CN117159546A - 石蒜碱在制备抗狂犬病的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了石蒜碱在制备抗狂犬病的药物中的应用。通过测定狂犬病毒感染后细胞与健康细胞中的CC₅₀值与IC₅₀值，发现石蒜碱能够作为狂犬病病毒的抑制剂，对于狂犬病病毒具有广谱抗病毒作用；该抗病毒作用没有毒株特异性并且不具备细胞依赖性，在所有狂犬病毒感染的细胞中都可以起到优异的抗病毒效果。进一步通过免疫荧光发现石蒜碱在浓度为6.25～25μmol/L时能对狂犬病毒起到良好的抑制效果，在浓度达到12.5μmol/L时，几乎完全抑制了狂犬病毒的表达，为防治狂犬病毒提供了新的药材原料。

Description

石蒜碱在制备抗狂犬病的药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及石蒜碱在制备抗狂犬病的药物中的应用。

背景技术

石蒜碱(Lycorine)属于异喹啉生物碱，分子式为C₁₆H₁₇NO₄，是传统药用植物石蒜的生物碱成分，最先由日本人森岛库太从传统中药石蒜的鳞片中分离得到。石蒜碱药用价值强，具有较为显著的催吐作用，毒性较小且具有祛痰作用；石蒜碱经过氢化后生成二氢石蒜碱，二氢石蒜碱具有较强的抗阿米巴痢疾作用，其毒性较小且目前以供临床使用；石蒜碱的丙胺盐在动物身上表现出抗肿瘤作用。生物活性研究表明，石蒜碱及其衍生物具有抗炎、抗疟剂、抑制乙酷胆碱酯酶和保护心血管作用。

狂犬病是由狂犬病病毒(RABV)入侵人或动物中枢神经系统(CNS)所引起的一种人兽共患烈性传染病，是一种出现临床症状后致死率几乎100％的病毒性传染病。狂犬病毒是弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒属的成员，其RNA全长约11kb左右，病毒的形态符合弹状病毒科病毒的典型特征：前端呈半圆形，后端平齐。根据对狂犬病毒N蛋白单克隆抗体以及G蛋白系列的分析和鉴定，全球各地的狂犬病毒主要分为4个血清型。其中血清1型为人们所熟知的地理分布最广、对世界人民健康威胁最大的狂犬病毒，包括野病毒和固定毒实验室株。随着现代分子生物学的研究进展，参照狂犬病毒核蛋白(Nprotein)基因N端500个核苷酸的相似率，狂犬病毒属被分为7种基因型。

据统计，全世界每年都有数万人死于狂犬病，其中我国政府每年都要投入上亿元用于狂犬病的预防，可见狂犬病依然是影响全球经济和公共卫生的重要疾病。目前，国内外针对狂犬病的被动免疫制剂主要为人狂犬病免疫球蛋白(HRIG)。人狂犬病免疫球蛋白取用于人狂犬病疫苗，按国家批准的免疫程序对健康人进行自动免疫所采集的血浆，经提取、纯化和病毒灭活等步骤制备而成。其缺点是产量低，供应有限，成本高，质量难以控制，并有血清病类过敏反应和血源疾病传染的风险。国内外临床上至今没有治疗狂犬病的特效药，一旦发病，其病毒的生长及活性难以抑制，感染病毒群体几乎100％死亡，是目前人类致死率最高的传染病。

因此研究狂犬病的治疗药物具有重要的科学意义和现实意义。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供石蒜碱在制备抗狂犬病的药物中的应用。

本发明的第一目的是提供石蒜碱在制备抗狂犬病的药物中的应用。

本发明的第二目的是提供一种抗狂犬病的药物。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

发明人通过测定狂犬病毒感染后细胞与健康细胞中的CC₅₀值与IC₅₀值，发现石蒜碱是狂犬病毒的抑制剂，并进一步通过免疫荧光发现石蒜碱作为抗狂犬病毒时的最佳浓度，因此本发明请求保护：

石蒜碱在制备抗狂犬病的药物中的应用。

优选地，所述狂犬病为狂犬病毒街毒株和/或狂犬病毒固定毒株引起的狂犬病。

优选地，所述抗狂犬病为：抑制狂犬病毒生长和/或降低狂犬病毒滴度。

抑制狂犬病毒生长和/或降低狂犬病毒蛋白表达量，所述狂犬病毒蛋白为狂犬病毒P蛋白和/或狂犬病毒G蛋白。

狂犬病毒G蛋白是构成狂犬病毒表面纤突的糖蛋白，具有凝集红细胞的特性，是狂犬病毒与细胞受体结合的主要蛋白结构；狂犬病毒P蛋白能够自身相互作用形成二聚体，也能与狂犬病毒L蛋白结合进而影响狂犬病毒的转录和复制，还可以与N-RNA复合体结合参与狂犬病毒的转录。

本发明还请求保护一种抗狂犬病的药物，所述药物以石蒜碱作为主要有效成分。

优选地，所述石蒜碱的浓度为6.25～25μmol/L。

更优选地，所述石蒜碱的浓度为12.5～25μmol/L。

进一步优选地，所述石蒜碱的浓度为12.5μmol/L。

优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

更优选地，所述药物的剂型为任何一种药剂学上所用的剂型。

优选地，所述狂犬病为狂犬病毒街毒株和/或狂犬病毒固定毒株引起的狂犬病。

其中狂犬病毒街毒株为从自然界中直接分离得到的狂犬病毒株；狂犬病毒固定毒株为将狂犬病毒反复注射于兔脊髓进行免疫后收集的狂犬病毒株。

优选地，所述抗狂犬病为：抑制狂犬病毒生长和/或降低狂犬病毒滴度。

抑制狂犬病毒生长和/或降低狂犬病毒蛋白表达量，所述狂犬病毒蛋白为狂犬病毒P蛋白和/或狂犬病毒G蛋白。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了石蒜碱在制备抗狂犬病的药物中的应用。通过测定狂犬病毒感染后细胞与健康细胞中的CC₅₀值与IC₅₀值，发现石蒜碱能够作为狂犬病病毒的抑制剂，对于狂犬病病毒具有广谱抗病毒作用；该抗病毒作用不仅没有毒株特异性并且不具备细胞依赖性，在所有狂犬病毒感染的细胞中都可以起到优异的抗病毒效果。进一步通过免疫荧光发现石蒜碱在浓度为6.25～25μmol/L时能对狂犬病毒起到良好的抑制效果，在浓度达到12.5μmol/L时，几乎完全抑制了狂犬病毒的表达，为防治狂犬病毒提供了新的药材原料。

附图说明

图1为石蒜碱的化学分子结构示意图；

图2为接种狂犬病病毒弱毒株HEP-Flury的NA细胞的免疫荧光观察结果图；

图3为接种狂犬病病毒强毒株CVS-11的NA细胞的免疫荧光观察结果图；

图4为接种狂犬病病毒街毒株GDSH-01的NA细胞的免疫荧光观察结果图；

图5为NA细胞和SK细胞在不同狂犬病毒毒株和不同浓度的石蒜碱处理后的免疫荧光观察结果图；

图6为病毒滴度计算结果图；

图7为感染RABV病毒后的NA细胞在石蒜碱处理后的G蛋白和P蛋白的表达量变化图；a为电泳结果图；b为P蛋白表达量变化柱形图；c为G蛋白表达量柱形图。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1石蒜碱在神经细胞和/或非神经细胞中的CC₅₀和IC₅₀

石蒜碱的化学分子结构示意图如图1所示。

1、实验方法

(1)石蒜碱在细胞中的半数细胞毒性浓度CC₅₀的测定

将100mmol/L的石蒜碱溶液用DMSO培养基稀释500倍得到200μmol/L的溶液，然后按照二倍比梯度稀释，得到浓度为0.78～200μmol/L的石蒜碱稀释液。

将NA细胞、SK细胞和BHK-21细胞分别以1×10⁵个细胞/孔平铺于96孔细胞板中，得到含有NA细胞的细胞板、SK细胞的细胞板和BHK-21细胞的细胞板，以含有NA细胞的细胞板为例，检测石蒜碱的半数细胞毒性浓度CC₅₀(μM)，具体如下：

实验孔设置为：分别将浓度为0.78～200μmol/L的石蒜碱稀释液以每孔100μL加入含有NA细胞的细胞板中，每个浓度的石蒜碱稀释液重复8个复孔(96孔板中的一列)；空白孔设置为：不添加药物处理；阴性孔设置为：以100μL/孔加入DMSO(0.1％，w/w)培养NA细胞。

所有细胞孔培养48h后，弃上清，使用1640培养液洗涤细胞，每孔加入20μL的MTT溶液(5mg/mL)，置于37℃恒温培养箱中孵育4h，孵育结束后弃上清，每孔加入150μL的DMSO，置于摇床上震荡10min，在酶标仪中于490nm波长处或570nm波长处检测OD值，分别检测得到各个浓度的石蒜碱培养的实验孔的OD值、空白孔的OD值和阴性孔的OD值，并按照式I计算细胞存活率(％)。

式I：细胞存活率(％)＝(实验孔OD值/阴性孔OD值)×100％。

细胞存活率为50％时，对应的实验孔的石蒜碱稀释液的浓度即为石蒜碱的半数细胞毒性浓度CC₅₀。

对含有SK细胞的细胞板和含有BHK-21细胞的细胞板进行同等处理，测定石蒜碱在SK细胞和BHK-21细胞中的CC₅₀(μM)。

(2)石蒜碱在细胞中IC₅₀的测定

以步骤(1)得到的含有NA细胞的细胞板为例，检测石蒜碱的IC₅₀，具体如下：

将狂犬病毒强毒株CVS-11以MOI＝1感染NA细胞后，将石蒜碱利用DMSO分别稀释得到浓度为1.56μmol/L、3.125μmol/L、6.25μmol/L、12.5μmol/L和25μmol/L的石蒜碱溶液。

向细胞板中分别加入1000μL不同浓度的石蒜碱溶液，培养24h后，分离上清液和培养后细胞，通过TCID₅₀技术检测培养后细胞中的狂犬病毒滴度的抑制效果，以狂犬病毒滴度为横坐标，石蒜碱浓度为纵坐标计算回归方程，将抑制一半的狂犬病毒滴度代入回归方程，计算得到石蒜碱在NA细胞中抑制半数狂犬病毒的药物浓度，即为IC₅₀(μM)。

对含有SK细胞的细胞板和含有BHK-21细胞的细胞板进行同等处理，测定石蒜碱在SK细胞和BHK-21细胞中抑制半数狂犬病毒的药物浓度。

2、实验结果

CC₅₀测定结果和IC₅₀测定结果如表1所示。

表1CC₅₀测定结果和IC₅₀测定结果

细胞	CC50(μmol/L)	IC50(μmol/L)
			BHK-21	0.71	88.61
NA	0.4	93.35
			SK	0.73	62.72

结果说明：石蒜碱在BHK-21细胞、NA细胞和SK细胞中CC₅₀较大，说明其对该细胞毒性较小；而IC₅₀较小，说明石蒜碱在较低浓度就能发挥良好的抗病毒作用，结果提示石蒜碱是一个潜在的狂犬病病毒抑制剂。

实施例2石蒜碱在NA细胞中的有效抗狂犬病病毒浓度的测定

1、实验方法

将生长状态良好的NA、SK和BHK-21细胞分别接种入不同的12孔板中，在37℃培养12h后，接种狂犬病毒毒株，1h后更换细胞培养液，给予不同浓度的石蒜碱处理，收集细胞。

具体如下：

以狂犬病毒弱毒株HEP-Flury为例，将NA细胞平均分为6组，分别按照MOI＝1.0接种狂犬病毒弱毒株HEP-Flury，1h后更换细胞培养液，其中5组分别给予1000μL浓度为1.56μmol/L、3.125μmol/L、6.25μmol/L、12.5μmol/L和25μmol/L的石蒜碱溶液，剩余1组作为空白对照组，给予等体积的0.1％(w/w)DMSO溶液。将各组NA细胞置于培养箱中培养24h后进行免疫荧光(分别使用FITC和DAPI作为染料)，使用荧光显微镜观察结果。

将狂犬病毒弱毒株HEP-Flury分别替换成狂犬病毒强毒株CVS-11和狂犬病毒街毒株GDSH-01，进行同等处理细胞，测定不同浓度的石蒜碱溶液处理狂犬病毒毒株后的免疫荧光。

2、实验结果

接种狂犬病病毒弱毒株HEP-Flury的细胞的免疫荧光观察结果如图2所示；接种狂犬病病毒强毒株CVS-11的细胞的免疫荧光观察结果如图3所示；接种狂犬病病毒街毒株GDSH-01的细胞的免疫荧光观察结果如图4所示；其中免疫荧光观察结果中首行为选用FITC作为荧光染料时的荧光观察结果，中间行为选用DAPI作为荧光染料时的荧光观察结果，第三行为选用FITC作为荧光染料的荧光观察结果与选用DAPI作为荧光染料时的荧光观察结果的叠加图。

结果显示：无论是接种狂犬病病毒弱毒株HEP-Flury、狂犬病病毒强毒株CVS-11或狂犬病病毒街毒株GDSH-01的细胞，与空白对照组相比，在石蒜碱添加浓度为12.5μmol/L时，几乎完全抑制了狂犬病病毒的荧光。

结果说明：石蒜碱在NA细胞中的有效抗病毒浓度为12.5μmol/L。

实施例3石蒜碱对感染RABV的神经细胞中病毒的影响

1、实验方法

(1)对RABV病毒在细胞中滴度的影响

取生长状态良好的NA细胞和SK细胞分别传代接入12孔板中，在37℃培养12h后，接种狂犬病毒，1h后更换细胞培养液，给予不同浓度的石蒜碱处理。

以NA细胞为例，具体如下：

将NA细胞平均分为5组，分别按照MOI＝1.0接种狂犬病毒强毒株CVS-11，1h后更换细胞培养液，其中4组分别给予1000μL浓度为1.56μmol/L、3.125μmol/L、6.25μmol/L、和12.5μmol/L的石蒜碱溶液，剩余1组作为空白对照组，给予等体积的0.1％(w/w)DMSO溶液；将各组细胞置于37℃培养箱中培养24h后，分别收集5组细胞的上清液，进行免疫荧光，使用荧光显微镜观察结果，并使用TCID₅₀方法计算狂犬病病毒滴度。

TCID₅₀方法：将生长状态良好的NA细胞使用胰酶消化成单个细胞悬液(2×10⁵个/mL)后，在96孔板中以每孔加入100μL单个细胞悬液，在37℃，5％CO₂培养箱中培养24h，待细胞生长至孔板面积的75％～80％后，在无菌条件下分别将5组细胞的上清液进行倍比稀释(10^-1～10^-8)，得到倍比稀释后的细胞上清(病毒液)，将病毒液按照50μL/孔加入96孔板中，每个浓度重复4个孔，接着在37℃，5％ CO₂培养箱中培养48h，取出96孔板并弃去液体，使用200μL质量浓度为80％，4℃的丙酮溶液洗涤一次后，弃去液体再每孔加入200μL质量浓度为80％，4℃的丙酮溶液，在-20℃固定30min后，弃去液体，使用PBS溶液洗涤3次后，每孔加入50μL异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗狂犬病病毒N单克隆抗体(RABV-N)，在37℃避光孵育1h，孵育结束后弃去抗体，用PBS洗涤三次后，在倒置荧光显微镜下观察，检测到特异性荧光的孔为记为阳性，根据Reed-Muench法计算病毒滴度。

对SK细胞进行同等处理，并观察不同浓度的石蒜碱溶液处理三种狂犬病毒毒株后的免疫荧光和病毒滴度。

(2)对RABV病毒蛋白在细胞中的的表达影响

取生长状态良好的NA细胞传代接入6孔板中，在37℃培养12h后，分别用1000μL浓度为1.56μmol/L、3.125μmol/L、6.25μmol/L、12.5μmol/L和25μmol/L的石蒜碱溶液处理不同孔中的NA细胞，2h后再按照MOI＝1接种狂犬病病毒HEP-Flury，接种病毒后继续培养24h。

培养结束后向每孔中加入200μL含PMSF的RIPA裂解液，置于冰上，摇动裂解30min后，用移液器吹打并转移至灭菌的1.5mL离心管中，进行Western blot检测P蛋白和G蛋白的表达。

2、实验结果

(1)NA细胞和SK细胞在狂犬病毒强毒株CVS-11感染后利用不同浓度的石蒜碱处理后的免疫荧光观察结果如图5所示，病毒滴度计算结果如图6所示。

结果显示：在NA细胞和SK细胞中，与空白对照组相比，随着石蒜碱浓度的升高，狂犬病毒的荧光逐渐下降，在石蒜碱浓度为1.56μmol/L时狂犬病毒滴度开始受到抑制。结果说明：石蒜碱能够抑制狂犬病病毒的的复制。

(2)感染RABV病毒后的NA细胞在石蒜碱处理后的G蛋白和P蛋白的表达量变化如图7所示，结果显示：石蒜碱浓度在12.5μmol/L时对狂犬病病毒HEP-Flury的蛋白表达具有显著抑制作用。

结果说明：石蒜碱可以抑制狂犬病病毒的复制。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.石蒜碱在制备抗狂犬病的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述狂犬病为狂犬病毒街毒株和/或狂犬病毒固定毒株引起的狂犬病。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗狂犬病为：抑制狂犬病毒生长和/或降低狂犬病毒滴度。

4.一种抗狂犬病的药物，其特征在于，所述药物以石蒜碱作为主要有效成分。

5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述石蒜碱的浓度为6.25～25μmol/L。

6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述石蒜碱的浓度为12.5～25μmol/L。

7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述石蒜碱的浓度为12.5μmol/L。

8.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

9.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述狂犬病为狂犬病毒街毒株和/或狂犬病毒固定毒株引起的狂犬病。

10.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述抗狂犬病为：抑制狂犬病毒生长和/或降低狂犬病毒滴度。