CN108018263B - 一种重组禽流感病毒的纯化浓缩方法及其系统 - Google Patents

一种重组禽流感病毒的纯化浓缩方法及其系统 Download PDF

Info

Publication number
CN108018263B
CN108018263B CN201711407814.7A CN201711407814A CN108018263B CN 108018263 B CN108018263 B CN 108018263B CN 201711407814 A CN201711407814 A CN 201711407814A CN 108018263 B CN108018263 B CN 108018263B
Authority
CN
China
Prior art keywords
avian influenza
influenza virus
purification
virus
hollow fiber
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201711407814.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108018263A (zh
Inventor
陈宏�
赵海源
曾显营
陈化兰
李金祥
田国彬
冯玉强
李莉
朱长动
王玉红
蒋晓梅
张天舒
王博
孙佰强
崔凯
赵博
刘金伟
曾晓敏
王仁君
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jilin Guanjie Biotechnology Co ltd
Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Original Assignee
Jilin Guanjie Biotechnology Co ltd
Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jilin Guanjie Biotechnology Co ltd, Harbin Veterinary Research Institute of CAAS filed Critical Jilin Guanjie Biotechnology Co ltd
Priority to CN201711407814.7A priority Critical patent/CN108018263B/zh
Publication of CN108018263A publication Critical patent/CN108018263A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108018263B publication Critical patent/CN108018263B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/12—Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及病毒纯化浓缩领域，特别涉及一种重组禽流感病毒的纯化浓缩方法及其系统。一种重组禽流感病毒的纯化浓缩方法，包括以下步骤：预处理的重组禽流感病毒经离心，去除大颗粒物质和细胞碎片，得到清液；清液使用中空纤维微滤系统处理，得到透过液；透过液使用膜包超滤浓缩系统处理，收集循环液，浓缩，即得。本发明提供的纯化浓缩方法，先经高速离心去除细胞碎片和大颗粒物质，中空纤维微滤系统纯化澄清去除小颗粒蛋白，然后经膜包超滤浓缩系统进行浓缩，得到纯化浓缩的重组禽流感病毒。整个过程简单易行，并有效降低病毒中的杂质含量和杂蛋白含量，病毒中杂蛋白含量去除90％以上；在浓缩后病毒效价明显提升。

Description

一种重组禽流感病毒的纯化浓缩方法及其系统
技术领域
本发明涉及病毒纯化浓缩领域，具体而言，涉及一种重组禽流感病毒的纯化浓缩方法及其系统。
背景技术
现有的重组禽流感疫苗主要采用鸡胚工艺进行抗原生产。在禽流感胚毒疫苗生产过程中，由于尿囊液中大量杂蛋白、内毒素、尿酸盐等使得抗原质量不稳定，疫苗使用中鸡体出现应激反应、局部溃烂、死亡等免疫副反应。特别是杂蛋白质和内毒素，不但干扰疫苗免疫抗体的产生，而且大大削减了单位抗原剂量的免疫效果，同时临床上因疫苗质量等造成的免疫失败、动物死亡的情况屡见不鲜。另外，抗原中过多的杂质使得抗原灭活中消耗大量灭活剂，造成灭活剂、防腐剂超标、残留，危害人类食品安全。
随着我国加入WTO，国际上对畜禽生产、动物性食品安全标准更进一步标准化，用药安全性、风险性的评估已成为畜禽生产主要控制指标。目前各生产厂家也在进行抗原浓缩等积极的纯化方法，但就从生产工艺上完全去除杂蛋白质、内毒素等还没有实际应用。在实验室中小批量的抗原纯化主要是以离心、离子交换处理等手段对病毒颗粒和相关性抗原进行纯化。在实际生产中提高抗原纯度，减少疫苗副反应是禽流感疫苗生产、使用过程中迫在眉睫的问题。
目前纯化禽流感病毒的方法主要有超滤法、亲和层析法和超速离心法。其中超速离心法是被广大研究者所普遍采用的方法。此外，PEG也有报道被用来纯化病毒。
现有技术在选用层析方法中填料的种类选择复杂，而且价格比较昂贵，增加疫苗生产成本。并且鸡胚工艺生产的病毒中杂质数量和种类较多，后期的浓缩阶段对前期粗纯和中纯过程要求高，然而超速离心机只能去除细胞碎片等大颗粒物质，并不能很好的达到纯度要求。因此，现有的传统纯化浓缩方法还有很多的不足之处，杂质去除效果有限，导致疫苗纯度低、安全性差、副作用大。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种重组禽流感病毒的纯化浓缩方法，以解决杂质去除难，导致疫苗纯度低、安全性差、副作用大等技术瓶颈。
本发明的第二目的在于提供一种重组禽流感病毒的纯化浓缩系统，纯化浓缩全程为管道化，安全可靠，更好满足密闭无菌要求，工艺简单，重复性好，易于生产工艺放大。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种重组禽流感病毒的纯化浓缩方法，包括以下步骤：预处理的重组禽流感病毒经离心，去除大颗粒物质和细胞碎片，得到清液；
所述清液使用中空纤维微滤系统处理，得到透过液；
所述透过液使用膜包超滤浓缩系统处理，收集循环液，浓缩，即得。
本发明提供的一种重组禽流感病毒的纯化浓缩方法，预处理的重组禽流感病毒经高速离心去除剩下的细胞碎片和大颗粒物质，中空纤维微滤系统纯化澄清去除小颗粒蛋白，然后经膜包超滤浓缩系统进行浓缩，得到纯化浓缩的重组禽流感病毒。整个过程简单易行，并有效降低病毒中的杂质含量和杂蛋白含量，病毒中杂蛋白含量去除90％以上；在浓缩后病毒保持较高的效价。
进一步地，所述预处理为：低温静置沉淀，然后抽取上清液。此过程可以去除大部分的细胞碎片。
优选地，所述离心采用离心机进行。
优选地，所述离心机为连续流离心机。连续流离心机是样品液在离心过程中连续导入，沉淀留在离心仓内，上清液不断排出的一种适于大规模制备的离心技术。
进一步地，所述离心机的转速为10000-15000转/分。如在不同的实施例中，离心机的转速可以为10000转/分、11000转/分、12000转/分、13000转/分、14000转/分、15000转/分等等。
离心过程中取样对浊度进行监测，当离心机在5000转/分时取样测得浊度300-500NTU之间；当离心机转速在10000转/分时离心效果在200-350NTU之间，还是存在一些风险；当把离心机转速调整到15000转/分时离心效果也就是浊度可以达到70-90NTU，完全符合离心纯化要求，保证了离心的效果。
优选地，所述中空纤维微滤系统所用的中空纤维柱膜孔径为0.45-1.0μm。如在不同的实施例中，中空纤维柱膜孔径可以为0.45μm、0.50μm、0.55μm、0.60μm、0.65μm、0.70μm、0.75μm、0.80μm、0.90μm、0.95μm、1.0μm等等。
经试验发现，进一步地，所述中空纤维微滤系统中空纤维膜柱数为5-8支。
中空纤维膜柱的个数太少，小颗粒蛋白去除的效果差，而经过5-8支中空纤维膜柱处理后，小颗粒蛋白去除效果佳；中空纤维膜柱的个数太多，如9支即以上，小颗粒蛋白去除的效果差异不大，但是处理效率低，病毒损失大且成本增高。
进一步地，所述膜包超滤浓缩系统中，膜包膜孔径为300-750kD。
优选地，所述膜包超滤浓缩系统中，膜包膜孔径为500-700kD，更优选为600-700kD。如在不同的实施例中，膜包膜孔径可以为500kD、550kD、600kD、650kD、700kD等等。
进一步地，所述膜包超滤浓缩系统中，膜包数量为10-18块。
如在不同的实施例中，膜包数量可以为10块、12块、14块、16块、18块等等。
本发明还提供了一种重组禽流感病毒的纯化浓缩系统，包括依次连接的连续流离心机、罐A、中空纤维微滤系统、罐B、膜包超滤浓缩系统；
其中，罐A与中空纤维微滤系统之间循环连接，罐B与膜包超滤浓缩系统之间循环连接。
本发明提供的一种重组禽流感病毒的纯化浓缩系统，纯化浓缩全程为管道化，安全可靠，更好满足密闭无菌要求，工艺简单，重复性好，易于生产工艺放大。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的一种重组禽流感病毒的纯化浓缩方法，所用的中空纤维微滤系统和膜包超滤浓缩系统均采用切向流过滤，温和低剪切力，减少对病毒的损伤，保持病毒颗粒完整性良好。
(2)本发明提供的一种重组禽流感病毒的纯化浓缩方法，在保持病毒有效活性的同时，有效降低病毒中的杂质含量和杂蛋白含量，为疫苗的生产提供良好的技术支撑。
(3)本发明提供的一种重组禽流感病毒的纯化浓缩方法，操作简单，重复性好，得到的重组禽流感病毒性能稳定。
(4)本发明提供的一种重组禽流感病毒的纯化浓缩方法，工艺简单，易于生产工艺放大。
(5)本发明提供的一种重组禽流感病毒的纯化浓缩系统，纯化浓缩全程为管道化，安全可靠，更好满足密闭无菌要求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例中提供的一种重组禽流感病毒的纯化浓缩系统结构示意图。
图中：
1-连续流离心机；2-中空纤维微滤系统；3-膜包超滤浓缩系统。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
一种重组禽流感病毒的纯化浓缩方法，包括以下步骤：
1)对待处理重组禽流感病毒(细胞源)H7N9 H7-Re1株低温静置沉淀，然后抽取上清液，得到预处理的重组禽流感病毒，测定，HA效价为29；EID50为108.0/0.1ml；TCID50为108.1/1ml。
2)使用连续流离心机1处理病毒，去除病毒中大颗粒物质
①用连续流离心机1，设定转速为15000转/分。
②收集离心后的清液，弃去重液，清液进入图1中罐A。
③送样品检测HA、EID50、TCID50和内毒素。
在连续流离心机1离心后HA、EID50、TCID50和内毒素指标均没有发生改变，无损失。
3)中空纤维微滤系统2处理收集的清液
①用于禽流感病毒纯化用中空纤维柱膜孔径是1μm，用于禽流感病毒纯化中空纤维系统中空纤维膜柱数是6支。
②收集透过液，进入图1中罐B。
③送样品检测HA、EID50、TCID50和内毒素。
经过中空纤维系统再次澄清后的HA效价为28，EID50为107.5/0.1ml，病毒回收率92％，TCID50为107.5/1ml，内毒素<5EU。
4)使用膜包超滤浓缩系统3处理收集的透过液
①用于禽流感病毒浓缩用膜包膜孔径是500kD，用于禽流感病毒浓缩用膜包超滤系统中膜包数量是12块。
②收集循环液，弃去透过液对病毒进行浓缩，最终浓缩液在图1中罐B。
③送样品检测HA、EID50、TCID50和内毒素。
经过膜包超滤系统浓缩后的病毒HA效价为211，EID50为108.3/0.1ml，病毒回收率97％，TCID50为108.3/1ml，内毒素<5EU。
另外，测定蛋白含量，预处理的重组禽流感病毒中杂蛋白含量为102.3mg/ml，纯化浓缩后杂蛋白含量为6.65mg/ml，杂蛋白去除率为93.50％。
通过本发明提供的纯化浓缩方法，设备间采用全管道化连接，能够安全、快速、稳定、有效的将重组禽流感病毒进行纯化浓缩。在每个环节均会送样品检测HA、EID50、TCID50和内毒素等相关指标，在料液处理量大幅提升的同时，病毒回收率也非常稳定。
实施例2
一种重组禽流感病毒的纯化浓缩方法，包括以下步骤：
1)对待处理重组禽流感病毒(细胞源)H7N9H7-Re1株低温静置沉淀，然后抽取上清液，得到预处理的重组禽流感病毒，测定，HA效价为29.1；EID50为108.1/0.1ml；TCID50为108.1/1ml。
2)使用连续流离心机1处理病毒，去除病毒中大颗粒物质
①用连续流离心机1，设定转速为10000转/分。
②收集离心后的清液，弃去重液，清液进入图1中罐A。
③送样品检测HA、EID50、TCID50和内毒素。
在连续流离心机1离心后HA、EID50、TCID50和内毒素指标均没有发生改变，无损失。
3)中空纤维微滤系统2处理收集的清液
①用于禽流感病毒纯化用中空纤维柱膜孔径是0.8μm，用于禽流感病毒纯化中空纤维系统中空纤维膜柱数是8支。
②收集透过液，进入图1中罐B。
③送样品检测HA、EID50、TCID50和内毒素。
经过中空纤维系统再次澄清后的HA效价为28.2，EID50为107.6/0.1ml，病毒回收率94％，TCID50为107.6/1ml，内毒素<5EU。
4)使用膜包超滤浓缩系统3处理收集的透过液
①用于禽流感病毒浓缩用膜包膜孔径是600kD，用于禽流感病毒浓缩用膜包超滤系统中膜包数量是10块。
②收集循环液，弃去透过液对病毒进行浓缩，最终浓缩液在图1中罐B。
③送样品检测HA、EID50、TCID50和内毒素。
经过膜包超滤系统浓缩后的病毒HA效价为210.8，EID50为108.2/0.1ml，病毒回收率95％，TCID50为108.2/1ml，内毒素<5EU。
另外，测定蛋白含量，预处理的重组禽流感病毒中杂蛋白含量为98.8mg/ml，纯化浓缩后杂蛋白含量为7.21mg/ml，杂蛋白去除率为92.70％。
通过本发明提供的纯化浓缩方法，设备间采用全管道化连接，能够安全、快速、稳定、有效的将重组禽流感病毒进行纯化浓缩。在每个环节均会送样品检测HA、EID50、TCID50和内毒素等相关指标，在料液处理量大幅提升的同时，病毒回收率也非常稳定。
实施例3
一种重组禽流感病毒的纯化浓缩方法，包括以下步骤：
1)对待处理重组禽流感病毒(细胞源)H7N9H7-Re1株低温静置沉淀，然后抽取上清液，得到预处理的重组禽流感病毒，测定，HA效价为29；EID50为108.0/0.1ml；TCID50为108.1/1ml。
2)使用连续流离心机1处理病毒，去除病毒中大颗粒物质
①用连续流离心机1，设定转速为12000转/分。
②收集离心后的清液，弃去重液，清液进入图1中罐A。
③送样品检测HA、EID50、TCID50和内毒素。
在连续流离心机1离心后HA、EID50、TCID50和内毒素指标均没有发生改变，无损失。
3)中空纤维微滤系统2处理收集的清液
①用于禽流感病毒纯化用中空纤维柱膜孔径是1μm，用于禽流感病毒纯化中空纤维系统中空纤维膜柱数是5支。
②收集透过液，进入图1中罐B。
③送样品检测HA、EID50、TCID50和内毒素。
经过中空纤维系统再次澄清后的HA效价为28.0，EID50为107.6/0.1ml，病毒回收率94％，TCID50为107.6/1ml，内毒素<5EU。
4)使用膜包超滤浓缩系统3处理收集的透过液
①用于禽流感病毒浓缩用膜包膜孔径是500kD，用于禽流感病毒浓缩用膜包超滤系统中膜包数量是14块。
②收集循环液，弃去透过液对病毒进行浓缩，最终浓缩液在图1中罐B。
③送样品检测HA、EID50、TCID50和内毒素。
经过膜包超滤系统浓缩后的病毒HA效价为210.5，EID50为108.10.1ml，病毒回收率93％，TCID50为108.0/1ml，内毒素<5EU。
另外，测定蛋白含量，预处理的重组禽流感病毒中杂蛋白含量为100.5mg/ml，纯化浓缩后杂蛋白含量为6.23mg/ml，杂蛋白去除率为93.80％。
通过本发明提供的纯化浓缩方法，设备间采用全管道化连接，能够安全、快速、稳定、有效的将重组禽流感病毒进行纯化浓缩。在每个环节均会送样品检测HA、EID50、TCID50和内毒素等相关指标，在料液处理量大幅提升的同时，病毒回收率也非常稳定。
实施例4
一种重组禽流感病毒的纯化浓缩方法：包括以下步骤：
1)对待处理重组禽流感病毒(细胞源)H7N9H7-Re1株低温静置沉淀，然后抽取上清液，得到预处理的重组禽流感病毒，测定，HA效价为29；EID50为108.0/0.1ml；TCID50为108.1/1ml。
2)使用连续流离心机1处理病毒，去除病毒中大颗粒物质
①用连续流离心机1，设定转速为13000转/分。
②收集离心后的清液，弃去重液，清液进入图1中罐A。
③送样品检测HA、EID50、TCID50和内毒素。
在连续流离心机1离心后HA、EID50、TCID50和内毒素指标均没有发生改变，无损失。
3)中空纤维微滤系统2处理收集的清液
①用于禽流感病毒纯化用中空纤维柱膜孔径是0.45μm，用于禽流感病毒纯化中空纤维系统中空纤维膜柱数是8支。
②收集透过液，进入图1中罐B。
③送样品检测HA、EID50、TCID50和内毒素。
经过中空纤维系统再次澄清后的HA效价为27.7，EID50为107.3/0.1ml，病毒回收率91％，TCID50为107.3/1ml，内毒素<5EU。
4)使用膜包超滤浓缩系统3处理收集的透过液
①用于禽流感病毒浓缩用膜包膜孔径是750kD，用于禽流感病毒浓缩用膜包超滤系统中膜包数量是16块。
②收集循环液，弃去透过液对病毒进行浓缩，最终浓缩液在图1中罐B。
③送样品检测HA、EID50、TCID50和内毒素。
经过膜包超滤系统浓缩后的病毒HA效价为210.8，EID50为108.2/0.1ml，病毒回收率96％，TCID50为108.1/1ml，内毒素<5EU。
另外，测定蛋白含量，预处理的重组禽流感病毒中杂蛋白含量为99.2mg/ml，纯化浓缩后杂蛋白含量为5.85mg/ml，杂蛋白去除率为94.10％。
通过本发明提供的纯化浓缩方法，设备间采用全管道化连接，能够安全、快速、稳定、有效的将重组禽流感病毒进行纯化浓缩。在每个环节均会送样品检测HA、EID50、TCID50和内毒素等相关指标，在料液处理量大幅提升的同时，病毒回收率也非常稳定。
实施例5
一种重组禽流感病毒的纯化浓缩方法：包括以下步骤：
1)对待处理重组禽流感病毒(细胞源)H7N9H7-Re1株低温静置沉淀，然后抽取上清液，得到预处理的重组禽流感病毒，测定，HA效价为29；EID50为108.0/0.1ml；TCID50为108.1/1ml。
2)使用连续流离心机1处理病毒，去除病毒中大颗粒物质
①用连续流离心机1，设定转速为14000转/分。
②收集离心后的清液，弃去重液，清液进入图1中罐A。
③送样品检测HA、EID50、TCID50和内毒素。
在连续流离心机1离心后HA、EID50、TCID50和内毒素指标均没有发生改变，无损失。
3)中空纤维微滤系统2处理收集的清液
①用于禽流感病毒纯化用中空纤维柱膜孔径是0.8μm，用于禽流感病毒纯化中空纤维系统中空纤维膜柱数是6支。
②收集透过液，进入图1中罐B。
③送样品检测HA、EID50、TCID50和内毒素。
经过中空纤维系统再次澄清后的HA效价为28，EID50为107.5/0.1ml，病毒回收率93％，TCID50为107.5/1ml，内毒素<5EU。
4)使用膜包超滤浓缩系统3处理收集的透过液
①用于禽流感病毒浓缩用膜包膜孔径是700kD，用于禽流感病毒浓缩用膜包超滤系统中膜包数量是10块。
②收集循环液，弃去透过液对病毒进行浓缩，最终浓缩液在图1中罐B。
③送样品检测HA、EID50、TCID50和内毒素。
经过膜包超滤系统浓缩后的病毒HA效价为211，EID50为108.3/0.1ml，病毒回收率97％，TCID50为108.3/1ml，内毒素<5EU。
另外，测定蛋白含量，预处理的重组禽流感病毒中杂蛋白含量为98.5mg/ml，纯化浓缩后杂蛋白含量为5.32mg/ml，杂蛋白去除率为94.60％。
通过本发明提供的纯化浓缩方法，设备间采用全管道化连接，能够安全、快速、稳定、有效的将重组禽流感病毒进行纯化浓缩。在每个环节均会送样品检测HA、EID50、TCID50和内毒素等相关指标，在料液处理量大幅提升的同时，病毒回收率也非常稳定。
实施例6
一种重组禽流感病毒的纯化浓缩方法：包括以下步骤：
1)对待处理重组禽流感病毒(细胞源)H7N9H7-Re1株低温静置沉淀，然后抽取上清液，得到预处理的重组禽流感病毒，测定，HA效价为29；EID50为108.0/0.1ml；TCID50为108.1/1ml。
2)使用连续流离心机1处理病毒，去除病毒中大颗粒物质
①用连续流离心机1，设定转速为15000转/分。
②收集离心后的清液，弃去重液，清液进入图1中罐A。
③送样品检测HA、EID50、TCID50和内毒素。
在连续流离心机1离心后HA、EID50、TCID50和内毒素指标均没有发生改变，无损失。
3)中空纤维微滤系统2处理收集的清液
①用于禽流感病毒纯化用中空纤维柱膜孔径是0.9μm，用于禽流感病毒纯化中空纤维系统中空纤维膜柱数是6支。
②收集透过液，进入图1中罐B。
③送样品检测HA、EID50、TCID50和内毒素。
经过中空纤维系统再次澄清后的HA效价为28，EID50为107.6/0.1ml，病毒回收率94％，TCID50为107.5/1ml，病毒回收率92％，内毒素<5EU。
4)使用膜包超滤浓缩系统3处理收集的透过液
①用于禽流感病毒浓缩用膜包膜孔径是300kD，用于禽流感病毒浓缩用膜包超滤系统中膜包数量是18块。
②收集循环液，弃去透过液对病毒进行浓缩，最终浓缩液在图1中罐B。
③送样品检测HA、EID50、TCID50和内毒素。
经过膜包超滤系统浓缩后的病毒HA效价为210.5，EID50为108.0/0.1ml，病毒回收率92％，TCID50为108.0/1ml，内毒素<5EU。
另外，测定蛋白含量，预处理的重组禽流感病毒中杂蛋白含量为101.3mg/ml，纯化浓缩后杂蛋白含量为4.96mg/ml，杂蛋白去除率为95.10％。
通过本发明提供的纯化浓缩方法，设备间采用全管道化连接，能够安全、快速、稳定、有效的将重组禽流感病毒进行纯化浓缩。在每个环节均会送样品检测HA、EID50、TCID50和内毒素等相关指标，在料液处理量大幅提升的同时，病毒回收率也非常稳定。
综上所述，本发明通过对重组禽流感病毒进行高速离心、中空纤维微滤系统2二次澄清和膜包超滤系统浓缩，合理搭配各装置达到对重组禽流感病毒纯化浓缩的目的，有效降低病毒中的杂质含量和杂蛋白含量，病毒中杂蛋白含量可以去除90％以上，并在浓缩后使病毒保持较高的效价，内毒素含量差异变化不明显，符合规定。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (3)

1.一种重组禽流感病毒的纯化浓缩方法，其特征在于，包括以下步骤：预处理的重组禽流感病毒经离心，去除大颗粒物质和细胞碎片，得到清液；所述离心采用离心机进行，所述离心机为连续流离心机；所述离心机的转速为10000-15000转/分；
所述清液使用中空纤维微滤系统处理，得到透过液；所述中空纤维微滤系统所用的中空纤维柱膜孔径为0.45-1.0μm，所述中空纤维微滤系统中空纤维膜柱数为5-8支；
所述透过液使用膜包超滤浓缩系统处理，收集循环液，即得；
膜包膜孔径为300-750kD；膜包数量为10-18块。
2.根据权利要求1所述的一种重组禽流感病毒的纯化浓缩方法，其特征在于，所述预处理为：低温静置沉淀，然后抽取上清液。
3.根据权利要求1所述的一种重组禽流感病毒的纯化浓缩方法使用的纯化浓缩系统，其特征在于，由依次连接的连续流离心机、罐A、中空纤维微滤系统、罐B、膜包超滤浓缩系统构成；
其中，罐A与中空纤维微滤系统之间循环连接，罐B与膜包超滤浓缩系统之间循环连接。
CN201711407814.7A 2017-12-22 2017-12-22 一种重组禽流感病毒的纯化浓缩方法及其系统 Active CN108018263B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711407814.7A CN108018263B (zh) 2017-12-22 2017-12-22 一种重组禽流感病毒的纯化浓缩方法及其系统

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711407814.7A CN108018263B (zh) 2017-12-22 2017-12-22 一种重组禽流感病毒的纯化浓缩方法及其系统

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108018263A CN108018263A (zh) 2018-05-11
CN108018263B true CN108018263B (zh) 2021-09-28

Family

ID=62074446

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711407814.7A Active CN108018263B (zh) 2017-12-22 2017-12-22 一种重组禽流感病毒的纯化浓缩方法及其系统

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108018263B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110129287B (zh) * 2019-05-15 2023-07-14 青岛蔚蓝生物制品有限公司 一种猪伪狂犬病毒双重超滤系统及纯化方法
CN116200346B (zh) * 2023-05-05 2023-09-12 北京赛尔富森生物科技有限公司 一种病毒单次过膜超滤浓缩的方法及系统

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007068154A1 (en) * 2005-10-31 2007-06-21 Jason Medical Group (Far East) Ltd A method for preparing specific igy against mutant avian influenza virus and the preparation tηereof
CN106540249A (zh) * 2015-09-19 2017-03-29 广东永顺生物制药股份有限公司 一种禽流感(h5n1)或猪繁殖与呼吸综合征(prrs)病毒疫苗的抗原浓缩纯化方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007068154A1 (en) * 2005-10-31 2007-06-21 Jason Medical Group (Far East) Ltd A method for preparing specific igy against mutant avian influenza virus and the preparation tηereof
CN106540249A (zh) * 2015-09-19 2017-03-29 广东永顺生物制药股份有限公司 一种禽流感(h5n1)或猪繁殖与呼吸综合征(prrs)病毒疫苗的抗原浓缩纯化方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
微生物的规模化浓缩技术;朱丽萍等;《中国微生态杂志》;20070430;第19卷(第2期);第227页左栏第1、3段、第1节第2段、第2节 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108018263A (zh) 2018-05-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104491855B (zh) 一种大规模制备高产率、高纯度、高安全的口蹄疫全病毒颗粒标记疫苗的方法及其产品
CN108042798B (zh) 一种悬浮细胞生产重组禽流感病毒灭活疫苗的方法
CN108018263B (zh) 一种重组禽流感病毒的纯化浓缩方法及其系统
CN107254449B (zh) 一种大规模生产高纯度猪伪狂犬病毒的方法
CN101491672A (zh) 一种鸡新城疫-禽流感二联油乳剂灭活疫苗及其制备方法
CN111920944B (zh) 一种流感病毒亚单位疫苗原液制备方法
EP3371302B1 (en) Method for the separation of virus compositions including depletion and purification thereof
CN103937754B (zh) 一种猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒纯化方法
CN112704733A (zh) 四价流感病毒鸡胚尿囊液纯化工艺、四价流感病毒裂解疫苗及其制备方法
CN114645024B (zh) 降低狂犬病病毒产品中细胞蛋白及dna残留的方法
CN117384735A (zh) 间充质干细胞外泌体的提取系统及其制备方法
CN107779441B (zh) 一种禽流感抗原的浓缩纯化方法、禽流感抗原
CN101688188B (zh) 纯化病毒悬浮液的方法
WO2022262206A1 (zh) Gmp级逆转录病毒载体的纯化方法与应用
CN110804578B (zh) 一种牛血清去除IgG的生产方法
CN108531462B (zh) 一种禽腺病毒精纯化的方法
CN103601793A (zh) 一种禽用疫苗抗原纯化的方法
CN108048602B (zh) 一种检测细胞源病毒抗原液的分离纯化效果的方法
CN110904276A (zh) 噬菌体在生物制品病毒清除工艺验证中的应用
CN111471658A (zh) 一种病毒纯化方法及经由该方法制备得到的二联灭活疫苗
Schneider Concentration and purification
NO142024B (no) Fremgangsmaate for fremstilling av en vaksine, saerlig influensavaksine, ved aa dyrke et virus
EP3055412B1 (en) Treated filter
CN109529031A (zh) 一种口蹄疫疫苗的制备方法及其制备装置
RU2614127C2 (ru) Способ получения концентрата рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц, экспрессирующих ген гемагглютинина вируса гриппа A/California/07/2009(H1N1)

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant