CN1563088A

CN1563088A - 一种抗流行性感冒特异性复合IgY及其新型制剂

Info

Publication number: CN1563088A
Application number: CN 200410008799
Authority: CN
Inventors: 包晟; 胡义结; 杨荣
Original assignee: YACHEN PHARMACEUTICAL GROUP (YUANDONG) CO Ltd
Current assignee: Shenzhen Jason Intelligent Biotechnology Co Limlted Prc
Priority date: 2004-03-19
Filing date: 2004-03-19
Publication date: 2005-01-12
Anticipated expiration: 2024-03-19
Also published as: CN1563088B

Abstract

本发明公开了一种抗流感病毒各个多肽抗原以及抗继发感染细菌的特异性复合IgY及其制备方法；本发明同时还提供了一种天然、安全又具有特效作用的、预防和治疗流行性感冒的抗流感病毒特异性IgY和/或抗继发感染特异性IgY口喷剂、鼻喷剂、滴鼻剂、滴眼剂以及各种注射剂。这些特异性的IgY完全可以从根本上预防和治疗由易变异的流感病毒所引起的流行性感冒，因此，可以克服“流感疫苗”固有的、对变异了的流感病毒没有作用的弱点，比“流感疫苗”更方便、更经济、更安全、更有效。

Description

一种抗流行性感冒特异性复合IgY及其新型制剂

技术领域

本发明涉及一种抗体及其新型制剂，特别是涉及一种抗流行性感冒特异性复合IgY及其新型制剂，属医药技术领域。

背景技术

流感是一种突然暴发、传染性强、发病率高、迅速蔓延的急性传染性疾病，在集体宿舍一次的发病率可高达人群的80％以上。流感对人的生命威胁也很大，甚至会对一个国家或地区的生产力造成严重破坏。

鉴于流感严重的危害性，科学家们一直在探索如何去预防流感，特别着重在疫苗上的研究；但由于流感病毒的抗原性不断漂移与变异，而流感疫苗的研制进展又往往跟不上，因此，实际效果成疑。其它药物，如金刚烷胺(amantadine)和金刚乙胺(rimantadine)对甲型流感有一定的防治作用，但该类药物有明显的中枢神经系统副作用，并且易出现耐药毒珠的传播，因而限制了其在临床上的应用，再如神经氨酸酶抑制剂扎那米韦(Zanamivir)和奥司他韦(Oseltamivir)已被美国批准用于治疗流感，但尚未被批准用于预防流感。

IgY(Immunoglobulin of yolk)属IgG类免疫球蛋白，具有中和抗体的作用，它能与相应抗原发生特异性结合，从而改变或抑制了该抗原(如病毒)的状态或活性，阻止该抗原(如病毒)吸附于易感细胞；另又，IgY与其相应的病毒结合后，形成免疫复合物，易被巨噬细胞所吞噬。

如前所述，流感感毒的抗原会不断漂移和变异，这就给抗流感病毒IgY的研制带来很大的困难。

流感病毒表面有二种多肽抗原——血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。这二种抗原结构易发生改变——漂移或变异，HA是由一个重链(HA₁)和一个轻链(HA₂)通过双硫链连接而成；它的抗体能抑制血凝及中和病毒，是最主要的保护性抗体。HA₂多肽的羧基末端位于病毒包膜内，HA₂多肽的氨基末端(即为融合体)藏于HA蛋白三维结构内部，当流感病毒接触易感细胞时，HA的双硫链断裂，而裂解成HA₁和HA₂，此时HA₂的氨基末端——融合体暴露，引起病毒包膜与易感细胞膜融合，于是病毒核壳体遂进入细胞浆内，进行增殖。HA₂在各型及亚型之间属于保守蛋白，结构比较稳定、变异小，并且又是介导流感病毒包膜与易感细胞膜融合的蛋白成分，因此抗HA₂的IgY抗体可阻止流感病毒包膜与易感细胞膜的融合，导致流感病毒不能进入细胞内，从而达到防治流感的目的。

技术内容

本发明的目的在于提供一种抗流感病毒各个多肽抗原(包括保守区)以及抗继发感染细菌肺炎双球菌，A簇B型溶血型链球菌，金黄色葡萄球菌和流感嗜血杆菌的特异性复合IgY；本发明的目的还在于提供一种抗流感病毒特异性复合IgY的制备方法；本发明第三个目的在于提供一种天然、安全又具有特效作用的、预防和治疗流行性感冒的抗流感病毒特异性复合IgY口喷剂、鼻喷剂、滴鼻剂、滴眼剂以及各种注射剂。

本发明的目的是通过以下方案实现的：

一、根据流行病学调查，选定有代表性的最常出现的流行性感冒病毒。

(1)A型流感病毒H3N2株、H1N1株及H2N2株(通过学术合作由新加坡国立大学提供)

(2)B型流感病毒B-Vactoria株(通过学术合作由新加坡国立大学提供)

二、培养有代表性的流感病毒并提纯

本发明将病毒株采用常规鸡胚尿囊法，分别在鸡胚尿囊中培养；收取含有病毒的尿囊液，然后以鸡红细胞法粗提；再用蔗糖密度梯度超速离心法或凝胶柱层析法纯化病毒。

三、制作抗原成份

本发明采用三种方法制作新型的抗原。

(一)病毒裂解法：

分别取上述提纯的各种流感病毒分别加入20％十二烷基硫酸钠(SDS)，最终浓度为2.0％，裂解30分钟，即分别得到上述各种流感病毒裂解液。经SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳)检验分析，浓缩胶4％，分离胶7％，240V，电泳30分钟。考玛氏亮蓝染色，观察蛋白带。检测确定含有血凝素重链(HA₁)、血凝素轻链(HA₂)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、P蛋白(P₁、P₂、P₃)、基质蛋白(M₁、M₂)和非结构蛋白(NS、NS₂)。与EnamiM，et al.实验结果一致。

(二)基因工程重组流感病毒多肽HA₂：

用RT-PCR方法从甲型流感病毒RNA克隆血凝素(HA₂)基因去掉信号肽和穿膜区的片段。先插入pGEM-T载体。测序证明所获得的基因序列正确后，用限制性内切酶EcoRI和Not I双酶消化，电泳回收目的片段，与用同样双酶消化的酵母表达载体pPIC9K连接。转化大肠杆菌。挑取阳性克隆，提质粒，酶切鉴定正确后，电转化毕氏酵母菌(Pichia pastoris)KM71和GS115。在不含组氨酸的培养基上筛选阳性克隆，然后再在含不同浓度的G418的培养基上筛选高拷贝转化株。挑取单个菌落接种到培养基中，在28度摇床培养过夜。稀释后继续培养。待细菌浓度达到OD600的吸光值约为0.8时，将培养基换成含甲醇的培养基，继续培养24-48小时。于培养的不同时间采样，用ELISA法测定上清中HA的表达量。选表达量最高的时间收获。离心去除细胞沉淀。上清中即含大量表达产物。经50％硫酸铵沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸镏水透析24小时，以及Sephacryl S-200和Sephacryl S-100柱层析后，即获得纯化的流感病毒HA₂抗原。

上面所说的流感病毒也可以直接应用目前世界上已研制成功“流三价疫苗”，这种新型疫苗已包含有H3N2、H2N2两种A型流感病毒两种亚型抗原成份以及B型流感病毒抗原成份，采用上述病毒裂解法裂解后，作为复合抗原的材料。

四、制作流感病毒复合抗原

(一)病毒裂解成分复合抗原：

将本发明上述裂解方法制备的H3N2、H1N1、H2N2、以及B-Vactoria 4种流感病毒裂解液，按1.0∶0.5∶0.5∶1.0的比例混合均匀，制成混合裂解液，再按1∶1的比例在混合裂解液中加入福氏佐剂，置入高速匀浆器中，以8,000rpm高速匀化，形成油包水液体，即制得含多种流感病毒裂解成份的病毒复合抗原。

(二)HA₂表达蛋白抗原：

将本发明上述基因工程技术所制得纯化的A型流感病毒HA₂表达蛋白(200微克/ml)按2∶1的比例和B-Vactoria流感病毒提纯液混和均匀制成混合物，然后将所得混合液按1∶1比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆器，以8,000rpm高速匀化，形成油包水液体，即制得含A型流感病毒HA₂表达蛋白的抗原。

(三)利用现成“流感三价疫苗”制作抗原

从香港卫生署购置“流感三价疫苗”，该疫苗具有预防H3N2、H2N2和B型流感病毒的作用，将这种疫苗混合均匀，然后采用病毒裂解法裂解，再将这种裂解液按1∶1的比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆器，以8,000rpm高速匀化，形成油包水液体，即制得“疫苗式”的复合抗原。

五、制备继发感染致病菌复合抗原

将A簇B型溶血性链球菌(2×10⁹/ml)、肺炎链球菌(2×10⁹/ml)、流感嗜血杆菌(2×10⁹/ml)和金黄色葡萄球菌(2×10⁹/ml)等量比例混合制备成致病细菌混合物，再将这种致病细菌混合物按1∶1比例加入等量的福氏佐剂，用高速匀浆器以8,000rpm处理，制得油包水的混合菌体抗原即继发感染致病细菌复合抗原。

六、制备抗流感病毒免疫蛋

应用本公司已申请的专利技术(专利申请号：00101270.3和021021244.9)，将采用上述方法制备的流感病毒裂解成分复合抗原或者HA₂表达蛋白抗原或流感疫苗复合抗原，分别对产蛋母鸡进行免疫；每隔二周再强化注射一次，计免疫三次；第一次免疫20天后，检取免疫的母鸡所产免疫蛋，并进行编码标记。

七、制备抗继发感染细菌免疫蛋

应用本公司已申请的专利技术(专利申请号：00101270.3和021021244.9)，将采用上述方法制备的流感继发感染细菌复合抗原，对产蛋母鸡进行免疫；每隔二周再强化注射一次，计免疫三次，第一次免疫20天后，检取免疫后的母鸡所产免疫蛋。对所检取的免疫蛋进行编码标记。

以上免疫方法和注射频率可根据母鸡免疫应答情况适当调整和变化，也可应用上述同样的免疫技术，采用上述不同抗原，分别对产蛋母鸭或产蛋母鹅或产蛋火鸡或产蛋鸵鸟等不同蛋禽类进行免疫，得到相应的免疫蛋。

八、抗流感病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性TgY粗提物的制备

首先根据被免疫的禽类不同以及免疫所用抗原不同，将免疫蛋分类并标记编码。用流动水洗净免疫蛋，酒精擦洗消毒，打蛋机打碎免疫蛋，蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀；按蛋黄液体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，用1.0N HCI溶液调pH至5.5-6.0。

将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时；将稀释液于10,000rpm离心20分钟；取分离所得的上清置超滤器中进行超滤浓缩10-20倍；继而加入2.0％海藻酸钠液，至终浓度为0.1％，搅拌至出现浑浊；再加入2.0％CaCl₂液，至终浓度为0.1％，搅拌均匀，4℃静置8-12小时；8,000rpm离心20分钟，取上清；0.45μm膜串连0.22μm膜过滤除菌；Ultipor VF^TMDV50除病毒过滤器除去病毒；冷冻干燥，即分别制得抗流感病毒特异性IgY粗提物干粉成品和抗继发感染细菌特异性TgY粗提物干粉成品；最后，将所制备的对应不同抗原的特异性TgY粗提物进行编码标记。

九、抗流感病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY的纯化；采用本公司已公开的专利技术(专利申请号：00101270.3，专利公开号：1307061)分别将以上二种粗提物溶解于pH7.0、0.01M PB(磷酸盐缓冲液)液中，再先后分别过离子交换柱和凝胶层析柱层析，即分别制得抗流感病毒特异IgY纯品和抗继发感染细菌特异性IgY纯品。

十、采用美国Pall Ultrafine Filtration Company制造的除病毒过滤系统的细菌病毒滤除装置，彻底滤除各种细菌病毒，确保所制备的IgY绝不含任何病毒和细菌。

第一道细菌滤除装置是用0.22μm膜除菌过滤器除去沙门菌(Salmonella)等细菌；第二道支原体滤除装置是用0.1μm膜除支原体过滤器除去支原体；第三道病毒滤除装置是用Ultipor VF^TM DV50除病毒过滤器除去包括禽流感病毒、肠病毒在内的多种病毒。

上述各种不同的抗流感病毒特异性IgY或抗继发感染特异性IgY可以再加入其它化学药品成份或中药成份制成各种复方药品。

将上述各种不同的抗流感病毒特异性IgY或者抗继发感染细菌特异性IgY或者这些IgY和化学药品、中药等配成的复方成份配以蒸馏水调配成浓度0.01-20.0％的溶剂，可制成各种新型雾化剂、口喷剂、鼻喷剂、滴鼻剂、滴眼剂、喷喉剂、注射剂等剂型。

也可将不同的抗流感病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY按1-10∶1-10的比例混合均匀，制成一种“抗流感特异性复合IgY”，配以蒸馏水调配成浓度0.01-20.0％的复合溶剂，制成一种新型复合雾化剂；

将0.01-20.0％的抗流感病毒特异性IgY或者抗流感病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY混合的“抗流感特异性复合IgY”，以及这一系列IgY加上化学药、中药组成的复方成份，配以99.99-80.0％的辅料，可制成各种临床可接受的剂型，如雾化剂、鼻喷剂、滴鼻剂、滴眼剂、喷喉剂、口喷剂、口含片等剂型，用于预防和治疗流行性感冒以及继发感染。

本发明利用抗流感病毒免疫球蛋白(IgY)保护局部粘膜(鼻腔、上呼吸道)细胞不受流感病毒的侵染，这是阻断其感染的关键，对流感病毒的吸附直接起到封闭作用，是抗流感病毒IgY具有预防作用的机理之一。抗流感病毒IgY还可对流感病人被侵染局部新释放的病毒进行中和，使其丧失再行扩散传播的能力，因而达到既可治疗又可防止流感传播的双重目的。这是其创新独到之处。

正是由于IgY这些优点，就可以克服抗病毒药物对流感病毒实际杀灭作用不大、而对人体毒副作用又十分明显的致命缺点，从而达到有的放矢地从发病根源上预防和治疗由各种流感病毒引发的流行性感冒的目的。

由于HA₂是介导流感病毒膜与细胞内小体膜融合的蛋白成份，本发明制成一种抗流感病毒HA₂的IgY，这种抗HA₂的抗体可以阻止流感病毒包膜与细胞内小体膜融合，乃至影响流感病毒与细胞膜融合，致使病毒核壳体不能进入细胞内，从而，对流感病毒产生有效的防止作用。这样，即使这种流感病毒的可变区(重链-HA₁)发生了变异，如前所述，其保守区(轻链-HA₂)是不变的，采用本发明的方法制备的抗流感病毒各个多肽抗原(包括保守区)的特异性IgY或者抗HA₂表达蛋白的特异性IgY仍然会对其产生有效的阻遏作用。

本发明设计了三种不同的方法制作流感病毒抗原成份，可根据不同情况选择其中一种，采用我们已申请专利的最佳免疫激活手段(专利申请号00101270.3和021021244.9)免疫产蛋禽类(鸡、鸭、鹅、鸵鸟等)，使其出现更强的免疫应答，产生种类更多、结合力更强而量又大的复合抗体。所制得的这种抗多种不同型或亚型的流感病毒特异性IgY，对各种常见的流感病毒，特别是变异了的流感病毒之预防作用明显超过流感疫苗。由于不同亚型的甲型流感病毒，均有相同的HA₂保守区，而本IgY可抗HA₂保守区，因此对不同的亚型均有特殊的效果。同时，对引致继发感染的常见致病菌也有很好的免疫调理作用。因此，这种特异性的复合IgY完全可以从根本上预防和治疗由易变异的流感病毒所引起的流行性感冒。因此，可以克服“流感疫苗”固有的、对变异了的流感病毒没有作用的弱点，成为一种比“流感疫苗”更方便、更经济、更安全又更有效得多的创新产品。

下面实验例与实施例用于进一步说明本发明。

实验例1：抗流感病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY的含量检测

应用SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠一聚丙烯凝胶)电泳测定法，分别对按以上工艺所制取的不同的抗流感病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY粗提物进行检测，结果含IgY 45-52％。IgY粗提物经二次过柱后，得到纯IgY。经SDS-PAGE分析，纯度达到PAGE纯，如下表所示：

IgY纯品纯IgY含量

抗流感病毒特异性IgY 99.99％

抗继发感染细菌特异性IgY 99.99％

实验例2：各种不同抗流感病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY的活性检测

采用本发明人发明的特殊免疫激活方法和改进的工艺技术所制得的抗流感病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY，采用“ELISA法”(酶联免疫吸附试验)进行活性检测。

检测结果显示，所制得的各种不同抗流感病毒特异性IgY，其中I型对前述4种有代表性的H3N2、H1N1和H2N2以及B-Vactoria等流感病毒的抗体结合效价都达到了1∶512以上。而II型对H3N2、H2N2、H1N1和B-Vactoria等流感病毒的抗体结合效价也达到1∶256以上；而III型则对H3N2、H2N2、B-Vactoria三种流感病毒的抗体结合效价都达到1∶1024以上。同样，抗继发感染细菌特异性IgY对有代表性的肺炎双球菌、A簇B型溶血型链球菌、金黄色葡萄球菌，流感嗜血杆菌的抗体效价也都在1∶256以上。

三种抗流感病毒特异性IgY效价检测结果

IgY 抗原抗体结合效价

H3N2 1∶2048

抗流感病毒特异性IgY(I)

H1N1 1∶1024

(以病毒裂能解成分作为抗原免疫)

H2N2 1∶512

B-Vactoria 1∶1024

H3N2 1∶256

抗流感病毒特异性IgY(II)

H1N1 1∶256

(以HA₂表达蛋白加B-Vactoria作为抗原免疫)

H2N2 1∶256

B-Vactoria 1∶512

H3N2 1∶1024

抗流感病毒特异性IgY(III)

H2N2 1∶1024

(以“流感三价疫苗”制作抗原免疫)

B-Vactoria 1∶1024

抗继发感染细菌特异性IgY效价检测结果

IgY 抗原抗体结合效价

肺炎双球菌 1∶512

抗继发感染细菌特异性 A簇B型溶血性链球菌 1∶512

IgY 金黄色葡萄球菌 1∶512

流感嗜血杆菌 1∶256

实验例3：用病毒裂解法制备的抗流感病毒特异性IgY I的活性检测

以学术合作研究形式由新加坡国立大学微生物实验室提供H3N2新加坡型流感病毒株和H1N1、H2N2流感病毒株，以及B-Vactoria流感病毒株，分别以常规鸡胚尿囊法培养，然后纯化分别得到H3N2新加坡型病毒蛋白20mg、H1N1型病毒蛋白10mg、H2N2病毒蛋白10mg、B-Vactoria病毒蛋白10mg。再采用裂解法分别制得以上四种病毒的裂解液。

将以上四种病毒裂解液按1∶0.5∶0.5∶0.5的比例混合均匀，再按1∶1的比例加入福氏佐剂高速匀化制成病毒裂解成份复合抗原；最后，用这种复合抗原免疫产蛋母鸡，并制备得到抗流感病毒特异性IgY I。

分别以H3N2新加坡型和H2N2香港型流感病毒为检测抗原，用“ELISA”方法检测所制得的这种抗流感病毒特异性IgY I对H2N2香港型流感病毒的

抗体效价，结果如下：

IgY 检测用抗原抗体效价

H3N2新加坡型流感病毒 1∶1024

抗流感病毒特异性IgY I

H2N2香港型流感病毒 1∶512

从以上检测结果可看出，采用病毒裂解法制作含病毒裂解成份的抗原，所制备的特异性IgY I，不但对H3N2新加坡型流感病毒有较高的抗体效价，对变异了的不同亚型的H2N2香港型流感毒，也有理想的抗体结合效价。

实验例4：用基因工程重组HA2表达蛋白制备得到抗HA₂特异性鸡IgY的活性检测

采用本发明的所述基因工程重组A型流感病毒多肽方法制得HA2表达蛋白纯品。

将此A型流感病毒HA₂表达蛋白1.0mg按1∶1比例加入福氏佐剂，并置入高速匀浆器高速匀化，制备含HA₂表达蛋白的抗原。

采用本发明的方法将这种HA₂表达蛋白抗原免疫产蛋母鸡，制备得到抗HA₂特异性IgY。再分别以H3N2新加坡型和H2N2香港型流感病毒作为检测抗原，用“ELISA”法检测这种抗HA₂特异性IgY对这两种不同抗原的抗体效价。结果如下：

IgY 检测用抗原抗体效价

H3N2新加坡型流感病毒 1∶256

抗HA₃特异性IgY

H2N2香港型流感病毒 1∶256

以上结果显示，采用基因工程制作HA₂抗原，所制备的抗HA₂特异性IgY对于结构内部都包含有具有保守性HA₂多肽的H3N2新加坡型流感病毒和H2N2香港型流感病毒均产生了免疫学反应，有一定的效价，这表明该IgY对这两种亚型流感病毒都有抑制作用。

实验例5：用流感三价疫苗复合抗原制备得到抗多种流感病毒特异性鸭IgY的活性检测

向香港卫生署购买“流感三价疫苗”50支，将这些“流感三价疫苗”混和后采用前述“病毒裂解法”制得裂解液，然后将这种裂解液按1∶1比例加入福氏佐剂，并置入高速匀浆器高速匀化，制备含H3N2、H2N2和B-Vactoria三种流感病毒抗原成份的疫苗式复合抗原。

采用本发明的方法用这种流感“三价疫苗式”复合抗原免疫产蛋母鸭，制备得到抗多种流感病毒特异性鸭IgY。再分别以H3N2新加坡型和H2N2香港型流感病毒以及B-Vactoria型流感病毒作为检测抗原，用“ELISA”法检测这种抗流感病毒特异性鸭IgY对这三种不同抗原的抗体结合效价。结果如下：

IgY 抗原抗体结合效价

抗流感病毒鸭IgY H3N2新加坡流感病毒 1∶512

(以“流感三价疫苗”制作 H2N2香港流感病毒 1∶512

抗原) B-Vactoria型流感病毒 1∶512

实验例6：抗流感继发感染特异性鸡IgY的活性检测

由新加坡国立大学微生物试验室提供用常规方法培养好的A簇B型溶血性链球菌，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌，金黄色葡萄球菌。将以上4种致病菌按1∶1∶1∶0.5的比例混合，制成10ml菌液再加入10ml福氏佐剂然后置入高速匀浆器高速匀化，制得继发感染细菌复合抗原20ml。

采用这种含全菌的复合抗原免疫母鸡，制备抗流感继发感染特异性IgY。然后将其与上述实验例1制备的任意一种抗流感病毒特异性IgY按1∶1的比例混合均匀，制得抗流感和继发感染特异性复合IgY。

最后，分别以H3N2新加坡型流感病毒，H2N2香港型流感病毒以及A簇B型溶血性链球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌作为检测抗原，用“ELISA”法检测这种复合IgY对这些抗原的抗体效价，结果如下：

IgY 检测用抗原抗体效价

H3N2新加坡型流感病毒 1∶512

H2N2香港型流感病毒 1∶512

A簇B型溶血性链球菌 1∶256

抗流感和继发感染复合IgY

肺炎链球菌 1∶256

流感嗜血杆菌 1∶128

金黄色葡萄球菌 1∶128

从以上检测结果显示，按本发明的方法所制备的抗流感和继发感染特异性复合IgY，对两个亚型流感病毒，以及常见的几种继发感染致病菌都有较高的效价。

实施例1：用病毒裂解法制备抗流感病毒特异性鸡IgY

首先选定以下4种流行性感冒病毒：A型流感病毒H3N2株、H1N1株及H2N2株和B型流感病毒B-Vactoria株；

将以上H3N2、H1N1、H2N2和B-Vactoria 4种流感病毒株分别采用下文所述常规鸡胚尿囊法，分别在鸡胚尿囊中培养；收取含有病毒的尿囊液，然后以下文所述鸡红细胞法粗提；再用下文所述蔗糖密度梯度超速离心法纯化病毒，分别得到提纯的H3N2、H1N1、H2N2和B-Vactoria 4种流感病毒悬浮液。具体操作如下：

鸡胚尿囊法按以下方法操作：

1.用70％酒精消毒鸡胚卵气室上部的卵壳，并在其上打1.0cm长的洞；

2.加一滴无菌液体石蜡在胚体上方的壳膜上；

3.用1ml的结核菌素注射器，将0.1-0.2ml的病毒标本注入尿囊腔，继而用无菌胶布封住开口；

4.置33-35℃孵箱培养2-4天；

5.置于4℃6-18h；

6.用75％酒精消毒气室部卵壳，扩大蛋壳上的开口，用装上纯型的18号针头的注射器抽取含有病毒的尿囊液置50ml的离心管中。

鸡红细胞粗提方法按以下方法操作：

首先将上述收取的尿囊液于4,000rpm离心30分钟以去除杂物碎片，去沉淀；每升尿囊液加入甲醛化的红细胞到最终度为2.5-3.5％，混合均匀，置于4℃约10小时；2,000rpm离心10分钟，去上清；0℃生理盐水洗红细胞2次(在冰浴中进行)，每次半分钟；2,000rpm在4℃离心5分钟，去上清；在沉淀的红细胞中加入原尿囊液体积五分之一的pH7.6、0.01M磷酸盐缓冲盐水，搅匀，置于37℃水浴3小时，2,000rpm离心10分钟，得上液，即为粗提的流感病毒悬浮液。

用蔗糖密度梯度超速离心法纯化流感病毒的具体方法如下：

取上述粗提的流感病毒悬浮液1.0ml，轻轻加到40％和60％不连续密度梯度的蔗糖液上面，经100,000g离心2小时，取蔗糖层中间区带液，加入pH7.2、0.01M磷酸盐缓冲盐水1.0ml，混匀，透析除糖，即得纯流感病毒悬浮液。

分别取提纯的H3N2、H1N1、H2N2和B-Vactoria 4种流感病毒液各1.0ml(浓度4.0万HAU，相当于病毒蛋白200微克)，分别加入20％十二烷基硫酸钠(SDS)，最终浓度为2.0％，于37℃裂解30分钟，即分别得到上述4种流感病毒裂解液。

将这4种流感病毒裂解液按1.0∶0.5∶0.5∶1.0的比例混合均匀，制成混合裂解液，再按1∶1的比例在混合裂解液中加入福氏佐剂，置入高速匀浆器中，以8,000rpm高速匀化，形成油包水液体，即制成含多种流感病毒裂解成份的病毒复合抗原，计150ml。

以这种复合抗原免疫健康的产蛋母鸡50只，每只肌内注射1ml，每隔二周注射一次，共计三次。

第一次注射后第20天开始检取免疫蛋，至第7个月将所检得的7,500只免疫蛋用流动水冲净，75％乙醇消毒，晾干破碎蛋壳，以蛋黄筛滤去蛋清，留取蛋黄加5倍蒸馏水搅匀，用1.0N HCI调pH至5.5-6.0，搅拌均匀，2-6℃静置过夜，于10,000rpm离心20分钟，取上清进行超滤浓缩10-20倍；继而加入2.0％海藻酸钠液，至终浓度为0.1％，搅拌至出现浑浊；再加入2.0％CaCI₂液，至终浓度为0.1％，搅拌均匀，4℃过夜10小时；8,000rpm离心20分钟，取上清；0.45μm膜串连0.22μm膜过滤除菌，Ultipor VF^TMDV50除病毒过滤器除去病毒；冷冻干燥；即制得抗流感病毒特异性IgY粗提物750克。

采用公开号为1307061的专利技术，将以上IgY粗提物先后过离子交换树脂柱和凝胶层析柱层析，即制得抗流感病毒特异性IgY纯品150克。

实施例2：用病毒裂解法制备抗流感病毒特异性鹅IgY

将以上H3N2、H1N1、H2N2和B-Vactoria 4种流感病毒株分别采用常规鸡胚尿囊法，分别在鸡胚尿囊中培养；收取含有病毒的尿囊液，然后以鸡红细胞法粗提；再用凝胶柱层析法纯化病毒，分别得到提纯的H3N2、H1N1、H2N2和B-Vactoria 4种流感病毒悬浮液。

具体操作如下：

分别用鸡胚尿囊法培养以上4种流感病毒，步骤如下详述：

1.70％酒精消毒鸡胚卵气室上部的卵壳，并在其上打1.0cm长的洞；

2.加一滴无菌液体石蜡在胚体上方的壳膜上；

4.置33-35℃孵箱培养2-4天；

5.置于4℃6-18h；

分别用鸡红细胞粗提以上4种流感病毒，步骤如下详述：

首先将收取的尿囊液于4,000rpm离心30分钟以去除杂物碎片，去沉淀；每升尿囊液加入甲醛化的红细胞到最终度为2.5-3.5％，混合均匀，置于4℃约10小时；2,000rpm离心10分钟，去上清；0℃生理盐水洗红细胞2次(在冰浴中进行)，每次半分钟；2,000rpm在4℃离心5分钟，去上清；在沉淀的红细胞中加入原尿囊液体积五分之一的pH7.6、0.01M磷酸盐缓冲盐水，搅匀，置于37℃水浴3小时，2,000rpm离心10分钟，得上液，即为粗提的流感病毒悬浮液。

分别用柱层析法纯化以上4种流感病毒，步骤如下详述：

取上述混悬液3-5ml加样于Sephadex G200凝胶层析柱(3×50cm)；用0.05M、pH7.4、PBS液洗脱；流速15-20ml/小时；每管收集5.0ml；于280nm测定洗脱曲线，并用血凝滴度测定流感病毒洗脱峰；收集病毒洗脱液，即为提纯的流感病毒液。

分别取提纯的H3N2、H1N1、H2N2和B-Vactoria 4种流感病毒液各10ml(浓度4.0万HAU，相当于病毒蛋白2,000微克)，分别加入20％十二烷基硫酸钠(SDS)，最终浓度为2.0％，于37℃裂解30分钟，即分别得到上述4种流感病毒裂解液。

将这4种流感病毒裂解液按1.0∶0.5∶0.5∶1.0的比例混合均匀，制成混合裂解液，再按1∶1的比例在混合裂解液中加入福氏佐剂，置入高速匀浆器中，以8,000rpm高速匀化，形成油包水液体，即制成含多种流感病毒裂解成份的病毒复合抗原，计2,250ml。

选具高免疫应答能力的良种100只母鹅，采用上述含多种流感病毒裂解成份的病毒复合抗原，计1,500ml分别对母鹅进行免疫，每次注射5ml抗原，在第一次注射后，每隔二周再强化注射一次，共三次，于第一次注射后第七个月，把这些鹅所产的蛋标记后按常规方法分别提取其中的IgY，以ELISA法(酶联免疫吸附试验)检测所制得的IgY的效价，选出其中能制得IgY效价≥256的免疫应答能力特别强的鹅，再用这批鹅所产的蛋孵出优良鹅种，待其长大至2-3个月，选出其中50只作为优选的高免疫应答能力的特种母鹅。

采用皮下注射和翅静脉注射相结合的强化免疫法，分别对优选的特种母鹅进行免疫，每只母鹅每次注射量达5ml抗原，每隔二周再强化注射一次，一个月内共免疫三次；每一次免疫20天后，检取母鹅所产免疫蛋至第7个月终止，共计检得免疫鹅蛋7,500只。

用前述方法所制备的含多种流感病毒裂解成份的病毒复合抗原，计750ml，将不同抗原的免疫蛋分别用流动水冲净，75％乙醇消毒、晾干，破碎蛋壳以卵黄筛滤去蛋清，留取蛋黄加5倍蒸馏水搅匀用1.0N HCI液调pH至5.5-6.0，搅拌均匀，2-6℃静置过夜，于10,000rpm离心20分钟，取上清进行超滤浓缩10-20倍；继而加入2.0％海藻酸钠液，至终浓度为0.1％，搅拌至出现浑浊；再加入2.0％CaCI₂液，至终浓度为0.1％，搅拌均匀，4℃过夜10小时；8,000rpm离心20分钟，取上清；0.45μm膜串连0.22μm膜过滤除菌，Ultipor VF^TMDV50除病毒过滤器除去病毒；冷冻干燥，即制得抗流感病毒特异性鹅IgY粗提物2,200克。

采用专利公开号为1307061的专利技术将以上IgY粗提物，先后过离子交换树脂柱和凝胶层析柱层析，即制得抗流感病毒特异性鹅IgY纯品400克。

实施例3：用基因工程法制备抗HA₂特异性鸵鸟IgY

用RT-PCR方法从甲型流感病毒RNA克隆血凝素(HA₂)基因去掉信号肽和穿膜区的片段。先插入pGEM-T载体。测序证明所获得的基因序列正确后，用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶消化，电泳回收目的片段，与用同样双酶消化的酵母表达载体pPIC9K连接。转化大肠杆菌。挑取阳性克隆，提质粒，酶切鉴定正确后，电转化毕氏酵母菌(Pichia pastoris)KM71和GS115。在不含组氨酸的培养基上筛选阳性克隆，然后再在含不同浓度的G418的培养基上筛选高拷贝转化株。挑取单个菌落接种到培养基中，在28度摇床培养过夜。稀释后继续培养。待细菌浓度达到OD600的吸光值约为0.8时，将培养基换成含甲醇的培养基，继续培养24-48小时。于培养的不同时间采样，用ELISA法测定上清中HA的表达量。选表达量最高的时间收获。离心去除细胞沉淀。上清中即含大量表达产物。经50％硫酸铵沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸镏水透析24小时，以及Sephacryl S-200和Sephacryl S-100柱层析后，即获得纯化的流感病毒HA₂抗原2,100ml。

选具高免疫应答能力的良种母鸵鸟50只，用上述纯化的流感病毒HA₂抗原1,500ml，对母鸵鸟分别免疫，每次注射10ml抗原，在第一次注射后，每隔二周再强化注射一次，共三次，于第一次注射后第七个月，把这些鸵鸟所产的蛋标记后按常规方法分别提取其中的IgY，以ELISA法(酶联免疫吸附试验)检测所制得的IgY的效价，选出其中能制得IgY效价≥256的免疫应答能力特别强的鸵鸟，再用这批鸵鸟所产的蛋孵出优良鸵鸟种，待其长大至2-3个月，选择其中10只作为优选的高免疫应答能力的特种产蛋鸵鸟。

采用以上述方法制作的HA₂表达蛋白抗原300ml，应用皮下注射和翅静脉注射相结合的强化免疫法，分别对优选的特种产蛋鸵鸟进行免疫，每只鸵鸟每次注射量达8-10ml抗原，每隔二周再强化注射一次，一个月内共免疫三次；第一次免疫20天后，检取鸵鸟所产免疫蛋共100只。

将所检取的100只免疫的鸵鸟蛋分别用流动水冲净，75％乙醇消毒、晾干，破碎蛋壳以卵黄筛滤去蛋清，留取蛋黄加5倍蒸馏水搅匀用1.0N HCI液调节pH至5.5-6.0，搅拌均匀，2-6℃静置过夜，于10,000rpm离心20分钟，取上清进行超滤浓缩10-20倍；继而加入2.0％海藻酸钠液，至终浓度为0.1％，搅拌至出现浑浊；再加入2.0％CaCI₂液，至终浓度为0.1％，搅拌均匀，4℃过夜；8,000rpm离心20分钟，取上清；0.45μm膜串连0.22μm膜过滤除菌，Ultipor VF^TMDV50除病毒过滤器除去病毒；冷冻干燥，即制得抗HA2特异性鸵鸟IgY粗提物1,000克。

采用专利公开号为1307061的专利技术，将以上IgY粗提物分别先后过离子交换树脂柱和凝胶柱层析，即制得抗HA₂特异性鸵鸟IgY纯品200克。

实施例4：用“三价疫苗”作抗原制备抗流感病毒特异性火鸡IgY

取“流感三价疫苗”50支(每支300μg/1.5ml)将其混和均匀，加入20％十二烷基硫酸钠(SDS)，最终浓度为2.0％，于37℃裂解30分钟，即得到流感病毒裂解液。

再将这种裂解液按1∶1的比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆器中，以8,000rpm高速匀化，形成油包水液体，即制成“疫苗式”复合抗原，计150ml。再以这种复合抗原免疫健康的产蛋火鸡50只，每只肌内注射1ml，每隔二周注射一次，共计三次。

第一次注射后第20天开始检取免疫蛋，至第50天，共检取1,200只免疫蛋；将其用流动水冲净，75％乙醇消毒，晾干破碎蛋壳，以蛋黄筛滤去蛋清，留取蛋黄加5倍蒸馏水搅匀，用1.0N HCI调pH至5.5-6.0，搅拌均匀，2-6℃静置过夜，于10,000rpm离心20分钟，取上清进行超滤浓缩10-20倍；继而加入2.0％海藻酸钠液，至终浓度为0.1％，搅拌至出现浑浊；再加入2.0％CaCI₂液，至终浓度为0.1％，搅拌均匀，4℃过夜；8,000rpm离心20分钟，取上清；0.45μm膜串连0.22μm膜过滤除菌，Ultipor VF^TMDV50除病毒过滤器除去病毒；冷冻干燥；即制得抗流感病毒特异性IgY粗提物120克。

采用专利公开号为1307061的专利技术，将以上IgY粗提物先后过离子交换树脂柱和凝胶层析柱层析，即制得一种以“三价疫苗”作抗原的抗流感病毒特异性IgY纯品25克。

实施例5：制备抗继发感染特异性IgY

(一)制备继发感染致病菌复合抗原

将A簇B型溶血性链球菌(2×10⁹/ml)、肺炎链球菌(2×10⁹/ml)、流感嗜血杆菌(2×10⁹/ml)和金黄色葡萄球菌(2×10⁹/ml)等量比例混合制备成致病细菌混合物，再将致病细菌混合物按1∶1比例加入等量的福氏佐剂，用高速匀浆器以8,000rpm处理，即得油包水的混合菌体抗原即继发感染致病细菌复合抗原。

(二)制备抗继发感染细菌免疫蛋

应用专利申请号为00101270.3和021021244.9的专利技术，用所制备的流感继发感染细菌复合抗原，免疫产蛋母鸡5只；每只肌肉注射1ml。每隔二周再强化注射一次，计免疫三次，第一次免疫20天后，检取免疫后的母鸡所产免疫蛋，至第7个月，共计检取7,500只免疫蛋。

(三)制备抗继发感染细菌特异性TgY粗提物

将所检取的免疫蛋用流动水洗净，酒精擦洗消毒，再用打蛋机打碎免疫蛋，用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀；按蛋黄液体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，用1.0N HCI溶液调pH至5.5-6.0。

将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时；将稀释液于10,000rpm离心20分钟；取分离所得的上清置超滤器中进行超滤浓缩10-20倍；继而加入2.0％海藻酸钠液，至终浓度为0.1％，搅拌至出现浑浊；再加入2.0％CaCl₂液，至终浓度为0.1％，搅拌均匀，4℃静置8-12小时；8,000rpm离心20分钟，取上清；0.45μm膜串连0.22μm膜过滤除菌；Ultipor VF^TMDV50除病毒过滤器除去病毒；冷冻干燥，即制得抗继发感染细菌特异性TgY粗提物干粉成品，计700克。

(四)抗继发感染细菌特异性IgY的纯化；采用专利公开号为1307061的专利技术将所制得的抗继发感染细菌特异性IgY粗提物溶解于pH7.0、0.01MPB(磷酸盐缓冲液)液中，再先后分别过离子交换柱和凝胶层析柱层析，即制得抗继发感染细菌特异性IgY纯品150克。

实施例6：制备抗继发感染特异性IgY常压喷雾剂

采用抗继发感染特异性IgY 50g，作为主要原料制成一种抗继发感染常压喷雾剂。

抗继发感染特异性IgY 50g

甘油 1,000g

PEG400 1,250g

薄荷脑 50g

香精 15g

乙醇 500ml

蒸馏水加至50升

将抗继发感染特异性IgY溶于蒸馏水中，加入甘油混匀。薄荷脑、香精加入乙醇溶解，再加PEG400混匀，在搅拌下加于上述溶液搅匀、过滤，补加蒸馏水至全量，用0.1mol、NaOH流液调pH至6.5。将药液灌入常压喷瓶中，每支20ml，全检合格后包装即得2,500支抗继发感染IgY常压喷雾剂。

实施例7：用按实施例1和5详述的方法所制备的抗流感病毒特异性IgY和抗继发感染特异性IgY按2∶1比例混合成抗流感特异性复合IgY200g(抗流感病毒特异性IgY 133.33g、抗继发特异性IgY 66.66g)，以此作为主要原料制成一种抗流感常压喷雾剂。

抗流感特异性复合IgY 200g

甘油 4,000g

PEG400 5,000g

薄荷脑 200g

香精 80g

乙醇 2,000ml

蒸馏水加至200升

抗流感特异性复合IgY溶于160升蒸馏水中，加入甘油混匀。薄荷脑、香精加入乙醇溶解，再加PEG400混匀，在搅拌下加于上述溶液搅匀、过滤，补加蒸馏水至全量，用0.1mol、NaOH溶液调pH至7.0，灌装。将药液灌入常压喷瓶中，每支20ml，全检合格后包装即得10,000支抗流感IgY常压喷雾剂。

实施例8：用按实施例3详述的方法制备抗流感病毒HA₂蛋白特异性鸵鸟IgY100g，作为主要原料制成一种应用基因工程的抗流感病毒常压喷雾剂。

抗HA₂蛋白特异性鸵鸟IgY 100g

甘油 2,000g

PEG400 2,500g

薄荷脑 100g

香精 30g

乙醇 1,000ml

蒸馏水加至100升

将抗HA₂蛋白特异性鸵鸟IgY溶于80升蒸馏水中，加入甘油混匀。薄荷脑、香精加入乙醇溶解，再加PEG400混匀，在搅拌下加于上述溶液搅匀、过滤，补加蒸馏水至全量，用0.1mol、NaOH溶液调pH至7.0，灌装。将药液灌入常压喷瓶中，每支20ml，全检合格后包装即得10,000支抗流感病毒IgY常压喷雾剂。

实施例9：用按实施例1详述的方法制备抗流感病毒特异性IgY 1.0克，用按实施例5详述的方法制备抗继发感染特异性IgY1.0克，按1∶1比例混合成抗流感特异性复合IgY 2.0克，以这种复合IgY为主要原料，制成一种口含片。

抗流感特异性复合IgY 2.0g

羧甲基纤维素 5.0g

硬脂酸镁 0.6g

阿斯巴甜 1.2g

薄荷香精 0.8g

香橙香精 1.0g

乙醇(30％浓度) 加至溶解羧甲基纤维素

成1％乙醇溶液

山梨糖醇补足至1,000g

共制成 1,000片

1、山梨糖醇与阿斯巴甜充分混合均匀，过60目筛两次备用。

2、羧甲基纤维素分散于30％乙醇中制成1％乙醇溶液。

3、将1项用适量2项制软材，14目筛网制粒，60℃通风干燥，18目筛整粒。用40目筛筛出适量细粉与IgY充分混匀并喷入薄荷、香橙香精搅匀，再拌入硬脂酸镁，一起与整批颗粒混合均匀，密闭4小时以上供压片每片0.6g。检验合格后，供包装，全验出厂。

实施例10：用按实施例1详述的方法制备抗流感病毒特异性IgY 5.0g，并制成一种预防和治疗流感的新型注射剂。

抗流感病毒特异性纯IgY 5g

Pluronic F₆₈ 10g

聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 10g

PGE400 110g

聚山梨醇酯-80 10g

注射用水加至 1,000ml

1、注射用水，加入Pluronic和PVP，加热溶解；另取聚山梨醇酯-80，加入PEG400混匀；在搅拌下加入上述混合液中；再加0.1％针用活性炭，60℃搅拌15min；脱炭过滤；滤液密闭加热100℃ 30min，冷却至室温备用。

2、取经活性炭处理过的灭菌注射用水，于灭菌容器中加入抗流感病毒特异性纯IgY冻干粉溶解，继续搅拌下，以细流加于上述混合液中，用0.1mol的NaOH溶液调节pH至6.0～7.5，用脱炭灭菌注射用水补足全量。

3、已灭菌的0.45μm串联0.22μm微孔滤膜除菌过滤。于无菌灌封机中灌封于无菌容器中。每支2ml含纯抗流感病毒特异性纯IgY冻干粉5mg。灯检、检漏、印字、包装即得500支IgY注射剂。规格5mg/2ml。

Claims

1、一种抗流感病毒的特异性IgY，其特征在于该特异性IgY是经以下方法制备而成：

选定两种流行性感冒病毒A型流感病毒H3N2株、H1N1株及H2N2株和B型流感病毒B-Vactoria株；

将上述四种病毒株分别采用常规鸡胚尿囊法，在鸡胚尿囊中培养；收取含有病毒的尿囊液，然后以鸡红细胞法粗提；再用蔗糖密度梯度超速离心法或凝胶柱层析法纯化病毒，即分别得到提纯的H3N2、H1N1、H2N2和B-Vactoria 4种流感病毒悬浮液；

分别取提纯的H3N2、H1N1、H2N2和B-Vactoria 4种流感病毒悬浮液，分别加入20％十二烷基硫酸钠，最终浓度为2.0％，于37℃裂解30分钟，即分别得到上述4种流感病毒裂解液；

将这4种流感病毒裂解液按1.0∶0.5∶0.5∶1.0的比例混合均匀，制成混合裂解液，再按1∶1的比例在混合裂解液中加入福氏佐剂，置入高速匀浆器中，以8,000rpm高速匀化，形成油包水液体，即制成含多种流感病毒裂解成份的病毒复合抗原；

以这种复合抗原免疫健康的产蛋母鸡，每隔二周再强化注射一次，共计免疫三次；

第一次注射后第20天开始检取免疫蛋，将其用流动水冲净，75％乙醇消毒，晾干破碎蛋壳，以蛋黄筛滤去蛋清，留取蛋黄加5倍蒸馏水搅匀，用1.0NHCI调pH至5.5-6.0，搅拌均匀，2-6℃静置过夜，于10,000rpm离心20分钟，取上清进行超滤浓缩10-20倍；继而加入2.0％海藻酸钠液，至终浓度为0.1％，搅拌至出现浑浊；再加入2.0％CaCI₂液，至终浓度为0.1％，搅拌均匀，4℃过夜10小时；8,000rpm离心20分钟，取上清；0.45μm膜串连0.22μm膜过滤除菌，Ultipor VF^TMDV50除病毒过滤器除去病毒；冷冻干燥；即制得抗流感病毒特异性IgY粗提物；

将以上IgY粗提物先后过离子交换树脂柱和凝胶层析柱层析，即制得抗流感病毒特异性IgY纯品。

2、如权利要求1所述的一种抗流感病毒的特异性IgY的制备方法，其特征在于该方法中含有的鸡胚尿囊法如下：

用70％酒精消毒鸡胚卵气室上部的卵壳，并在其上打1.0cm长的洞；加一滴无菌液体石蜡在胚体上方的壳膜上；用1ml的结核菌素注射器，将0.1-0.2ml的病毒标本注入尿囊腔，继而用无菌胶布封住开口；置33-35℃孵箱培养2-4天；置于4℃、6-18h；用75％酒精消毒气室部卵壳，扩大蛋壳上的开口，用装上纯型的18号针头的注射器抽取含有病毒的尿囊液置50ml的离心管中。

3、如权利要求1所述的一种抗流感病毒的特异性IgY的制备方法，其特征在于该方法中含有的鸡红细胞法粗提法为：

将收取的尿囊液于4,000rpm离心30分钟以去除杂物碎片，去沉淀；每升尿囊液加入甲醛化的红细胞到最终度为2.5-3.5％，混合均匀，置于4℃约10小时；2,000rpm离心10分钟，去上清；冰浴中用0℃生理盐水洗红细胞2次，每次半分钟；2,000rpm在4℃离心5分钟，去上清；在沉淀的红细胞中加入原尿囊液体积五分之一的pH7.6、0.01M磷酸盐缓冲盐水，搅匀，置于37℃水浴3小时，2,000rpm离心10分钟，得上液，即为粗提的流感病毒悬浮液。

4、如权利要求1所述的一种抗流感病毒的特异性IgY的制备方法，其特征在于该方法中含有的蔗糖密度梯度超速离心提纯法为：

取粗提的流感病毒悬浮液，轻轻加到40％和60％不连续密度梯度的蔗糖液上面，经100,000g离心2小时，取蔗糖层中间区带液，加入pH7.2、0.01M磷酸盐缓冲盐水，混匀，透析除糖，即得纯流感病毒悬浮液。

5、如权利要求1所述的一种抗流感病毒的特异性IgY的制备方法，其特征在于该方法中含有的凝胶柱层析提纯法为：

取粗提的流感病毒悬浮液加样于Sephadex G200凝胶层析柱；用0.05M、pH7.4、PBS液洗脱；流速15-20ml/小时；每管收集5.0ml；于280nm测定洗脱曲线，并用血凝滴度测定流感病毒洗脱峰；收集病毒洗脱液，即为提纯的流感病毒液。

6、一种抗流感病毒的特异性IgY，其特征在于该特异性IgY是经以下方法制备而成：

取流感三价疫苗，将这种疫苗混合均匀，加入20％十二烷基硫酸钠，最终浓度为2.0％，于37℃裂解30分钟，即得到流感病毒裂解液；

将这种裂解液按1∶1的比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆器中，以8,000rpm高速匀化，形成油包水液体，即制成疫苗式复合抗原；

将这种复合抗原免疫健康的产蛋母鸡；每隔二周再强化注射一次，计免疫三次；第一次免疫20天后，检取免疫的母鸡所产免疫蛋，并进行编码标记；

用流动水洗净免疫蛋，酒精擦洗消毒，打蛋机打碎免疫蛋，蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀；按蛋黄液体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，用1.0N HCI溶液调pH至5.5-6.0；

将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时；将稀释液于10,000rpm离心20分钟；取分离所得的上清置超滤器中进行超滤浓缩10-20倍；继而加入2.0％海藻酸钠液，至终浓度为0.1％，搅拌至出现浑浊；再加入2.0％CaCl₂液，至终浓度为0.1％，搅拌均匀，4℃静置8-12小时；8,000rpm离心20分钟，取上清；0.45μm膜串连0.22μm膜过滤除菌；Ultipor VF^TMDV50除病毒过滤器除去病毒；冷冻干燥，即制得抗流感病毒特异性IgY粗提物干粉成品；

将以上粗提物溶解于pH7.0、0.01M磷酸盐缓冲液液中，再先后分别过离子交换柱和凝胶层析柱层析，即制得抗流感病毒特异IgY纯品。

7、一种抗流感病毒HA₂特异性IgY，其特征在于该特异性IgY是经以下方法制备而成：

用RT-PCR方法从甲型流感病毒RNA克隆HA₂即血凝素基因去掉信号肽和穿膜区的片段，先插入pGEM-T载体，测序证明所获得的基因序列正确后，用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶消化，电泳回收目的片段，与用同样双酶消化的酵母表达载体pPIC9K连接，转化大肠杆菌；挑取阳性克隆，提质粒，酶切鉴定正确后，电转化毕氏酵母菌KM71和GS115；在不含组氨酸的培养基上筛选阳性克隆，然后再在含不同浓度的G418的培养基上筛选高拷贝转化株；挑取单个菌落接种到培养基中，在28度摇床培养过夜；稀释后继续培养；待细菌浓度达到OD600的吸光值0.8时，将培养基换成含甲醇的培养基，继续培养24-48小时，于培养的不同时间采样，用ELISA法测定上清中HA的表达量，选表达量最高的时间收，离心去除细胞沉淀，上清中即含大量表达产物，经50％硫酸铵沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸镏水透析24小时，以及Sephacryl S-200和Sephacryl S-100柱层析后，即获得纯化的流感病毒HA₂抗原；

将采用上述方法制备的HA₂表达蛋白抗原，对产蛋母鸡进行免疫；每隔二周再强化注射一次，计免疫三次；第一次免疫20天后，检取免疫的母鸡所产免疫蛋，并进行编码标记；

将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时；将稀释液于10,000rpm离心20分钟；取分离所得的上清置超滤器中进行超滤浓缩10-20倍；继而加入2.0％海藻酸钠液，至终浓度为0.1％，搅拌至出现浑浊；再加入2.0％CaCl₂液，至终浓度为0.1％，搅拌均匀，4℃静置8-12小时；8,000rpm离心20分钟，取上清；0.45μm膜串连0.22μm膜过滤除菌；Ultipor VF^TMDV50除病毒过滤器除去病毒；冷冻干燥，即制得抗流感病毒HA₂特异性IgY粗提物；

将以上IgY粗提物分别先后过离子交换树脂柱和凝胶柱层析，即制得抗流感病毒HA₂特异性IgY纯品。

8、一种抗继发感染细菌的特异性复合IgY，其特征在于该特异性复合IgY是经以下方法制备而成：

将A簇B型溶血性链球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和金黄色葡萄球菌等量比例混合制备成致病细菌混合物，并向致病细菌混合物中加入等量的福氏佐剂，用高速匀浆器以8,000rpm处理，制得油包水的混合菌体抗原即继发感染致病细菌复合抗原；

将上述流感继发感染细菌复合抗原，对产蛋母鸡进行免疫；每隔二周再强化注射一次，计免疫三次，第一次免疫20天后，检取免疫后的母鸡所产免疫蛋，对所检取的免疫蛋进行编码标记；

将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时；将稀释液于10,000rpm离心20分钟；取分离所得的上清置超滤器中进行超滤浓缩10-20倍；继而加入2.0％海藻酸钠液，至终浓度为0.1％，搅拌至出现浑浊；再加入2.0％CaCl₂液，至终浓度为0.1％，搅拌均匀，4℃静置8-12小时；8,000rpm离心20分钟，取上清；0.45μm膜串连0.22μm膜过滤除菌；Ultipor VF^TMDV50除病毒过滤器除去病毒；冷冻干燥，即制得抗继发感染细菌的特异性复合IgY粗提物干粉成品；

分别将以上粗提物溶解于pH7.0、0.01M磷酸盐缓冲液液中，再先后分别过离子交换柱和凝胶层析柱层析，即制得抗继发感染细菌的特异性复合IgY纯品。

9、如权利要求1、2、3、4、5、6、7所述的制备抗流感病毒特异性IgY的制备方法，其特征在于制备免疫蛋的免疫方法和注射频率可根据母鸡免疫应答情况适当调整和变化；也可应用同样的免疫技术，采用上述不同抗原，分别对产蛋母鸭或产蛋母鹅或产蛋火鸡或产蛋鸵鸟等不同蛋禽类进行免疫，得到相应的免疫蛋。

10、如权利要求8所述的制备抗继发感染细菌的特异性IgY的制备方法，其特征在于制备免疫蛋的免疫方法和注射频率可根据母鸡免疫应答情况适当调整和变化；也可应用同样的免疫技术，分别对产蛋母鸭或产蛋母鹅或产蛋火鸡或产蛋鸵鸟等不同蛋禽类进行免疫，得到相应的免疫蛋。

11、如权利要求1、2、3、4、5、6、7所述的抗流感病毒特异性IgY，其特征在于可制成雾化剂、口喷剂、鼻喷剂、滴鼻剂、滴眼剂、喷喉剂、注射剂、口含片。

12、如权利要求1、2、3、4、5、6、7所述的抗流感病毒特异性IgY，其特征在于可以加入各种化学药品或中药，制成各种复方药品，可制成雾化剂、口喷剂、鼻喷剂、滴鼻剂、滴眼剂、喷喉剂、注射剂、口含片。

13、如权利要求11所述的一种制剂，其特征在于：

抗流感病毒特异性纯IgY 5重量份

Pluronic F₆₈ 10重量份

聚乙烯吡咯烷酮 10重量份

PGE400 110重量份

聚山梨醇酯-80 10重量份

取注射用水，加入Pluronic和PVP，加热溶解；另取聚山梨醇酯-80，加入PEG400混匀；在搅拌下加入上述混合液中；再加0.1％针用活性炭，60℃搅拌15min；脱炭过滤；滤液密闭加热100℃ 30min，冷却至室温备用；

另取经活性炭处理过的灭菌注射用水，于灭菌容器中加入抗流感病毒特异性纯IgY冻干粉溶解，继续搅拌下，以细流加于上述混合液中，用0.1mol的NaOH液调节pH6.0～7.5用脱炭灭菌注射用水补足全量；

用灭菌0.45μm串联0.22μm微孔滤膜除菌过滤，于无菌灌封机中灌封于无菌容器中，灯验、检漏、印字、包装即得IgY注射剂。

14、如权利要求11所述的一种制剂，其特征在于：

抗HA₂蛋白特异性IgY 100重量份

甘油 2,000重量份

PEG400 2,500重量份

薄荷脑 100重量份

香精 30重量份

将抗HA₂蛋白特异性IgY溶于蒸馏水中，加入甘油混匀，薄荷脑、香精加入乙醇溶解，再加PEG400混匀，在搅拌下加于上述溶液搅匀、过滤，补加蒸馏水至全量，用0.1mol NaOH液调pH至7.0，灌装，将药液灌入常压喷瓶中，全检合格后包装即得一种抗流感常压喷雾剂。

15、如权利要求8所述的抗继发感染细菌的特异性IgY，其特征在于可制成雾化剂、口喷剂、鼻喷剂、滴鼻剂、滴眼剂、喷喉剂、注射剂、口含片。

16、如权利要求8所述抗继发感染细菌特异性IgY，其特征在于可以加入各种化学药品或中药，制成各种复方药品，可制成雾化剂、口喷剂、鼻喷剂、滴鼻剂、滴眼剂、喷喉剂、注射剂、口含片。

17、如权利要求15所述的一种制剂，其特征在于：

抗继发感染特异性IgY 50重量份

甘油 1,000重量份

PEG400 1,250重量份

薄荷脑 50重量份

香精 15重量份

将抗继发感染特异性IgY溶于蒸馏水中，加入甘油混匀；薄荷脑、香精加入乙醇溶解，再加PEG400混匀，在搅拌下加于上述溶液搅匀、过滤，补加蒸馏水至全量，用0.1mol、NaOH溶液调pH至6.5；将药液灌入常压喷瓶中，全检合格后包装即得一种继发感染IgY常压喷雾剂。

18、一种抗流感特异性复合IgY制剂，其特征在于该制剂是将抗流感病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY按1～10∶1～10的比例混合均匀而制成的。

19、如权利要求18所述的一种抗流感特异性复合IgY制剂，其特征在于该制剂是将不同的抗流感病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY按1∶1的比例混合均匀而制成的。

20、如权利要求18所述的一种抗流感特异性复合IgY制剂，其特征在于该制剂是将不同的抗流感病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY按2∶1的比例混合均匀而制成的。

21、如权利要求18、19、20所述的制剂是雾化剂、口喷剂、鼻喷剂、滴鼻剂、滴眼剂、喷喉剂、注射剂、口含片。

22、如权利要求21所述的一种制剂，其特征在于：将抗流感病毒特异性IgY与抗继发特异性IgY按2∶1的比例混合均匀，制成一种“抗流感特异性复合IgY”；

抗流感特异性复合IgY 200重量份

甘油 4,000重量份

PEG400 5,000重量份

薄荷脑 200重量份

香精 60重量份

将抗流感特异性复合IgY溶于蒸馏水中，加入甘油混匀；薄荷脑、香精加入乙醇溶解，再加PEG400混匀，在搅拌下加于上述溶液搅匀、过滤，补加蒸馏水至全量，用0.1mol NaOH液调pH至6.5～8.5；将药液灌入常压喷瓶中，全检合格后包装即得一种抗流感和继发感染的常压喷雾剂。

23、如权利要求21所述的一种“抗流感特异性复合IgY”，其特征在于：将抗流感病毒特异性IgY与抗继发特异性IgY按1∶1的比例混合均匀，制成一种“抗流感特异性复合IgY”片剂；

抗流感特异性复合IgY 2.0重量份

羧甲基纤维素 5.0重量份

硬脂酸镁 0.6重量份

阿斯巴甜 1.2重量份

薄荷香精 0.8重量份

香橙香精 1.0重量份

30％乙醇溶解羧甲基纤维素

成1％溶液

山梨糖醇 589.4重量份将山梨糖醇与阿斯巴甜充分混合均匀制成混合物，过60目筛两次备用；羧甲基纤维素分散于30％乙醇中制成1％乙醇溶液；将混合物用适量1％乙醇溶液制成软材，14目筛网制粒，60℃通风干燥，18目筛整粒；用40目筛筛出适量细粉与IgY充分混匀并喷入薄荷、香橙香精搅匀，再拌入硬脂酸镁，一起与整批颗粒混合均匀，密闭4小时以上供压片，检验合格后，供包装，全验出厂。