ES2241219T3

ES2241219T3 - Nuevo polisacarido inmunoestimulante procedente de la cepa de la especie phellinus, y su uso.

Info

Publication number: ES2241219T3
Application number: ES99120033T
Authority: ES
Inventors: Ick-Dong Yoo; Soo-Muk Cho; Byeung-Wook Park; Jae-Kuk Yoo; Nam-Doo Hong; Hwan-Mook Kim; Sang-Bae Han; Chang-Woo Lee
Original assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST; Korea Institute of Science and Technology KIST
Current assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST; Korea Institute of Science and Technology KIST
Priority date: 1998-04-30
Filing date: 1999-10-18
Publication date: 2005-10-16
Anticipated expiration: 2019-10-18
Also published as: JPH11318432A; HK1036823A1; EP1096022A1; EP1096022B1; PT1096022E; JP3093194B2

Abstract

Es un objeto de la presente invención proporcionar una cepa de la especie Phellinus que produce un nuevo polisacárido de actividad inmunoestimulante. Es otro objeto de la presente invención proporcionar un nuevo polisacárido que muestra una potente actividad inmunoestimulante frente a enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario. Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar el uso del polisacárido como un agente de inmunoterapia o en el estudio del mecanismo básico de las enfermedades. Para lograr estos objetos, primeramente se cultivaron diversas cepas de la especie Phellinus, y se les aisló el ADN total mediante un método de SDS-fenol. Del ADN total, sólo se obtuvo el ADN mitocondrial. El ADN mitocondrial se digirió con enzimas de restricción BamHI, ClaI, EcoRI y PvuII, seguido de la electroforesis en un gel de agarosa. La filogenia de ADN, entre las cepas de Phellinus, se analizó según el método de Nei y Li (1979). A partir de los datos analíticos se encontró unanueva cepa que forma una nueva filogenia con otras cepas. Esta cepa se denominó Phellinus linteus Yoo, y se depositó en la Colección Coreana para Cultivos Tipo, Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology, el 17 de Noviembre de 1997 (número de depósito KCTC 0399BP). Se realizó una investigación de las características microbiológicas de la cepa KCTC 0399BP. Se aisló un nuevo polisacárido, y se purificó a partir de los cuerpos fructíferos y de los micelios de la nueva cepa, y se estudió para determinar la actividad inmunoestimulante. El polisacárido inmunoestimulante se analizó para determinar sus unidades de azúcares y su composición, seguido del análisis estructural del componente de hidratos de carbono. De forma similar, para comparación, se cultivaron otras diversas cepas de la especie Phellinus, y sus cuerpos fructíferos y micelios se sometieron a aislamiento y purificación para dar polisacáridos que también tenían actividad inmunoestimulante.

Description

Nuevo polisacárido inmunoestimulante procedente de la cepa de la especie Phellinus, y su uso.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a una cepa que pertenece al género Phellinus, un galactomanoglucano inmunoestimulante producido a partir de la cepa, y al uso del polisacárido que se produce a partir de dicha cepa. Más particularmente, la presente invención se refiere a una nueva cepa de la especie Phellinus, que produce un polisacárido inmunoestimulante, y al uso del polisacárido en el tratamiento de profilaxis de enfermedades relacionadas con la inmunidad, tales como cánceres y SIDA, y en su estudio del mecanismo.

2. Descripción de la técnica anterior

Las setas, un tipo de hongos superiores, son heterotróficas; toman nutrientes orgánicos procedentes del exterior a través de hifas estructuradas microscópicamente. En la biosfera, desempeñan un papel como un agente de descomposición que degrada materiales orgánicos complejos en formas inorgánicas simples, y finalmente las devuelven a la naturaleza. Las setas pertenecen a los basidiomicetos que de modo característico forman basidios que tienen cada uno en su superficie cuatro basidiosporas exógenas al llegar a la madurez. Las setas se clasifican además en himenomicetos que liberan activamente esporas a partir de himenios expuestos. Los himenomicetos representativos son afiloforales y agaricales. Dentro de la categoría de afiloforales se encuentran Ramaria botrytis, Hymenochaete yasudai Imaz., Climancodon septentrionalis, Coriolus versicolor, y Canoderma applanatum, y dentro de la categoría de agaricales se encuentran Pleurotus ostreatus, Lentinus edodes, Schizophyllum commune, Tricholoma mastsutake, Amanits muscaria, y Coprinus comatus.

Desde tiempos pasados, es conocido en la fitoterapia oriental que muchas setas que pertenecen a afiloforales, un tipo de basidomicetos, son terapéuticamente activas frente a diversas enfermedades, especialmente tumores. En Corea, se han transmitido de generación en generación como fitoterapias o medicinas populares, y, entre las setas, particularmente la Phellinus linteus, que pertenece a la familia de poliporáceas, se ha considerado como un medicamento extremadamente precioso. Sin embargo, la Phellinus linteus es una especie muy rara en la naturaleza, de forma que su cuerpo fructífero es muy difícil de obtener. Además, el aislamiento y cultivo artificial del micelio de Phellinus linteus se consideran casi imposible. En consecuencia, no se ha tomado activamente ventaja de Phellinus linteus a pesar de estar reconocido como un agente terapéuticamente muy eficaz contra tumores.

Para tratar cánceres, se usan convencionalmente diversos métodos que incluyen quimioterapia, radioterapia y cirugía. Aunque estas terapias son eficaces para un cáncer sólido, son insuficientes para la conquista perfecta de los cánceres. En particular, no son útiles para tumores metastásicos.

Habitualmente, la quimioterapia que usa agentes anticancerosos, tales como adriamicina, y la radioterapia provocan serios efectos secundarios. A fin de atenuar los efectos secundarios, tal agente anticanceroso se administraba a una dosis reducida. En este caso, sin embargo, el efecto terapéutico del compuesto químico es muy bajo. Lo que es peor, no se puede evitar la metástasis del cáncer, incluso después de recibir quimioterapia en el tratamiento de cánceres. De este modo, la quimioterapia convencional es eficaz hasta cierto grado frente al crecimiento de cánceres, pero no puede curar completamente los cánceres.

Un método alternativo es utilizar inmunosupresores, conocido como inmunoterapia. Los ejemplos representativos de los inmunosupresores son citoquinas, tales como interleuquina-2, factores de necrosis tumoral, etc. La interleuquina-2 muestra efectos terapéuticos superiores, particularmente para la metástasis del cáncer. Cuando se aplica al cuerpo humano, es necesario usar interleuquina-2 en una gran cantidad de forma que provoca efectos secundarios serios. La investigación reciente de sustancias inmunoestimulantes nuevas, que no sean citoquinas y que muestren una excelente actividad frente al cáncer, sin efecto secundario, ha dado como resultado el desarrollo de Lentinan y OK-432.

Durante los últimos años recientes ha ganado fuerza una nueva tecnología en la que se usa la quimioterapia en combinación con la inmunoterapia, conocida como inmunoquimioterapia. Por ejemplo, se coadministran la adriamicina y los inmunopotenciadores a los pacientes que sufren cáncer, con el objeto de potenciar los efectos anticancerosos a la vez que reducir los efectos secundarios del producto químico.

Que se sepa, hasta ahora no se ha dado a conocer ningún estudio sobre las características microbiológicas y genéticas de las cepas de la especie Phellinus. Los microorganismos, incluso de la misma especie, pueden ser significativamente diferentes entre sí en los tipos y cantidades de materiales que producen, y pueden mostrar una gran diversidad en condiciones de cultivo, estabilidad de la cepa, y frecuencia de la variación genética. El primer paso a dar en la investigación de los hongos Phellinus, con respecto a sus productos valiosos, es seleccionar las cepas que pueden producir una gran cantidad de los productos y que se pueden cultivar en caldos, además de tener una variación genética baja. Las cepas de Phellinus linteus son muy diversas y tienen morfología modificada según se observa con un microscopio, de forma que son difíciles de identificar. Sin embargo, su clasificación ha dependido prácticamente de la discriminación morfológica bajo un microscopio.

Recientemente, se han desarrollado nuevos métodos de análisis de ADN para la investigación en genética y filogenética de poblaciones. Con respecto a los métodos de análisis de fenotipos, los métodos de análisis del ADN tienen la ventaja de ser capaces de analizar genotipos en base a la tasa de evolución y a la tendencia hereditaria. La técnica de polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (en lo sucesivo denominada como "RFLP") permite deducir la mutación de secuencia de bases para analizar genotipos (Dowling et al. 1990, 1990. Nucleic acid II: Restriction site analysis. En: Molecular systematics, ed. por D. M. Hills y C. Moritz. P250-317. Sinauer Associates Press). Debido a que el ADN nuclear es demasiado grande para analizarlo fácilmente, habitualmente se utilizan genomas de orgánulos para el análisis de ADN (White y Densmore, 1992 Mitochondrial DNA isolation. En: Molecular genetic analysis of populations: A practical approach. Ed. por A. R. Hoelzel. P29-58. Oxford university press). Particularmente, se aprovecha el ADN mitocondrial. Generalmente, el ADN mitocondrial tiene un tamaño más pequeño y una tasa de cambio evolutivo más rápida que el ADN nuclear, y experimenta herencia haploide materna, de forma que el ADN mitocondrial se usa frecuentemente para el estudio de la estructura genética y de la historia de una población. Particularmente, el RFLP de ADN mitocondrial se utiliza para el estudio de mutación entre especies (Foster et al., 1988. Estimation of relatedness between Phythophothora species by analysis of mitochondrial DNA. Mycologia 80:466-478).

Sumario de la invención

Mediante la intensa y concienzuda investigación de cepas de la especie Phellinus, utilizando el método de análisis de ADN, se ha encontrado que un nuevo polisacárido que produce una cepa de Phellinus tiene una potente actividad inmunoestimulante.

Por lo tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar una cepa de la especie Phellinus que produce un nuevo polisacárido de actividad inmunoestimulante.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un nuevo polisacárido que muestra una potente actividad inmunoestimulante frente a enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar el uso del polisacárido como un agente de inmunoterapia o en el estudio del mecanismo básico de las enfermedades.

Para lograr estos objetos, primeramente se cultivaron diversas cepas de la especie Phellinus, y se les aisló el ADN total mediante un método de SDS-fenol. Del ADN total, sólo se obtuvo el ADN mitocondrial. El ADN mitocondrial se digirió con enzimas de restricción BamHI, ClaI, EcoRI y PvuII, seguido de la electroforesis en un gel de agarosa. La filogenia de ADN, entre las cepas de Phellinus, se analizó según el método de Nei y Li (1979). A partir de los datos analíticos se encontró una nueva cepa que forma una nueva filogenia con otras cepas. Esta cepa se denominó Phellinus linteus Yoo, y se depositó en la Colección Coreana para Cultivos Tipo, Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology, el 17 de Noviembre de 1997 (número de depósito KCTC 0399BP). Se realizó una investigación de las características microbiológicas de la cepa KCTC 0399BP. Se aisló un nuevo polisacárido, y se purificó a partir de los cuerpos fructíferos y de los micelios de la nueva cepa, y se estudió para determinar la actividad inmunoestimulante. El polisacárido inmunoestimulante se analizó para determinar sus unidades de azúcares y su composición, seguido del análisis estructural del componente de hidratos de carbono. De forma similar, para comparación, se cultivaron otras diversas cepas de la especie Phellinus, y sus cuerpos fructíferos y micelios se sometieron a aislamiento y purificación para dar polisacáridos que también tenían actividad inmunoestimulante.

Se realizaron ensayos con animales. Los polisacáridos inmunoestimulantes se administraron a ratones en los que se implantaron células cancerosas cutáneas, para medir su actividad anticancerosa. También, cuando se coadministraron con compuestos químicos, los polisacáridos se midieron para determinar su cambio en la actividad anticancerosa. Se estudió el efecto del polisacárido sobre el crecimiento de las células cancerosas humanas. Se administró el polisacárido a ratones a los que se les inyectó intravenosamente células cancerosas cutáneas en las colas, a fin de investigar su influencia sobre la metástasis del cáncer. En la presente invención, se encontró que la actividad anticancerosa del polisacárido era diferente de la de los compuestos químicos anticancerosos, en cuanto al mecanismo.

Breve descripción de los dibujos

Lo anterior y otros objetos y aspectos de la invención serán manifiestos a partir de la descripción siguiente de realizaciones haciendo referencia a los dibujos que se acompañan, en los que:

la Fig. 1 es un árbol filogenético que muestra la filogenia entre las cepas de la especie Phellinus;

la Fig. 2 es una gráfica que muestra las propiedades de cultivos de los micelios de Phellinus linteus;

la Fig. 3 es un procedimiento que muestra la purificación del polisacárido a partir de las cepas de Phellinus;

la Fig. 4 es un cromatografía de gases para las unidades de azúcares del polisacárido inmunoestimulante;

la Fig. 5 es un cromatograma en gel HW 65F para el polisacárido estimulante;

la Fig. 6 es un espectro de RMN de carbono para el polisacárido inmunoestimulante;

la Fig. 7 es una gráfica que muestra las afinidades anticancerosas del polisacárido frente a células cancerosas de ratón, según la manera de administración;

la Fig. 8a es una gráfica que muestra las actividades anticancerosas de una combinación del polisacárido y de adriamicina 0,1 mg/kg frente a células cancerosas de ratón;

la Fig. 8b es una gráfica que muestra las actividades anticancerosas de una combinación del polisacárido y de adriamicina 0,3 mg/kg frente a células cancerosas de ratón;

la Fig. 9a es una gráfica que muestra el cambio de las células cancerosas humanas según el tratamiento con el polisacárido y la adriamicina;

la Fig. 9b es una gráfica que muestra el peso final de las células cancerosas humanas según el tratamiento con el polisacárido y la adriamicina;

la Fig. 10a es una gráfica que muestra un efecto de prevención de la adriamicina sobre la metástasis del cáncer;

la Fig. 10b es una gráfica que muestra un efecto de prevención de una combinación del polisacárido y de la adriamicina sobre la metástasis del cáncer; y

la Fig. 11 es una gráfica que muestra la citotoxicidad de la adriamicina y del polisacárido.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

Se cultivan cada una de las 13 cepas de Phellinus, incluyendo la nueva Phellinus linteus Yoo KCTC 0399BP, en un agar con dextrosa de patata (PDA). Usando una técnica de SDS-fenol, se aísla un ADN total a partir de los micelios de cada uno de los cultivos, seguido del aislamiento adicional del ADN mitocondrial a partir del ADN total. Estos ADN mitocondriales son útiles para analizar la relación de conexión entre las cepas. Para este análisis, los ADN mitocondriales se digieren con enzimas de restricción, y los fragmentos de ADN digeridos se separan en un gel de agarosa mediante electroforesis. Las distancias a las que los fragmentos de ADN se mueven en el gel son los datos para calcular los valores de filogenia de los fragmentos de las enzimas de restricción (F), y para calcular los valores de la divergencia de secuencias (p). Basándose en los valores, se encontró una nueva cepa con una relación de conexión y se denominó "Phellinus linteus Yoo", y se depositó en la Colección Coreana para Cultivo Tipo, Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology el 17 de Noviembre de 1997 (número de depósito KCTC 0399BP). Un estudio de las características microbiológicas del cuerpo fructífero de Phellinus linteus Yoo KCTC 0399BP es útil en la proliferación de esta seta.

A fin de extraer la sustancia que se piensa que es terapéuticamente eficaz, la seta se cultiva y se hace proliferar. Una extracción con agua caliente da una nueva sustancia que demuestra ser un tipo de polisacárido, según se analiza mediante técnicas con fenol-ácido sulfúrico y Folín-fenol. Además, las características estructurales de este polisacárido se pueden revelar mediante una técnica de RMN.

Después de ser administrado a un animal, el polisacárido se ensaya para determinar la actividad inmunoestimulante contando el número y midiendo la proliferación de sus linfocitos. Para comparación, se lleva a cabo un procedimiento similar al realizado para Phellinus linteus Yoo, para otras cepas de Phellinus. Esto es, se realizan secuencialmente el cultivo de la cepa, la extracción del micelio y el aislamiento de la sustancia. Las sustancias aisladas se ensayan también para determinar la actividad inmunoestimulante. Además, los polisacáridos que se obtienen de los cuerpos fructíferos de las cepas Phellinus demuestran tener actividad inmunoestimulante.

A fin de ensayar la actividad del polisacárido contra el cáncer, se realizaron ensayos con animales. Primero se implantaron células cancerosas cutáneas derivadas de ratón a ratones a los que se les administra entonces el polisacárido y otros compuestos químicos, solos o en combinación. En cualquier caso, se comparan las viabilidades de los ratones. La actividad del polisacárido frente al cáncer humano se mide usando ratones atímicos en los que se implantan células cancerosas humanas. A los ratones atímicos se les administra, solos o en combinación, el polisacárido y la adriamicina. Además, el polisacárido es muy eficaz evitando la metástasis del cáncer. Para esto, se inyectaron intravenosamente células cancerosas cutáneas de ratón en las colas de los ratones, seguido de la administración del polisacárido y de la adriamicina. Se utiliza un método con sulforrodamina B para medir las células cancerosas cutáneas de ratón viables y las células cancerosas de pulmón humanas que se tratan previamente con el polisacárido y la adriamicina, solos o en combinación.

Se puede obtener una mejor comprensión de la presente invención a través de los siguientes ejemplos que se dan como ilustración de la presente invención. En los siguientes ejemplos, se usaron esplenocitos tomados de ratones B_{6}C_{3}F para la medida de la actividad inmunoestimulante de los polisacáridos aislados de Phellinus linteus Yoo y de otras cepas de la especie Phellinus. Primeramente, los esplenocitos se inmunizaron durante 2 días mediante tratamiento con las sustancias y con lipopolisacárido como control positivo. Los anticuerpos formados se midieron mediante un espectrofotómetro, y se consideraron como un patrón para la actividad inmunoestimulante. El efecto del polisacárido sobre la proliferación de células T se midió mediante una técnica de respuesta linfocitaria mixta. Para detectar la proliferación de linfocitos, se midió, usando ^{3}H-timidina, el ADN nuclear que se sintetizó recientemente en linfocitos.

Ejemplo I Cultivo de la Cepa de Phellinus

En la Tabla 1, a continuación, se dan las cepas de la especie Phellinus que se cultivaron cada una en un agar con dextrosa de patata (PDA), a una temperatura constante de 28ºC durante 5-12 días. Después de la inoculación en 450 ml
de un caldo de PD, cada una de las cepas se hizo crecer a 28ºC durante 12 días con agitación a 120 rpm.

TABLA 1 Especies Phellinus usadas y procedencias

Cepas	Origen
P. linteus WD1222	Japón
P. linteus ATCC 26410	USA
P. linteus KCTC 0399BP	Corea
P. linteus PL5	Corea
P. linteus PL4	Corea
P. linteus PLM	Corea
P. tremulae ATCC 32233	USA
P. johnsonianus ATCC 60051	USA
P. pini ATCC 12240	USA
P. tuberculosis ATCC 13271	USA
P. nigricans FP-71807-S	USA
P. chrysoloma HHB-3585-Sp	USA

Ejemplo II Aislamiento de ADN Total

Se utilizó un método con SDS-fenol para el aislamiento de ADN total a partir de los micelios. Cada uno de los micelios cultivados en el Ejemplo I se lavó con 20 mM de EDTA, se recolectó mediante filtración a vacío usando un papel de filtro (Whatman nº 1), se almacenó en un congelador intenso mantenido a -70ºC, y se sometió a liofilización. Los micelios liofilizados se molieron finamente, y se añadieron 2 g de cada uno de estos polvos con 20 ml de un tampón de extracción (0,2 M de Tris\cdotHCl, pH 8,5; 0,25 M de NaCl; 25 mM de EDTA; 0,5% (p/v) de SDS), y después con 14 ml de fenol y 6 ml de cloroformo. Después de mezclarla mediante agitación lenta, la disolución se centrifugó. El sobrenadante resultante se trató con 15 \mul de RNasa A (10 mg/ml) a 37ºC durante 30 minutos, y después adicionalmente con 15 \mul de proteinasa K (10 mg/ml) a 60ºC durante 15 minutos. Seguidamente, el sobrenadante tratado con la enzima se mezcló bien con un volumen igual de una mezcla de fenol, cloroformo y alcohol isoamílico (25:24:1), seguido de la centrifugación a 12.000 x g durante 30 minutos a 4ºC. Antes de repetir la misma centrifugación, el sobrenadante se mezcló bien con un volumen igual de una mezcla de cloroformo y alcohol isoamílico (24:1). El sobrenadante así obtenido se mezcló con 0,54 volúmenes de isopropanol sometiendo a remolino, y se centrifugó en las mismas condiciones que antes, para dar un pelete de ADN. Este pelete se lavó con etanol al 70%, y se secó en aire. El ADN se disolvió en 8 ml de un tampón de TE (10 mM de Tris\cdotHCl, 1 mM de EDTA, pH 8,0), y se almacenó a - 20ºC.

Ejemplo III Aislamiento de ADN Mitocondrial

Se llevó a cabo una ultracentrifugación para aislar el ADN mitocondrial a partir del ADN total obtenido de cada una de las cepas en el Ejemplo II. Después de mezclarla con 8,8 g de cloruro de cesio, comercialmente disponible de Sigma, U.S.A., y con 6 \mul de una disolución de bisbenzimida (10 mg/ml), la disolución de ADN total (8 ml) se ultracentrifugó a 40.000 x g durante 40 horas a 20ºC.

Después de la confirmación de dos bandas de ADN a la luz UV, sólo se recuperó la banda superior, esto es, una fracción de ADN mitocondrial, con la ayuda de una aguja de jeringuilla de calibre 21. La fracción de ADN mitocondrial así obtenida se añadió con un volumen igual de isopropanol saturado con CsCl, se mezcló mediante remolino débil, y se centrifugó a 1.200 x g a 4ºC. Esta etapa de lavado se repitió 6-7 veces para eliminar completamente la bisbenzimida de la fracción de ADN mitocondrial. La eliminación del cloruro de cesio se logró añadiendo etanol al 70% tres veces el volumen de la fracción de ADN mitocondrial, al ADN mitocondrial, y centrifugando a una velocidad de 100 x g a 4ºC durante 10 min. Esta etapa de lavado se repitió una vez más, para dar un ADN mitocondrial libre de bisbenzimida y de Cs. Después de secarlo en aire, el ADN mitocondrial se disolvió en un tampón de TE (pH 8,0), y se cuantificó a 260 nm con un espectrofotómetro, tal como el vendido por Beckman, U.S.A., con el nombre comercial de "Espectrómetro DU-64". El ADN mitocondrial se almacenó a -20ºC.

Ejemplo IV Digestión de los ADN Mitocondriales con Enzimas de Restricción

Las enzimas de restricción usadas en el ejemplo, así como los tampones para las mismas, se adquirieron de Boehringer Mannheim (Alemania), y se dan enumeradas en la Tabla 2, a continuación, junto con sus sitios de reconocimiento. Cada una de las muestras de ADN mitocondrial de las cepas de Phellinus, obtenidas en el Ejemplo III, tuvo una concentración de 1 \mug por 10 \mul de tampón, y se digirió a 37ºC durante 3 horas.

TABLA 2 Enzimas de restricción y sus sitios de reconocimiento

Enzima de restricción	Sitios de reconocimiento
BamHI	G\downarrowGATCC
ClaI	AT\downarrowCGAT
EcoRI	G\downarrowAATTC
PvuII	CAG\downarrowCTG

Ejemplo V Electroforesis en Gel de Agarosa

Las muestras de ADN, que se habían tratado con las enzimas de restricción en el Ejemplo VI, se mezclaron con un tampón de carga de gel (0,25% de azul de bromofenol, 0,25% de xilencianol FF, 30% de glicerol), y se sometieron a electroforesis en 1% de gel de agarosa (agarosa MP), vendido por Boehringer Mannheim, Alemania, durante 4 horas en un analizador de electroforesis horizontal, comercialmente disponible de BRL, U.S.A., usando un tampón de TAE (40 mM de Tris-acetato, 1 mM de EDTA, pH 8,0) como tampón de pasada, aplicando 50 V a través del analizador. Después de hacer pasar a las muestras de ADN, el gel de agarosa se sumergió en un tampón de bromuro de etidio (0,5 \mug/ml
en agua) para detectar fácilmente los ADN en una lámpara de UV. En la Tabla 3, a continuación, se muestran los tamaños de ADN mitocondriales que se determinaron mediante la electroforesis.

TABLA 3 Tamaños de ADN mitocondrial aislado de la especie Phellinus

Cepas	Tamaño del ADN
P. linteus WD1222	58Kb
P. linteus ATCC 27410	59Kb
P. linteus KCTC 0399BP	61Kb
P. linteus PL5	61Kb

TABLA 3 (Continuación)

Cepas	Tamaño del ADN
P. linteus PL4	73Kb
P. linteus PLM	63Kb
P. tremulae ATCC 32233	77Kb
P. johnsonianus ATCC 60051	76Kb
P. pini ATCC 12240	76Kb
P. tuberculosis ATCC 13271	57Kb
P. nigricans FP-71807-S	58Kb
P. chrysoloma HHB-3585-Sp	60Kb

Ejemplo VI Análisis de Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos de Restricción (RFLP)

El análisis para determinar la filogenia de ADN entre cepas de Phellinus se llevó a cabo según el método de Nei y Li. Suponiendo que los fragmentos de ADN eran idénticos entre sí si se movieron la misma distancia cuando se sometieron a electroforesis en gel de agarosa como en el Ejemplo V, se obtuvieron los valores de filogenia de los fragmentos de las enzimas de restricción (F) y los valores de la divergencia de secuencias (p). A partir de los valores de P, la filogenia entre la cepa de Phellinus linteus Yoo (KCTC 0399BP) y otras cepas de la especie Phellinus se analizó mediante una técnica de agrupamiento según el método de grupos de pares no ponderados usando la media aritmética (UPGMA). Los valores de P y F se calcularon en base a las siguientes ecuaciones, respectivamente:

F = 2n_{xy}/(n_{x} + n_{y})

en la que F muestra una filogenia entre dos especies Phellinus, n_{xy} es el número de fragmentos en común entre ellas, y n_{x} y n_{y} son cada uno el número total de los fragmentos mostrados por los aislados x e y;

p = -(lnF)/r

en la que p es una estimación de la proporción de la sustitución de bases nucleotídicas por posición de nucleótido, y r es el número de los pares de bases nucleotídicas para el sitio de reconocimiento de endonucleasas de restricción.

En la Tabla 4 se enumeran, junto con sus valores p correspondientes, los valores F obtenidos cuando se utiliza un tratamiento con la enzima de restricción BamHI; en la Tabla 5 se enumeran, junto con sus valores p correspondientes, los valores F cuando se utiliza un tratamiento con la enzima de restricción ClaI; en la Tabla 6 se enumeran, junto con sus valores p correspondientes, los valores F cuando se utiliza un tratamiento con la enzima de restricción EcoRI; y en la Tabla 7 se enumeran, junto con sus valores p correspondientes, los valores F cuando se utiliza un tratamiento con la enzima de restricción PvuII. La Tabla 8 contiene las proporciones de los fragmentos en común y las distancias medias aritméticas que corresponden a los valores p enumerados a lo largo de la línea diagonal que se extiende desde la parte superior izquierda hasta la parte inferior derecha en cada una de las Tablas 4-7. A partir de estos resultados se dedujo un árbol filogenético, y se da como se muestra en la Fig. 1, sugiriendo fuertemente que la cepa de la presente invención está recién diferenciada de las cepas de Phellinus con una filogenia significativa.

TABLA 4 Valores de F y P a partir de PRLP del ADN mitocondrial digerido mediante BamHI

1

TABLA 5 Valores de F y P a partir de PRLP del ADN mitocondrial digerido mediante ClaI

3

TABLA 6 Valores de F y P a partir de PRLP del ADN mitocondrial digerido mediante EcoRI

5

TABLA 7 Valores de F y P a partir de PRLP del ADN mitocondrial digerido mediante PvuII

6

TABLA 8 Proporciones de fragmentos en común y distancias medias aritméticas que corresponden a los valores p

7

Ejemplo VII Características Microbiológicas de la Cepa KCTC 0399BP de Phellinus linteus Yoo

La cepa Phellinus linteus Yoo KCTC 0399BP, que se identificó como una nueva cepa recientemente diferenciada de Phellinus con una gran filogenia, se estudió con respecto a sus características microbiológicas. Su cuerpo fructífero, no germinativo y perenne, tuvo una parte leñosa con un virus semicircular de alrededor de 10 cm de ancho y alrededor de 4 cm de grosor. En el momento de recogerla, esta seta tuvo una superficie marrón oscura, pero, con el transcurso del tiempo, la superficie tuvo muchas fisuras sobre ella y el color pardo negruzco mientras que su capa himeneal cambió de color desde rojo vivo a marrón amarillento. El tubo de la capa himeneal tuvo una estructura de múltiples capas, con un poro fino redondeado. Su espora de 3-4 cm de longitud era subglobosa y de un color pardo amarillento claro. También tuvo muchas setas, y un clamido de dimensión de 15-30 x 8-10 \mum. Se encontró que la cepa de la presente invención era idéntica, en casi todos los aspectos, a Phellinus linteus descrito en "Colored Illustrations of Mushrooms of Japan", p. 189, impreso por Hoikusha Imazeki, editado por Imazeki, R. y Hongo, T., y denominada Phellinus linteus Yoo. Esta nueva cepa se depositó en la Colección Coreana para Cultivos Tipo, Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology, el 17 de Noviembre de 1997, y recibió el número de depósito KCTC 0399BP.

Ejemplo VIII Cultivo de Phellinus linteus Yoo KCTC 0399BP

Un caldo de cultivo que contiene almidón 50 g, peptona 10 g y extracto de levadura 10 g por 1 l de agua destilada, suplementado con KH_{2}PO_{4} 0,8 g, MgSO_{4}\cdot7H_{2}O 0,5 g y CaCl_{2} 0,3 g, se ajustó hasta pH 6,0 y se sometió a autoclave. Los micelios de Phellinus linteus Yoo KCTC 0399BP se inocularon en 3,5 litros del caldo de cultivo en un baño de fermentación de 5 litros, y se cultivaron a 28ºC durante 11 días mientras se aireaba el caldo a 2 vvm y se hacía girar el baño a 160 rpm. Cinco días después del cultivo, se obtuvo el rendimiento más elevado para los micelios (30 g/l), según se muestra en la Fig. 2. A partir de los micelios cultivados durante 5 días, los polisacáridos se extrajeron mediante agua caliente, con un rendimiento de 0,873% por peso de micelios secos.

TABLA 9 Rendimientos de producción para micelios de P. linteus y para polisacárido

Elementos	Micelios de P. linteus cultivados durante 5 días
Peso de micelios secos (g/l)	30
Peso de polisácarido seco bruto	262
Rendimiento de polisacárido bruto (%)	0,873

Ejemplo IX Extracción de Cultivo Miceliar de Cepa de Phellinus linteus Yoo

Se llevó a cabo un procedimiento de extracción y purificación en un cultivo miceliar de la cepa de Phellinus linteus Yoo a fin de obtener sustancias inmunoestimulantes brutas. Primeramente, se sometieron 280 g del cultivo miceliar, obtenido en el Ejemplo VIII, a una extracción mediante agua caliente, seguida de la concentración para dar 3 g de un extracto en agua caliente. Este extracto se añadió con etanol hasta una concentración final de 80%, se dejó reposar a 4ºC durante 24 horas, y se centrifugó. El pelete se disolvió en agua y después se dializó a 10ºC durante 72 horas usando un tubo de celulosa, tal como el vendido por Nippon Junko Jun Yaku Seihing, mientras que la disolución de diálisis se renovaba cada 12 horas. La disolución en el tubo de celulosa se liofilizó para dar un extracto bruto de
2,45 g.

Ejemplo X Aislamiento de Sustancia Inmunoestimulante Pura

La purificación se logró llevando a cabo una cromatografía de intercambio iónico y una cromatografía de filtración en gel, sucesivamente.

Primero, el extracto bruto obtenido en el Ejemplo IX se disolvió en un tampón de fosfato de sodio 5 mM (pH 7,2), se cargó en una columna de DEAE-celulosa, y se lavó con el mismo tampón. Como tampón eluyente se usó una disolución de NaCl, en el mismo tampón, que tiene un gradiente de concentración de 0 a 1 M. Se hizo pasar a través de la columna a un caudal de 5 ml/min., y el eluato se recogió a 15 ml por tubo de ensayo. Las fracciones eluidas se midieron con respecto al contenido de azúcar, mediante un método de fenol-ácido sulfúrico, y con respecto al contenido de proteína, mediante el método de Bradford. Las fracciones que contienen azúcar se aplicaron a la parte superior de una columna que consiste en perlas porosas, tales como las vendidas con el nombre comercial de Toyopearl HW 65F, y se purificaron adicionalmente mediante cromatografía de filtración en gel, eluyendo con agua, para dar una fracción activa pura que tenía propiedades y un peso molecular homogéneos. Su contenido de azúcar y de proteína se midió mediante los mismos métodos como antes. La sustancia inmunoestimulante pura, así obtenida, se denominó "PL".

Ejemplo XI Actividad Inmunoestimulante del Polisacárido

Se sabe que el polisacárido derivado de basidomicetos tiene una influencia positiva sobre la proliferación o actividad de linfocitos, aumentando de ese modo la inmunidad frente a factores externos e incluso frente a células cancerosas. Esta función del polisacárido no se atribuye a citotoxicidad directa, sino resulta de la potenciación inmunológica, de forma que produce ventajosamente in vivo pocos efectos secundarios. Esto es, los polisacáridos de basidomicetos inducen una potenciación en la función citotóxica y en la formación de anticuerpos de los linfocitos, células B y células T, mostrando de ese modo una potente inmunoactividad anticancerosa. Por lo tanto, los polisacáridos pueden demostrar indirectamente que tienen inmunoactividad anticancerosa mediante el recuento del número de linfocitos anti-formadores, y midiendo la proliferación de células T.

En este ejemplo, las células B se contaron mediante el uso de un método de célula formador de anticuerpos, y la proliferación de las células T se midió mediante una técnica de respuesta linfocítica mixta. Además, a fin de detectar el efecto del polisacárido sobre la proliferación de linfocitos, se midió, usando ^{3}H-timidina, el ADN nuclear que se sintetizó recientemente. Los resultados se dan en la Tabla 10, a continuación.

TABLA 10 Actividad inmunoestimulante de diversas sustancias

Sustancia	Efecto de la proliferación de	Actividad de las células T	Células B formadoras de
	linfocitos (DPM X 10^{4})	(DPM X 10^{4})	anticuerpos (Abs 576 nm)
P. linteus yoo	8,4 \pm 0,5	2,5 \pm 0,1	0,66 \pm 0,01
LPS	-	-	0,81 \pm 0,23
Control	1,6 \pm 0,5	0,5 \pm 0,05	0,00 \pm 0,00
* Cada sustancia se usó a una concentración de 10 \mug/ml

Como es manifiesto a partir de los datos de la Tabla 10, el polisacárido extraído de la nueva cepa de Phellinus de la presente invención es superior para el control de la proliferación de linfocitos y de la actividad de células T, ambos por un factor de alrededor de 5 veces. El polisacárido de la presente invención muestra un elevado poder de formación de anticuerpos de células B, similar al de lipopolisacárido. El lipopolisacárido es un agente inmunosupresor muy potente, pero no se puede usar libremente debido a sus serios efectos secundarios in vivo.

Ejemplo XII Unidad de Azúcar y Composición del Polisacárido Inmunoestimulante

El polisacárido obtenido del Ejemplo X se sometió a cromatografía de gases para analizar sus unidades de azúcares (Fig. 4). Se llevó a cabo un método de fenol-ácido sulfúrico y un método de Folín-fenol para medir sus componentes de hidratos de carbono y de proteína, respectivamente. El análisis se llevó a cabo en un aparato, comercialmente disponible de Hewlett Packard, identificado como "HP 5890 GC", provisto de una columna capilar de sílice pirolizada sp-2330 (0,32 mm x 30 m), en las siguientes condiciones. La columna se mantuvo primeramente a 200ºC durante 2 min., y se calentó a una velocidad de elevación de 4ºC por min. hasta 250ºC, que entonces se mantuvo durante 2 min. Un detector y un inyector, proporcionados con el aparato, se mantuvieron a 260ºC y 250ºC, respectivamente. Se tomaron 2 mg de cada una de las fracciones del extracto obtenidas en el Ejemplo XI, se hidrolizaron con TFA 2 N, se redujeron con NaBH_{4}, y se acetilaron con ácido acético anhidro para dar el acetato de alditol para uso en la cromatografía de gases. Los resultados se dan en la Tabla 11, a continuación.

TABLA 11 Unidades de azúcar y composición de la fracción inmunoactiva

Extracto de polisacárido	Hidrato de carbono (%)	Proteína (%)	Unidades de azúcar (% en moles)
			Glucosa	Manosa	Galactosa
PL	82,7	17,3	78,6	18,0	3,4

Ejemplo XIII Análisis Estructural del Polisacárido Inmunoestimulante

El polisacárido Inmunoestimulante se sometió a análisis estructural.

Primero, se confirmó su pureza mediante el uso de cromatografía en columna sobre gel 65F. La Fig. 5 es el resultado de esta cromatografía. Como se puede observar, apareció un único pico simétrico para cada componente de hidrato de carbono y de proteína, demostrando que PL era puro.

\newpage

A partir de un espectro de resonancia magnética nuclear de carbono (Fig. 6), se identificó al PL como un galactomanoglucano en el que las unidades de glucosa estaban unidas mediante enlaces alfa(1-4) y \beta(1-6) para formar una cadena larga, y la manosa y galactosas estaban enlazadas como ramificaciones a la cadena larga.

Este análisis estructural, de acuerdo con el resultado de la composición, reveló que el PL fue un nuevo polisacárido, bastante diferente en estructura del \beta-glucano.

Ejemplo XIV Extracción de Polisacáridos a Partir de Micelios de la especie Phellinus. Su Purificación y Actividad Inmunoestimulante (para comparación)

Se cultivaron cepas de la especie Phellinus, incluyendo Phellinus igniarius, P. baumi, P. pini, P. gilvus y P. nigricans, para obtener sus micelios. A partir de ellos, se extrajeron y se purificaron polisacáridos, y después se usaron para inducir una potenciación en la función citotóxica y en la formación de anticuerpos de los linfocitos, de las células B y de las células T, como en los Ejemplos VIII a XI. Sus inmunoactividades anticancerosas se evaluaron indirectamente contando el número de linfocitos antiformadores, y midiendo la proliferación de células T. Se obtuvieron resultados similares a los del Ejemplo XI.

Ejemplo XV Extracción de Polisacáridos a Partir de Cuerpos Fructíferos de la especie Phellinus. Su Purificación y Actividad Inmunoestimulante (para comparación)

Se cultivaron cepas de la especie Phellinus, incluyendo Phellinus igniarius, P. baumi, P. pini, P. gilvus y P. nigricans, para obtener sus cuerpos fructíferos. A partir de ellos, se extrajeron y se purificaron polisacáridos, y después se usaron para inducir una potenciación en la función citotóxica y en la formación de anticuerpos de los linfocitos, de las células B y de las células T, como en los Ejemplos VIII a XI. Sus inmunoactividades anticancerosas se evaluaron indirectamente contando el número de linfocitos antiformadores, y midiendo la proliferación de células T. Se obtuvieron resultados similares a los del Ejemplo XI.

Ejemplo XVI Actividad Terapéutica del Polisacárido Frente a Células Cancerosas Según el Tiempo de Administración

Se utilizaron células cancerosas cutáneas B16F10, derivadas de ratón, para la medida de la actividad anticancerosa del polisacárido. Se cultivaron células cutáneas B16F10 en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero, y se subcultivaron dos veces cada semana. Se implantaron en la cavidad peritoneal 100.000 células de B16F10 por ratón. Los ratones implantados se registraron con respecto a la viabilidad, durante 30 días. El registro también se realizó para los ratones a los que se les administró peritonealmente el polisacárido desde una semana antes del implante de células cancerosas hasta 12 días después del implante (pretratamiento), y para los ratones a los que se les administró peritonealmente el polisacárido durante 12 días después del implante (post-tratamiento). Los resultados se dan como se muestra en la Fig. 7, y se resumen en la Tabla 12, a continuación. Como se puede observar, el grupo de ratones pretratados fue el de mayor viabilidad media, después le sigue el grupo de ratones post-tratados, y el menor es el grupo de ratones no tratados. Los ratones ensayados no cambiaron su peso corporal.

TABLA 12 Inmunoterapia del polisacárido

Grupos de ensayo (mg/Kg)	Viabilidad media	Proporción (%)	Nº de ratones viables en el 30º día
Sin tratar	20,8	100	0/10
Pretratados (100)	29,0	139	8/10
Post-tratados (100)	25,8	124	2/10

\newpage

Ejemplo XVII Actividad del Polisacárido Frente a Células Cancerosas Según Inmunoquimioterapia

Experimento 1

Actividad anticancerosa según la coadministración del polisacárido y la adriamicina

Se utilizó un sistema de ensayo de plantación homogénea de célula cancerosa cutánea B16F10 para la medida de la actividad anticancerosa con la coadministración del polisacárido y de la adriamicina. Las células cancerosas cutáneas se implantaron en la cavidad peritoneal de ratones. La adriamicina se administró peritonealmente a los ratones durante 12 días tras el implante del tumor, mientras que el polisacárido se administró peritonealmente desde una semana antes del implante hasta 12 días después del implante. Durante 60 días, se registró diariamente la viabilidad de los ratones. La adriamicina se usó en cantidades bajas para no dañar a los ratones.

Los resultados se dan como se muestran en las Figs. 8a y 8b, y se resumen en la Tabla 13, a continuación. Como es manifiesto a partir de los datos, los ratones a los que no se les trató con los agentes tuvieron muy mala viabilidad, y los ratones que fueron tratados con el polisacárido sólo fueron superiores en viabilidad con respecto a los ratones no tratados. En las Figs. 8a y 8b se muestran los resultados cuando se administró adriamicina a una dosis de 0,1 mg y 0,3 mg por kg de peso corporal de un ratón, respectivamente. La viabilidad fue mucho mejor a una dosis de 0,3 mg/kg
que a 0,1 mg/kg. En el caso de la coadministración con el polisacárido, la adriamicina también elevó más la viabilidad del ratón a una dosis de 0,3 mg/kg que a 0,1 mg/kg. Numéricamente, los ratones a los que se les implantaron células cancerosas cutáneas B16F10 vivieron una media de 18,1 días. Cuando fueron tratados con el polisacárido sólo, su viabilidad media se prolongó hasta 31 días. La adriamicina permitió que los ratones vivieran durante 35,4 días de media, cuando se les administraba sola a una dosis de 0,1 mg/kg, mientras que los ratones pudieron vivir 40,1 días de media mediante la administración única de adriamicina a una dosis de 0,3 mg/kg. Cuando la adriamicina se administró en combinación con el polisacárido, la viabilidad media de los ratones se prolongó significativamente desde 46,9 días, a una dosis de 0,1 mg/kg, hasta 57,8 días, a una dosis de 0,3 mg/kg. Durante el ensayo, los ratones no perdieron peso corporal.

TABLA 13 Inmunoterapia de combinación de adriamicina y el polisacárido

Grupo de ensayo (mg/Kg)	Viabilidad media	Proporción (%)	Nº de ratones viables en el 60º día
Sin tratar	18,1	100,0	0/10
P.S^{1}(100)	31,0	171,3	0/10
Am^{2}(0,1)	35,4	195,6	0/10
Am(0,1)+P.S.(100)	46,9	259,1	4/10
Am(0,3)	40,1	240,9	2/10
Am(0,3)+P.S(100)	57,8	319,3	9/10
^{1} Polisacárido
^{2} Adriamicina

Experimento 2

Actividad anticancerosa según la coadministración del polisacárido y de mitomicina C

Se utilizó un sistema de ensayo de plantación homogénea de célula cancerosa cutánea B16F10 para la medida de la actividad anticancerosa con la coadministración del polisacárido y de mitomicina C, como en el Experimento 1. Las células cancerosas cutáneas se implantaron en la cavidad peritoneal de ratones. La mitomicina C se administró peritonealmente a los ratones durante 12 días después de la implantación del tumor, mientras que el polisacárido se administró peritonealmente desde una semana antes de la implantación hasta 12 días después de la implantación. La viabilidad de los ratones se registró diariamente, durante 60 días. La mitomicina C se usó en cantidades bajas para no dañar a los ratones.

Se obtuvieron resultados similares a los del Experimento 1, y se resumen en la Tabla 14, a continuación. Como es manifiesto a partir de los datos, los ratones que no fueron tratados con los agentes tuvieron una viabilidad muy pobre, y los ratones que fueron tratados con el polisacárido sólo tuvieron una viabilidad muy superior a la de los ratones sin tratar. Numéricamente, los ratones a los que se les implantaron células cancerosas cutáneas B16F10 vivieron 18,1 días de media, pero cuando se les trató con el polisacárido sólo su viabilidad media se prolongó hasta 31 días. La
mitomicina C permitió que los ratones vivieran durante 32,5 días de media cuando se administró individualmente a una dosis de 0,2 mg/kg, mientras que los ratones pudieron vivir 38,0 días de media mediante la administración individual de mitomicina C a una dosis de 0,6 mg/kg. Cuando la mitomicina C se administró en combinación con el polisacárido, la viabilidad media de los ratones se prolongó significativamente desde 43,5 días, a una dosis de 0,2 mg/kg,
hasta 51,5 días, a una dosis de 0,6 mg/kg. Durante el ensayo, los ratones no perdieron peso corporal.

TABLA 14 Inmunoterapia de combinación de mitomicina C y el polisacárido

Grupo de ensayo (mg/Kg)	Viabilidad media	Proporción (%)	Nº de ratones viables en el 60º día
Sin tratar	18,1	100,0	0/10
P.S^{1}(100)	31,0	171,3	0/10
M.C^{2}(0,2)	32,5	179,6	0/10
M.C(0,2)+P.S.(100)	43,5	240,3	3/10
M.C(0,6)	38,0	209,9	1/10
M.C(0,6)+P.S(100)	51,5	284,5	7/10
^{1} Polisacárido
^{2} Mitomicina C

Experimento 3

Actividad anticancerosa según la coadministración del polisacárido y cisplatino

Se utilizó un sistema de ensayo de plantación homogénea de célula cancerosa cutánea B16F10 para la medida de la actividad anticancerosa con la coadministración del polisacárido y de cisplatino, como en los experimentos anteriores. Las células cancerosas cutáneas se implantaron en la cavidad peritoneal de los ratones. El cisplatino se administró peritonealmente a los ratones durante 12 días después de la implantación del tumor, mientras que el polisacárido se administró peritonealmente desde una semana antes de la implantación hasta 12 días después de la implantación. La viabilidad de los ratones se registró diariamente durante 60 días. El cisplatino se usó en cantidades bajas para no dañar a los ratones.

Se obtuvieron resultados similares a los de los experimentos anteriores, y se resumen en la Tabla 15, a continuación. Como es manifiesto a partir de los datos, los ratones que no fueron tratados con los agentes tuvieron una viabilidad muy pobre, y los ratones que fueron tratados con el polisacárido sólo fueron muy superiores en la viabilidad con respecto a los ratones sin tratar. Numéricamente, los ratones a los que se les implantaron células cancerosas cutáneas B16F10 vivieron durante 18,1 días de media, pero cuando se les trató con el polisacárido sólo su viabilidad media se prolongó hasta 31 días. El cisplatino permitió que los ratones vivieran durante 33 días de media cuando se administró individualmente a una dosis de 0,5 mg/kg, mientras que los ratones pudieron vivir 40,5 días de media mediante la administración individual de cisplatino a una dosis de 1,5 mg/kg. Cuando el cisplatino se administró en combinación con el polisacárido, la viabilidad media de los ratones se prolongó significativamente desde 44,0 días, a una dosis de 0,5 mg/kg, hasta 52,6 días, a una dosis de 1,5 mg/kg. Durante el ensayo, los ratones no perdieron peso corporal.

TABLA 15 Inmunoterapia de combinación de cisplatino y el polisacárido

Grupo de ensayo (mg/Kg)	Viabilidad media	Proporción (%)	Nº de ratones viables en el 60º día
Sin tratar	18,1	100,0	0/10
P.S^{1}(100)	31,0	171,3	0/10
C.P^{2}(0,5)	33,0	182,3	0/10
C.P(0,5)+P.S(100)	44,0	243,0	3/10
C.P(1,5)	40,5	223,8	2/10
C.P(1,5)+P.S(100)	52,6	290,6	7/10
^{1} Polisacárido
^{2} Cisplatino

Experimento 4

Actividad anticancerosa según la coadministración del polisacárido y de 5-fluorouracilo

Se utilizó un sistema de ensayo de plantación homogénea de célula cancerosa cutánea B16F10 para la medida de la actividad anticancerosa con la coadministración del polisacárido y de 5-fluorouracilo, como en los experimentos anteriores. Las células cancerosas cutáneas se implantaron en la cavidad peritoneal de los ratones. El 5-fluorouracilo se administró peritonealmente a los ratones durante 12 días después de la implantación del tumor, mientras que el polisacárido se administró peritonealmente desde una semana antes de la implantación hasta 12 días después de la implantación. La viabilidad de los ratones se registró diariamente durante 60 días. El 5-fluorouracilo se usó en cantidades bajas para no dañar a los ratones. Se obtuvieron resultados similares a los de los experimentos anteriores, y se resumen en la Tabla 16, a continuación. Como es manifiesto a partir de los datos, los ratones que no fueron tratados con los agentes tuvieron una viabilidad muy mala, y los ratones a los que se les trató con el polisacárido sólo tuvieron una viabilidad muy superior a la de los ratones sin tratar. Numéricamente, el 5-fluorouracilo permitió que los ratones vivieran durante 34,2 días de media cuando se administró individualmente a una dosis de 1 mg/kg, y durante 45,5 días de media cuando se administró en combinación con el polisacárido. Una dosis de 3 mg/kg de 5-fluorouracilo permitió que los ratones vivieran 40,2 días de media cuando se administró solo, y que vivieran 54,8 días de media cuando se administró junto con el polisacárido. Durante el ensayo, los ratones no perdieron peso
corporal.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 16

Grupo de ensayo (mg/Kg)	Viabilidad media	Proporción (%)	Nº de ratones viables en el 60º día
Sin tratar	18,1	100,0	0/10
P.S^{1}(100)	31,0	171,3	0/10
5-FU^{2}(1)	33,0	187,8	0/10
5-FU(1)+P.S(100)	44,0	251,4	4/10
5-FU(3)	40,5	222	2/10
5-FU(3)+P.S(100)	52,6	302,0	8/10
^{1} Polisacárido
^{2} Fluorouracilo

Ejemplo XVIII Actividad del Polisacárido Contra Células Cancerosas Derivadas del Cuerpo Humano

La actividad del polisacárido contra el cáncer humano se ensayó usando NCl-H23, una estirpe celular de cáncer pulmonar. Se implantaron células de cáncer pulmonar NCl-H23 subcutáneamente a ratones atímicos. El polisacárido y la adriamicina se administraron peritonealmente a los ratones atímicos durante 12 días tras la implantación de las células cancerosas. Se midió el tamaño de la masa de las células cancerosas, y las células cancerosas se separaron y se pesaron en el 19º día después de la implantación de las células cancerosas. Debido a que los ratones atímicos carecían de células T, su competencia inmunológica se atribuyó generalmente a la actividad de células asesinas naturales o de células macrófagas. Por lo tanto, el potenciamiento inmunológico obtenido cuando se administró el polisacárido se estudió a través de estos dos tipos celulares.

Los resultados se dan como se muestran en las Figs. 9a y 9b, y se enumeran en las Tablas 17 y 18, a continuación. Como es manifiesto a partir de estos datos, las células cancerosas que no fueron tratadas ni con adriamicina ni con el polisacárido tuvieron el tamaño más grande, seguidas de las células cancerosas tratadas con el polisacárido, y las más pequeñas fueron las células cancerosas tratadas con adriamicina. Los ratones estudiados no ganaron ni perdieron peso corporal.

TABLA 17 Inmunoterapia para células cancerosas humanas (tamaño celular, mm^{3})

Grupo de ensayo	Día 14º	Día 17º	Día 18º	Día 19º
Sin tratar	43	105	131	158
P.S^{1}(100mg/Kg)	20	39	40	43
Am^{2}(1mg/Kg)	12	27	34	33
^{1} Polisacárido
^{2} Adriamicina

TABLA 18 Inmunoterapia para células cancerosas humanas

Grupo de ensayo	Peso final del cáncer
Sin tratar	259
P.S^{1}(100mg/Kg)	113
Adriamicina(1mg/Kg)	95
^{1} Polisacárido

Ejemplo XIX Efecto del Polisacárido Sobre la Metástasis de Células Cancerosas de Ratón

A fin de estudiar al polisacárido en cuanto a la prevención de la metástasis del cáncer, se implantaron células cancerosas cutáneas B16F10 en las venas de la cola de ratones C57BL/6. Al 14º día después de la implantación, los pulmones se aislaron de los ratones para investigar si se produjo metástasis del cáncer, o en qué grado se produjo. Se administró peritonealmente adriamicina a los ratones durante 12 días después de la implantación del tumor, mientras que el polisacárido se administró peritonealmente desde una semana antes de la implantación hasta 12 días después de la implantación. Las células cancerosas cutáneas B16F10, inyectadas intravenosamente en las colas, se movieron para formar puntos negros en los pulmones. Los resultados se dan según se muestran en las Figs. 10a y 10b, y se resumen numéricamente en la Tabla 19, a continuación. Como se muestra en la Fig. 10a, se encontraron alrededor de 272 puntos cancerosos en el grupo de ratones que no fue tratado con ningún agente, y se redujeron hasta 197 cuando se administró adriamicina a una dosis de 1 mg/kg, y se redujo adicionalmente hasta 172 cuando se administró adriamicina a una dosis de 3 mg/kg. La adriamicina a una dosis de 0,1-0,3 mg/kg mostró una potente actividad en la prevención del crecimiento de células cancerosas, pero sólo mostró un efecto muy débil en la prevención de la metástasis del cáncer a una dosis de 1-3 mg/kg. El número de puntos cancerosos se redujo hasta 83 mediante la administración del polisacárido sólo. Se encontraron 136 y 131 puntos cancerosos en los grupos de ratones a los que se les administró el polisacárido en combinación con adriamicina a una dosis de 1 mg/kg y 3 mg/kg, respectivamente. Por lo tanto, el polisacárido es más eficaz en la prevención de la metástasis del cáncer que la adriamicina.

TABLA 19

Grupo de ensayo	Nº de puntos
Sin tratar	272
P.S^{1}(100mg/Kg)	83
Adriamicina (1mg/Kg)	197
Adriamicina (1mg/Kg)+P.S (100mg/kg)	136
Adriamicina (3mg/Kg)	172
Adriamicina (3mg/Kg)+P.S (100mg/Kg)	131
^{1} Polisacárido

Ejemplo XX Ensayo Para Determinar la Citotoxicidad Directa del Polisacárido Para las Células Cancerosas

Se estudió la actividad anticancerosa del polisacárido para determinar si se expresó a través de potenciación inmunológica o mediante citotoxicidad directa para las células cancerosas. Las células de cáncer cutáneo de ratón B16F10 y las células de cáncer de pulmón humano NCl-H23 se trataron directamente con el polisacárido y con adriamicina a una cantidad de 0,3-30 \mug/kg. Las células cancerosas, todavía vivas en el 2º día después del tratamiento, se midieron según un método de sulforrodamina B. Los resultados se dan como se muestra en la Fig. 11, y se resumen numéricamente en la Tabla 20, a continuación. La cantidad de células de los grupos de ensayo que no fueron tratados con ningún compuesto químico se expresó como "100%", y las cantidades de células de los grupos de ensayo tratados se compararon con este patrón. Como es manifiesto a partir de los datos, la adriamicina muestra una potente citotoxicidad para los dos tipos de células cancerosas, mientras que el polisacárido no. Tomados juntos, los datos obtenidos en los ejemplos anteriores muestran que la adriamicina ejerce actividad anticancerosa a través de citotoxicidad, mientras que el polisacárido desarrolla actividad anticancerosa a través de potenciación inmunológica.

TABLA 20 Citotoxicidad directa del polisacárido

Grupo de ensayo	Adriamicina	Polisacárido
	B16F10	NCl-H23	B16F10	NCl-H23
Sin tratar	100	100	100	100
0,3 \mug/ml	56	100	93	93
1 \mug/ml	29	71	89	89
3 \mug/ml	9	39	80	80
10 \mug/ml	-10	7	78	78
30 \mug/ml	-10	-1	77	77

Ejemplo XXI Ensayo Para Uso Como un Auxiliar en la Profilaxis y Tratamiento de SIDA

El polisacárido según la presente invención se ensayó para determinar la disponibilidad de una ayuda para la profilaxis y el tratamiento de SIDA, y se encontró que era eficaz para ello.

Tomados juntos, los datos de los Ejemplos muestran que la seta de la presente invención es una cepa nueva con una filogenia con respecto a la especie Phellinus según se analiza mediante RFLP, y que el polisacárido obtenido de los micelios de la especie Phellinus tiene una actividad anticancerosa al incitar la citotoxicidad de células T y la potencia formadora de anticuerpos de células B. Además, el polisacárido de la presente invención muestra una potente actividad frente a la metástasis del cáncer. En consecuencia, el polisacárido, que puede estimular la inmunidad del cuerpo, puede ser eficaz en la profilaxis y tratamiento de enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario, tales como cánceres y SIDA, y de este modo es muy útil en la industria biomédica.

Claims

1. Una cepa, Phellinus linteus Yoo KCTC 0399BP, que produce un polisacárido inmunoestimulante y que tiene un ADN mitocondrial de 61 kb de tamaño.

2. Un galactomanoglucano inmunoestimulante natural, en el que las unidades de glucosa están unidas mediante enlaces alfa(1\rightarrow4) y \beta(1\rightarrow6), obtenible extrayéndolo y purificándolo de los cultivos del micelio o del cuerpo fructífero de Phellinus linteus Yoo KCTC 0399BP.

3. La sustancia estimulante según la reivindicación 1, en la que la sustancia consiste en manosa, galactosa y glucosa.

4. Un método para preparar un polisacárido inmunoestimulante, que comprende las etapas de:

cultivar la cepa Phellinus linteus Yoo KCTC 0399BP según la reivindicación 1, en un medio que contiene glucosa, extracto de levadura y peptona, para dar micelios o cuerpos fructíferos;

extraer la sustancia de los micelios o de los cuerpos fructíferos, mediante agua caliente;

aislar la sustancia mediante precipitación en etanol, suspendiéndola en agua y dializando con un tubo de diálisis; y purificar la sustancia mediante la ejecución secuencial de cromatografía en DEAE-celulosa y la cromatografía en gel.

5. Una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del polisacárido o de sus derivados obtenido de los micelios o de los cuerpos fructíferos de Phellinus linteus Yoo KCTC 0399BP según la reivindicación 1, en la que el polisacárido o sus derivados tienen actividad inmunoestimulante.