，可根据需要包含着香剂、矫味剂等。
并且，对上述赋形剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂、着香剂等的术语定义记载于该领域中公知的文献中，可包含其功能等相同至类似的。
除了作为可包含在本发明的保健食品组合物的必要成分含有上述诺丽果乙醇提取物或其分馏物之外，其他成分不受特别限制，如同通常的食品，可包含多种生药提取物、食品辅助添加剂或天然碳水化合物等作为追加成分。
并且，上述食品辅助添加剂包含该领域中通常的食品辅助添加剂，例如调味剂、风味剂、着色剂、填充剂、稳定剂等。
上述天然碳水化合物的例为单糖，例如葡萄糖、果糖等；二糖，例如麦芽糖、蔗糖等；以及多糖，例如糊精、环糊精等之类的通常的糖及木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等糖醇。除了上述内容之外，作为调味剂，可有利地使用天然调味剂(例如莱苞迪甙A、甘草甜素等)及合成调味剂(糖精、阿斯巴甜等)。
除了上述内容之外，本发明的保健食品组合物可包含多种营养剂、维生素、矿物(电解质)、合成风味剂及天然风味剂等风味剂、着色剂及填充剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增粘剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精、用于碳酸饮料的碳酸化剂等。此外，可包含用于制备天然果汁及果汁饮料及蔬菜饮料的果肉。这种成分可独立或组合使用。
本发明的第三实施方式涉及解酒方法，在该解酒方法中，以有效量将包含来源于诺丽果提取物的平均分子量为8kDa至10kDa的多糖体或含有上述多糖体的诺丽果提取物或其分馏物的组合物给药到需要其的个体中。
在本发明的解酒方法中，包含来源于上述诺丽果提取物的平均分子量为8kDa至10kDa的多糖体或含有上述多糖体的诺丽果提取物或其分馏物的组合物的特性及效果的说明与上述内容相同，因而省略其记载。
本发明中使用的术语“给药”意味着以任意适当的方法向个体提供规定的本发明的组合物。
本发明的组合物的优选给药量根据个体的状态及体重、宿醉的程度、组合物的制剂形态等不同，但可为了实现所图的解酒效果适当地选择。
本发明中使用的术语“有效量”意味着通过增进ADH和/或ALD H活性来有效去除宿醉原因物质，充分减少呕吐、恶心、眩晕、口渴、乏力、头痛、肌肉痛、记忆中断、烧心等宿醉现象或完全消除的诺丽果提取物或其分馏物的量。为了优选效果，本发明的组合物可在饮酒前后或饮酒期间反复一次至多次来给药。
在本发明的解酒方法中，上述组合物能够以多种途径给药到个体中，优选地，可口服给药。并且，可为了解酒单独或与其他方法并用。
本发明的第四实施方式涉及当制备用于解酒的药剂或食品时，包含来源于诺丽果提取物的平均分子量为8kDa至10kDa的多糖体或含有上述多糖体的诺丽果提取物或其分馏物的组合物的用途。
同样，在本发明的用途中，包含来源于上述诺丽果提取物的平均分子量为8kDa至10kDa的多糖体或含有上述多糖体的诺丽果提取物或其分馏物的组合物的特性及效果的说明与上述内容相同，因而省略其记载。
以下，通过实施例更详细说明本发明。这些实施例仅用于例示本发明，不被解释为本发明的范围局限于这些实施例，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。
制备例1
利用10(v/v)％乙醇的诺丽果提取物的制备
确认及筛选经加工及干燥的诺丽果中是否有混入的异物等之后，为了提高提取效率，以40至100目(mesh)粉碎干燥的诺丽果。将相对于粉碎的粉碎物的重量10倍数的10(v/v)％乙醇放入提取器之后，慢慢投入作为原料的干燥的诺丽果粉碎物。原料投入结束之后，在80℃温度中，搅拌提取4小时。之后使用沃特曼(Whatman)No.4纸过滤器滤纸进行过滤。针对过滤结束的提取液在60～70℃中经过减压浓缩过程制备浓缩液之后进行冷冻干燥，以制备成粉末形态。
制备例2
10(v/v)％乙醇诺丽果提取物的分馏物的制备
将在60～70℃中减压浓缩制备例1的10(v/v)％乙醇提取物的10～20Brix浓缩液投入于填充有HP-20树脂的开放柱中，作为溶出液，以纯化水、30％乙醇及70％乙醇条件按照各个不同划分进行分馏及纯化。
比较例1
成熟诺丽果汁原液的准备
从网上得到6.5Brix以上的产自印度尼西亚的发酵成熟诺丽原液(UD.Herbali，进口商爱赫斯(Asher))来使用。
比较例2
利用热水的诺丽果提取物的制备
除了将热水用作提取溶剂之外，以与上述制备例1相同的方法制备诺丽果提取物。
比较例3
利用30(w/w)％乙醇的诺丽果提取物的制备
除了将30(w/w)％乙醇用作提取溶剂之外，以与上述制备例1相同的方法制备诺丽果提取物。
比较例4
30(w/w)％乙醇诺丽果提取物的分馏物的制备
将在60～70℃中减压浓缩制备例2的30(w/w)％乙醇提取物的10～20Brix浓缩液投入于填充有HP-20树脂的开放柱中，作为溶出液，使用纯化水进行分馏及纯化。
比较例5
利用50(v/v)％乙醇的诺丽果提取物的制备
除了将50(v/v)％乙醇用作提取溶剂之外，以与上述制备例1相同的方法制备诺丽果提取物。
比较例6
利用70(v/v)％乙醇的诺丽果提取物的制备
除了将70(v/v)％乙醇用作提取溶剂之外，以与上述制备例1相同的方法制备诺丽果提取物。
比较例7
利用95(v/v)％乙醇的诺丽果提取物的制备
除了将95(v/v)％乙醇用作提取溶剂之外，以与上述制备例1相同的方法制备诺丽果提取物。
比较例8
枳根果实提取物的准备
从(株)SaeRom B&F得到枳根果实提取粉末SR-23853来使用。该产品中以80：20包含枳根果实浓缩液(固体成分11％)：糊精。
将制备例1至制备例2及比较例1至比较例8中获取的物质整理于表1中来表示。
表1
实施例1
诺丽提取物内有效成分的确认
本发明人确认诺丽提取物内多种成分中呈现解酒功效的实质性的有效成分，试图制备提高其含量的提取物。据公知，诺丽中含有包含多种多酚类化合物在内的环烯醚萜、芦丁、莨菪亭等，因而本实施例中评价从诺丽分离的个别成分的ADH活性。
1-1.多酚类化合物的酒精分解能力的测定
为此，测定作为被发现包含在诺丽中的多酚类化合物的绿原酸(chlorogenicacid)、对甲氧基苯甲酸(p-anisic acid)、没食子酸(gall ic acid)、表儿茶素(epicatechin)、咖啡酸(caffeic acid)及4-羟基苯甲酸(4-hydroxybenzoic acid)的乙醇脱氢酶(Alcohol Dehydrogena se，ADH)活性增进功效。
ADH活性参考文献[Bergmeyer，H.U.1974.Methods of enzyma ticanalysis.Academic Press，New York.pp.28]根据其提出的方法测定。所有试样以10μM处理，将未处理试样的对照组(CTL)的活性为100％基准，由相对于对照组的相对活性(％)表示各个试样的ADH活性。
其结果，如从图1中所确认，所有试样的ADH活性未呈现相对于对照组的增加，由此可知诺丽的多种多酚类化合物并非是呈现解酒功效的实质性的有效成分。
1-2.芦T、莨菪亭及环烯醚萜的酒精分解能力的测定
以与实施例1-1相同的方法测定作为被发现包含在诺丽中的芦丁、莨菪亭及三种环烯醚萜化合物的去乙酰基车叶草苷酸(Deacetylasperul osidic acid，DAA)、车叶草苷酸(Asperulosidic acid，ASPA)及车叶草苷(Asperuloside，ASP)的ADH活性增进功效。所有试样以10μM处理，将未处理试样的对照组(CTL)的活性作为100％基准，由相对于对照组的相对活性(％)表示各个试样的ADH活性。
其结果，如从图2中所确认，芦丁、莨菪亭及三种环烯醚萜化合物全部未呈现相对于对照组的ADH活性增加，由此可知诺丽的芦丁、莨菪亭及三种环烯醚萜化合物也并非是呈现解酒功效的实质性的有效成分。
实施例2
诺丽果提取物的酒精分解能力的测定
通过确认被发现包含在诺丽果中的多种个别成分不影响酒精分解，本实施例中将诺丽果制备成多种提取物形态，确认到对于各个提取物的ADH活性增进功效。
为此，本实施例中以与实施例1-1相同的方法测定上述制备例1及比较例2、比较例3及比较例5至比较例7中制备的各个提取物的ADH活性增进功效，所有试样以100μg/ml、200μ/ml处理，将未添加诺丽果提取物的组作为对照组(CTL)，试样的ADH的活性由相对于对照组的相对活性(％)表示。
其结果，如从图3中所确认，ADH活性按照诺丽果热水提取物<50(v/v)％乙醇诺丽果提取物<30(w/w)％乙醇诺丽果提取物<10(v/v)％乙醇诺丽果提取物的顺序呈现高。
实施例3
对于10(v/v)％乙醇诺丽果提取物的分馏物的酒精分解能力的测定及其有效成分的确认
3-2.对10(v/v)％乙醇诺丽果提取物的分馏物的酒精分解能力的测定
为了在呈现最优秀的ADH活性的制备例1的10(v/v)％乙醇诺丽果提取物中确认明确的有效成分，与上述制备例2相同地追加制备分馏物来筛选。
分别对10(v/v)％乙醇诺丽果提取物的纯化水分馏物(fractionat ion)、30％乙醇分馏物及70％乙醇分馏物的酒精分解能力与实施例1-1相同地测定ADH活性来评价，作为追加比较组，一同评价比较例1的产自印度尼西亚的成熟诺丽果汁的ADH活性。所有试样以100μg/ml处理。
其结果，如从图4中所确认，10(v/v)％乙醇诺丽果提取物的纯化水分馏物中呈现最高的ADH活性，确认到ADH活性上升因子包含在大部分纯化水分馏物。
3-2.对10(v/v)％乙醇诺丽果提取物的纯化水分馏物的GPC分析
为了在大部分确认到ADH活性增进功效的纯化水分馏物中确认实质性地呈现功效的物质，进行凝胶渗透色谱(GPC，Gel Permeation Chromatography)分析。表2中表示分析条件。
表2
将用作标准物质的普鲁兰(安捷伦普鲁兰多糖试剂盒，PL2090-0101)及10(v/v)％乙醇诺丽果提取物的纯化水分馏物的GPC结果分别示于图5a及图5b中。如从图5a及图5b中所确认，确认到纯化水分馏物内包含平均分子量为8～10kDa的多糖体，这些多糖体为增进AD H活性的实质性的有效成分。
实施例4
30(w/w)％乙醇诺丽果提取物的组成成分的确认
为了确认图2中确认的制备例1的10(v/v)％乙醇诺丽果提取物和比较例3的30(w/w)％乙醇诺丽果提取物的功效差异是否由主要组成成分的差异引起，以与实施例3-2相同的方法对30(w/w)％乙醇诺丽果提取物的纯化水分馏物执行GPC分析。30(w/w)％乙醇诺丽果提取物的纯化水分馏物如比较例4中所记载。
将用作标准物质的普鲁兰(安捷伦普鲁兰多糖试剂盒，PL2090-0101)及30(w/w)％乙醇诺丽果提取物的纯化水分馏物的GPC结果分别示于图6a及图6b中。如图6a及图6b所示，确认到30(w/w)％乙醇诺丽果提取物的纯化水分馏物内主要包含平均分子量为10kDa以上的多糖体。
比较图5a至图5b及图6a至图6b的结果，确认10(v/v)％乙醇诺丽果提取物的主要组成成分为平均分子量为8～10kDa的多糖体，相反，30(w/w)％乙醇诺丽果提取物的主要组成成分为平均分子量为10kDa以上的多糖体，判断ADH活性增进功效根据多糖体的平均分子量不同。
实施例5
成熟诺丽果汁原液的组成成分的确认
为了确认图4中确认的制备例1的10(v/v)％乙醇诺丽果提取物和比较例1的成熟诺丽果汁原液的功效差异是否由主要组成成分的差异引起，同样以与实施例3-2相同的方法对成熟诺丽果汁原液执行GPC分析。
将用作标准物质的普鲁兰(安捷伦普鲁兰多糖试剂盒，PL2090-0101)及成熟诺丽果汁原液的GPC结果分别示于图8a及图8b中。如图8a及图8b所示，诺丽果汁原液中主要包含平均分子量为1.0kDa的多糖体。
若比较图5a至图5b、图6a至图6b及图8a至图8b的结果，则确认10(v/v)％乙醇诺丽果提取物的主要组成成分为平均分子量为8～10kDa的多糖体，30(w/w)％乙醇诺丽果提取物的主要组成成分为平均分子量为10kDa以上的多糖体，相反，诺丽果汁原液的主要组成成分为平均分子量为1.0kDa的多糖体，确认到与ADH活性增进功效根据多糖体的平均分子量明显不同的实施例3的结果相一致。
实施例6
包含多种平均分子量的多糖体的诺丽提取物或分馏物的酒精分解能力的测定
通过实施例4及实施例5的结果，可知在诺丽提取物内呈现解酒功效的主要有效成分为多糖体，但酒精分解能力根据多糖体的平均分子量明显不同。由此，本实施例中制备以高浓度包含多糖体的多种形态的诺丽提取物或分馏物，确认它们的酒精分解能力及多糖体的平均分子量。
6-1.成熟诺丽果汁原液的粗多糖体的制备
以95％乙醇在4℃中使比较例1的成熟诺丽果汁原液沉淀12小时来制备成熟诺丽果汁粗多糖体。
6-2.成熟诺丽果汁原液的粗多糖体的酒精分解能力的测定
为了测定实施例6-1中制备的成熟诺丽果汁原液的粗多糖体的酒精分解能力，以与实施例1-1相同的方法测定ADH活性，作为比较组，一同评价制备例1的10(v/v)％乙醇诺丽果提取物、制备例2的10(v/v)％乙醇诺丽果提取物的纯化水分馏物及比较例1的产自印度尼西亚的成熟诺丽果汁的ADH活性。
如从图7a中所确认，10(v/v)％乙醇诺丽果提取物及其纯化水分馏物呈现相比于相同容量的诺丽果汁高5～7倍、相比于诺丽果汁粗多糖体高约1.2～1.7倍的ADH活性。
6-3.10(v/v)％乙醇诺丽果提取物的水饱和丁醇分馏物的制备
将在60～70℃中减压浓缩制备例1的10(v/v)％乙醇提取物的10～20Brix浓缩液放入分液漏斗之后，投入浓缩液体积的1～2倍的水饱和丁醇来剧烈摇晃进行混合，之后，静置约30分钟使两种溶剂分离。之后将仅单独分离/浓缩分离成两层的溶剂中溶解有多糖体的上层的水饱和丁醇的物质作为分馏物。
6-4.10(v/v)％乙醇诺丽果提取物的水饱和丁醇分馏物的酒精分解能力的测定
为了测定实施例6-3中制备的乙醇10(v/v)％诺丽果提取物的水饱和丁醇分馏物的酒精分解能力，以与实施例1-1相同的方法测定ADH活性，作为比较组，一同评价制备例1的10(v/v)％乙醇诺丽果提取物的纯化水分馏物及制备例2的10(v/v)％乙醇诺丽果提取物的纯化水分馏物的ADH活性。
如从图7b中所确认，水饱和丁醇分馏物呈现明显低于10(v/v)％乙醇提取物及其纯化水分馏物的ADH活性。
6-5.组成成分的确认
为了确认实施例6-1中制备的成熟诺丽果汁原液的粗多糖体及实施例6-3中制备的乙醇10(v/v)％诺丽果提取物的水饱和丁醇分馏物的主要组成成分，以与实施例3-2相同的方法执行GPC分析。对标准物质的GPC分析结果为图8a。
根据GPC分析结果，如从图8c中所确认，成熟诺丽果汁原液的粗多糖体中主要包含平均分子量为13.2kDa的多糖体，如从图8d中所确认，水饱和分馏物中主要包含平均分子量为1.1kDa的多糖体。通过如上所述的结果，判断相比于其他平均分子量，平均分子量为8～10kDa的多糖体呈现优秀的酒精分解能力。
实施例7
来源于诺丽提取物的平均分子量为8～10kDa的多糖体分馏物的解酒有效性的确认
7-1.不同多糖体分子量尺寸分馏物的分离
综合实施例1至实施例6的结果，本发明人判断诺丽内多种成分中多糖体影响解酒功效，但功效可根据多糖体的平均分子量明显不同，尤其判断平均分子量为8～10kDa的多糖体对酒精分解呈现卓越的功效。
考虑到这种实验结果，本发明人按照不同分子量尺寸分离10(v/v)％乙醇诺丽果提取物内多糖体，确认各个分馏物的酒精分解能力。
为此，如图9所示，将在60～70℃中减压浓缩10(v/v)％乙醇提取物的10～20Brix浓缩液投入于填充有HP-20树脂的开放柱中，作为溶出液，使用纯化水以50ml的方式进行分馏。如图10所示，以不同Brix及性状差异为基准将获取的共10个分馏物进行分组来冷冻干燥。分组为4个的分馏物的详细说明如表3所示。
表3
为了确认包含在各个试样的多糖体的平均分子量，以表4的条件执行GPC，图11a表示用作标准物质的普鲁兰(安捷伦普鲁兰多糖试剂盒，PL2090-0101)的GPC结果和校准曲线，图11b至图11e中按照表3的4个试样表示GPC结果，图12中比较包含在4个试样(分馏1至分馏4)的多糖体的平均分子量和葡聚糖来表示。
表4
如从图11b至图11e及图12中所确认，确认到从分馏1越到分馏4，包含在分馏物内的多糖体的平均分子量越减少，分馏3中包含平均分子量为8.4kDa的多糖体。
7-2.不同多糖体分子量尺寸的酒精分解能力的测定
针对表3的4个试样以与实施例1-1相同的方法测定ADH活性。
如从图13中所确认，包含平均分子量为8～10kDa的多糖体的分馏3中呈现最高的ADH活性。因此，可确认诺丽提取物的多糖体中呈现最优秀的解酒功效的成分为8～10kDa的多糖体。
实施例8
诺丽提取物内平均分子量为8～10kDa的多糖体的解酒效果特异性的确认
为了确认平均分子量为8～10kDa的所有多糖体是否呈现优秀的解酒功效，将被熟知平均分子量为9～11kDa的葡聚糖作为比较组以与实施例1-1相同的方法测定ADH活性。将葡聚糖的ADH活性示于图13中，将可确认葡聚糖的平均分子量的GPC结果示于图11f中。对于标准物质的GPC分析结果为图11a。
如从图13中所确认，可确认即使多糖体的尺寸接近于8～10kDa，并不是所有多糖体中呈现解酒功效，来源于诺丽的多糖体，尤其尺寸为8～10kDa的多糖体为呈现最优秀的宿醉功效的有效成分。
实施例9
生物体内(in vivo)中的诺丽果提取物及其分馏物的解酒能力的确认
本实施例中将生物体外(in vitro)实验中包含呈现最优秀的ADH活性的平均分子量为8～10kDa的多糖体的10(v/v)％乙醇诺丽果提取物作为对象评价生物体内(in vivo)中的解酒能力。
9-1.实验设计
使5周龄的SD大鼠(从(株)DooYeol Biotech购买)经过一周的检疫及适应过程之后，随机分配10只给各个组，如下列表5所示地处理试样。
表5
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将试样的给药时间表示于图14中。具体地，诺丽果提取物给药组+酒精给药组中分别以50mg及100mg将制备例1的10(v/v)％乙醇诺丽果提取物进行口服给药，30分钟之后将酒精(40％发酵乙醇，3g/kg)进行口服给药。按照相同的给药时间表枳根果实提取物+酒精给药组中将比较例8的包含糊精的枳根果实提取物250mg进行口服给药。酒精给药之后，分别在第一个小时、第三个小时及第五个小时从各个组的大鼠中采集血液。
9-2.血液酒精及乙醛浓度的测定
分别以如下的方法测定实施例8-1中采集的血液中血液酒精及乙醛的浓度。
首先从血液中分离血清之后，使用乙醇测定试剂盒(Abcam)根据制造商提出的方法测定血清内的乙醇浓度。使用分析缓冲液(assay buffer)适当地稀释血清来采集0.05ml之后，添加反应混合物调配物质(reaction mix preparation)0.05ml来反应1小时，之后，在570nm中测定吸光度。利用使用乙醇标准溶液制定的标准曲线计算出血清内乙醇含量。并且，为了评价随着时间的血清乙醇浓度的关系，根据梯形法则(trapezoid rule)计算浓度-时间曲线下面积(Area under the cur ve，AUC)。
根据制造商提出的方法使用乙醛测定试剂盒(Megazyme)测定血清内乙醛浓度。在0.05ml血清中混合0.02ml缓冲液和0.02ml NAD+溶液反应2分钟之后，在340nm中测定吸光度(A1)。其中添加乙醇脱氢酶0.005ml之后反应4分钟，之后，在340nm中测定吸光度(A2)。以如下公式计算出血清内乙醛含量。
公式
C(g乙醛/L)＝(ΔA样品/ΔA标准)×g/L标准×F
ΔA样品＝样品(A2-A1)
ΔA标准＝标准(A2-A1)
F＝稀释因子
并且，为了评价随着时间的血清乙醛浓度的关系，计算浓度-时间曲线下面积(AUC)。
其结果，如图15及图16所示，确认到诺丽果提取物给药组+酒精给药组中血液乙醇及乙醛浓度与诺丽果提取物的浓度依赖性地显著减少。并且，尽管诺丽果提取物给药组+酒精给药组相比于枳根果实提取物+酒精给药组，试样的给药量少，血液酒精及乙醛减少效果呈现更优秀。
9-3.乙醇脱氢酶及醛脱氢酶活性的测定
图14的给药时间表中酒精给药之后在第五个小时牺牲大鼠来摘除肝组织。在摘除的肝组织内分别测定乙醇脱氢酶(ADH)及醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase，ALDH)的活性。
与实施例1-1相同地测定ADH活性，ALDH活性使用醛脱氢酶活性比色分析试剂盒(A1dehyde dehydrogenase activity colorimetric ass ay kit)(BioVision)根据协议测定。
如从图17中所确认，肝组织内ADH及ALDH活性与诺丽提取物的处理浓度依赖性地增加。同样，尽管诺丽果提取物给药组+酒精给药组相比于枳根果实提取物+酒精给药组，试样的给药量少，ADH及ALDH活性增进效果呈现更优秀。
由此，确认到包含平均分子量为8～10kDa的多糖体作为主要组成的10(v/v)％乙醇诺丽果提取物整体作用于体内酒精分解代谢，呈现卓越的解酒能力。
上述的本发明的说明用于例示，本发明所属技术领域的普通技术人员可理解可在不变更本发明的技术思想或必要特征的情况下以其他具体的形态容易变形。因而应当理解以上描述的实施例在所有方面是例示性的，而非限定。
Claims (16)
1.一种解酒用组合物，其特征在于，包含：
多糖体，来源于诺丽果提取物，平均分子量为8kDa至10kDa；或者
诺丽果提取物或其分馏物，包含平均分子量为8kDa至10kDa的多糖体。
2.根据权利要求1所述的解酒用组合物，其特征在于，上述诺丽果提取物以10％乙醇提取。
3.根据权利要求1所述的解酒用组合物，其特征在于，上述分馏物为以10％乙醇提取的诺丽果提取物的纯化水分馏物。
4.根据权利要求1所述的解酒用组合物，其特征在于，上述解酒用组合物呈现如下的(a)至(d)的效果：
(a)增进乙醇脱氢酶的活性；
(b)增进醛脱氢酶的活性；
(c)减少血液酒精浓度；以及
(d)减少血液乙醛浓度。
5.一种解酒用食品组合物，其特征在于，包含权利要求1至4中任一项所述的解酒用组合物。
6.根据权利要求5所述的解酒用食品组合物，其特征在于，上述解酒用食品组合物为保健食品组合物。
7.一种解酒方法，其特征在于，以有效量将包含来源于诺丽果提取物的平均分子量为8kDa至10kDa的多糖体或含有上述多糖体的诺丽果提取物或其分馏物的组合物给药到需要其的个体中。
8.根据权利要求7所述的解酒方法，其特征在于，上述诺丽果提取物以10％乙醇提取。
9.根据权利要求7所述的解酒方法，其特征在于，上述分馏物为以10％乙醇提取的诺丽果提取物的纯化水分馏物。
10.根据权利要求7所述的解酒方法，其特征在于，上述组合物呈现如下的(a)至(d)的效果：
(a)增进乙醇脱氢酶的活性；
(b)增进醛脱氢酶的活性；
(c)减少血液酒精浓度；以及
(d)减少血液乙醛浓度。
11.根据权利要求7所述的解酒方法，其特征在于，上述组合物为食品组合物或保健食品组合物。
12.一种组合物的用途，其特征在于，当制备用于解酒的药剂或食品时，上述组合物包含来源于诺丽果提取物的平均分子量为8kDa至10kDa的多糖体或含有上述多糖体的诺丽果提取物或其分馏物。
13.根据权利要求12所述的组合物的用途，其特征在于，上述诺丽果提取物以10％乙醇提取。
14.根据权利要求12所述的组合物的用途，其特征在于，上述分馏物为以10％乙醇提取的诺丽果提取物的纯化水分馏物。
15.根据权利要求12所述的组合物的用途，其特征在于，上述组合物呈现如下的(a)至(d)的效果：
(a)增进乙醇脱氢酶的活性；
(b)增进醛脱氢酶的活性；
(c)减少血液酒精浓度；以及
(d)减少血液乙醛浓度。
16.根据权利要求12所述的组合物的用途，其特征在于，上述食品为保健食品。
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-
2021
- 2021-11-17 CN CN202180077537.6A patent/CN116528690A/zh active Pending
Patent Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN103340457A (zh) * | 2013-07-15 | 2013-10-09 | 镇江丹和醋业有限公司 | 一种具有解酒功能的醋饮料 |
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|---|
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