CN104546895B - λ‑卡拉胶寡糖在制备抗狂犬病毒药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了λ‑卡拉胶寡糖在制备抗狂犬病毒药物中的新用途。试验证明：λ‑卡拉胶寡糖细胞毒性小，可以在多种类型的细胞上抑制多种毒株的狂犬病毒，并且在狂犬病毒入侵细胞的各个阶段均具有抑制效果，尤其是在病毒吸附后的阶段，在病毒感染细胞后12小时，λ‑卡拉胶寡糖仍能够显著减少细胞内的狂犬病毒量。依据上述发现，λ‑卡拉胶寡糖可以作为一种廉价的、有效的伤口处理剂，代替抗狂犬病毒免疫球蛋白，最大限度地减少伤口部位的病毒，降低狂犬病的发病率。
Description
技术领域
本发明涉及λ-卡拉胶寡糖的药物新用途，尤其是在制备抗狂犬病毒药物中的新用途。
背景技术
狂犬病是最古老的传染病之一，是由狂犬病毒(Rabies virus，RABV)引起的一种人畜共患传染病。狂犬病是迄今为止人类病死率最高的急性传染病，一旦发病，病死率几乎达100％。据世界卫生组织(WHO)报告，全世界每年有约55000人死于狂犬病，其中绝大多数分布在非洲和亚洲。近些年，我国平均每年约有3000人左右死于狂犬病，多数发生在广大农村地区或是城乡结合部，主要是由带毒动物咬伤而被感染。RABV随唾液进入咬伤部位，在肌肉中短暂孵育后进入最近的神经纤维，并逐渐向脑移行，伤口部位离大脑越近，其发病也越快。一旦进入神经系统，RABV复制和迁移将不易干涉。暴露后处置(PEP)是预防和控制狂犬病的最有效途径，根据咬伤的程度，通常采用三种手段：1)采用0.1％的肥皂水冲洗创口；2)用抗RABV免疫球蛋白注射创口，中和伤口部位的病毒；3)紧急免疫4-5针狂犬疫苗。目前，许多人只重视免疫狂犬病疫苗，忽略了创口的处理，使RABV在疫苗免疫产生足够的中和抗体之前(通常需要2-4周)潜入大脑，造成免疫失败。由于抗RABV免疫球蛋白价格高昂，难以广泛用于创口的处理，而且需要到一定规模的医疗机构才能接受抗RABV免疫球蛋白处理，难以在咬伤后的第一时间处理伤口。因此，迫切需要开发一种能够在创口部位有效抑制RABV，并且价格低廉，能够广泛应用于广大医疗欠发达地区的药物。
λ-卡拉胶是一种从海洋红藻(诸如角叉菜、杉藻、麒麟菜)中提取得到的水溶性多糖，其结构具有重复的α-(1-4)-D-半乳吡喃糖-β-(1-3)-D-半乳吡喃糖二糖单元骨架，骨架上的多个位置取代有硫酸基团，其降解产物λ-卡拉胶寡糖的化学结构式如下。λ-卡拉胶寡糖有抗凝血、抗病毒(如疱疹病毒)、抗肿瘤等多种生物活性，但是，目前还没有抗狂犬病毒的相关文献报导。
发明内容
本发明发现λ-卡拉胶寡糖能够在体外有效抑制RABV，且具有较长的有效作用时间。故可将λ-卡拉胶寡糖作为外敷或清洗药物用于清除咬伤部位的狂犬病毒，代替价格高昂的抗RABV免疫球蛋白。
经细胞实验表明λ-卡拉胶寡糖细胞毒性弱，如图1所示，即使在细胞培养基中添加1000ug/ml的λ-卡拉胶寡糖，通过MTS分析表明细胞活性无显著下降。同时我们还发现λ-卡拉胶寡糖在多种细胞，如SK-N-SH细胞(人神经瘤细胞)、NA细胞(小鼠神经瘤细胞)和HEK-293T细胞(人胚胎肾细胞)中均能够显著抑制狂犬病毒的增殖，表明药物的作用具有广泛性，而不是细胞特异性的(如图2所示)。
同时我们检测了药物对多个RABV毒株的抑制作用，包括实验室毒株SAD和CVS-B2c株，以及分离于病犬的野毒安徽株，结果表明采用250ug/ml以上浓度的λ-卡拉胶寡糖，均不能在细胞上清中检测到上述三种病毒，表明λ-卡拉胶寡糖能够高效抑制多种毒株的RABV(如图3所示)。
进一步的研究表明：λ-卡拉胶寡糖对RABV的抑制作用发生在病毒入侵细胞的多个阶段，包括病毒对细胞的吸附阶段、病毒进入细胞之后的融合阶段，以及病毒在细胞质中的转录与翻译阶段(如图4所示)。其中，对病毒吸附细胞的影响较小(病毒滴度仅下降10倍)，不影响到病毒吸附后的内吞(如图5所示)，但是显著影响到病毒糖蛋白介导的膜融合过程，从而影响到病毒的脱壳(如图6所示)。此外，λ-卡拉胶寡糖对病毒脱壳后的复制也有一定的抑制作用。
我们还进一步测试了病毒在进入细胞之后λ-卡拉胶寡糖的有效作用时间，分别在病毒进入细胞之后的0、6、12和24小时检测细胞上清中的病毒滴度，发现随着感染后时间的延续，药物对病毒的清除能力逐渐下降，但是在12小时之后，药物仍然对RABV有显著的抑制作用(如图7所示)。
鉴于λ-卡拉胶寡糖与肝素和硫酸乙酰肝素有着类似的结构，我们检测肝素和硫酸乙酰肝素是否也能够抑制RABV。通过在病毒感染细胞的各个阶段中分别添加一定浓度的肝素和硫酸乙酰肝素，如图8所示，结果发现λ-卡拉胶寡糖、肝素和硫酸乙酰肝素在病毒的吸附阶段均对RABV有较弱的抑制作用，但在病毒吸附后阶段，肝素和硫酸乙酰肝素远没有λ-卡拉胶寡糖抑制病毒的能力强大。
总之，我们发现λ-卡拉胶寡糖在细胞中能够高效抑制RABV的增殖，且无细胞有毒性，因此可以作为狂犬病伤口处理的药物，最大限度的消除伤口部位的病毒。目前处理伤口的抗RABV免疫球蛋白由于价格高昂，难以广泛使用，而λ-卡拉胶寡糖来自海洋藻类，成本较低，可以制成药膏、洗剂等多种制剂形式，从而广泛应用。基于λ-卡拉胶寡糖的上述发现，我们还可以进一步优化其结构，降低分子量，使之能够通过血脑屏障，最终开发出一种能够抑制中枢神经系统中RABV的药物，破解狂犬病发病后不可治疗的神话。
附图说明
图1是λ-卡拉胶寡糖的细胞毒性检测结果。
图2是在不同细胞系测试λ-卡拉胶寡糖对RABV SAD株抑制作用的结果。
图3是在SK-N-SH细胞上测试RABV不同毒株对λ-卡拉胶寡糖的敏感性结果。
图4是探索λ-卡拉胶寡糖对RABV抑制作用机制的结果。
图5是测试λ-卡拉胶寡糖是否影响RABV进入细胞。
图6是测试λ-卡拉胶寡糖是否影响RABV表面糖蛋白诱导的膜融合。
图7是RABV SAD株感染SK-N-SH细胞后不同时间点用λ-卡拉胶寡糖处理细胞后的情况。
图8是λ-卡拉胶寡糖与硫酸乙酰肝素和肝素对病毒抑制效果的比较。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1病毒
狂犬病病毒实验室固定毒株SAD-L16、CVS-B2c、狂犬病病毒野毒安徽株DRV-AH08(犬源狂犬病病毒)均由华中农业大学农业微生物国家重点实验室保存。
1.1.2海洋寡糖
λ-卡拉胶寡糖由中国海洋大学提供，分子量约为4，000Da，最大水溶解度为50mg/mL。分别用DMEM或ddH2O溶解成5mg/mL溶液，经0.22μm微孔滤器过滤除菌，分装后置于4℃保存备用，实验时用细胞生长液、维持液或ddH2O稀释成所需浓度。
1.1.3细胞和单克隆抗体
SK-N-SH细胞(人神经瘤细胞)，生长于含15％胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)(Gibco,Grand Island,NY)的MEM(Minimum Essential Medium,MEM)(Mediatech,Herndon,VA)。HEK-293T细胞(人胚胎肾细胞)，生长于含10％胎牛血清(Fetal bovineserum,FBS)(Gibco,Grand Island,NY)的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM)(Mediatech,Herndon,VA)培养液。鼠神经瘤细胞(Mouse neuroblastoma cells,NA)，生长于含10％FBS的RMPI 1640培养液(Mediatech)。异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate,FITC)标记的狂犬病毒核蛋白单克隆抗体购自Fujirebio(Melvin,PA)公司。
1.1.4主要试剂
MTS一步法细胞活力检测试剂盒购自Promega公司。肝素购自sigma-aldrich公司。硫酸乙酰肝素购自Iduron公司。
1.2细胞毒性测试
用MTS法测试λ-卡拉胶寡糖对SK-N-SH细胞的毒性作用。选择1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL、15.125μg/mL七个浓度进行测试。
(1)长成单层的SK-N-SH细胞用含有不同浓度的λ-卡拉胶寡糖的细胞维持液处理，在37℃孵育72小时。
(2)在每孔加入20μl的MTS溶液，于37℃孵育1小时。
(3)将细胞培养板置于酶标仪，于490nm测吸光值，将所测值于对照细胞比较。
1.3抑制RABV效果的测试
在前期的实验中发现λ-卡拉胶寡糖浓度为250μg/mL时对狂犬病病毒增殖具有抑制作用。选择250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL、15.125μg/mL五个浓度进行试验，比较不同浓度λ-卡拉胶寡糖抑制狂犬病病毒的效果。
(1)长成单层的细胞经胰酶消化后，以生长液稀释接种24孔细胞培养板中，置于37℃的CO2恒温培养箱培养。
(2)单层细胞长至80％后，弃去原生长液，分别加入含有250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL、15.125μg/mL的λ-卡拉胶寡糖细胞维持液，于37℃的CO2恒温培养箱孵育2h。
(3)将维持液暂时移至别处(不弃去)，加入0.01MOI SAD病毒悬液，于37℃的CO2恒温培养箱孵育50min。
(4)弃去病毒悬液，移回含λ-卡拉胶寡糖细胞维持液，于37℃的CO2恒温培养箱培养48h。
(5)收集上述细胞培养液，8500r/min离心15min，取上清进行病毒滴度测定。
1.4病毒滴定
取96孔细胞培养板，以4行×9列为一个样品区，每板两个分区，将每个孔内加入90μl的含10％FBS的DMEM细胞培养液，每个样品设4个重复，将10μl的病毒原液加入到96孔细胞板的第一列，充分混合后吸取10μl混合液到第二列，充分混匀，再吸出10ul混合液到下一列，依次连续进行10倍的倍比稀释，至第9列孔后弃掉10μl的混合液。每孔加入5×104的BSR细胞后于37℃，5％CO2感作48h，然后弃细胞上清液，用80％冷丙酮固定感染细胞。以抗狂犬病毒N蛋白荧光抗体染色后，通过荧光显微镜观察并记录抗原阳性区域。根据Reed-muench法进行病毒毒力的计算并记录为FFU/ml。
1.5作用阶段测试
用狂犬病病毒SAD毒株感染SK-N-SH细胞为模型，确定λ-卡拉胶寡糖抑制狂犬病病毒增殖的阶段，通过病毒滴度测定试验观察结果。
1.5.1保护作用
(1)长成单层的SK-N-SH细胞经胰酶消化后，以生长液稀释接种24孔细胞培养板中，置于37℃的CO2恒温培养箱培养。
(2)细胞长至50％后，分别加入含有250μg/mLλ-卡拉胶寡糖的生长液孵育至细胞长至80％。
(3)弃去生长液，用PBS洗涤2次，加0.01MOI病毒悬液于37℃的CO2恒温培养箱孵育50min。
(4)弃去病毒液，PBS洗涤2次，加维持液37℃培养48h。
(5)收集上述细胞培养液，8500r/min离心15min，取上清进行病毒滴度测定。
1.5.2抑制病毒吸附作用
(1)长成单层的SK-N-SH细胞经胰酶消化后，以生长液稀释接种24孔细胞培养板中，置于37℃的CO2恒温培养箱培养。
(2)细胞长至80％后，分别加入含有0.01MOI病毒和250μg/mLλ-卡拉胶寡糖的维持液37℃孵育50min。
(3)取出细胞板，弃去液体，以PBS洗涤2次，加维持液37℃培养48h。
(4)收集上述细胞培养液，8500r/min离心15min，取上清进行病毒滴度测定。
1.5.3治疗作用
(1)长成单层的SK-N-SH细胞经胰酶消化后，以生长液稀释接种24孔细胞培养板中，置于37℃的CO2恒温培养箱培养。
(2)细胞长至80％后，加入含有0.01MOI病毒于37℃孵育50min。
(3)取出细胞板，弃去液体，以PBS洗涤2次，分别加入含有250μg/mLλ-卡拉胶寡糖维持液于37℃培养48h。
(4)收集上述细胞培养液，8500r/min离15min，取上清进行病毒滴度测定。
1.6病毒吸附细胞后，侵入细胞的病毒基因组RNA定量检测
(1)以5M.O.I.的SAD接种长成单层的SK-N-SH，于4℃孵育1h。
(2)弃去病毒，用PBS洗细胞3遍，除去没有吸附上细胞的病毒粒子。
(3)加入含有或者不含有药物的2％FBS的DMEM于37℃CO2恒温培养箱培养1h，使吸附上细胞的病毒进入细胞。
(4)弃去培养基，用PBS洗3遍。
(5)加入蛋白酶K于4℃孵育45min，除去吸附但没有进入细胞的病毒。
(6)弃去蛋白酶K，用PBS轻柔地洗2遍，加入Trizol。
(7)提取总RNA，进行定量PCR。引物为：病毒基因组RNA，5’-GAGGAATTCTTCGGGAAAGG-3’，5’-CCTCGTCGTCAGAGTTGACA-3’；人源b-actin mRNA，5’-CCTGTGGCATCCACGAAACTA-3’，5’-TGTCAAGAAAGGGTGTAACGCAA-3’。
1.7低pH依赖的细胞融合试验
(1)以5MOI的SAD接种BSR细胞于24孔板，37℃CO2恒温培养箱培养48h。
(2)弃去培养基，加入融合培养基(pH＝5.5的DMEM)处理2min。
(3)弃去融合培养基，加入含2％FBS的DMEM于37℃孵育1h。
(4)弃去培养基，用80％冷丙酮固定细胞，加入碱性品红染色，于显微镜下观察结果。
2.实验结果
2.1细胞毒性
如图1所示，即使在细胞培养基中添加1000ug/ml的λ-卡拉胶寡糖，通过MTS分析表明细胞活性无显著下降，说明λ-卡拉胶寡糖细胞毒性弱。
2.2λ-卡拉胶寡糖在不同细胞系上抑制RABV的情况
分别在SK-N-SH细胞(人神经瘤细胞)、NA细胞(小鼠神经瘤细胞)和HEK-293T细胞(人胚胎肾细胞)上测试了λ-卡拉胶寡糖对RABV SAD株的抑制效果。图2显示，λ-卡拉胶寡糖能在上述细胞系上对RABV具有高效的抑制效果，在浓度高于250ug/ml时在细胞上清中均检测不到病毒的存在。
2.3不同RABV毒株对λ-卡拉胶寡糖的敏感性
选取SK-N-SH细胞接种RABV不同毒株，包括实验室固定毒株SAD和CVS-B2c株，以及分离于病犬的野毒安徽株DRV-AH08，测试λ-卡拉胶寡糖对上述毒株的抑制效果。实验结果(图3)显示，λ-卡拉胶寡糖对所测试所有毒株均具有显著地抑制效果。
2.4λ-卡拉胶寡糖抑制RABV作用方式的测试
用λ-卡拉胶寡糖以不同的方式处理RABV和细胞，然后检测病毒滴度。图4显示，药物对RABV的抑制作用发生在多个阶段：包括影响到病毒对细胞的吸附、RABV进入细胞之后的阶段。其中，在病毒吸附细胞后加入药物，病毒的增殖被完全地抑制了。表明λ-卡拉胶寡糖对病毒的抑制主要发生在病毒吸附后阶段。
接着测试了在病毒吸附细胞后，药物是否影响了病毒进入细胞。图5显示，药物并没有影响病毒吸附细胞后内吞这一过程。图6显示，在细胞融合前加入药物能够完全抑制RABV G蛋白诱导的膜融合，显示药物可能抑制了病毒进入细胞后的脱壳阶段。
2.5λ-卡拉胶寡糖也影响RABV脱壳后的行为
在病毒感染细胞后不同时间加入药物。图7显示，随着时间的滞后，药物对病毒的清除能力逐渐下降，但是在6小时之后(病毒脱壳已全部完成)，药物仍然对RABV有显著的抑制作用。这一结果提示药物除了抑制病毒脱壳，还能够作用于病毒脱壳后的复制阶段。
2.6λ-卡拉胶寡糖与硫酸乙酰肝素、肝素对RABV抑制效果的比较
由于λ-卡拉胶寡糖在结构上与硫酸乙酰肝素和肝素相似，我们在病毒感染的不同阶段比较了这三类药物对病毒增殖的影响。图8所示，在测试的三种阶段，硫酸乙酰肝素和肝素仅对RABV有轻微的抑制作用，而λ-卡拉胶寡糖对RABV在吸附细胞后阶段的抑制作用显著优于上述两种药物。
Claims (2)
1.λ-卡拉胶寡糖在制备抗狂犬病毒药物中的用途，所述抗狂犬病毒药物为狂犬病伤口处理药物。
2.一种狂犬病伤口处理药物，含有有效剂量的λ-卡拉胶寡糖，所述药物为洗液，所述洗液中含有250ug/ml以上浓度的λ-卡拉胶寡糖。
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