CN106832004B

CN106832004B - 一种口服禽干扰素融合蛋白及其作为免疫增强剂的应用

Info

Publication number: CN106832004B
Application number: CN201710089744.9A
Authority: CN
Inventors: 刘文军; 李晶; 范文辉; 杨利敏; 刘薇
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2017-02-20
Filing date: 2017-02-20
Publication date: 2019-09-24
Anticipated expiration: 2037-02-20
Also published as: CN106832004A

Abstract

本发明公开了一种口服禽干扰素融合蛋白及其作为免疫增强剂的应用。本发明提供的融合蛋白包括鸡α干扰素和鸡β干扰素。本发明还保护融合蛋白的应用：作为免疫增强剂；作为口服型免疫增强剂；制备免疫增强剂；制备口服型免疫增强剂；作为疫苗的免疫增强剂；作为疫苗的口服型免疫增强剂；作为禽流感病毒疫苗的免疫增强剂；作为禽流感病毒疫苗的口服型免疫增强剂；制备疫苗；制备禽流感病毒疫苗；作为抗病毒制剂；制备抗病毒制剂；作为抗水疱性口炎病毒制剂；(c14)制备抗水疱性口炎病毒制剂。本发明提供的融合蛋白，作为免疫增强剂或抗病毒制剂，可以通过口服给药，对提高鸡群早期免疫力具有很好的临床效果。

Description

一种口服禽干扰素融合蛋白及其作为免疫增强剂的应用

技术领域

本发明涉及一种口服禽干扰素融合蛋白及其作为免疫增强剂的应用。

背景技术

免疫抑制性疾病在畜禽中普遍存在，疫苗无法提供有效的保护。近年随着畜禽饲养规模的不断扩大，疾病传播的机会也大大增加。尽管应用各种疫苗对畜禽的重要传染病进行预防，但是生产实践中，疾病却时常发生，究其原因为病毒性免疫抑制病。免疫抑制是指由于疾病、应激、营养等因素影响，机体对抗原的应答能力低下甚至缺失的现象。正是由于这些病毒性免疫抑制病的存在，使得畜禽养殖业受到巨大挑战。免疫抑制性疾病除了本身的直接危害之外，更为重要的是造成免疫抑制，可使低致病性的病原体引起多种疾病综合症发生，甚至达到难以控制的程度。还造成对疫苗接种反应增强、副作用加大，或使免疫失败和对治疗无应答。

免疫抑制性病的危害对畜禽健康的威胁日益增加。当前最常发生并危害严重的猪免疫抑制性疾病是猪繁殖与呼吸综合症、伪狂犬病、猪流感和圆环病毒Ⅱ型感染；禽主要是传染性法氏囊炎、鸡传染性贫血、马立克氏病、白血病、禽网状内皮增生病及禽呼肠孤病毒感染等。

发明内容

本发明的目的是提供一种口服禽干扰素融合蛋白及其作为免疫增强剂的应用。

本发明提供了一种融合蛋白，包括区段甲和区段乙；所述区段甲为鸡α干扰素；所述区段乙为鸡β干扰素。

所述鸡α干扰素为如下(a1)或(a2)：

(a1)由序列表中序列1第1-193位氨基酸残基组成的蛋白质；

(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有α干扰素功能的由(a1)衍生的蛋白质。

所述鸡β干扰素为如下(a3)或(a4)：

(a3)由序列表中序列1第204-406位氨基酸残基组成的蛋白质；

(a4)将(a3)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有β干扰素功能的由(a3)衍生的蛋白质。

所述融合蛋白具体可为如下(a5)或(a6)或(a7)：

(a5)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a6)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a7)将(a5)或(a6)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白质。

编码所述融合蛋白的基因也属于本发明的保护范围。

所述基因为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)的DNA分子：

(b1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

(b2)编码区如序列表中序列4所示的DNA分子；

(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的DNA序列杂交且编码所述融合蛋白的DNA分子；

(b4)与(b1)或(b2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码所述融合蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

本发明还保护所述融合蛋白的应用，为如下(c1)至(c14)中的至少一种：

(c1)作为免疫增强剂；

(c2)作为口服型免疫增强剂；

(c3)制备免疫增强剂；

(c4)制备口服型免疫增强剂；

(c5)作为疫苗的免疫增强剂；

(c6)作为疫苗的口服型免疫增强剂；

(c7)作为禽流感病毒疫苗的免疫增强剂；

(c8)作为禽流感病毒疫苗的口服型免疫增强剂；

(c9)制备疫苗；

(c10)制备禽流感病毒疫苗；

(c11)作为抗病毒制剂；

(c12)制备抗病毒制剂；

(c13)作为抗水疱性口炎病毒制剂；

(c14)制备抗水疱性口炎病毒制剂。

所述(c7)或(c8)中，所述禽流感病毒疫苗具体可为重组禽流感病毒H5亚型三价灭活疫苗(Re-6株+Re-7株+Re-8株)。

所述(c7)或(c8)或(c10)中，所述禽流感具体可为H5亚型禽流感病毒引起的禽流感。

本发明还保护将编码所述融合蛋白的基因导入宿主菌得到的重组菌。所述宿主菌可为大肠杆菌，具体可为大肠杆菌BL-21(DE3)。编码所述融合蛋白的基因具体可通过重组表达载体导入所述宿主菌。所述重组表达载体具体可为重组质粒pET28b-ChIFNα-β。重组质粒pET28b-ChIFNα-β为在载体pET28b(+)的多克隆位点(例如BamH I和Xho I酶切位点之间)插入序列表的序列2所示的双链DNA分子得到的重组质粒。

本发明还保护大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21/pET28b-ChIFNα-β，已于2017年01月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC NO.13645。大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21/pET28b-ChIFNα-β简称重组菌BL21/pET28b-ChIFNα-β。

本发明还保护以上任一所述重组菌在制备所述融合蛋白中的应用。

本发明还保护重组菌BL21/pET28b-ChIFNα-β在制备所述融合蛋白中的应用。

本发明还保护所述融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：培养以上任一所述重组菌，得到所述融合蛋白。

本发明还保护所述融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：培养重组菌BL21/pET28b-ChIFNα-β，得到所述融合蛋白。

本发明还保护一种产品，包括鸡α干扰素和鸡β干扰素。

所述鸡α干扰素为如下(a1)或(a2)：

(a1)由序列表中序列1第1-193位氨基酸残基组成的蛋白质；

所述鸡β干扰素为如下(a3)或(a4)：

(a3)由序列表中序列1第204-406位氨基酸残基组成的蛋白质；

所述产品的功能为如下(c1)至(c14)中的至少一种：

(c1)作为免疫增强剂；

(c2)作为口服型免疫增强剂；

(c3)制备免疫增强剂；

(c4)制备口服型免疫增强剂；

(c5)作为疫苗的免疫增强剂；

(c6)作为疫苗的口服型免疫增强剂；

(c7)作为禽流感病毒疫苗的免疫增强剂；

(c8)作为禽流感病毒疫苗的口服型免疫增强剂；

(c9)制备疫苗；

(c10)制备禽流感病毒疫苗；

(c11)作为抗病毒制剂；

(c12)制备抗病毒制剂；

(c13)作为抗水疱性口炎病毒制剂；

(c14)制备抗水疱性口炎病毒制剂。

本发明提供的融合蛋白，作为免疫增强剂或抗病毒制剂，可以通过口服给药，简单且易操作，对提高鸡群早期免疫力具有很好的临床效果。

附图说明

图1为his₆-ChIFN-α-β溶液的电泳图。

图2为实施例4的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

载体pET28b(+)：北京碧橙蓝生物科技有限责任公司，产品目录号：S18-10。大肠杆菌BL-21(DE3)：北京康为世纪生物科技有限公司，货号为CW0809。DF-1细胞(鸡成纤维细胞系)：上海歌凡生物细胞库，产品目录号：ATCC DF-1。VSV病毒(水疱性口炎病毒)：中国兽医药品监察所。

PBS缓冲液的制备方法：8g NaCl、0.2g KCl、1.38g Na₂HPO₄、0.2g KH₂PO₄溶于1LddH₂0，调pH至7.4。

实施例1、融合蛋白的制备

一、重组质粒的构建

1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。

将序列表的序列2所示的双链DNA分子命名为ChIFN-α-β融合基因。

序列表的序列2所示的双链DNA分子编码序列表的序列1所示的蛋白质。将序列表的序列1所示的蛋白质命名为ChIFN-α-β融合蛋白。

序列表的序列1中，第1-193位氨基酸残基组成鸡α干扰素，第194-203位氨基酸残基组成连接肽(柔性Linker)，第204-406位氨基酸残基组成鸡β干扰素。

序列表的序列2中，第1-579位核苷酸编码鸡α干扰素，第580-609位核苷酸编码连接肽，第610-1218位核苷酸编码鸡β干扰素，第1219-1221位核苷酸为终止密码子。

2、以步骤1得到的双链DNA分子为模板，采用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

上游引物：5’-GGAAGGATCCG ATGGCTGTGCCTGCAAG-3’；

下游引物：5’-CCGGCTCGAG TCACTGGGTGTTGAGACGT-3’。

3、取步骤2得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶BamH I和Xho I进行双酶切，回收酶切产物。

4、取载体pET28b(+)，用限制性内切酶BamH I和Xho I进行双酶切，回收约5.3kb的载体骨架。

5、将步骤3得到的酶切产物和步骤4得到的载体骨架连接，得到重组质粒pET28b-ChIFNα-β。

根据测序结果，对重组质粒pET28b-ChIFNα-β进行结构描述如下：在载体pET28b(+)的BamH I和Xho I酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的双链DNA分子。

重组质粒pET28b-ChIFNα-β中，外源插入的DNA分子与载体骨架上的部分核苷酸形成序列表的序列4所示的DNA分子，将其命名为his₆-ChIFN-α-β融合基因。序列表的序列4所示的DNA分子编码序列表的序列3所示的蛋白质，将其命名为his₆-ChIFN-α-β融合蛋白。

序列表的序列3中，第5-10位氨基酸残基组成his₆标签，第35-227位氨基酸残基组成鸡α干扰素，第228-237位氨基酸残基组成连接肽，第238-440位氨基酸残基组成鸡β干扰素。

序列表的序列4中，第13-30位核苷酸编码his₆标签，第103-681位核苷酸编码鸡α干扰素，第682-711位核苷酸编码连接肽，第712-1320位核苷酸编码鸡β干扰素，第1321-1323位核苷酸为终止密码子。

二、重组菌的获得

将重组质粒pET28b-ChIFNα-β导入大肠杆菌BL-21(DE3)，得到若干重组菌。

目的蛋白为his₆-ChIFN-α-β融合蛋白。将目的蛋白表达量最高的重组菌命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21/pET28b-ChIFNα-β，已于2017年01月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC NO.13645。大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21/pET28b-ChIFNα-β简称重组菌BL21/pET28b-ChIFNα-β。

剩余的重组菌中，按照目的蛋白表达量由高至低的顺序将前5株菌依次命名为重组菌A、重组菌B、重组菌C、重组菌D和重组菌E。

三、对照菌的获得

将载体pET28b(+)导入大肠杆菌BL-21(DE3)，得到对照菌。

四、his₆-ChIFN-α-β融合蛋白的制备

1、将重组菌BL21/pET28b-ChIFNα-β接种于2L含30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm振荡培养至OD_600nm值＝0.6，加入IPTG并使其在体系中的浓度为1mmol/L，然后37℃、180rpm振荡培养4h。

2、完成步骤1后，离心收集菌体，用PBS缓冲液重悬，在冰浴上进行超声破碎(超声6s、间隔12s，99次，300W)，然后4℃、12000rpm离心10min，收集沉淀(包涵体)。

3、取步骤2得到的沉淀，依次用washing buffer、resuspension buffer洗涤，然后4℃、12000rpm离心10min，收集沉淀(包涵体)。

washing buffer(pH8.0)：0.5g/100mL Triton-100、50mM Tris、300mM NaCl、10mMEDTA、10mM DTT，余量为水。

resuspension buffer(pH8.0)：50mM Tris、100mM NaCl、10mM EDTA、10mM DTT，余量为水。

4、取步骤3得到的沉淀，用dissolution buffer溶解，然后4℃、12000rpm离心10min，收集上清液。

dissolution buffer(pH8.0)：6M Gua-HCl(盐酸胍)、10％(体积比)甘油、50mMTris、100mM NaCl、10mM EDTA、10mM DTT，余量为水。

5、取步骤4得到的上清液，缓慢滴加到refolding buffer中，4℃、100rpm振荡20小时。

refolding buffer(pH8.0)：100mM Tris、400mM L-Arginine hydrochloride、2mMEDTA、5mM GSH、0.5mM GSSG，余量为水。

6、完成步骤5后，取整个液相，采用millpore超滤离心管进行浓缩和换液(20mMTris、150mM NaCl，余量为水，pH8.0)，得到4ml浓缩液。

7、取步骤6得到的浓缩液，4℃、12000rpm离心10min，收集上清液。

8、取步骤7得到的上清液，上样于Superdex 75 10/300GL分子筛层析柱(柱体积为24ml；填充物为葡聚糖凝胶)，然后用洗脱液洗脱(流速为0.3ml/min)，收集洗脱体积为12.8ml-15.1ml的过柱后溶液，即为含有his₆-ChIFN-α-β融合蛋白的溶液，将其命名为his₆-ChIFN-α-β溶液。

洗脱液(pH8.0)：20mM Tris、150mM NaCl，余量为水。

检测his₆-ChIFN-α-β溶液中的his₆-ChIFN-α-β融合蛋白浓度(以蛋白总浓度计)，计算完成步骤1后每升体系中his₆-ChIFN-α-β融合蛋白的产量，为150mg。

his₆-ChIFN-α-β溶液的电泳图见图1。1和2均对应his₆-ChIFN-α-β溶液，结果表明his₆-ChIFN-α-β溶液电泳仅显示一条带，即his₆-ChIFN-α-β融合蛋白。

五、采用各个重组菌生产his₆-ChIFN-α-β融合蛋白的产量的比较

用重组菌A代替重组菌BL21/pET28b-ChIFNα-β，按照步骤四进行操作。完成步骤1后每升体系中his₆-ChIFN-α-β融合蛋白的产量为75mg。

用重组菌B代替重组菌BL21/pET28b-ChIFNα-β，按照步骤四进行操作。完成步骤1后每升体系中his₆-ChIFN-α-β融合蛋白的产量为49mg。

用重组菌C代替重组菌BL21/pET28b-ChIFNα-β，按照步骤四进行操作。完成步骤1后每升体系中his₆-ChIFN-α-β融合蛋白的产量为35mg。

用重组菌D代替重组菌BL21/pET28b-ChIFNα-β，按照步骤四进行操作。完成步骤1后每升体系中his₆-ChIFN-α-β融合蛋白的产量为26mg。

用重组菌E代替重组菌BL21/pET28b-ChIFNα-β，按照步骤四进行操作。完成步骤1后，每升体系中his₆-ChIFN-α-β融合蛋白的产量为12mg。

用对照菌代替重组菌BL21/pET28b-ChIFNα-β，按照步骤四进行操作。完成步骤1后，每升体系中his₆-ChIFN-α-β融合蛋白的产量为0mg。

六、his₆-ChIFN-α融合蛋白的制备

1、在载体pET28b(+)的BamH I和Xho I酶切位点之间插入序列表的序列5所示的双链DNA分子，得到重组质粒pET28b-ChIFNα。

2、将重组质粒pET28b-ChIFNα导入大肠杆菌BL-21(DE3)，得到重组菌。

3、将步骤2得到的重组菌代替重组菌BL21/pET28b-ChIFNα-β，按照步骤四进行操作，得到的过柱后溶液，即为含有his₆-ChIFN-α融合蛋白的溶液，将其命名为his₆-ChIFN-α溶液。

七、his₆-ChIFN-β融合蛋白的制备

1、在载体pET28b(+)的BamH I和Xho I酶切位点之间插入序列表的序列6所示的双链DNA分子，得到重组质粒pET28b-ChIFNβ。

2、将重组质粒pET28b-ChIFNβ导入大肠杆菌BL-21(DE3)，得到重组菌。

3、将步骤2得到的重组菌代替重组菌BL21/pET28b-ChIFNα-β，按照步骤四进行操作，得到的过柱后溶液，即为含有his₆-ChIFN-β融合蛋白的溶液，将其命名为his₆-ChIFN-β溶液。

实施例2、抗病毒活性的测定

1、取生长良好的DF-1细胞，消化后用含10％FBS的DMEM培养液悬浮，得到细胞浓度为5×10⁵个/mL的细胞悬液。

2、取96孔细胞培养板，加入步骤1制备的细胞悬液(100μl/孔)，在37℃、5％CO₂条件下培养8-10h(形成单层细胞)。

3、取实施例1的步骤四制备的his₆-ChIFN-α-β溶液，用含10％FBS的DMEM培养液稀释，得到蛋白浓度为0.001mg/ml的溶液，将其命名为母液。取母液，用含10％FBS的DMEM培养液进行4倍梯度稀释，得到6种梯度的稀释液。

4、取完成步骤2的96孔板，吸弃培养上清，在3个阳性对照孔和3个阴性对照孔中加入含10％FBS的DMEM培养液(100μl/孔)，在18个试验孔中加入步骤3得到的稀释液(100μl/孔)(每个稀释液占用3个试验孔)，然后在37℃、5％CO₂条件下培养15小时。

5、取VSV病毒，用DMEM培养液稀释，得到1000TCID₅₀/ml的病毒液。

6、取完成步骤4的96孔板，在3个阳性对照孔中加入步骤5制备的病毒液(100μl/孔)，在3个阴性对照孔中加入DMEM培养液(100μl/孔)，在18个试验孔中加入步骤5制备的病毒液(100μl/孔)，然后在37℃、5％CO₂条件下培养24小时。

7、取完成步骤6的96孔板，吸弃上清，加入结晶紫染色液100μl(100μl/孔)，室温静置30min。

8、取完成步骤7的96孔板，吸弃上清，用双蒸水冲洗，然后加入脱色液(100μl/孔)，室温静置10min。脱色液：50ml乙醇、50ml双蒸水和0.1ml乙酸混合。

9、取完成步骤8的96孔板，利用酶标仪测定OD_570nm值并记录。

以能抑制50％细胞病变的蛋白量定义为一个活性单位，运用Reed-Muench法计算蛋白效价，见表1。

表1运用Reed-Muench法计算效价

X：阴性对照的OD_570nm平均值；

Y：阳性对照的OD_570nm平均值。

根据上表计算各项值，最后根据G项按照如下公式计算效价(假设上述计算中G4项计算值大于0.5，而G5项计算值小于0.5)：

蛋白效价(U/0.001mg)＝预先稀释倍数×4^{(4+(G4-0.5)/(G4-G5))}。

his₆-ChIFN-α-β融合蛋白的效价为1.48±0.03×10⁷U/mg。

实施例3、实施例4、实施例5中的his₆-ChIFN-α-β融合蛋白量均以U计量。

实施例3、稳定性及保质期测定

基于作为口服制剂的特殊性，对实施例1的步骤四制备的his₆-ChIFN-α-β溶液(三个生产批次：LW2016001、LW2016002、LW2016003)在不同条件下的稳定性(特别是在高温、高湿下的稳定性)进行考察。

“温度4℃-8℃，相对湿度60±10％”条件下保存6个月、12个月或18个月，然后按照实施例2的方法检测蛋白效价。

“温度25℃，相对湿度60±10％”条件下保存1个月、3个月或6个月，然后按照实施例2的方法检测蛋白效价。

结果见表2。

表2

在“温度4℃-8℃，相对湿度60±10％”的条件下存放18个月，在“温度25℃，相对湿度60±10％”的条件下存放3个月，生物活性无明显变化。

结果表明，his₆-ChIFN-α-β融合蛋白在上述条件下是稳定的。

实施例4、免疫增强作用

2’,5’-OAS和PKR是由干扰素诱导产生的两个重要的抗病毒蛋白。I型干扰素通过与位于细胞表面的IFNAR1来发挥其下游功能。IL-6和IL-8是经干扰素刺激后产生的重要炎性因子。

取DF-1细胞，接种6孔板，采用含10％FBS的DMEM培养液，在37℃、5％CO₂条件下培养12小时，然后加入实施例1的步骤四制备的his₆-ChIFN-α-β溶液(his₆-ChIFN-α-β融合蛋白在体系中的浓度为100U/mL)，继续在37℃、5％CO₂条件下培养24小时。每两个小时取细胞样本，提取细胞样本的总RNA并反转录得到cDNA，通过real-time PCR检测各个相关基因的表达水平。

结果见图2。2’,5’-OAS基因的表达水平在12h达到最高。PKR基因的表达水平8h达到最高。IFNAR1基因的表达水平在8h-12h达到最高。IL-6基因的表达水平在8h达到最高。IL-8基因的表达水平在12h达到最高。

实施例5、对流感病毒感染雏鸡的预防作用

本实施例中所用的流感病毒为H5亚型禽流感病毒；参考文献：曹伟胜徐成刚任涛罗开健张桂红廖明；H5亚型禽流感病毒分离株对金刚烷胺耐药性的鉴定；《华南农业大学学报》，2006年04期。

流感灭活疫苗：易邦生物工程有限公司生产的，重组禽流感病毒H5亚型三价灭活疫苗(Re-6株+Re-7株+Re-8株)；https://detail.1688.com/pic/538505887036.html？spm ＝a261y.7663282.1998411378.1.LeQFro。

北京白羽鸡：北京市大兴区种猪种鸡场。

一、分组给药

选用2周龄的SPF级北京白羽鸡为试验动物进行免疫。

试验分为五组，每组20只鸡，各组的免疫情况如下：

第一组(阴性对照组)：试验第1天和第15天各免疫一次PBS缓冲液(免疫方式：肌肉注射；单次单只的免疫体积：0.5ml)；

第二组(疫苗组)：试验第1天和第15天各免疫一次流感灭活疫苗(免疫方式：肌肉注射；单次单只的免疫剂量：10⁸EID₅₀；单次单只的免疫体积：0.5ml，用PBS缓冲液调整体积)；

第三组(疫苗+his₆-ChIFN-α-β融合蛋白组)：试验第1天和第15天各免疫一次流感灭活疫苗(免疫方式：肌肉注射；单次单只的免疫剂量：10⁸EID₅₀；单次单只的免疫体积：0.5ml，用PBS缓冲液调整体积)，每次免疫后口服实施例1的步骤四制备的his₆-ChIFN-α-β溶液0.5ml(其中his₆-ChIFN-α-β融合蛋白含量为10000U)；

第四组(疫苗+his₆-ChIFN-α融合蛋白组)：试验第1天和第15天各免疫一次流感灭活疫苗(免疫方式：肌肉注射；单次单只的免疫剂量：10⁸EID₅₀；单次单只的免疫体积：0.5ml，用PBS缓冲液调整体积)，每次免疫后口服实施例1的步骤六制备的his₆-ChIFN-α溶液0.5ml(其中his₆-ChIFN-α蛋白含量为10000U)；

第五组(灭活疫苗+his₆-ChIFN-β融合蛋白组)：试验第1天和第15天各免疫一次流感灭活疫苗(免疫方式：肌肉注射；单次单只的免疫剂量：10⁸EID₅₀；单次单只的免疫体积：0.5ml，用PBS缓冲液调整体积)，每次免疫后口服实施例1的步骤七制备的his₆-ChIFN-β溶液0.5ml(其中his₆-ChIFN-β蛋白含量为10000U)。

二、临床表征

每天观察试验动物，对临床症状进行统计评分。临床症状观察项目：精神状态、有无食欲、是否呕吐、是否有分泌物、粪便形状、采食及死亡情况、增重情况等。临床症状评分标准：按照下表给鸡群进行打分，分数越高，体况越好，满分10分，评分标准见表3，评分结果见表4。评分时间和频率：对试验动物从实验第1天开始每10天评分一次。

表3临床症状评分标准

表4鸡群临床症状评分统计结果

根据临床观察，结果表明各试验组及阴性对照组临床症状评分统计学上不存在着差异，即灭活疫苗和his₆-ChIFN-α-β融合蛋白口服联合使用，对鸡的生长无不良影响。

三、免疫学指标

试验第28天，取PBMC细胞以检测淋巴细胞增殖水平，颈静脉采血并收集血清以检测血凝抑制效价。

淋巴细胞增殖水平的检测方法如下(在含5％CO₂的37℃细胞培养箱中培养)：①将PBMC细胞悬浮于含有10mM HEPES、抗生素(青霉素和链霉素各100U/ml)和10％(体积百分含量)胎牛血清的PRIM-1640培养基，接种至96孔板(2×10⁶个细胞/孔)，培养24小时；②完成步骤①后，取所述96孔板，加入流感病毒作为刺激物，同时以Marc-145细胞(购自中国兽医药品监察所)作为刺激物的阴性对照，培养72小时；③完成步骤②后，取所述96孔板，加入MTT(20μL/孔)，培养4小时；④完成步骤③后，取所述96孔板，加入DMSO(150μL/孔)，混匀，10分钟厚测定570nm吸光值。刺激因子(SI)＝OD570值(样本孔-空白孔)/OD570值(阴性孔-空白孔)。

血凝抑制效价的检测方法(在含5％CO₂的37℃细胞培养箱中培养)：①胰酶消化Marc-145细胞，以6×10⁵细胞数/孔的量接种至96孔板中，培养20h；②用56℃水浴锅灭活待测血清30分钟，然后将血清与含100TCID50流感病毒和2％(体积比)FBS的DMEM培养液采用不同体积比混合(血清被稀释2¹倍、2²倍、2³倍或2⁴倍)，混匀后，37℃孵育1h；③取完成步骤①的96孔板，吸弃上清，然后加入步骤②得到的血清-病毒混合物(100μL/孔)，培养1h；④完成步骤③后，取所述96孔板，弃除上清，用无菌PBS缓冲液洗2次，吸弃上清，加入含2％(体积比)FBS的DMEM培养液，培养4天；⑤完成步骤④后，观察细胞病变CPE；计算中和抗体滴度(效价)。

结果见表5。

表5

与其它各组相比，第三组中淋巴细胞增殖水平和血凝抑制效价存在着差异，明显高于其它组。结果表明，his₆-ChIFN-α-β融合蛋白作为口服免疫增强剂可以显著增强市售灭活疫苗的免疫效力。

四、ELISA方法检测IgA

每组的20只鸡中，10只进行步骤四。分别于试验第28天取3只鸡、第35天取3只鸡，第42天取4只鸡，采集气管液，将气管液用抗体稀释液(NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 3.58g/L，KH₂PO₄ 0.2g/L，1％BSA，余量为水)稀释至10倍体积，得到气管液稀释液。

1、取鸡流感病毒H5型(FLUV-H5)ELISA试剂盒(购自北京冬歌博业生物科技有限公司)中的酶标板，每孔加入100μL气管液稀释液，37℃孵育1h，然后用PBST溶液洗涤5次。

2、完成步骤1后，取所述酶标板，每孔加入100μL酶标二抗，37℃孵育1h，然后用PBST溶液洗涤5次。酶标二抗为HRP标记的羊抗鸡IgA(购自SouthernBiotec)。酶标二抗用抗体稀释液按1：5000稀释后使用。

3、完成步骤2后，取所述酶标板，每孔加入100μL TMB显色液，37℃孵育15min，然后每孔加入50μL终止液(2mol/L硫酸水溶液)，最后用酶标仪测定450nm下的吸光值(OD₄₅₀)。

OD₄₅₀结果见表6。

表6

组别	试验第28天	试验第35天	试验第42天
				第一组	0.197	0.195	0.189
第二组	0.352	0.448	0.534
				第三组	0.759	0.925	1.085
第四组	0.489	0.615	0.714
				第五组	0.472	0.639	0.722

与其它各组相比，第三组气管液中IgA水平明显高于其它组。结果表明，his₆-ChIFN-α-β融合蛋白作为口服免疫增强剂可以显著增强市售灭活疫苗的免疫效力，且效果显著优于对照。

五、攻毒实验

每组的20只鸡中，步骤四以外的10只进行步骤五。

在实验第28天，进行攻毒试验，攻毒方式为肌肉注射0.5ml流感病毒(病毒剂量为2000pfu)，攻毒7天后检测保护率(存活率)。

结果表明，第一组的10只鸡全部死亡，第二组的10只鸡中6只存活(保护率为60％)，第三组的10只鸡均存活(保护率为100％)，第四组的10只鸡中7只存活(保护率为70％)，第五组的10只鸡中7只存活(保护率为70％)。

以上数据均表明his₆-ChIFN-α-β融合蛋白溶液可以作为口服的禽用疫苗的免疫增强剂，显著增加疫苗的免疫效果。将his₆-ChIFN-α-β融合蛋白作为口服制剂，在鸡群早期给药，与现有疫苗联合使用，可以有效地预防鸡流感的发生，对鸡群具有保护力。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 一种口服禽干扰素融合蛋白及其作为免疫增强剂的应用

<130> GNCYX170342

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 406

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ala Val Pro Ala Ser Pro Gln His Pro Arg Gly Tyr Gly Ile Leu

1 5 10 15

Leu Leu Thr Leu Leu Leu Lys Ala Leu Ala Thr Thr Ala Ser Ala Cys

20 25 30

Asn His Leu Arg Pro Gln Asp Ala Thr Phe Ser His Asp Ser Leu Gln

35 40 45

Leu Leu Arg Asp Met Ala Pro Thr Leu Pro Gln Leu Cys Pro Gln His

50 55 60

Asn Ala Ser Cys Ser Phe Asn Asp Thr Ile Leu Asp Thr Ser Asn Thr

65 70 75 80

Arg Gln Ala Asp Lys Thr Thr His Asp Ile Leu Gln His Leu Phe Lys

85 90 95

Ile Leu Ser Ser Pro Ser Thr Pro Ala His Trp Asn Asp Ser Gln Arg

100 105 110

Gln Ser Leu Leu Asn Arg Ile His Arg Tyr Thr Gln His Leu Glu Gln

115 120 125

Cys Leu Asp Ser Ser Asp Thr Arg Ser Arg Thr Arg Trp Pro Arg Asn

130 135 140

Leu His Leu Thr Ile Lys Lys His Phe Ser Cys Leu His Thr Phe Leu

145 150 155 160

Gln Asp Asn Asp Tyr Ser Ala Cys Ala Trp Glu His Val Arg Leu Gln

165 170 175

Ala Arg Ala Trp Phe Leu His Ile His Asn Leu Thr Gly Asn Thr Arg

180 185 190

Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Thr Ala Asn His

195 200 205

Gln Ser Pro Gly Met His Ser Ile Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Ala

210 215 220

Leu Thr Thr Thr Phe Ser Cys Asn His Leu Arg His Gln Asp Ala Asn

225 230 235 240

Phe Ser Trp Lys Ser Leu Gln Leu Leu Gln Asn Thr Ala Pro Pro Pro

245 250 255

Pro Gln Pro Cys Pro Gln Gln Asp Val Thr Phe Pro Phe Pro Glu Thr

260 265 270

Leu Leu Lys Ser Lys Asp Lys Lys Gln Ala Ala Ile Thr Thr Leu Arg

275 280 285

Ile Leu Gln His Leu Phe Asn Met Leu Ser Ser Pro His Thr Pro Lys

290 295 300

His Trp Ile Asp Arg Thr Arg His Ser Leu Leu Asn Gln Ile Gln His

305 310 315 320

Tyr Ile His His Leu Glu Gln Cys Phe Val Asn Gln Gly Thr Arg Ser

325 330 335

Gln Arg Arg Gly Pro Arg Asn Ala His Leu Ser Ile Asn Lys Tyr Phe

340 345 350

Arg Ser Ile His Asn Phe Leu Arg His Asn Asn Tyr Ser Ala Cys Thr

355 360 365

Trp Asp His Val Arg Leu Gln Ala Arg Asp Cys Phe Arg His Val Asp

370 375 380

Thr Leu Ile Gln Trp Met Lys Ser Arg Ala Pro Leu Thr Ala Ser Ser

385 390 395 400

Lys Arg Leu Asn Thr Gln

405

<210> 2

<211> 1221

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggctgtgc ctgcaagccc acagcaccca cgggggtacg gcatcctgct gctcacgctc 60

cttctgaaag ctctcgccac caccgcctcc gcctgcaacc accttcgccc ccaggatgcc 120

accttctctc acgacagcct ccagctcctc cgggacatgg ctcccacact accccagctg 180

tgcccacagc acaacgcgtc ttgctccttc aacgacacca tcctggacac cagcaacacc 240

cggcaagccg acaaaaccac ccacgacatc cttcagcacc tcttcaaaat cctcagcagc 300

cccagcactc cagcccactg gaacgacagc caacgccaaa gcctcctcaa ccggatccac 360

cgctacaccc agcacctcga gcaatgcttg gacagcagcg acacgcgctc ccggacgcga 420

tggcctcgca accttcacct caccatcaaa aaacacttca gctgcctcca caccttcctc 480

caagacaacg attacagcgc ctgcgcctgg gaacacgtcc gcctgcaagc tcgtgcctgg 540

ttcctgcaca tccacaacct cacaggcaac acgcgcactg gtggcggagg gagtggtggc 600

ggagggagta tgactgcaaa ccatcagtct ccagggatgc acagcatcct actgctcttg 660

cttctgccag ctctcaccac caccttctcc tgcaaccatc ttcgtcacca ggatgccaac 720

ttctcttgga aaagcctcca gctccttcag aatacggctc cacctccacc acagccttgc 780

ccacaacaag acgtgacttt tccatttcca gaaacccttc tgaaaagcaa ggacaagaag 840

caagcagcca tcaccaccct ccgcatcctc caacacctct tcaacatgct tagcagccca 900

cacactccaa aacactggat tgaccgcaca cgccacagcc tcctcaacca gatccagcat 960

tacatccatc accttgagca atgcttcgta aaccaaggca cgcgctccca gaggcgaggg 1020

cctcgcaacg ctcacctcag catcaacaaa tacttcagat ccatccacaa cttcctacgg 1080

cacaacaact acagtgcttg tacctgggac catgtccgcc tccaggctcg tgactgcttc 1140

cgacacgtgg acacactcat acaatggatg aaaagtcgag ctcctctcac agcctcatcc 1200

aaacgtctca acacccagtg a 1221

<210> 3

<211> 440

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg

20 25 30

Asp Pro Met Ala Val Pro Ala Ser Pro Gln His Pro Arg Gly Tyr Gly

35 40 45

Ile Leu Leu Leu Thr Leu Leu Leu Lys Ala Leu Ala Thr Thr Ala Ser

50 55 60

Ala Cys Asn His Leu Arg Pro Gln Asp Ala Thr Phe Ser His Asp Ser

65 70 75 80

Leu Gln Leu Leu Arg Asp Met Ala Pro Thr Leu Pro Gln Leu Cys Pro

85 90 95

Gln His Asn Ala Ser Cys Ser Phe Asn Asp Thr Ile Leu Asp Thr Ser

100 105 110

Asn Thr Arg Gln Ala Asp Lys Thr Thr His Asp Ile Leu Gln His Leu

115 120 125

Phe Lys Ile Leu Ser Ser Pro Ser Thr Pro Ala His Trp Asn Asp Ser

130 135 140

Gln Arg Gln Ser Leu Leu Asn Arg Ile His Arg Tyr Thr Gln His Leu

145 150 155 160

Glu Gln Cys Leu Asp Ser Ser Asp Thr Arg Ser Arg Thr Arg Trp Pro

165 170 175

Arg Asn Leu His Leu Thr Ile Lys Lys His Phe Ser Cys Leu His Thr

180 185 190

Phe Leu Gln Asp Asn Asp Tyr Ser Ala Cys Ala Trp Glu His Val Arg

195 200 205

Leu Gln Ala Arg Ala Trp Phe Leu His Ile His Asn Leu Thr Gly Asn

210 215 220

Thr Arg Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Thr Ala

225 230 235 240

Asn His Gln Ser Pro Gly Met His Ser Ile Leu Leu Leu Leu Leu Leu

245 250 255

Pro Ala Leu Thr Thr Thr Phe Ser Cys Asn His Leu Arg His Gln Asp

260 265 270

Ala Asn Phe Ser Trp Lys Ser Leu Gln Leu Leu Gln Asn Thr Ala Pro

275 280 285

Pro Pro Pro Gln Pro Cys Pro Gln Gln Asp Val Thr Phe Pro Phe Pro

290 295 300

Glu Thr Leu Leu Lys Ser Lys Asp Lys Lys Gln Ala Ala Ile Thr Thr

305 310 315 320

Leu Arg Ile Leu Gln His Leu Phe Asn Met Leu Ser Ser Pro His Thr

325 330 335

Pro Lys His Trp Ile Asp Arg Thr Arg His Ser Leu Leu Asn Gln Ile

340 345 350

Gln His Tyr Ile His His Leu Glu Gln Cys Phe Val Asn Gln Gly Thr

355 360 365

Arg Ser Gln Arg Arg Gly Pro Arg Asn Ala His Leu Ser Ile Asn Lys

370 375 380

Tyr Phe Arg Ser Ile His Asn Phe Leu Arg His Asn Asn Tyr Ser Ala

385 390 395 400

Cys Thr Trp Asp His Val Arg Leu Gln Ala Arg Asp Cys Phe Arg His

405 410 415

Val Asp Thr Leu Ile Gln Trp Met Lys Ser Arg Ala Pro Leu Thr Ala

420 425 430

Ser Ser Lys Arg Leu Asn Thr Gln

435 440

<210> 4

<211> 1323

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgggatc cgatggctgt gcctgcaagc 120

ccacagcacc cacgggggta cggcatcctg ctgctcacgc tccttctgaa agctctcgcc 180

accaccgcct ccgcctgcaa ccaccttcgc ccccaggatg ccaccttctc tcacgacagc 240

ctccagctcc tccgggacat ggctcccaca ctaccccagc tgtgcccaca gcacaacgcg 300

tcttgctcct tcaacgacac catcctggac accagcaaca cccggcaagc cgacaaaacc 360

acccacgaca tccttcagca cctcttcaaa atcctcagca gccccagcac tccagcccac 420

tggaacgaca gccaacgcca aagcctcctc aaccggatcc accgctacac ccagcacctc 480

gagcaatgct tggacagcag cgacacgcgc tcccggacgc gatggcctcg caaccttcac 540

ctcaccatca aaaaacactt cagctgcctc cacaccttcc tccaagacaa cgattacagc 600

gcctgcgcct gggaacacgt ccgcctgcaa gctcgtgcct ggttcctgca catccacaac 660

ctcacaggca acacgcgcac tggtggcgga gggagtggtg gcggagggag tatgactgca 720

aaccatcagt ctccagggat gcacagcatc ctactgctct tgcttctgcc agctctcacc 780

accaccttct cctgcaacca tcttcgtcac caggatgcca acttctcttg gaaaagcctc 840

cagctccttc agaatacggc tccacctcca ccacagcctt gcccacaaca agacgtgact 900

tttccatttc cagaaaccct tctgaaaagc aaggacaaga agcaagcagc catcaccacc 960

ctccgcatcc tccaacacct cttcaacatg cttagcagcc cacacactcc aaaacactgg 1020

attgaccgca cacgccacag cctcctcaac cagatccagc attacatcca tcaccttgag 1080

caatgcttcg taaaccaagg cacgcgctcc cagaggcgag ggcctcgcaa cgctcacctc 1140

agcatcaaca aatacttcag atccatccac aacttcctac ggcacaacaa ctacagtgct 1200

tgtacctggg accatgtccg cctccaggct cgtgactgct tccgacacgt ggacacactc 1260

atacaatgga tgaaaagtcg agctcctctc acagcctcat ccaaacgtct caacacccag 1320

tga 1323

<210> 5

<211> 582

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggctgtgc ctgcaagccc acagcaccca cgggggtacg gcatcctgct gctcacgctc 60

cttctgaaag ctctcgccac caccgcctcc gcctgcaacc accttcgccc ccaggatgcc 120

accttctctc acgacagcct ccagctcctc cgggacatgg ctcccacact accccagctg 180

tgcccacagc acaacgcgtc ttgctccttc aacgacacca tcctggacac cagcaacacc 240

cggcaagccg acaaaaccac ccacgacatc cttcagcacc tcttcaaaat cctcagcagc 300

cccagcactc cagcccactg gaacgacagc caacgccaaa gcctcctcaa ccggatccac 360

cgctacaccc agcacctcga gcaatgcttg gacagcagcg acacgcgctc ccggacgcga 420

tggcctcgca accttcacct caccatcaaa aaacacttca gctgcctcca caccttcctc 480

caagacaacg attacagcgc ctgcgcctgg gaacacgtcc gcctgcaagc tcgtgcctgg 540

ttcctgcaca tccacaacct cacaggcaac acgcgcactt ga 582

<210> 6

<211> 612

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgactgcaa accatcagtc tccagggatg cacagcatcc tactgctctt gcttctgcca 60

gctctcacca ccaccttctc ctgcaaccat cttcgtcacc aggatgccaa cttctcttgg 120

aaaagcctcc agctccttca gaatacggct ccacctccac cacagccttg cccacaacaa 180

gacgtgactt ttccatttcc agaaaccctt ctgaaaagca aggacaagaa gcaagcagcc 240

atcaccaccc tccgcatcct ccaacacctc ttcaacatgc ttagcagccc acacactcca 300

aaacactgga ttgaccgcac acgccacagc ctcctcaacc agatccagca ttacatccat 360

caccttgagc aatgcttcgt aaaccaaggc acgcgctccc agaggcgagg gcctcgcaac 420

gctcacctca gcatcaacaa atacttcaga tccatccaca acttcctacg gcacaacaac 480

tacagtgctt gtacctggga ccatgtccgc ctccaggctc gtgactgctt ccgacacgtg 540

gacacactca tacaatggat gaaaagtcga gctcctctca cagcctcatc caaacgtctc 600

aacacccagt ga 612

Claims

1.一种融合蛋白，为如下(a1)或(a2)：

(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述融合蛋白的基因。

3.权利要求1所述融合蛋白的应用，为如下(c1)至(c6)中的至少一种：

(c1)制备免疫增强剂；

(c2)制备口服型免疫增强剂；

(c3)制备疫苗；

(c4)制备禽流感病毒疫苗；

(c5)制备抗病毒制剂；

(c6)制备抗水疱性口炎病毒制剂。

4.将权利要求2所述基因导入宿主菌得到的重组菌。

5.大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21/pET28b-ChIFNα-β，其保藏编号为CGMCCNO.13645。

6.权利要求4所述重组菌或权利要求5所述大肠埃希氏菌在制备权利要求1所述融合蛋白中的应用。

7.一种权利要求1所述融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：培养权利要求4所述重组菌或权利要求5所述大肠埃希氏菌，得到所述融合蛋白。