CN104829743B - 一种辣木叶多糖的制备方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于天然产物化学领域，具体涉及一种辣木叶多糖的制备方法及其用途。本发明的制备方法是采用微波‑超声波协同提取,盐酸法脱蛋白，过氧化氢法脱色和AB‑8型大孔吸附树脂柱分离制得辣木叶多糖，该辣木叶制备方法具有提取时间短，提取温度低，耗能低，提取率高和纯度高的优点。另外，经动物试验证明，制得的辣木叶的多糖对高尿酸症具有显著的治疗效果，该辣木叶通过降低胆固醇、三酰甘油、尿素氮、肌酐和黄嘌呤氧化酶的含量从而达到降低尿酸生成，同时也可以直接分解尿酸，改善肾功能、促进尿酸排泄、保护血管等功能，更有利于高尿酸血症患者的康复，具有广阔的医学应用前景。
Description
技术领域
本发明属于天然产物化学领域，具体涉及一种辣木叶多糖的制备方法及其用途。
背景技术
辣木（MoringaoleiferaLam.）为辣木科辣木属的植物，是多年生热带落叶乔木，广泛种植在亚洲和非洲热带和亚热带地区，对土壤条件和降雨量有很强的 适应性。我国广东、台湾等地亦有栽培，辣木既可以供观赏，而且根、叶和嫩果可食用；种子可榨油，含油30%左右，具有很高的经济价值。经研究发现，辣木除了具有丰富的营养价值外，在抗氧化、降血糖、降血脂、抗真菌方面亦表现出良好的活性，而且辣木叶中的多糖类化合物和多糖类化合物具有降血糖、降脂、降压、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、治疗心血管病、改善睡眠等功效，是具有极大研究开拓潜力的植物。
鉴于辣木叶多糖具有的多种药理作用，辣木叶多糖成为人们研究的热点，尤其是对辣木叶多糖的提取工艺的研究。陈瑞娇发表了一篇题为“辣木叶多糖的提取及分离纯化”的论文，该论文公开的辣木叶多糖的最佳提取工艺为：料液比为1:20，在80℃水浴条件下，提取3次，每次1.5h，该工艺提取的粗多糖得率为15.86%，但是，该提取方法提取温度较高，耗能较多，提取时间长，不利于该提取方法的工业化生产。彭凌发表了一篇题为：“辣木叶多糖超声波辅助提取工艺条件优化研究”的论文，该论文公开了超声波辅助提取工艺的最优条件为：料液比为1:30，在60℃条件下，超声波处理20min，提取2次，该工艺提取的辣木叶多糖提取率为24.52%，但是，其提取率较低，不利于其大规模的生产和应用。。
尿酸是人类嘌呤化合物的终末代谢产物。嘌呤代谢紊乱导致高尿酸血症。随着人们生活水平提高和饮食结构改变，高尿酸血症的患病率日益上升，严重威胁到人类的健康。目前，有研究表明辣木叶多糖对降血糖、抗肿瘤、抗病毒和治疗心血管病都具有显著的效果，但是辣木叶多糖对高尿酸症治疗效果尚未见有研究，因此，致力于研究辣木叶多糖对治疗高尿酸症的效果具有重要意义。
发明内容
为了解决现有技术辣木叶多糖提取工艺的提取时间较长，提取率低的缺陷，本发明的目的在于提供一种辣木叶多糖的制备方法及其用途，以解决以上缺陷。
本发明提供的一种辣木叶多糖的制备方法，包括以下步骤：
（1）备料：称取辣木叶，干燥，粉碎，过40-50目筛，得辣木叶粉；
（2）提取：取步骤（1）得到的辣木叶粉，加入辣木叶粉质量20-30倍体积的蒸馏水，在微波下处理6-8min，置45℃-55℃温水浴中超声提取2-3次，每次处理30-40min，过滤，合并滤液，将滤液减压浓缩，在14℃下离心10 min，取上清液，将上清液浓缩，得浓缩液；
（3）脱蛋白：将步骤（2）得到的浓缩液加入盐酸调节其pH值至3.0-4.0，静置过夜，在3000r/min条件下离心4-6min，弃沉淀取上清液；
（4）脱色：将步骤（3）的上清液放置温度为75-85℃水浴中，加入NaOH溶液调节其pH值至8-9，接着加入过氧化氢脱色，过氧化氢的添加量是上清液体积的0.2-0.3倍，脱色20-30min，过滤取滤液；
（5）分离：将步骤（4）的滤液进行逆流水透析 40-48 h，蒸馏水透析 20-24h，将透析液浓缩，加入大孔吸附树脂柱，加蒸馏水洗脱，洗脱至洗脱液加入95%乙醇无沉淀，收集洗脱液；将洗脱液浓缩后加入无水乙醇使含醇量达到80%，于4℃冰箱中过夜醇沉，在4℃下离心10 min，取沉淀，将沉淀依次用无水乙醇、丙酮洗涤2-4次，干燥后即得辣木叶多糖粉末。
本发明辣木叶多糖的制备方法步骤（2）中的微波的功率为500-600W。
进一步的，所述步骤（2）中的超声波的功率为300-400W。
本发明辣木叶多糖的制备方法步骤（2）中离心机的转速进一步限定为 10000 r/min。
更进一步的，本发明辣木叶多糖的制备方法步骤（4）中过氧化氢的浓度为16%-23%，进一步优选过氧化氢的浓度为20%。
还有，本发明辣木叶多糖的制备方法步骤（5）中的吸附树脂柱为AB-8 型大孔吸附树脂柱。
进一步限定步骤（5）中离心机的转速为 40000 r/min。
优选的，本发明辣木叶多糖的最佳制备方法，包括以下步骤：
（1）备料：称取1kg辣木叶于50℃干燥2.5 h，粉碎，过45目筛，得辣木叶粉；
（2）提取：取步骤（1）得到的辣木叶粉，加入辣木叶粉质量25倍体积的蒸馏水，在功率为500W的微波下处理7min，置50℃温水浴中功率为300W的超声提取2次，每次处理35min，过滤，合并滤液，将滤液减压浓缩至原体积的1/3，在14℃下，转速为10000 r/min的离心机离心10 min，取上清液，将上清液浓缩至原体积的1/4，得浓缩液；
（3）脱蛋白：将步骤（2）得到的浓缩液加入2mol/L盐酸调节其pH值至3.5，静置过夜，在3000r/min条件下离心55min，弃沉淀取上清液；
（4）脱色：将步骤（3）的上清液放置温度为80℃水浴中，加入0.1%的NaOH溶液调节其pH值至8.5，接着加入浓度为20%的过氧化氢，过氧化氢的添加量是上清液体积的0.25倍，脱色25min，过滤取滤液；
（5）分离：将步骤（4）的滤液进行逆流水透析 48 h，蒸馏水透析24h，将透析液浓缩，加入AB-8 型大孔吸附树脂柱，加蒸馏水洗脱，洗脱至洗脱液加入95%乙醇无沉淀，收集洗脱液；将洗脱液浓缩至原体积的1/5后加入无水乙醇使含醇量达到80%，于4℃冰箱中过夜醇沉，在4℃下，转速为 40000 r/min的离心机离心10 min，取沉淀，将沉淀依次用无水乙醇、丙酮反复洗涤3次，在50℃低温干燥至恒重，即得辣木叶多糖粉末。
本发明的制备方法采用微波-超声波协同提取，盐酸法脱蛋白，过氧化氢法脱色和AB-8型大孔吸附树脂柱分离得到辣木叶多糖，该辣木叶制备方法具有提取时间短，提取温度低，耗能低和提取率高的优点。
本发明的微波-超声波协同提取辣木叶多糖是利用微波能使细胞内部的温度迅速上升，细胞内部压力增高使细胞破裂，药材内有效成分流出，并在较低的温度下溶于提取液。 该方法加热均匀，热效率较高，提取速度快。与比传统的回流提取具有高效、省时、节能的优点，在中药提取中具有良好的应用前景。
本发明采用的盐酸法脱蛋白具有脱蛋白率高，提取多糖纯度高的优点，同时，采用过氧化氢法脱色，具有脱色率高，操作简单，成本低，且不易与辣木叶多糖溶液中的色素发生吸附作用的优点，为得到高品质的辣木叶多糖提供可有价值的工艺条件。本发明制备的辣木叶多糖在波长为620nm下测定其含量达到28-31%，与传统的辣木叶制备方法相比，具有提取率高，省时、节能的优势。
另外，本发明还提供了辣木叶多糖在制备治疗高尿酸血症药物中的用途。经本发明的试验例证实，本发明的辣木叶多糖高、中和低剂量组具有降尿酸作用，而且在一定的范围内，辣木叶多糖剂量越多降尿酸作用越明显，该辣木叶通过降低胆固醇、三酰甘油、尿素氮、肌酐和黄嘌呤氧化酶的含量从而达到降低尿酸生成，同时也可以直接分解尿酸，改善肾功能、促进尿酸排泄、保护血管等功能，更有利于高尿酸血症患者的康复，具有广阔的医学应用前景。
与现有技术相比，本发明的辣木叶多糖的制备方法具有以下优点：
（1）本发明辣木叶多糖的制备方法采用了微波-超声波协同提取辣木叶多糖，与比传统的回流提取具有高效、省时、节能的优点，在中药提取中具有良好的应用前景；
（2）本发明辣木叶多糖的制备方法采用了盐酸法脱蛋白，具有脱蛋白率高，提取制备得到的多糖纯度高的优点；
（3）本发明辣木叶多糖的制备方法采用了 过氧化氢法脱色，具有脱色率高，操作简单，成本低，且不易与辣木叶多糖溶液中的色素发生吸附作用的优点，为得到高品质的辣木叶多糖提供可有价值的工艺条件。
具体实施方式：
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
实施例1、辣木叶多糖的制备
（1）备料：称取1kg辣木叶于50℃干燥2h，粉碎，过40目筛，得辣木叶粉；
（2）提取：取步骤（1）得到的辣木叶粉，加入辣木叶粉质量20倍体积的蒸馏水，在功率为500W的微波下处理6min，置45℃温水浴中功率为300W的超声提取2次，每次处理30min，过滤，合并滤液，将滤液减压浓缩至原体积的1/3，在14℃下，转速为10000 r/min的离心机离心10 min，取上清液，将上清液浓缩至原体积的1/4，得浓缩液；
（3）脱蛋白：将步骤（2）得到的浓缩液加入2mol/L盐酸调节其pH值至3.0，静置过夜，在3000r/min条件下离心4min，弃沉淀取上清液；
（4）脱色：将步骤（3）的上清液放置温度为75℃水浴中，加入0.1%的NaOH溶液调节其pH值至8，接着加入浓度为16%的过氧化氢，过氧化氢的添加量是上清液体积的0.2倍，脱色20min，过滤取滤液；
（5）分离：将步骤（4）的滤液进行逆流水透析 40 h，蒸馏水透析 20h，将透析液浓缩，加入AB-8 型大孔吸附树脂柱，加蒸馏水洗脱，洗脱至洗脱液加入95%乙醇无沉淀，收集洗脱液；将洗脱液浓缩至原体积的1/5后加入无水乙醇使含醇量达到80%，于4℃冰箱中过夜醇沉，在4℃下，转速为 40000 r/min的离心机离心10 min，取沉淀，将沉淀依次用无水乙醇、丙酮反复洗涤2次，在50℃低温干燥至恒重，即得辣木叶多糖粉末。
实施例2、辣木叶多糖的制备
（1）备料：称取1kg辣木叶于50℃干燥2.5 h，粉碎，过45目筛，得辣木叶粉；
（2）提取：取步骤（1）得到的辣木叶粉，加入辣木叶粉质量25倍体积的蒸馏水，在功率为500W的微波下处理7min，置50℃温水浴中功率为300W的超声提取2次，每次处理35min，过滤，合并滤液，将滤液减压浓缩至原体积的1/3，在14℃下，转速为10000 r/min的离心机离心10 min，取上清液，将上清液浓缩至原体积的1/4，得浓缩液；
（3）脱蛋白：将步骤（2）得到的浓缩液加入2mol/L盐酸调节其pH值至3.5，静置过夜，在3000r/min条件下离心55min，弃沉淀取上清液；
（4）脱色：将步骤（3）的上清液放置温度为80℃水浴中，加入0.1%的NaOH溶液调节其pH值至8.5，接着加入浓度为20%的过氧化氢，过氧化氢的添加量是上清液体积的0.25倍，脱色25min，过滤取滤液；
（5）分离：将步骤（4）的滤液进行逆流水透析 48 h，蒸馏水透析24h，将透析液浓缩，加入AB-8 型大孔吸附树脂柱，加蒸馏水洗脱，洗脱至洗脱液加入95%乙醇无沉淀，收集洗脱液；将洗脱液浓缩至原体积的1/5后加入无水乙醇使含醇量达到80%，于4℃冰箱中过夜醇沉，在4℃下，转速为 40000 r/min的离心机离心10 min，取沉淀，将沉淀依次用无水乙醇、丙酮反复洗涤3次，在50℃低温干燥至恒重，即得辣木叶多糖粉末。
实施例3、辣木叶多糖的制备
（1）备料：称取1kg辣木叶于50℃干燥3 h，粉碎，过50目筛，得辣木叶粉；
（2）提取：取步骤（1）得到的辣木叶粉，加入辣木叶粉质量25倍体积的蒸馏水，在功率为500W的微波下处理8min，置55℃温水浴中功率为300W的超声提取3次，每次处理40min，过滤，合并滤液，将滤液减压浓缩至原体积的1/3，在14℃下，转速为10000 r/min的离心机离心10 min，取上清液，将上清液浓缩至原体积的1/4，得浓缩液；
（3）脱蛋白：将步骤（2）得到的浓缩液加入2mol/L盐酸调节其pH值至4.0，静置过夜，在3000r/min条件下离心6min，弃沉淀取上清液；
（4）脱色：将步骤（3）的上清液放置温度为85℃水浴中，加入0.1%的NaOH溶液调节其pH值至9，接着加入浓度为23%的过氧化氢，过氧化氢的添加量是上清液体积的0.3倍，脱色30min，过滤取滤液；
（5）分离：将步骤（4）的滤液进行逆流水透析48 h，蒸馏水透析24h，将透析液浓缩，加入AB-8 型大孔吸附树脂柱，加蒸馏水洗脱，洗脱至洗脱液加入95%乙醇无沉淀，收集洗脱液；将洗脱液浓缩至原体积的1/5后加入无水乙醇使含醇量达到80%，于4℃冰箱中过夜醇沉，在4℃下，转速为 40000 r/min的离心机离心10 min，取沉淀，将沉淀依次用无水乙醇、丙酮反复洗涤4次，在50℃低温干燥至恒重，即得辣木叶多糖粉末。
对比例1、辣木叶多糖的制备
步骤（2）中的提取步骤为超声波协助提取，其余步骤如实施例2。
对比例2、辣木叶多糖的制备
步骤（3）中的脱蛋白步骤为用10%三氯乙酸调节其pH值至3，其余步骤如实施例2。
对比例3、辣木叶多糖的制备
步骤（4）中的脱色步骤为添加量是上清液体积的0.25倍活性炭脱色30min，其余步骤如实施例2。
试验例一、辣木叶多糖含量的测定试验
1、试验材料：实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2和对比例3提取的辣木叶多糖。
2、试验方法：在波长为620nm下，采用陈瑞娇等发表的题为“辣木叶中多糖含量的测定”论文中蒽酮-硫酸比色法测定的方法测定。
3、试验结果：
试验结果如表1所示。
表1 辣木叶多糖含量的测定试验数据
由表1可知，本发明的辣木叶多糖的制备方法提取的辣木叶多糖提取率高，纯度高的优点，与现有技术的回流提具有省时、节能的优点，利于该提取方法的大规模推广和应用。
试验例二、辣木叶多糖对高尿酸血症的影响试验
1、试验对象：雄性昆明小鼠60只。
2、高尿酸血症动物模型建立：采用腹腔注射氧嗪酸钾盐法，在昆明小鼠的腹腔一次性腹腔注射300mg/kg的氧嗪酸钾，正常小鼠相比，血清尿酸水平显著提高，有显著性差异，表明造模成功。
3、给药方法：
将60只昆明小鼠随机分为6组，留一组作为对照组，其余均在昆明小鼠的腹腔一次性腹腔注射300mg/kg的氧嗪酸钾盐，分别标志为模型组、别嘌呤醇组、多糖高剂量组、多糖中剂量组和多糖低剂量组，给药方式如下：
对照组：灌胃给予相同体积的生理盐水；
模型组；灌胃给予相同体积的生理盐水；
别嘌呤醇组：灌胃给予40mg/kg的别嘌呤醇；
中剂量组；灌胃给予200mg/kg实施例2制备的辣木叶多糖；
低剂量组；灌胃给予100mg/kg实施例2制备的辣木叶多糖；
高剂量组；灌胃给予300mg/kg实施例2制备的辣木叶多糖。
4、试验结果：
连续灌胃7天，末次给药1h后，取血，分离血清，采用酶联免疫吸附试验法（ELISA法）测定小鼠血尿酸、胆固醇、三酰甘油、尿素氮、肌酐；取肝脏组织检测黄嘌呤氧化酶活性的活性，结果如表2所示。
表 2 辣木叶多糖对高尿酸血症的影响试验数据
与模型组相比：*P<0.05，**P<0.01。
由表2得出，本发明的辣木叶多糖高、中和低剂量组的降尿酸作用与模型组相比具有显著的效果，而且在一定的范围内，辣木叶多糖剂量越多降尿酸作用越明显。与阳性对照组别嘌呤醇组相比，本发明的辣木叶多糖高剂量组的降尿酸作用强于别嘌呤醇组，而且本发明的辣木叶通过降低胆固醇、三酰甘油、尿素氮、肌酐和黄嘌呤氧化酶的含量从而达到降低尿酸生成，改善肾功能、促进尿酸排泄、保护血管等功能，更有利于高尿酸血症患者的康复，具有广阔的医学应用前景。
Claims (1)
1.一种辣木叶多糖在制备治疗高尿酸血症药物中的用途，其特征在于，所述辣木叶多糖的制备方法包括以下步骤：
(1)备料：称取1kg辣木叶于50℃干燥2h，粉碎，过40目筛，得辣木叶粉；
(2)提取：取步骤(1)得到的辣木叶粉，加入辣木叶粉质量20倍体积的蒸馏水，在功率为500W的微波下处理6min，置45℃温水浴中功率为300W的超声提取2次，每次处理30min，过滤，合并滤液，将滤液减压浓缩至原体积的1/3，在14℃下，转速为10000r/min的离心机离心10min，取上清液，将上清液浓缩至原体积的1/4，得浓缩液；
(3)脱蛋白：将步骤(2)得到的浓缩液加入2mol/L盐酸调节其pH值至3.0，静置过夜，在3000r/min条件下离心4min，弃沉淀取上清液；
(4)脱色：将步骤(3)的上清液放置温度为75℃水浴中，加入0.1％的NaOH溶液调节其pH值至8，接着加入浓度为16％的过氧化氢，过氧化氢的添加量是上清液体积的0.2倍，脱色20min，过滤取滤液；
(5)分离：将步骤(4)的滤液进行逆流水透析40h，蒸馏水透析20h，将透析液浓缩，加入AB-8型大孔吸附树脂柱，加蒸馏水洗脱，洗脱至洗脱液加入95％乙醇无沉淀，收集洗脱液；将洗脱液浓缩至原体积的1/5后加入无水乙醇使含醇量达到80％，于4℃冰箱中过夜醇沉，在4℃下，转速为40000r/min的离心机离心10min，取沉淀，将沉淀依次用无水乙醇、丙酮反复洗涤2次，在50℃低温干燥至恒重，即得辣木叶多糖粉末。
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